Summary
Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.
Abstract
Les hétérocycles spirocycliques ont récemment été rapportés dans la littérature comme étant des médicaments potentiels pour le traitement du cancer. La synthèse de ces nouveaux systèmes d’anneaux orthogonaux est difficile. Une méthodologie efficace pour synthétiser ces composés a récemment été publiée qui décrit la synthèse en phase solide en quatre étapes au lieu des cinq étapes précédemment rapportées. L’avantage de cette synthèse plus courte est l’élimination de l’utilisation de réactifs toxiques. La résine à base de linker Regenerating Michael (REM) à faible charge s’est avérée cruciale dans la synthèse, car les versions à charge élevée empêchaient l’ajout de réactifs contenant du phényle volumineux et des chaînes latérales aromatiques. Le test colorimétrique de bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour examiner la cytotoxicité des concentrations micromolaires de ces nouvelles molécules spirocycliques in vitro. Le MTT est facilement disponible dans le commerce et produit des résultats relativement rapides et fiables, ce qui rend ce test idéal pour ces hétérocycles spirocycliques. Les structures des anneaux orthogonaux ainsi que la furfurylamine (un précurseur de la méthode de synthèse contenant un motif cyclique similaire à 5 membres) ont été testées.
Introduction
L’inhibition à petite molécule de l’interaction de l’homologue E3 ubiquitine-ligase souris double minute 2 (MDM2) avec p53 est connue pour restaurer l’induction médiée par p53 de l’apoptosedes cellules tumorales 1,2,3. MDM2 est un régulateur négatif de la voie p53 et est souvent surexprimé dans les cellules cancéreuses 4,5,6,7,8,9. Des études cristallographiques et biochimiques récentes ont révélé que de petites molécules contenant un cadre spirocyclique peuvent inhiber efficacement les interactions MDM2-p5310. Le cadre spirocyclique (Figure 1, ombré en bleu) est considéré comme un motif privilégié car la dérivatisation de ce système d’anneaux orthogonaux rigides a conduit à la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques. L’accès à cette architecture intéressante pose un défi lors de l’utilisation des techniques traditionnelles de synthèse organique. Bien que les effets thérapeutiques des molécules spirocycliques dans les systèmes biologiques aient été étudiés, la synthèse de ces molécules est encore un processus lourd. Les produits secondaires indésirables, l’utilisation de conditions difficiles et les métaux de transition dangereux sont souvent problématiques.
L’utilisation potentielle du motif spirocyclique dans le développement de médicaments a conduit au développement d’un protocole utilisant la synthèse en phase solide pour générer une bibliothèque de molécules avec le motif en plus d’autres groupes fonctionnels interchangeables11,12. La séparation des produits et des réactifs entre les étapes pourrait être réalisée en utilisant simplement un agent de liaison REM fixé à une bille de résine et à un récipient filtrant en phase solide. Cela réduirait les étapes et augmenterait potentiellement les rendements. Cette approche synthétique pourrait produire un large éventail de candidats médicaments potentiels. Cependant, l’efficacité de ces molécules dans un système biologique nécessiterait des recherches plus approfondies.
Pour déterminer la cytotoxicité de ces composés spirocycliques, le test MTT13,14 a été utilisé. Cette méthode mesure la viabilité cellulaire et peut être utilisée pour déterminer indirectement la cytotoxicité cellulaire. Différentes concentrations d’inhibiteurs ont été ajoutées à des cellules cultivées dans une plaque de 96 puits, et la proportion de cellules vivantes a été mesurée par analyse colorimétrique de l’étendue de la réduction du MTT jaune par les déshydrogénases mitochondriales en composé formazan pourpre (Figure 2). L’activité est le plus souvent rapportée comme une valeur IC 50 - la concentration à laquelle la croissance cellulaire est inhibée de50% par rapport à un témoin non traité. Cet article décrit le protocole du test MTT et les résultats préliminaires de ces nouvelles molécules spirocycliques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Plusieurs produits chimiques et réactifs biologiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérogènes. Consultez les fiches signalétiques (FS) pertinentes avant de les utiliser. Utilisez des équipements de protection individuelle appropriés (lunettes de sécurité approuvées par l’Occupational Safety and Health Administration, gants appropriés, blouses de laboratoire, pantalons longs et chaussures fermées) avant de commencer l’expérience. En outre, adopter des pratiques de sécurité appropriées lors de la synthèse et de la manipulation de produits chimiques toxiques et de réactifs (hotte).
1. Synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques 6 et 7
NOTE: La synthèse était basée sur des travaux publiés précédemment11,12. Le protocole mis à jour révèle que l’ouverture cyclique catalysée par le fluorure de tétrabutylammonium de l’hétérocycle tricyclique n’était pas nécessaire, et donc son élimination raccourcit la procédure synthétique.
- Effectuer l’ajout de furfurylamine à Michael au linker REM (durée: 25 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
- Ajouter 1 g (1 équivalent [équiv.]) de résine REM, 20 mL (20 équivalents) de diméthylformamide (DMF) et 2,4 mL de furfurylamine dans une cuve de réaction en phase solide de 25 mL. Agiter la cuve de réaction à température ambiante pendant 24 heures après le début de la réaction.
REMARQUE: Assurez-vous d’un mélange complet afin que la résine ne reste pas au fond du récipient. - Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, laver 4x, en alternant entre le dichlorométhane (DCM) et le méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.
- Ajouter 1 g (1 équivalent [équiv.]) de résine REM, 20 mL (20 équivalents) de diméthylformamide (DMF) et 2,4 mL de furfurylamine dans une cuve de réaction en phase solide de 25 mL. Agiter la cuve de réaction à température ambiante pendant 24 heures après le début de la réaction.
- Effectuer l’addition Michael en tandem/cycloaddition 1,3-dipolaire (durée : 25 min de configuration + 48 h de temps de réaction).
- À la résine sèche, ajouter 1,48 mL (5 équivalents) de triéthylamine (TEA), 0,637 g (2 équivalents) de nitro-oléfine et 10 mL de toluène sec dans la cuve de réaction.
- Ensuite, ajouter 1,085 mL (4 équivalents) de chlorure de triméthylsilyle (TMSCl) dans la cuve de réaction dans une hotte bien ventilée.
NOTE: Comme cette réaction produit du gaz HCl, ne pas boucher le récipient de réaction tant que le gaz n’a pas été libéré sous une hotte. - Boucher solidement la cuve de réaction et agiter à température ambiante pendant 48 h.
REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger la résine avec les réactifs. - Utilisez 5 mL de méthanol pour éteindre la réaction.
- Vidangez le récipient pour éliminer la solution, puis lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.
- Effectuer la N-alkylation de l’hétérocycle lié à la résine pour former l’amine quaternaire (durée : 10 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
- Ajouter à la résine sèche dans la cuve de réaction 5 mL de DMF et 10 équivalents d’halogénure d’alkyle, et agiter à température ambiante pendant 24 h.
REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger les réactifs avec la résine. - Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, utilisez du DCM et du méthanol en alternance pour laver 4x. Sécher la résine dans le récipient de réaction après les lavages.
- Ajouter à la résine sèche dans la cuve de réaction 5 mL de DMF et 10 équivalents d’halogénure d’alkyle, et agiter à température ambiante pendant 24 h.
- Effectuer β-élimination de l’amine quaternaire pour le clivage du support polymère (durée: 15 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
- À la résine sèche dans la cuve de réaction, ajouter 3 mL de DCM et 1,49 mL (5 équivalents) de TEA pour cliver l’hétérocycle du support polymère.
- Agiter le mélange réactionnel pendant 24 h pour assurer un mélange complet de la résine avec la solution. Lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Recueillir l’élution de tous les lavages et concentrer par évaporation rotative.
- Triturer avec du méthanol pour purifier l’oxime spirocyclique. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages pour la réutiliser dans de futures expériences.
2. Essai de cytotoxicité à l’aide de MTT 14
- Préparer 20 mL d’une solution de MTT à 5 mg/mL en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS, NaCl à 0,9 % dans l’eau) comme diluant. Filtrer et conserver à -20 °C. Ensuite, préparer une dilution 1:1 de la solution de MTT à partir de l’étape 2.1 dans un milieu de culture cellulaire sans sérum (DMEM).
- Préparer 1 mL de solutions mères dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM et 0,01 μM de composés à essai dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à -20 °C. Préparer 200 μL par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations mères 1:1000 dans un milieu sans sérum dans des tubes de 1,5 mL.
- Dans le capot de culture tissulaire, ensemencer des cellules COS-7 (cellules rénales de singe vert africain, rein de Cercopithecus aethiops ) dans un milieu complet [DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS)] sur des plaques à fond plat traitées par culture tissulaire à 96 puits à une concentration de 4 × 103 cellules/200 μL par puits à l’aide d’un pipeteur multicanaux. Les cellules COS-7 ont été choisies parce que (1) ce sont des cellules couramment utilisées pour les tests de cytotoxicité et (2) elles étaient déjà disponibles dans l’établissement.
- Incuber les cellules COS-7 pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
- Aspirer le surnageant des puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre fixée à une pompe à vide. Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai à l’aide des solutions de travail préparées à l’étape 2.2 (voir tableau 1). Incuber les cellules comme décrit à l’étape 2.4.
- Aspirer le surnageant des puits. Ajouter 200 μL de solution de MTT à chaque puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% deCO2 pendant 4 h.
- Aspirez doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazan pourpre. Ajouter 200 μL de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan violet. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Mesurer l’absorbance à 590 nm14 ou 600 nm pour chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques de 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance. Soustrayez la valeur de fond moyenne de l’absorbance de la valeur d’absorbance de chaque puits traité. Normaliser les données en pourcentage de la valeur posologique nulle moyenne (moyenne des trois valeurs de dose nulle). Tracer les données sur l’axe des y: linéaire (% de viabilité cellulaire relative); axe des abscisses : log (concentration). Tracer chaque série comme une courbe individuelle (p. ex., les données triplées devraient avoir 3 courbes)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les oximes spirocycliques 6 et 7 ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié (Figure 1). L’ajout Michael de furfurylamine à un agent de liaison REM 1b a permis d’obtenir une résine liée au polymère 2. La progression de la réaction a été surveillée par spectroscopie infrarouge (IR) en détectant la disparition de l’ester α,β-insaturé à 1722 cm-1 (Figure 3). La résine spirocyclique 4 a été formée à partir de 2 via un intermédiaire transitoire 3. L’hydrolyse méthanolique de 4 a produit l’ester méthylique 7 de l’acide 3-[(3E)-(2S,4R)-2-phényl-3-hydroxyimino 4-hydroxyméthyl-pyrrolidin-1-yl]-propionique, tandis que l’alkylation suivie d’une élimination β a permis d’obtenir l’ester méthyl(3E)-(2S, 4R)-4-hydroxyméthyl-1-méthyl-2-phényl-3-pyrrolidine oxime6. L’identité des oximes spirocycliques a été déterminée par l’analyse spectroscopique par résonance magnétique nucléaire 1H et 13Cet la pureté par spectroscopie de masse sur la base de nos résultats précédents11.
Le test MTT est un test colorimétrique bien connu pour déterminer la viabilité cellulaire12. Comme le montre la figure 2, les réductases mitochondriales présentes dans les cellules vivantes convertissent le tétrazolium jaune du MTT en un solide de formazan pourpre insoluble. À l’aide d’un spectrophotomètre, la formation de formazan est quantifiée en mesurant l’absorbance à 600 nm. Le cisplatine, connu pour induire la mort cellulaire à des concentrations élevées, a été utilisé comme témoin positif (Figure 4). Comme prévu, plus la concentration de cisplatine est élevée, plus la viabilité cellulaire est faible. Ensuite, le test MTT a été utilisé pour tester les composés spirocycliques 6 et 7 et la furfurylamine. La furfurylamine a été utilisée pour déterminer l’effet du cycle furane seul par rapport au cadre spirocyclique. Comme le montre la figure 5, la furfurylamine et l’oxime spirocyclique 6 présentaient une cytotoxicité similaire. Cependant, la toxicité du composé spirocyclique 7 était sensiblement supérieure à celle de la furfurylamine et du 6. Une bibliothèque d’oximes spirocycliques sera synthétisée pour étudier pleinement la cytotoxicité ainsi que les autres effets anticancéreux de ces hétérocycles.
Figure 1 : Construction de composés spirocycliques à l’aide d’une synthèse en phase solide mise à jour. Le cadre spirocycique orthogonal est ombré en bleu. Notez que l’étape (c) n’est pas nécessaire, ce qui évite d’utiliser le réactif toxique TBAF. Les conditions de réaction sont les suivantes : a) furfurylamine, DMF, b) β-nitrostyrène, TMSCl, TEA, toluène, (c) TBAF, (d) halogénure d’alkyle, DMF, et (e) TEA, DCM. Abréviations : TBAF = fluorure de tétrabutylammonium; DMF = diméthylformamide; TMSCl = chlorure de triméthylsilyle; TEA = triéthylamine; DCM = dichlorométhane; ISOC = cycloaddition intramoléculaire de silyoxy oléfine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mécanisme du test MTT. Le sel de tétrazolium visiblement jaune du MTT est réduit par les réductases mitochondriales dans les cellules vivantes COS-7 pour former du formazan insoluble pourpre. Abréviation : MTT = bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Surveillance de la progression de chaque étape de réaction en phase solide par spectroscopie infrarouge. La fréquence d’étirement à 1717 cm-1 indiquait la présence d’un ester insaturé, 1733 cm-1 indiquait un ester saturé et le signal autour de 3300-3500 cm-1 indiquait la présence d’un groupe hydroxyle. Les fréquences d’étirement détectables pour le polystyrène sont également indiquées. Abréviations : REM = Regenerating Michael; ISOC = cycloaddition intramoléculaire de silyoxy oléfine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets du cisplatine sur la viabilité cellulaire du COS-7 dans un test MTT modifié. Les concentrations de cisplatine variaient de 0 μM à 60 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effets des composés d’essai sur la viabilité des cellules COS-7 dans un essai MTT modifié. Les concentrations variaient de 0 μM à 100 μM et ont été tracées sur une échelle logarithmique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Disposition de la plaque de 96 puits. Toutes les lignes de données de test étaient en trois exemplaires. Des puits contenant uniquement des cellules COS-7 et un milieu ont été utilisés comme témoins. Pour s’assurer que le DMSO n’était pas la cause de la cytotoxicité dans les cellules dosées au cisplatine, des puits contenant uniquement du DMSO ont été utilisés comme témoins de solvants. Les puits contenant des cellules COS-7 sont mis en évidence. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La synthèse des composés spirocycliques était basée sur des recherches antérieures menées par ce laboratoire, mais avec quelques modifications (Figure 1)11,12. La progression de chaque étape de réaction a été surveillée par spectroscopie IR. L’ajout Michael du linker REM 1 avec furfurylamine a permis d’obtenir une liaison polymère 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). D’après le rapport précédent, l’ISOC de 2 a produit le composé hétérocyclique tricyclique 3, comme le confirme la détection du groupe TMS (IR 1214 cm-1). Il s’agit d’une étape critique de la synthèse, car l’ISOC a fourni la régiostérilité et la stéréosélectivité nécessaires des produits. Une fréquence d’étirement du groupe hydroxyle de 3500 cm-1 a été observée au lieu de la fréquence du groupe fonctionnel TMS. Cela peut être dû au fait que le composé tricyclique est un intermédiaire transitoire qui conduit au système spirocyclique.
Différents types de résine REM ont été trouvés pour limiter la synthèse. Le polymère à haute charge (1,00 mmol/g) empêchait la synthèse de composés spirocycliques contenant des chaînes latérales R2 volumineuses. En raison des similitudes entre les groupes fonctionnels des résines 4 et 5, les résultats de l’IR n’ont pas été concluants. Le succès de cette étape n’a pu être déterminé qu’en tentant de régénérer l’éditeur de liens REM (5 → 1). La régénération ne s’est pas produite dans les cas où un groupe R2 volumineux a été ajouté. Les résines à faible charge (0,5 mmol/g ou moins) sont recommandées pour une synthèse réussie. Cette méthode de synthèse est conforme aux procédures décrites dans la littérature.
Comme test préliminaire, un protocole a été développé pour un test de cytotoxicité utilisant MTT. Au cours de plusieurs essais, des étapes critiques et des limites ont été découvertes. Pour que les résultats soient normalisés dans tous les puits, les cellules devaient être ensemencées uniformément dans les puits, ce qui nécessitait la mesure de la concentration cellulaire avant l’ensemencement. L’essai nécessitait des plaques avec des puits à fond plat, car l’absorbance ne pouvait pas être lue avec précision à partir de puits à fond rond. De plus, l’excès de MTT qui restait après l’incubation devait être éliminé pour éviter toute interférence dans les lectures sans perturber le formazan insoluble.
L’absorbance du formazan dissous doit être lue à 590 nm. Cependant, l’instrumentation actuelle dans le laboratoire nécessitait plutôt de prendre des mesures à 600 nm. Le stockage à 0 °C s’est avéré important pour les produits chimiques utilisés dans l’essai (cisplatine, molécules spirocycliques, furfurylamine). Le DMSO, un produit chimique dont la cytotoxicité est connue, a été utilisé comme solvant pour les composés d’essai et a été utilisé pour effectuer des dilutions pour l’essai. Le réactif MTT lui-même devait être préparé, car il était stocké sous forme de poudre qui devait être dissoute et filtrée, car les particules insolubles interféraient avec les lectures.
Dans l’ensemble, les résultats de ce test sont destinés à être préliminaires, car seul un petit nombre de molécules ont été testées. Un test exhaustif avec une batterie de molécules est prévu, et un manuscrit complet sera à venir. En outre, la synthèse pourrait être applicable aux amines dérivées du pyrrole-2-carbaldéhyde. Dans ce cas, les pyrrolidines spirocycliques peuvent être synthétisées et testées pour leurs effets cytotoxiques sur les lignées cellulaires cancéreuses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherche de la faculté à K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. et J.F.M. sont récipiendaires de la bourse SURE (Scholarly Undergraduate Research Experience). S.K.M. et B.M.R. sont récipiendaires des bourses de recherche STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Nous sommes reconnaissants au Dr Matthew Berezuk et au Dr Philip Cox pour leurs conseils sur les essais biologiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
