Summary
ここでは、以前に合成したスピロ環式オキシムをテストするために、3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を使用するバイオアッセイについて説明します。
Abstract
スピロ環式複素環は、癌治療のための潜在的な薬物であることが最近文献で報告されている。これらの新しい直交環系の合成は困難である。これらの化合物を合成するための効率的な方法論が最近発表され、以前に報告された5つのステップではなく4つのステップで固相合成が説明されました。この短い合成の利点は、有毒な試薬の使用を排除することです。低負荷再生マイケル(REM)リンカーベースの樹脂は、高負荷バージョンではかさばるフェニルおよび芳香族側鎖を含む試薬の添加が妨げられるため、合成に重要であることがわかりました。比色3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して、これらの新規スピロ環式分子のマイクロモル濃度の細胞毒性をin vitroで調べました。MTTは市販品として容易に入手でき、比較的高速で信頼性の高い結果を生成するため、このアッセイはこれらのスピロ環式複素環に最適です。直交環構造ならびにフルフリルアミン(類似の5員環モチーフを含む合成法の前駆体)を試験した。
Introduction
E3ユビキチン-リガーゼマウスダブルミニッツ2ホモログ(MDM2)とp53との相互作用の低分子阻害は、腫瘍細胞アポトーシスのp53媒介誘導を回復させることが知られている1,2,3。MDM2はp53経路の負の調節因子であり、癌細胞でしばしば過剰発現している4、5、6、7、8、9。最近の結晶学的および生化学的研究は、スピロ環状フレームワークを含む小分子がMDM2-p53相互作用を効果的に阻害できることが明らかになりました10。スピロサイクリックフレームワーク(図1、青の網掛け)は、この剛直交環系の誘導体化が新しい治療薬の発見につながったため、特権的なモチーフと考えられています。この興味深いアーキテクチャにアクセスすることは、従来の有機合成技術を使用する場合に課題をもたらします。生体系におけるスピロ環状分子の治療効果は研究されているが、これらの分子の合成は依然として煩雑なプロセスである。過酷な条件を使用した不要な副産物、および危険な遷移金属はしばしば問題になります。
医薬品開発におけるスピロサイクリックモチーフの潜在的な使用は、他の交換可能な官能基に加えてモチーフを有する分子のライブラリを生成するための固相合成を利用するプロトコルの開発につながった11,12。ステップ間の生成物と反応物の分離は、樹脂ビーズと固相フィルター容器に取り付けられたREMリンカーを利用するだけで実現できます。これにより、ステップが削減され、歩留まりが向上する可能性があります。この合成アプローチは、潜在的な薬剤候補の大規模な配列を生成する可能性があります。ただし、生物学的システムにおけるこれらの分子の有効性には、さらなる調査が必要です。
これらのスピロ環状化合物の細胞毒性を決定するために、MTTアッセイ13、14 を採用した。この方法は、細胞生存率を測定し、細胞傷害性を間接的に決定するために使用できます。異なる濃度の阻害剤を96ウェルプレートの培養細胞に添加し、紫色ホルマザン化合物に対するミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる黄色MTTの減少の程度を比色分析により生細胞の割合を測定しました(図2)。活性は、ほとんどの場合、IC50 値(未処理の対照と比較して細胞増殖が50%阻害される濃度)として報告されます。この論文では、MTTアッセイのプロトコルと、これらの新しいスピロ環式分子の予備的な結果について説明します。
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Protocol
注:このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質および生物学的試薬は、有毒で発がん性があります。使用する前に、関連する製品安全データシート(MSDS)を参照してください。実験を開始する前に、適切な個人用保護具(労働安全衛生局が承認した安全ゴーグル、適切な手袋、白衣、フルレングスのズボン、つま先の開いた靴)を使用してください。さらに、合成を行い、有毒な化学物質や試薬(ヒュームフード)を取り扱う際には、適切な安全対策を講じてください。
1. スピロ環式複素環6および7の固相合成
注:合成は以前に発表された研究11,12に基づいていました。更新されたプロトコルは、三環式複素環のテトラブチルアンモニウムフルオリド触媒開環が不要であり、したがってその除去が合成手順を短縮することを明らかにしている。
- REMリンカーへのフルフリルアミンのマイケル添加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。
- 1 g(1当量[当量])のREM樹脂、20 mL(20当量)のジメチルホルムアミド(DMF)、および2.4 mLのフルフリルアミンを25 mLの固相反応容器に加えます。反応開始後24時間室温で反応容器を撹拌する。
メモ: レジンが容器の底に収まらないように、十分に混合してください。 - 反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、ジクロロメタン(DCM)とメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。
- 1 g(1当量[当量])のREM樹脂、20 mL(20当量)のジメチルホルムアミド(DMF)、および2.4 mLのフルフリルアミンを25 mLの固相反応容器に加えます。反応開始後24時間室温で反応容器を撹拌する。
- タンデムマイケル付加/1,3-双極子環化付加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 48時間の反応時間)。
- 乾燥樹脂に、1.48 mL (5当量) のトリエチルアミン (TEA)、0.637 g (2当量) のニトロオレフィン、および 10 mL の乾燥トルエンを反応容器に加えます。
- 次に、1.085 mL(4当量)のトリメチルシリルクロリド(TMSCl)を、換気の良いドラフト内の反応容器に追加します。
注意: この反応はHClガスを生成するため、ガスがヒュームフードの下で放出されるまで反応容器に蓋をしないでください。 - 反応容器にしっかりと蓋をし、室温で48時間撹拌する。
注:樹脂と試薬を完全に混合してください。 - 5 mLのメタノールを使用して反応を停止します。
- 容器を排水して溶液を除去し、DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。
- 樹脂結合複素環の N-アルキル化を行い、第4級アミンを形成します(持続時間:10分のセットアップ+24時間の反応時間)。
- 反応容器内の乾燥樹脂に、DMF5mLとハロゲン化アルキル10当量を加え、室温で24時間撹拌する。
注:試薬と樹脂を完全に混合してください。 - 反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、DCMとメタノールを交互に使用して4回洗浄します。洗浄後、反応容器内の樹脂を乾燥させる。
- 反応容器内の乾燥樹脂に、DMF5mLとハロゲン化アルキル10当量を加え、室温で24時間撹拌する。
- ポリマー支持体からの切断のために第四級アミンのβ脱離を実行します(持続時間:15分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。
- 反応容器内の乾燥樹脂に、3 mLのDCMと1.49 mL(5当量)のTEAを加えて、ポリマー支持体から複素環を切断します。
- 反応混合物を24時間攪拌して、樹脂と溶液を完全に混合します。DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。すべての洗浄液から溶出物を収集し、回転蒸発によって濃縮します。
- メタノールで粉砕して、スピロ環状オキシムを精製します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させ、将来の実験で再利用します。
2. MTT 14を用いた細胞毒性アッセイ
- 希釈剤として滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、水中0.9%NaCl)を使用して、20 mLの5 mg/mL MTT溶液を調製します。ろ過し、-20°Cで保存します。 次に、ステップ2.1のMTT溶液の1:1希釈液を無血清細胞培養培地(DMEM)で調製します。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)中の100 mM、10 mM、100 μM、10 μM、1 μM、1 μM、0.1 μM、および0.01 μMの試験化合物の1.5 mLマイクロ遠心チューブに各1 mLのストック溶液を調製します。-20°Cで保存してください。 1.5 mLチューブの無血清培地でストック濃度を1:1000に希釈することにより、試験化合物の作業溶液の用量あたり200 μLを調製します。
- 組織培養フード内で、COS-7細胞(アフリカミドリザル腎細胞、 セルコピテクス・エチオプス 腎臓)を完全培地[10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM]に播種し、マルチチャンネルピペッターを使用して、ウェルあたり4 ×10 3 細胞/200 μLの濃度で平底の組織培養処理96ウェルプレートに播種します。COS-7細胞が選ばれた理由は、(1)細胞毒性アッセイに一般的に使用される細胞であり、(2)これらはすでに施設内で利用可能であったためです。
- COS-7細胞を5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。
- ウェルから上清を吸引するには、真空ポンプに取り付けられたガラス製パスツールピペットを使用します。ステップ2.2で調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3連で細胞に投与します(表1を参照)。ステップ2.4に記載されているように細胞をインキュベートします。
- ウェルから上清を吸引します。200 μLのMTT溶液を各ウェルに加えます。5%CO2 を含む雰囲気中で37°Cで4時間インキュベートします。
- 紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200 μLのDMSOを加えて、紫色のホルマザン結晶を溶解します。室温で15分間インキュベートします。
- 96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの590 nm14 または600 nmでの吸光度を測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。各処理ウェルの吸光度値からバックグラウンド値の平均吸光度を差し引く。データを平均ゼロ線量値のパーセンテージとして正規化します(3つのゼロ線量値を平均します)。y軸にデータをプロットします:線形(%相対細胞生存率);X軸:ログ(濃度)。各系列を個別の曲線としてプロットします(たとえば、三重データには3つの曲線が必要です)
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Representative Results
スピロ環式オキシム6および7は、改変されたプロトコルを用いて合成した(図1)。REMリンカー1bへのフルフリルアミンのマイケル付加により、ポリマー結合樹脂2を得た。反応の進行は、1722 cm-1でのα,β-不飽和エステルの消失を検出することにより、赤外(IR)分光法によってモニターされました(図3)。スピロ環結合樹脂4は、一過性中間体3を介して2から形成された。4のメタノール加水分解により,3-[(3E)-(2S,4R)-2-フェニル-3-ヒドロキシイミノ4-ヒドロキシメチル-ピロリジン-1-イル]-プロピオン酸メチルエステル7が生成し,アルキル化とそれに続くβ脱離により(3E)-(2S,4R)-4-ヒドロキシメチル-1-メチル-2-フェニル-3-ピロリジンオキシム6が得られた。スピロ環式オキシムの同一性は1Hおよび13C核磁気共鳴分光分析によって決定され、純度は以前の結果に基づいて質量分析によって決定されました11。
MTTアッセイは、細胞生存率を決定するための周知の比色アッセイである12。図2に見られるように、生細胞に存在するミトコンドリアレダクターゼは、MTTの黄色テトラゾリウムを不溶性の紫色ホルマザン固体に変換する。分光光度計を用いて、ホルマザン形成は、600nmにおける吸光度を測定することによって定量される。ポジティブコントロールとして、高濃度で細胞死を誘導することが知られているシスプラチンを使用しました(図4)。予想通り、シスプラチンの濃度が高いほど、細胞生存率は低くなります。次に、MTTアッセイを用いて、スピロ環状化合物 6 および 7 ならびにフルフリルアミンを試験した。フルフリルアミンは、スピロ環式フレームワークと比較したフラン環単独の効果を決定するために使用されました。図5に描かれているように、フルフリルアミンおよびスピロ環式オキシム 6 は同様の細胞毒性を示した。しかし、スピロ環状化合物 7 の毒性は、フルフリルアミンおよび 6の毒性よりも著しく大きかった。スピロ環式オキシムのライブラリは、細胞毒性とこれらの複素環の他の抗癌効果を完全に調査するために合成されます。
図1:更新された固相合成法を用いたスピロ環式化合物の構築。 直交するスパイロサイトフレームワークは青色で網掛けされています。なお、ステップ(c)は不要であり、毒性試薬TBAFの使用を回避する。反応条件は以下の通りである:(a)フルフリルアミン、DMF、(b)β−ニトロスチレン、TMSCl、TEA、トルエン、(c)TBAF、(d)ハロゲン化アルキル、DMF、および(e)TEA、DCM。略語:TBAF =テトラブチルアンモニウムフルオリド;DMF = ジメチルホルムアミド;TMSCl = トリメチルシリルクロリド;TEA = トリエチルアミン;DCM = ジクロロメタン;ISOC =分子内シリオキシオレフィン環化付加。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MTTアッセイのメカニズム。 MTTの目に見えて黄色のテトラゾリウム塩は、生きているCOS-7細胞中のミトコンドリアレダクターゼによって還元され、紫色の不溶性ホルマザンを形成します。略称:MTT = 3−(4',5'−ジメチルチアゾール−2'−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:赤外分光法による各固相反応工程の進行のモニタリング。 1717cm-1での伸張頻度は不飽和エステルの存在を示し、1733cm-1は飽和エステルを示し、3300-3500cm-1付近のシグナルはヒドロキシル基の存在を示した。ポリスチレンの検出可能な延伸頻度も示されています。略語:REM =再生マイケル;ISOC =分子内シリオキシオレフィン環化付加。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:修正MTTアッセイにおけるCOS-7細胞生存率に対するシスプラチンの効果。 シスプラチンの濃度は0μMから60μMの範囲であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:改変MTTアッセイにおけるCOS-7細胞生存率に対する試験化合物の影響。 濃度は0μMから100μMの範囲であり、対数スケールでプロットされた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:96ウェルプレートのレイアウト。 すべてのテストデータ行は3重でした。COS-7細胞および培地のみを含むウェルを対照として用いた。DMSOがシスプラチン投与細胞の細胞毒性の原因ではないことを確認するために、DMSOのみを含むウェルを溶媒コントロールとして使用しました。COS-7細胞を含むウェルが強調表示されます。略語:DMSO =ジメチルスルホキシド;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
スピロ環状化合物の合成は、本研究室が実施した先行研究に基づいていましたが、いくつかの変更が加えられています(図1)11,12。各反応工程の進行をIR分光法によりモニターした。REMリンカー1とフルフリルアミンのマイケル添加により、ポリマー結合2が得られました(IR 1722 cm-1→ 1731 cm-1)。前回の報告から、TMS基(IR 1214 cm-1)の検出によって確認されたように、2のISOCは三環式複素環化合物3を生成した。ISOCは生成物の必要な位置選択性および立体選択性を提供するため、これは合成の重要なステップです。TMS官能基の周波数の代わりに3500cm-1の水酸基伸長頻度が観察された。これは、三環式化合物がスピロ環式系に至る一過性の中間体であるためであり得る。
異なる種類のREM樹脂が合成を制限することがわかった。高負荷ポリマー(1.00 mmol/g)は、嵩高いR2側鎖を含むスピロ環式化合物の合成を妨げた。樹脂4と5の官能基は類似しているため、IRの結果は決定的ではありませんでした。このステップの成功は、REMリンカーの再生成を試みることによってのみ判断できました(5→1)。嵩高いR2基が付加された場合には再生は起こらなかった。合成を成功させるには、低負荷樹脂(0.5 mmol/g以下)をお勧めします。この合成方法は、文献に記載の手順と一致する。
予備試験として、MTTを用いた細胞毒性アッセイのプロトコルが開発された。いくつかの試験の過程で、重要なステップと限界が発見されました。結果をすべてのウェルで正規化するには、細胞をウェル間で均等に播種する必要があり、播種前に細胞濃度を測定する必要がありました。アッセイには、丸底ウェルから吸光度を正確に読み取ることができなかったため、平底ウェルを備えたプレートが必要でした。さらに、インキュベーション後に残った過剰なMTTは、不溶性ホルマザンを乱すことなく測定値の干渉を防ぐために除去する必要がありました。
溶解したホルマザンの吸光度は590 nmで読み取る必要があります。しかし、実験室の現在の機器では、代わりに600nmで測定値を取得する必要がありました。0°Cでの保存は、アッセイに使用した化学物質(シスプラチン、スピロ環式分子、フルフリルアミン)にとって重要であることがわかった。DMSO(既知の細胞毒性を有する化学物質)を試験化合物の溶媒として使用し、アッセイの希釈に使用しました。MTT試薬自体は、不溶性粒子が読み取りを妨げるため、溶解およびろ過が必要な粉末として保存されていたため、調製する必要がありました。
全体として、このアッセイの結果は、少数の分子のみがテストされたため、予備的なものであることを意図しています。分子のバッテリーによる徹底的なテストが計画されており、完全な原稿が近日公開されます。さらに、この合成は、ピロール-2-カルブアルデヒドから誘導されるアミンにも適用できる可能性があります。この場合、スピロ環状ピロリジンを合成し、癌細胞株に対する細胞毒性効果について試験することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ファカルティリサーチカウンシルからK.S.H.(アズサパシフィック大学研究助成金局-米国)への助成金によって資金提供されました。A.N.G.とJFMは、学術学部研究経験(SURE)フェローシップの受賞者です。S.K.M.とB.M.R.は、STEM研究フェローシップ助成金(米国アズサパシフィック大学科学研究センター)の受賞者です。バイオアッセイの指導をしてくれたマシュー・ベレズク博士とフィリップ・コックス博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
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