Summary
Her beskriver vi et bioassay ved hjælp af 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) for at teste tidligere syntetiserede spirocykliske oximer.
Abstract
Spirocykliske heterocykler er for nylig blevet rapporteret i litteraturen for at være potentielle lægemidler til kræftbehandling. Syntesen af disse nye ortogonale ringsystemer er udfordrende. En effektiv metode til syntetisering af disse forbindelser blev for nylig offentliggjort, der beskrev fastfasesyntesen i fire trin snarere end de tidligere rapporterede fem trin. Fordelen ved denne kortere syntese er eliminering af brugen af giftige reagenser. Regenererende Michael (REM) linkerbaseret harpiks med lav belastning viste sig at være afgørende i syntesen, da versioner med høj belastning forhindrede tilsætning af reagenser indeholdende omfangsrige phenyl- og aromatiske sidekæder. Det kolorimetriske 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev anvendt til at undersøge cytotoksiciteten af mikromolære koncentrationer af disse nye spirocykliske molekyler in vitro. MTT er let tilgængelig kommercielt og producerer relativt hurtige, pålidelige resultater, hvilket gør dette assay ideelt til disse spirocykliske heterocykler. Ortogonale ringstrukturer samt furfurylamin (en forløber i syntesemetoden indeholdende et lignende 5-mands ringmotiv) blev testet.
Introduction
Småmolekylehæmning af interaktionen mellem E3 ubiquitin-ligase mus dobbelt minut 2 homolog (MDM2) med p53 er kendt for at genoprette p53-medieret induktion af tumorcelleapoptose 1,2,3. MDM2 er en negativ regulator af p53-vejen og er ofte overudtrykt i kræftceller 4,5,6,7,8,9. Nylige krystallografiske og biokemiske undersøgelser har afsløret, at små molekyler indeholdende en spirocyklisk ramme effektivt kan hæmme MDM2-p53-interaktioner10. Den spirocykliske ramme (figur 1, skraveret i blåt) betragtes som et privilegeret motiv, da derivatisering af dette stive ortogonale ringsystem har ført til opdagelsen af nye terapeutiske lægemidler. Adgang til denne interessante arkitektur udgør en udfordring, når man bruger traditionelle organiske synteseteknikker. Selvom de terapeutiske virkninger af spirocykliske molekyler i biologiske systemer er blevet undersøgt, er syntese af disse molekyler stadig en besværlig proces. Uønskede sideprodukter, brug af barske forhold og farlige overgangsmetaller er ofte problematiske.
Den potentielle anvendelse af det spirocykliske motiv i lægemiddeludvikling førte til udviklingen af en protokol, der anvendte fastfasesyntese til at generere et bibliotek af molekyler med motivet ud over andre udskiftelige funktionelle grupper11,12. Adskillelsen af produkter og reaktanter mellem trin kunne opnås ved blot at anvende en REM-linker fastgjort til en harpiksperle og en fastfasefilterbeholder. Dette ville reducere trin og potentielt øge udbyttet. Denne syntetiske tilgang kan producere en lang række potentielle lægemiddelkandidater. Imidlertid ville effektiviteten af disse molekyler i et biologisk system kræve yderligere undersøgelse.
For at bestemme cytotoksiciteten af disse spirocykliske forbindelser blev MTT-assayet13,14 anvendt. Denne metode måler cellelevedygtighed og kan bruges til indirekte at bestemme cellecytotoksicitet. Forskellige koncentrationer af hæmmerne blev tilsat til dyrkede celler i en 96-brøndsplade, og andelen af levende celler blev målt ved kolorimetrisk analyse af omfanget af reduktion af gul MTT ved mitokondrie dehydrogenaser til den lilla formazanforbindelse (figur 2). Aktiviteten rapporteres oftest som en IC 50-værdi - den koncentration, hvor cellevækst hæmmes med50% i forhold til en ubehandlet kontrol. Dette papir beskriver protokollen for MTT-analysen og de foreløbige resultater af disse nye spirocykliske molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Flere kemikalier og biologiske reagenser, der anvendes i denne protokol, er giftige og kræftfremkaldende. Se relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) inden brug. Brug passende personlige beskyttelsesudstyr (sikkerheds- og sundhedsadministrationsgodkendte sikkerhedsbriller, korrekte handsker, laboratoriefrakker, bukser i fuld længde og sko med lukket tå), inden eksperimentet startes. Derudover skal du vedtage passende sikkerhedspraksis ved udførelse af syntese og håndtering af giftige kemikalier og reagenser (røghætte).
1. Fastfasesyntese af spirocykliske heterocykler 6 og 7
BEMÆRK: Syntesen var baseret på tidligere udgivet arbejde11,12. Den opdaterede protokol afslører, at den tetrabutylammoniumfluoridkatalyserede ringåbning af den tricykliske heterocykel ikke var nødvendig, og dermed forkorter dens eliminering den syntetiske procedure.
- Udfør Michael tilsætning af furfurylamin til REM-linkeren (varighed: 25 min opsætning + 24 timers reaktionstid).
- Der tilsættes 1 g (1 ækvivalenter [equiv.]) REM-harpiks, 20 ml (20 ækvivalenter) dimethylformamid (DMF) og 2,4 ml furfurylamin til en 25 ml fastfasereaktionsbeholder. Reaktionsbeholderen omrøres ved stuetemperatur i 24 timer efter reaktionsinitieringen.
BEMÆRK: Sørg for grundig blanding, så harpiksen ikke sidder i bunden af beholderen. - Vask harpiksen med DMF 1x, når reaktionen er afsluttet. Vask derefter 4x, skiftevis mellem dichlormethan (DCM) og methanol. Tør harpiksen grundigt i reaktionsbeholderen efter vask.
- Der tilsættes 1 g (1 ækvivalenter [equiv.]) REM-harpiks, 20 ml (20 ækvivalenter) dimethylformamid (DMF) og 2,4 ml furfurylamin til en 25 ml fastfasereaktionsbeholder. Reaktionsbeholderen omrøres ved stuetemperatur i 24 timer efter reaktionsinitieringen.
- Udfør tandem Michael addition / 1,3-dipolar cycloaddition (varighed: 25 min opsætning + 48 timers reaktionstid).
- Til tørharpiksen tilsættes 1,48 ml (5 ækvivalent) triethylamin (TEA), 0,637 g (2 ækvivalenter) nitro-olefin og 10 ml tør toluen til reaktionsbeholderen.
- Derefter tilsættes 1.085 ml (4 ækvivalent) trimethylsilylchlorid (TMSCl) til reaktionsbeholderen i en godt ventileret røghætte.
BEMÆRK: Da denne reaktion producerer HCI-gas, må reaktionsbeholderen ikke lukkes, før gassen er frigivet under en røghætte. - Dæk reaktionsbeholderen sikkert, og omrør ved stuetemperatur i 48 timer.
BEMÆRK: Sørg for grundig blanding af harpiksen med reagenserne. - Brug 5 ml methanol til at slukke reaktionen.
- Tøm beholderen for at fjerne opløsningen, og vask derefter 4x, skiftevis mellem DCM og methanol. Tør harpiksen grundigt i reaktionsbeholderen efter vask.
- Udfør N-alkylering af den harpiksbundne heterocyklus for at danne den kvaternære amin (varighed: 10 min opsætning + 24 timers reaktionstid).
- Til tørharpiksen i reaktionsbeholderen tilsættes 5 ml DMF og 10 ækvivalent alkylhalogenid og omrøres ved stuetemperatur i 24 timer.
BEMÆRK: Sørg for grundig blanding af reagenserne med harpiksen. - Vask harpiksen med DMF 1x, når reaktionen er afsluttet. Brug derefter DCM og methanol skiftevis til at vaske 4x. Tør harpiksen i reaktionsbeholderen efter vask.
- Til tørharpiksen i reaktionsbeholderen tilsættes 5 ml DMF og 10 ækvivalent alkylhalogenid og omrøres ved stuetemperatur i 24 timer.
- Udfør β-eliminering af den kvaternære amin til spaltning fra polymerstøtten (varighed: 15 min opsætning + 24 timers reaktionstid).
- Til tørharpiksen i reaktionsbeholderen tilsættes 3 ml DCM og 1,49 ml (5 ækvivalent) TEA for at spalte heterocyklen fra polymerstøtten.
- Omrør reaktionsblandingen i 24 timer for at sikre grundig blanding af harpiksen med opløsningen. Vask 4x, skiftevis mellem DCM og methanol. Saml elutionen fra alle vaskene, og koncentrer dig via roterende fordampning.
- Triturat med methanol for at rense den spirocykliske oxim. Tør harpiksen grundigt i reaktionsbeholderen efter vask til genbrug i fremtidige forsøg.
2. Cytotoksicitetsassay ved anvendelse af MTT 14
- Der fremstilles 20 ml 5 ml/ml MTT-opløsning med sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS, 0,9 % NaCl i vand) som fortyndingsmiddel. Filtrer og opbevar ved -20 °C. Derefter fremstilles en 1:1 fortynding af MTT-opløsningen fra trin 2.1 i serumfrit cellekulturmedium (DMEM).
- Der fremstilles 1 ml hver stamopløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør på 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM og 0,01 μM testforbindelser i dimethylsulfoxid (DMSO). Opbevares ved -20 °C. Der fremstilles 200 μL pr. dosis af arbejdsopløsningerne af testforbindelser ved at fortynde stamkoncentrationerne 1:1000 i serumfrit medium i 1,5 ml rør.
- I vævskulturhætten er frø COS-7-celler (afrikanske grønne abenyreceller, Cercopithecus aethiops nyre) i komplet medium [DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS)] på fladbundede, vævskulturbehandlede 96-brøndplader i en koncentration på 4 × 103 celler / 200 μL pr. Brønd ved hjælp af en flerkanals pipettor. COS-7-celler blev valgt, fordi (1) disse er almindeligt anvendte celler til cytotoksicitetsassays og (2) disse allerede var tilgængelige i institutionen.
- Cos-7-celler inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 % CO2.
- Aspirer supernatanten fra brøndene ved hjælp af en glas Pasteur-pipette fastgjort til en vakuumpumpe. Cellerne doseres i tre eksemplarer med testforbindelserne ved hjælp af de arbejdsopløsninger, der er fremstillet i trin 2.2 (se tabel 1). Inkubere celler som beskrevet i trin 2.4.
- Aspirer supernatanten fra brøndene. Tilsæt 200 μL MTT-opløsning til hver brønd. Der inkuberes ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 % CO2 i 4 timer.
- Opsæt forsigtigt supernatanten fra brøndene uden at forstyrre de lilla formazankrystaller. Tilsæt 200 μL DMSO til hver brønd for at opløse de lilla formazankrystaller. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
- Absorbansen måles ved 590 nm14 eller 600 nm for hver brønd ved hjælp af en pladelæser med 96 brønde. Brug brønde uden celler som baggrund og gennemsnit absorbansværdien. Træk den gennemsnitlige baggrundsværdi for absorbans fra absorbansværdien for hver behandlet brønd. Normaliser dataene som en procentdel af den gennemsnitlige nuldosisværdi (gennemsnit de tre nuldosisværdier). Afbild data på y-aksen: lineær (% relativ cellelevedygtighed); x-akse: log (koncentration). Afbild hver serie som en individuel kurve (f.eks. skal tredobbelte data have 3 kurver)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spirocykliske oximer 6 og 7 blev syntetiseret ved hjælp af en modificeret protokol (figur 1). Michael tilsætning af furfurylamin til en REM-linker 1b gav polymerbundet harpiks 2. Reaktionens forløb blev overvåget ved infrarød (IR) spektroskopi ved at detektere forsvinden af den α,β-umættede ester ved 1722 cm-1 (figur 3). Spirocyklisk bundet harpiks 4 blev dannet fra 2 via et forbigående mellemprodukt 3. Methanolhydrolyse af 4 producerede 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-phenyl-3-hydroxyimino 4-hydroxymethyl-pyrrolidin-1-yl]-propionsyremethylester 7, mens alkylering efterfulgt af β-elimination gav (3E)-(2S, 4R)-4-hydroxymethyl-1-methyl-2-phenyl-3-pyrrolidinoxim 6. Identiteten af de spirocykliske oximer blev bestemt ved 1H og 13C kernemagnetisk resonansspektroskopisk analyse og renheden ved massespektroskopi baseret på vores tidligere resultater11.
MTT-analysen er et velkendt kolorimetrisk assay til bestemmelse af cellelevedygtighed12. Som det ses i figur 2, omdanner mitokondriereduktaser, der findes i levende celler, det gule tetrazolium af MTT til et uopløseligt lilla formazanfaststof. Ved hjælp af et spektrofotometer kvantificeres formazandannelsen ved at måle absorbansen ved 600 nm. Cisplatin, som er kendt for at inducere celledød ved høje koncentrationer, blev anvendt som en positiv kontrol (figur 4). Som forventet, jo højere koncentration af cisplatin, jo lavere er cellelevedygtigheden. Dernæst blev MTT-analysen brugt til at teste de spirocykliske forbindelser 6 og 7 og furfurylamin. Furfurylamin blev brugt til at bestemme effekten af furanringen alene sammenlignet med den spirocykliske ramme. Som afbildet i figur 5 viste furfurylamin og spirocyklisk oxim 6 lignende cytotoksicitet. Toksiciteten af spirocyklisk forbindelse 7 var imidlertid mærkbart større end for furfurylamin og 6. Et bibliotek af spirocykliske oximer vil blive syntetiseret for fuldt ud at undersøge cytotoksiciteten såvel som de andre kræftvirkninger af disse heterocykler.
Figur 1: Konstruktion af spirocykliske forbindelser ved hjælp af en opdateret fastfasesyntese. Den ortogonale spirocycic ramme er skraveret i blåt. Bemærk, at trin (c) ikke er nødvendigt, hvilket undgår at bruge det giftige reagens TBAF. Reaktionsbetingelserne er som følger: a) furfurylamin, DMF, b) β-nitrostyren, TMSCl, TEA, toluen, c) TBAF, d) alkylhalogenid, DMF og e) TEA, DCM. Forkortelser: TBAF = tetrabutylammoniumfluorid; DMF = dimethylformamid; TMSCl = trimethylsilylchlorid; TE = triethylamin; DCM = dichlormethan; ISOC = intramolekylær silyoxy olefin cycloaddition. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mekanisme for MTT-analysen. Synligt gult tetrazoliumsalt af MTT reduceres af mitokondriereduktaser i levende COS-7-celler til dannelse af lilla uopløselig formazan. Forkortelse: MTT = 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Overvågning af fremskridtene for hver fast fasereaktion trin ved infrarød spektroskopi. Strækningsfrekvensen ved 1717 cm-1 indikerede tilstedeværelsen af en umættet ester, 1733 cm-1 afbildede en mættet ester, og signal omkring 3300-3500 cm-1 indikerede tilstedeværelsen af en hydroxylgruppe. Detekterbare strækfrekvenser for polystyren vises også. Forkortelser: REM = Regenerering af Michael; ISOC = intramolekylær silyoxy olefin cycloaddition. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Virkninger af cisplatin på COS-7-cellelevedygtighed i et modificeret MTT-assay. Koncentrationerne af cisplatin varierede fra 0 μM til 60 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Virkninger af testforbindelser på COS-7-cellelevedygtighed i et modificeret MTT-assay. Koncentrationerne varierede fra 0 μM til 100 μM og blev plottet på en log skala. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Layout af 96-brøndspladen. Alle testdatarækker var i tre eksemplarer. Brønde, der kun indeholdt COS-7-celler og -medium, blev anvendt som kontrol. For at sikre, at DMSO ikke var årsagen til cytotoksicitet i de cisplatindoserede celler, blev brønde, der kun indeholdt DMSO, anvendt som opløsningsmiddelkontrol. Brønde indeholdende COS-7-celler fremhæves. Forkortelser: DMSO = dimethylsulfoxid; PBS = fosfatbufferet saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntesen af de spirocykliske forbindelser var baseret på tidligere forskning udført af dette laboratorium, men med nogle ændringer (figur 1)11,12. Forløbet af hvert reaktionstrin blev overvåget ved IR-spektroskopi. Michael tilføjelse af REM-linker 1 med furfurylamin gav polymerbundet 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Fra den foregående rapport producerede ISOC af 2 den tricykliske heterocykliske forbindelse 3, som bekræftet ved påvisning af TMS-gruppen (IR 1214 cm-1). Dette er et kritisk trin i syntesen, da ISOC leverede den nødvendige regio- og stereoselektivitet af produkterne. En hydroxylgruppestrækfrekvens på 3500 cm-1 blev observeret i stedet for frekvensen af TMS-funktionsgruppen. Dette kan skyldes, at den tricykliske forbindelse er et forbigående mellemprodukt, der fører til det spirocykliske system.
Forskellige typer REM-harpiks viste sig at begrænse syntesen. Højlastende polymer (1,00 mmol/g) forhindrede syntesen af spirocykliske forbindelser indeholdende omfangsrige R2-sidekæder. På grund af lighederne i de funktionelle grupper i harpikser 4 og 5 var resultaterne af IR ufattelige. Succesen af dette trin kunne kun bestemmes ved at forsøge at regenerere REM-linkeren (5 → 1). Regenerering forekom ikke i tilfælde, hvor en omfangsrig R2-gruppe blev tilsat. Harpikser med lav belastning (0,5 mmol / g eller lavere) anbefales til vellykket syntese. Denne syntesemetode er i overensstemmelse med procedurer beskrevet i litteraturen.
Som en foreløbig test blev der udviklet en protokol til et cytotoksicitetsassay ved anvendelse af MTT. I løbet af flere forsøg blev kritiske trin og begrænsninger opdaget. For at resultaterne kunne normaliseres på tværs af alle brønde, skulle cellerne sås jævnt på tværs af brønde, hvilket nødvendiggjorde måling af cellekoncentrationen inden såning. Analysen krævede plader med fladbundede brønde, da absorbansen ikke kunne læses nøjagtigt fra rundbundede brønde. Derudover måtte overskydende MTT, der var tilbage efter inkubation, fjernes for at forhindre interferens i aflæsningerne uden at forstyrre den uopløselige formazan.
Absorbansen af den opløste formazan skal læses ved 590 nm. Imidlertid nødvendiggjorde den nuværende instrumentering i laboratoriet at tage aflæsninger ved 600 nm i stedet. Opbevaring ved 0 °C viste sig at være vigtig for de kemikalier, der blev anvendt i analysen (cisplatin, spirocykliske molekyler, furfurylamin). DMSO - et kemikalie med kendt cytotoksicitet - blev anvendt som opløsningsmiddel til testforbindelserne og blev brugt til at fremstille fortyndinger til analysen. MTT-reagenset selv skulle fremstilles, da det blev opbevaret som et pulver, der skulle opløses og filtreres, da uopløselige partikler forstyrrede aflæsninger.
Samlet set er resultaterne for denne analyse beregnet til at være foreløbige, da kun et lille antal molekyler blev testet. En udtømmende test med et batteri af molekyler er planlagt, og et fuldt manuskript vil komme. Desuden kan syntesen anvendes på aminer afledt af pyrrol-2-carbaldehyd. I dette tilfælde kan spirocykliske pyrromidiner syntetiseres og testes for cytotoksiske virkninger på kræftcellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra fakultetets forskningsråd til KSH (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. og J.F.M. er modtagere af Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. og B.M.R. er modtagere af STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi er taknemmelige for Dr. Matthew Berezuk og Dr. Philip Cox for vejledning om bioassays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
