Summary
Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.
Abstract
Recientemente se ha informado en la literatura que los heterociclos espirocíclicos son fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer. La síntesis de estos novedosos sistemas de anillos ortogonales es un desafío. Recientemente se publicó una metodología eficiente para sintetizar estos compuestos que describía la síntesis en fase sólida en cuatro pasos en lugar de los cinco pasos previamente informados. La ventaja de esta síntesis más corta es la eliminación del uso de reactivos tóxicos. Se descubrió que la resina basada en enlazadores de baja carga Regenerating Michael (REM) era crucial en la síntesis, ya que las versiones de alta carga evitaban la adición de reactivos que contenían cadenas laterales voluminosas de fenilo y aromáticas. El ensayo colorimétrico de bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para examinar la citotoxicidad de las concentraciones micromolares de estas nuevas moléculas espirocíclicas in vitro. MTT está fácilmente disponible comercialmente y produce resultados relativamente rápidos y confiables, lo que hace que este ensayo sea ideal para estos heterociclos espirocíclicos. Se probaron estructuras de anillos ortogonales, así como furfurilamina (un precursor en el método de síntesis que contiene un motivo de anillo similar de 5 miembros).
Introduction
Se sabe que la inhibición de moléculas pequeñas de la interacción del homólogo de doble minuto 2 del ratón ubiquitina-ligasa E3 (MDM2) con p53 restaura la inducción mediada por p53 de la apoptosis de células tumorales 1,2,3. MDM2 es un regulador negativo de la vía p53 y a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas 4,5,6,7,8,9. Estudios cristalográficos y bioquímicos recientes han revelado que moléculas pequeñas que contienen un marco espirocíclico pueden inhibir eficazmente las interacciones MDM2-p5310. El marco espirocíclico (Figura 1, sombreado en azul) se considera un motivo privilegiado ya que la derivatización de este sistema de anillos ortogonales rígidos ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos terapéuticos. Acceder a esta interesante arquitectura plantea un desafío cuando se utilizan técnicas tradicionales de síntesis orgánica. Aunque se han investigado los efectos terapéuticos de las moléculas espirocíclicas en los sistemas biológicos, la síntesis de estas moléculas sigue siendo un proceso engorroso. Los productos secundarios no deseados, el uso de condiciones adversas y los metales de transición peligrosos a menudo son problemáticos.
El uso potencial del motivo espirocíclico en el desarrollo de fármacos condujo al desarrollo de un protocolo que utiliza la síntesis en fase sólida para generar una biblioteca de moléculas con el motivo además de otros grupos funcionales intercambiables11,12. La separación de productos y reactivos entre los pasos podría lograrse simplemente utilizando un enlazador REM conectado a un cordón de resina y un recipiente de filtro de fase sólida. Esto reduciría los escalones y potencialmente aumentaría los rendimientos. Este enfoque sintético podría producir una gran variedad de posibles candidatos a fármacos. Sin embargo, la efectividad de estas moléculas en un sistema biológico requeriría más investigación.
Para determinar la citotoxicidad de estos compuestos espirocíclicos, se empleó el ensayo MTT13,14. Este método mide la viabilidad celular y se puede utilizar para determinar indirectamente la citotoxicidad celular. Se agregaron diferentes concentraciones de los inhibidores a las células cultivadas en una placa de 96 pocillos, y la proporción de células vivas se midió mediante análisis colorimétrico del grado de reducción de MTT amarillo por deshidrogenasas mitocondriales al compuesto formazán púrpura (Figura 2). La actividad se informa con mayor frecuencia como un valor IC 50, la concentración en la que el crecimiento celular se inhibe en un50% en relación con un control no tratado. Este artículo describe el protocolo para el ensayo MTT y los resultados preliminares de estas nuevas moléculas espirocíclicas.
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Protocol
NOTA: Varios productos químicos y reactivos biológicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Use equipos de protección personal apropiados (gafas de seguridad aprobadas por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional, guantes adecuados, batas de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) antes de comenzar el experimento. Además, adoptar prácticas de seguridad adecuadas al realizar síntesis y manipular productos químicos tóxicos y reactivos (campana extractora).
1. Síntesis en fase sólida de heterociclos espirocíclicos 6 y 7
NOTA: La síntesis se basó en trabajos publicados previamente11,12. El protocolo actualizado revela que la abertura del anillo catalizada por fluoruro de tetrabutilamonio del heterociclo tricíclico no era necesaria y, por lo tanto, su eliminación acorta el procedimiento sintético.
- Realizar la adición de furfurilamina de Michael al enlazador REM (duración: 25 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
- Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción.
NOTA: Asegúrese de mezclar bien para que la resina no se asiente en el fondo del recipiente. - Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, lave 4x, alternando entre diclorometano (DCM) y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción.
- Realizar adición de Michael en tándem / cicloadición 1,3-dipolar (duración: configuración de 25 min + tiempo de reacción de 48 h).
- A la resina seca, agregue 1.48 mL (5 equiv.) de trietilamina (TEA), 0.637 g (2 equiv.) de nitro-olefina y 10 mL de tolueno seco al recipiente de reacción.
- Luego, agregue 1.085 ml (4 equiv.) de cloruro de trimetilsilil (TMSCl) al recipiente de reacción en una campana extractora bien ventilada.
NOTA: Como esta reacción produce gas HCl, no tapar el recipiente de reacción hasta que el gas se haya liberado debajo de una campana extractora. - Tapar firmemente el recipiente de reacción y agitar a temperatura ambiente durante 48 h.
NOTA: Asegúrese de mezclar completamente la resina con los reactivos. - Use 5 ml de metanol para apagar la reacción.
- Drene el recipiente para eliminar la solución y luego lave 4x, alternando entre DCM y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- Realizar N-alquilación del heterociclo unido a resina para formar la amina cuaternaria (duración: 10 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h.
NOTA: Asegúrese de mezclar bien los reactivos con la resina. - Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, use DCM y metanol alternativamente para lavar 4x. Seque la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h.
- Realizar β eliminación de la amina cuaternaria para la escisión del soporte del polímero (duración: configuración de 15 min + tiempo de reacción de 24 h).
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 3 ml de DCM y 1,49 ml (5 equivalentes) de TEA para separar el heterociclo del soporte del polímero.
- Agitar la mezcla de reacción durante 24 h para asegurar una mezcla completa de la resina con la solución. Lavar 4x, alternando entre DCM y metanol. Recoger la elución de todos los lavados y concentrar por evaporación rotatoria.
- Triturar con metanol para purificar la oxima espirocíclica. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados para su reutilización en futuros experimentos.
2. Ensayo de citotoxicidad utilizando MTT 14
- Prepare 20 ml de una solución MTT de 5 mg/ml utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, NaCl al 0,9% en agua) como diluyente. Filtrar y conservar a -20 °C. Luego, prepare una dilución 1: 1 de la solución MTT del paso 2.1 en medio de cultivo celular libre de suero (DMEM).
- Preparar 1 ml de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM y 0,01 μM de compuestos problema en dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a -20 °C. Preparar 200 μL por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre 1:1000 en medio libre de suero en tubos de 1,5 ml.
- En la campana de cultivo de tejidos, sembrar células COS-7 (células de riñón de mono verde africano, riñón de Cercopithecus aethiops ) en medio completo [DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS)] en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano a una concentración de 4 × 103 células/200 μL por pocillo utilizando un pipetor multicanal. Se eligieron células COS-7 porque (1) son células de uso común para ensayos de citotoxicidad y (2) ya estaban disponibles en la institución.
- Incubar células COS-7 durante 24 h a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
- Aspire el sobrenadante de los pocillos con una pipeta de vidrio Pasteur conectada a una bomba de vacío. Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo preparadas en el paso 2.2 (véase el cuadro 1). Incubar las células como se describe en el paso 2.4.
- Aspirar el sobrenadante de los pozos. Agregue 200 μL de solución MTT a cada pocillo. Incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2 durante 4 h.
- Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazan púrpura. Añadir 200 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán púrpura. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Mida la absorbancia a 590 nm14 o 600 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia. Reste el valor de fondo de absorbancia promedio del valor de absorbancia de cada pocillo tratado. Normalice los datos como un porcentaje del valor promedio de dosis cero (promedio de los tres valores de dosis cero). Trazar datos en el eje y: lineal (% de viabilidad relativa de la celda); Eje X: log (concentración). Trazar cada serie como una curva individual (por ejemplo, los datos triplicados deben tener 3 curvas)
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Representative Results
Las oximas espirocíclicas 6 y 7 se sintetizaron utilizando un protocolo modificado (Figura 1). La adición de furfurilamina de Michael a un enlazador REM 1b proporcionó resina 2 unida a polímeros. El progreso de la reacción fue monitoreado por espectroscopia infrarroja (IR) detectando la desaparición del éster α,β-insaturado a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 unida a espirocíclicos se formó a partir de 2 a través de un intermedio transitorio 3. La hidrólisis metanólica de 4 produjo éster metílico 7 de ácido 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-fenil-3-hidroxiimino 4-hidroximetil-pirrolidin-1-il]-propiónico 7, mientras que la alquilación seguida de β-eliminación proporcionó (3E)-(2S, 4R)-4-hidroximetil-1-metil-2-fenil-3-pirrolidina oxima 6. La identidad de las oximas espirocíclicas se determinó mediante análisis espectroscópico de resonancia magnética nuclear de 1 H y 13C y la pureza por espectroscopia demasas basada en nuestros resultados anteriores11.
El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico bien conocido para determinar la viabilidad celular12. Como se ve en la Figura 2, las reductasas mitocondriales presentes en las células vivas convierten el tetrazolio amarillo de MTT en un sólido formazán púrpura insoluble. Usando un espectrofotómetro, la formación de formazan se cuantifica midiendo la absorbancia a 600 nm. El cisplatino, que se sabe que induce la muerte celular a altas concentraciones, se utilizó como control positivo (Figura 4). Como era de esperar, cuanto mayor sea la concentración de cisplatino, menor será la viabilidad celular. A continuación, se utilizó el ensayo MTT para probar los compuestos espirocíclicos 6 y 7 y furfurilamina. Se utilizó furfurilamina para determinar el efecto del anillo de furano solo en comparación con el marco espirocíclico. Como se muestra en la Figura 5, la furfurilamina y la oxima espirocíclica 6 mostraron una citotoxicidad similar. Sin embargo, la toxicidad del compuesto espirocíclico 7 fue notablemente mayor que la de furfurilamina y 6. Se sintetizará una biblioteca de oximas espirocíclicas para investigar completamente la citotoxicidad, así como los otros efectos anticancerígenos de estos heterociclos.
Figura 1: Construcción de compuestos espirocíclicos utilizando una síntesis en fase sólida actualizada. El marco espirocícico ortogonal está sombreado en azul. Tenga en cuenta que el paso (c) no es necesario, lo que evita el uso del reactivo tóxico TBAF. Las condiciones de reacción son las siguientes: (a) furfurilamina, DMF, (b) β-nitroestireno, TMSCl, TEA, tolueno, (c) TBAF, (d) haluro de alquilo, DMF, y (e) TEA, DCM. Abreviaturas: TBAF = fluoruro de tetrabutilamonio; DMF = dimetilformamida; TMSCl = cloruro de trimetilsililo; TEA = trietilamina; MCD = diclorometano; ISOC = cicloadición intramolecular de silioxi olefina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mecanismo del ensayo MTT. La sal de tetrazolio visiblemente amarilla de MTT se reduce por reductasas mitocondriales en células COS-7 vivas para formar formazán insoluble púrpura. Abreviatura: MTT = bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Monitoreo del progreso de cada paso de reacción en fase sólida por espectroscopia infrarroja. La frecuencia de estiramiento a 1717 cm-1 indicó la presencia de un éster insaturado, 1733 cm-1 representó un éster saturado, y la señal alrededor de 3300-3500 cm-1 indicó la presencia de un grupo hidroxilo. También se muestran frecuencias de estiramiento detectables para poliestireno. Abreviaturas: REM = Regenerando a Michael; ISOC = cicloadición intramolecular de silioxi olefina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos del cisplatino sobre la viabilidad celular de COS-7 en un ensayo MTT modificado. Las concentraciones de cisplatino variaron de 0 μM a 60 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos de los compuestos de ensayo sobre la viabilidad celular de COS-7 en un ensayo MTT modificado. Las concentraciones variaron de 0 μM a 100 μM y se trazaron en una escala logarítmica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Disposición de la placa de 96 pocillos. Todas las filas de datos de prueba estaban por triplicado. Se utilizaron pocillos que contenían solo células COS-7 y medio como controles. Para asegurar que el DMSO no fuera la causa de citotoxicidad en las células dosificadas con cisplatino, se utilizaron pocillos que contenían solo DMSO como controles con disolventes. Se destacan los pocillos que contienen células COS-7. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La síntesis de los compuestos espirocíclicos se basó en investigaciones previas realizadas por este laboratorio, pero con algunas modificaciones (Figura 1)11,12. El progreso de cada paso de reacción fue monitoreado por espectroscopia IR. La adición de Michael del enlazador REM 1 con furfurilamina proporcionó 2 unido al polímero (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). A partir del informe anterior, ISOC de 2 produjo el compuesto heterocíclico tricíclico 3, como lo confirma la detección del grupo TMS (IR 1214 cm-1). Este es un paso crítico de la síntesis, ya que ISOC proporcionó la regio y la estereoselectividad necesarias de los productos. Se observó una frecuencia de estiramiento del grupo hidroxilo de 3500 cm-1 en lugar de la frecuencia del grupo funcional TMS. Esto puede deberse a que el compuesto tricíclico es un intermediario transitorio que conduce al sistema espirocíclico.
Se encontraron diferentes tipos de resina REM para limitar la síntesis. El polímero de alta carga (1,00 mmol/g) impidió la síntesis de compuestos espirocíclicos que contenían cadenas laterales R2 voluminosas. Debido a las similitudes en los grupos funcionales en las resinas 4 y 5, los resultados de IR no fueron concluyentes. El éxito de este paso solo podría determinarse intentando regenerar el enlazador REM (5 → 1). La regeneración no ocurrió en los casos en que se agregó un grupo R2 voluminoso. Se recomiendan resinas de baja carga (0,5 mmol / g o menos) para una síntesis exitosa. Este método de síntesis es consistente con los procedimientos descritos en la literatura.
Como prueba preliminar, se desarrolló un protocolo para un ensayo de citotoxicidad utilizando MTT. En el transcurso de varios ensayos, se descubrieron pasos críticos y limitaciones. Para que los resultados se normalizaran en todos los pozos, las células tenían que ser sembradas uniformemente a través de los pozos, lo que requería la medición de la concentración celular antes de la siembra. El ensayo requirió placas con pocillos de fondo plano, ya que la absorbancia no se podía leer con precisión de los pocillos de fondo redondo. Además, el exceso de MTT que quedaba después de la incubación tuvo que ser eliminado para evitar interferencias en las lecturas sin alterar la formazan insoluble.
La absorbancia del formazán disuelto debe leerse a 590 nm. Sin embargo, la instrumentación actual en el laboratorio requería tomar lecturas a 600 nm en su lugar. Se encontró que el almacenamiento a 0 °C era importante para los productos químicos utilizados en el ensayo (cisplatino, moléculas espirocíclicas, furfurilamina). El DMSO, un producto químico con citotoxicidad conocida, se utilizó como disolvente para los compuestos de prueba y se utilizó para hacer diluciones para el ensayo. El reactivo MTT en sí tenía que ser preparado, ya que se almacenaba como un polvo que necesitaba ser disuelto y filtrado, ya que las partículas insolubles interferían con las lecturas.
En general, los resultados de este ensayo están destinados a ser preliminares, ya que solo se probó un pequeño número de moléculas. Se planea una prueba exhaustiva con una batería de moléculas, y se publicará un manuscrito completo. Además, la síntesis podría ser aplicable para aminas derivadas del pirrol-2-carbaldehído. En este caso, las pirrolidinas espirocíclicas se pueden sintetizar y probar para determinar sus efectos citotóxicos en las líneas celulares cancerosas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de la Facultad a K.S.H. (Oficina de Investigación y Subvenciones, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. y J.F.M. son beneficiarios de la beca Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. y B.M.R. son beneficiarios de las becas de investigación STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Agradecemos al Dr. Matthew Berezuk y al Dr. Philip Cox por su orientación sobre los bioensayos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
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