Summary
כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.
Abstract
הטרוציקלים ספירוציקליים דווחו לאחרונה בספרות כתרופות פוטנציאליות לטיפול בסרטן. הסינתזה של מערכות טבעות אורתוגונליות חדשניות אלה מאתגרת. לאחרונה פורסמה מתודולוגיה יעילה לסינתזה של תרכובות אלה, שתיארה את סינתזת הפאזה המוצקה בארבעה שלבים במקום חמשת השלבים שדווחו קודם לכן. היתרון של סינתזה קצרה זו הוא חיסול השימוש של ריאגנטים רעילים. שרף מבוסס קישור של מיכאל (REM) בטעינה נמוכה נמצא כחיוני בסינתזה, שכן גרסאות בעלות עומס גבוה מנעו הוספת ריאגנטים המכילים פניל מגושם ושרשראות צד ארומטיות. בדיקת הקולורימטריה 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) שימשה לבחינת הציטוטוקסיות של ריכוזי מיקרומולאר של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה במבחנה. MTT זמין בקלות מסחרית ומפיק תוצאות מהירות ואמינות יחסית, מה שהופך את הבדיקה הזו לאידיאלית עבור הטרוציקלים ספירוציקליים אלה. נבדקו מבני טבעת אורתוגונליים וכן פורפורילאמין (מבשר בשיטת הסינתזה המכיל מוטיב טבעת דומה בן 5 איברים).
Introduction
עיכוב מולקולות קטנות של האינטראקציה של עכבר יוביקוויטין-ליגאז E3 דקה כפולה 2 הומולוג (MDM2) עם p53 ידוע לשחזר אינדוקציה בתיווך p53 של אפופטוזיס תאי גידול 1,2,3. MDM2 הוא מווסת שלילי של מסלול p53 ולעתים קרובות הוא מבוטא יתר על המידה בתאים סרטניים 4,5,6,7,8,9. מחקרים קריסטלוגרפיים וביוכימיים אחרונים גילו כי מולקולות קטנות המכילות מסגרת ספירוציקלית יכולות לעכב ביעילות אינטראקציות MDM2-p5310. המסגרת הספירוציקלית (איור 1, המוצללת בכחול) נחשבת למוטיב מיוחס מכיוון שנגזרת של מערכת הטבעות האורתוגונלית הנוקשה הזו הובילה לגילוי תרופות טיפוליות חדשניות. הגישה לארכיטקטורה מעניינת זו מציבה אתגר בעת שימוש בטכניקות סינתזה אורגניות מסורתיות. למרות שההשפעות הטיפוליות של מולקולות ספירוציקליות במערכות ביולוגיות נחקרו, סינתזה של מולקולות אלה היא עדיין תהליך מסורבל. מוצרי לוואי לא רצויים, שימוש בתנאים קשים ומתכות מעבר מסוכנות הם לעתים קרובות בעייתיים.
השימוש הפוטנציאלי במוטיב הספירוציקלי בפיתוח תרופות הוביל לפיתוח פרוטוקול המשתמש בסינתזה בפאזה מוצקה כדי ליצור ספרייה של מולקולות עם המוטיב בנוסף לקבוצות תפקודיות אחרות הניתנות להחלפה11,12. הפרדת המוצרים והמגיבים בין השלבים יכולה להיות מושגת פשוט על ידי שימוש במקשר REM המחובר לחרוז שרף וכלי מסנן פאזה מוצקה. זה יצמצם את הצעדים ואולי יעלה את התשואות. גישה סינתטית זו יכולה לייצר מגוון גדול של מועמדים פוטנציאליים לתרופות. עם זאת, היעילות של מולקולות אלה במערכת ביולוגית תדרוש חקירה נוספת.
כדי לקבוע את הציטוטוקסיות של תרכובות ספירוציקליות אלה, נעשה שימוש במבחן MTT13,14. שיטה זו מודדת את כדאיות התא וניתן להשתמש בה כדי לקבוע בעקיפין ציטוטוקסיות של תאים. ריכוזים שונים של המעכבים נוספו לתאים בתרבית בצלחת של 96 בארות, ושיעור התאים החיים נמדד על-ידי ניתוח קולורימטרי של מידת ההפחתה של MTT צהוב על-ידי דהידרוגנזות מיטוכונדריאליות לתרכובת הפורמזן הסגולה (איור 2). הפעילות מדווחת לרוב כערך IC 50 - הריכוז שבו צמיחת התאים מעוכבתב-50% ביחס לבקרה שאינה מטופלת. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול של בדיקת MTT ואת התוצאות הראשוניות של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מספר כימיקלים וריאגנטים ביולוגיים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים ומסרטנים. יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (משקפי בטיחות שאושרו על ידי מינהל הבטיחות והבריאות התעסוקתית, כפפות מתאימות, מעילי מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות) לפני תחילת הניסוי. בנוסף, לאמץ נוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע סינתזה וטיפול בכימיקלים רעילים וריאגנטים (אדים מכסה אדים).
1. סינתזת פאזה מוצקה של הטרוציקלים ספירוציקליים 6 ו-7
הערה: הסינתזה התבססה על עבודה שפורסמה בעבר11,12. הפרוטוקול המעודכן מגלה כי לא היה צורך בפתיחת הטבעת המזורזת של הטטרבוטילמוניום פלואוריד של ההטרוציקלית הטריציקלית, ולכן חיסולה מקצר את ההליך הסינתטי.
- בצע מיכאל תוספת של פורפורילאמין למקשר REM (משך: 25 דקות התקנה + 24 שעות זמן תגובה).
- הוסף 1 גרם (1 שווה ערך [שווה ערך]) של שרף REM, 20 מ"ל (20 שווה ערך) של דימתילפורמיד (DMF), ו-2.4 מ"ל של פורפורילאמין לכלי תגובה בפאזה מוצקה של 25 מ"ל. התסיסו את כלי התגובה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לאחר תחילת התגובה.
הערה: הקפידו על ערבוב יסודי כדי שהשרף לא יישב בתחתית הכלי. - יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש לשטוף 4x, לסירוגין בין דיכלורומתאן (DCM) למתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
- הוסף 1 גרם (1 שווה ערך [שווה ערך]) של שרף REM, 20 מ"ל (20 שווה ערך) של דימתילפורמיד (DMF), ו-2.4 מ"ל של פורפורילאמין לכלי תגובה בפאזה מוצקה של 25 מ"ל. התסיסו את כלי התגובה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לאחר תחילת התגובה.
- בצע טנדם מיכאל תוספת/ציקלואדיטור 1,3-דיפולרי (משך: 25 דקות התקנה + 48 שעות זמן תגובה).
- לשרף היבש, יש להוסיף 1.48 מ"ל (שווה ערך ל-5) של טריאתילאמין (TEA), 0.637 גרם (שווה ערך ל-2) של ניטרו-אולפין ו-10 מ"ל של טולואן יבש לכלי התגובה.
- לאחר מכן, הוסיפו 1.085 מ"ל (שווה ערך ל-4) של טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl) לכלי התגובה במכסה אדים מאוורר היטב.
הערה: מכיוון שתגובה זו מייצרת גז HCl, אין לכסות את כלי התגובה עד שהגז משתחרר מתחת למכסה אדים. - יש לכסות היטב את כלי התגובה, ולהתסיס בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של השרף עם הריאגנטים. - השתמש 5 מ"ל של מתנול כדי להרוות את התגובה.
- מסננים את הכלי כדי להסיר את הפתרון, ולאחר מכן לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM ו מתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
- בצע N-alkylation של הטרוציקל הקשור לשרף כדי ליצור את האמין הרבעוני (משך: 10 דקות הגדרה + 24 שעות זמן תגובה).
- לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 5 מ"ל של DMF ו-10 שווה ערך של אלקיל הליד, והתסיסו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של הריאגנטים עם השרף. - יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש להשתמש ב-DCM ובמתנול לסירוגין כדי לשטוף פי 4. יבשו את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
- לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 5 מ"ל של DMF ו-10 שווה ערך של אלקיל הליד, והתסיסו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
- בצע חיסול β של האמין הרבעוני לביקוע מתמיכת הפולימר (משך: 15 דקות התקנה + זמן תגובה של 24 שעות).
- לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 3 מ"ל של DCM ו-1.49 מ"ל (שווה ערך ל-5) של TEA כדי לבקע את ההטרוציקל מתמיכת הפולימר.
- התסיסו את תערובת התגובה במשך 24 שעות כדי להבטיח ערבוב יסודי של השרף עם התמיסה. יש לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM למתנול. אוספים את השטיפה מכל השטיפות, ומתרכזים באמצעות אידוי סיבובי.
- טריטורט עם מתנול כדי לטהר את האוקסימה הספירוציקלית. יבשו את השרף ביסודיות בכלי התגובה לאחר שטיפות לשימוש חוזר בניסויים עתידיים.
2. בדיקת ציטוטוקסיות באמצעות MTT 14
- יש להכין 20 מ"ל של תמיסת MTT של 5 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS, 0.9% NaCl במים) כמדלל. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C. לאחר מכן, הכן דילול 1:1 של תמיסת MTT משלב 2.1 במדיום תרבית תאים ללא סרום (DMEM).
- הכן 1 מ"ל כל אחד מפתרונות מלאי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל של 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM ו- 0.01 μM של תרכובות בדיקה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. הכן 200 μL למנה של תמיסות העבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי מלאי 1:1000 במדיום ללא סרום בצינורות 1.5 מ"ל.
- במכסה המנוע של תרבית הרקמה, זרעו תאי COS-7 (תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, כליית Cercopithecus aethiops ) במדיום שלם [DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS)] על צלחות 96-well שטופלו בתרבית רקמה בריכוז של 4 × 103 תאים /200 μL לבאר באמצעות פיפטור רב-ערוצי. תאי COS-7 נבחרו מכיוון ש-(1) אלה תאים נפוצים לבדיקות ציטוטוקסיות ו-(2) אלה כבר היו זמינים במוסד.
- לדגום תאי COS-7 במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2.
- שאפו את הסופר-נטנט מהבארות באמצעות פיפטה מזכוכית פסטר המחוברת למשאבת ואקום. מינון התאים במשולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות העבודה שהוכנו בשלב 2.2 (ראה טבלה 1). דגירה של תאים כמתואר בשלב 2.4.
- שאפו את הסופרנטנט מהבארות. הוסף 200 μL של תמיסת MTT לכל באר. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2 למשך 4 שעות.
- שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזן הסגולים. הוסף 200 μL של DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- מדוד את הספיגה ב-590 ננומטר14 או 600 ננומטר עבור כל באר באמצעות קורא צלחות של 96 בארות. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה. הפחת את ערך הרקע הממוצע של הספיגה מערך הספיגה של כל מטופל היטב. נרמל את הנתונים כאחוז מערך המינון האפס הממוצע (ממוצע שלושת ערכי מינון אפס). נתוני התווייה על ציר y: ליניארי (% כדאיות תא יחסית); ציר x: לוג (ריכוז). התווה כל סדרה כעקומה נפרדת (לדוגמה, נתונים משולשים צריכים לכלול 3 עקומות)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אוקסימים ספירוציקליים 6 ו-7 סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה (איור 1). תוספת מיכאל של פורפורילאמין למקשר REM 1b העניקה שרף הקשור לפולימר 2. התקדמות התגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום (IR) על ידי גילוי היעלמות האסטר הבלתי רווי α,β בעומק 1722 ס"מ-1 (איור 3). שרף הקשור לספירוציקלית 4 נוצר מ-2 דרך ביניים חולף 3. הידרוליזה מתנולית של 4 מיוצרת 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-פניל-3-הידרוקסימינו 4-הידרוקסימתיל-פירולידין-1-yl]-חומצה פרופיונית מתיל אסטר 7, ואילו אלקילציה ואחריה חיסול β (3E)-(2S, 4R)-4-הידרוקסימתיל-1-מתיל-2-פניל-3-פירולידין אוקסימה 6. זהותם של האוקסימים הספירוציקליים נקבעה על ידי אנליזה ספקטרוסקופית של תהודה מגנטית גרעינית של 1שעות ו-13מעלות צלזיוס והטוהר על ידי ספקטרוסקופיית מסה בהתבסס על התוצאות הקודמות שלנו11.
מבחן MTT הוא מבחן קולורימטרי ידוע לקביעת כדאיות התא12. כפי שניתן לראות באיור 2, רדוקטזות מיטוכונדריאליות שנמצאות בתאים חיים ממירות את הטטרזוליום הצהוב של MTT למוצק פורמזן סגול בלתי מסיס. באמצעות ספקטרופוטומטר, מכמתים את תצורת פורמזאן על ידי מדידת הספיגה ב-600 ננומטר. ציספלטין, שידוע כגורם למוות של תאים בריכוזים גבוהים, שימש כבקרה חיובית (איור 4). כצפוי, ככל שריכוז הציספלטין גבוה יותר, כך יכולת הקיום של התא נמוכה יותר. לאחר מכן, מבחן MTT שימש לבדיקת התרכובות הספירוציקליות 6 ו -7 ופורפורילמין. Furfurylamine שימש כדי לקבוע את ההשפעה של טבעת furan לבד בהשוואה למסגרת spirocyclic. כפי שמתואר באיור 5, פורפורילאמין ואוקסימה ספירוציקלית 6 הראו ציטוטוקסיות דומה. עם זאת, הרעילות של תרכובת ספירוציקלית 7 הייתה גדולה במידה ניכרת מזו של פורפורילאמין ו-6. ספרייה של אוקסימים ספירוציקליים תסונתז כדי לחקור באופן מלא את הציטוטוקסיות, כמו גם את ההשפעות האנטי-סרטניות האחרות של הטרוציקלים אלה.
איור 1: בנייה של תרכובות ספירוציקליות באמצעות סינתזת פאזה מוצקה מעודכנת. המסגרת הספירוציצית האורתוגונלית מוצללת בכחול. שים לב שאין צורך בשלב (c), אשר נמנע משימוש ב- TBAF מגיב רעיל. תנאי התגובה הם כדלקמן: (א) פורפורילאמין, DMF, (ב) β-ניטרוסטירן, TMSCl, תה, טולואן, (ג) TBAF, (ד) אלקיל הליד, DMF, ו-(ה) תה, DCM. קיצורים: TBAF = טטרבוטילמוניום פלואוריד; DMF = דימתילפורמיד; TMSCl = טרימתילסיליל כלוריד; TEA = טריאתילאמין; DCM = דיכלורומתאן; ISOC = ציקלודוקציה תוך-מולקולרית של סיליוקסי אולפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מנגנון בדיקת MTT. מלח טטרזוליום צהוב בעליל של MTT מופחת על ידי רדוקטזות מיטוכונדריאליות בתאי COS-7 חיים ליצירת פורמזאן סגול בלתי מסיס. קיצור: MTT = 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מעקב אחר ההתקדמות של כל שלב בתגובת פאזה מוצקה באמצעות ספקטרוסקופיה אינפרה-אדומה. תדירות המתיחה ב 1717 ס"מ-1 הצביעה על נוכחות של אסטר בלתי רווי, 1733 ס"מ-1 תיאר אסטר רווי, ואות סביב 3300-3500 ס"מ-1 הצביע על נוכחות של קבוצת הידרוקסיל. תדרי מתיחה הניתנים לזיהוי עבור פוליסטירן מוצגים גם כן. קיצורים: REM = התחדשות מיכאל; ISOC = ציקלודוקציה תוך-מולקולרית של סיליוקסי אולפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ההשפעות של ציספלטין על הכדאיות של תאי COS-7 בבדיקת MTT שונה. ריכוזי הציספלטין נעו בין 0 μM ל-60 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: השפעות של תרכובות בדיקה על הכדאיות של תאי COS-7 בבדיקת MTT שונה. הריכוזים נעו בין 0 μM ל-100 μM ושורטטו בסולם בולי עץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: פריסת לוח 96 הבאר. כל שורות נתוני הבדיקה היו משולשות. בארות המכילות רק תאי COS-7 ומדיום שימשו כבקרות. כדי להבטיח ש-DMSO לא היה הגורם לציטוטוקסיות בתאים במינון ציספלטין, בארות המכילות רק DMSO שימשו כבקרות ממסים. בארות המכילות תאי COS-7 מודגשות. קיצורים: DMSO = דימתילסולפוקסיד; PBS = מלח חצוב פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסינתזה של התרכובות הספירוציקליות התבססה על מחקר קודם שנערך במעבדה זו, אך עם כמה שינויים (איור 1)11,12. ההתקדמות של כל שלב תגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית IR. תוספת מיכאל של מקשר REM 1 עם פורפורילאמין ניתנת לפולימר 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). מהדו"ח הקודם, ISOC של 2 ייצר את התרכובת הטרוציקלית הטריציקלית 3, כפי שאושר על ידי זיהוי קבוצת TMS (IR 1214 cm-1). זהו שלב קריטי בסינתזה שכן ISOC סיפק את הרג'יו והסטריאוסלקטיביות הדרושות של המוצרים. קבוצת הידרוקסיל מתיחה בתדירות של 3500 ס"מ-1 נצפתה במקום התדירות של הקבוצה הפונקציונלית TMS. ייתכן שהסיבה לכך היא שהתרכובת הטריציקלית היא מתווך חולף שמוביל למערכת הספירוציקלית.
נמצאו סוגים שונים של שרף REM המגבילים את הסינתזה. פולימר בעל עומס גבוה (1.00 מילימול/גרם) מנע סינתזה של תרכובות ספירוציקליות שהכילו שרשראות צד R2 מגושמות. בשל הדמיון בקבוצות הפונקציונליות בשרפים 4 ו -5, התוצאות של IR לא היו חד משמעיות. ההצלחה של צעד זה יכולה להיקבע רק על ידי ניסיון לחדש את מקשר REM (5 → 1). התחדשות לא התרחשה במקרים שבהם נוספה קבוצת R2 מגושמת. שרפים בעלי עומס נמוך (0.5 מילימול/גרם ומטה) מומלצים לסינתזה מוצלחת. שיטת סינתזה זו עולה בקנה אחד עם ההליכים המתוארים בספרות.
כבדיקה ראשונית, פותח פרוטוקול לבדיקת ציטוטוקסיות באמצעות MTT. במהלך מספר ניסויים התגלו שלבים קריטיים ומגבלות. כדי לנרמל את התוצאות בכל הבארות, התאים היו צריכים להיזרע באופן שווה על פני בארות, מה שהצריך מדידה של ריכוז התאים לפני הזריעה. הבדיקה דרשה לוחות עם בארות בעלות תחתית שטוחה, שכן לא ניתן היה לקרוא במדויק את הספיגה מבארות בעלות תחתית עגולה. בנוסף, היה צורך להסיר עודפי MTT שנותרו לאחר הדגירה כדי למנוע הפרעה בקריאות מבלי להפריע לפורמזאן הבלתי מסיס.
את הספיגה של פורמזן מומס יש לקרוא ב 590 ננומטר. עם זאת, המכשור הנוכחי במעבדה הצריך לקיחת קריאות ב-600 ננומטר במקום זאת. אחסון בטמפרטורה של 0 מעלות צלזיוס נמצא כחשוב עבור הכימיקלים המשמשים בבדיקה (ציספלטין, מולקולות ספירוציקליות, פורפורילמין). DMSO - כימיקל בעל ציטוטוקסיות ידועה - שימש כממס לתרכובות הבדיקה ושימש לביצוע דילולים לבדיקה. היה צורך להכין את מגיב MTT עצמו, שכן הוא אוחסן כאבקה שיש להמיס ולסנן, שכן חלקיקים בלתי מסיסים הפריעו לקריאות.
בסך הכל, התוצאות עבור בדיקה זו נועדו להיות ראשוניות, שכן רק מספר קטן של מולקולות נבדקו. מתוכננת בדיקה ממצה עם סוללה של מולקולות, וכתב יד מלא ייצא בקרוב. בנוסף, הסינתזה עשויה להיות ישימה עבור אמינים שמקורם בפירול-2-קרבלדהיד. במקרה זה, פירולידים ספירוציקליים יכולים להיות מסונתזים ונבדקים להשפעות ציטוטוקסיות על קווי תאים סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק ממועצת המחקר של הפקולטה לק.ס.ה. (משרד המחקר והמענקים, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). A.N.G. ו- J.F.M. הם מקבלי מלגת התנסות מחקרית לתואר ראשון (SURE). S.K.M. ו-B.M.R. זוכים במענקי מלגת מחקר STEM (המרכז למחקר במדע, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). אנו מודים לד"ר מתיו ברזוק ולד"ר פיליפ קוקס על ההדרכה על הבדיקות הביולוגיות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
