Summary
Her beskriver vi et bioassay ved bruk av 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) for å teste tidligere syntetiserte spirocykliske oksimer.
Abstract
Spirocykliske heterocykliske sykluser har nylig blitt rapportert i litteraturen for å være potensielle legemidler for kreftbehandling. Syntesen av disse nye ortogonale ringsystemene er utfordrende. En effektiv metode for å syntetisere disse forbindelsene ble nylig publisert som beskrev fastfasesyntesen i fire trinn i stedet for de tidligere rapporterte fem trinnene. Fordelen med denne kortere syntesen er eliminering av bruk av giftige reagenser. Lavlastende regenererende Michael (REM) linkerbasert harpiks ble funnet å være avgjørende i syntesen, da høybelastningsversjoner forhindret tilsetning av reagenser som inneholder store fenyl- og aromatiske sidekjeder. Den kolorimetriske 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen ble brukt til å undersøke cytotoksisiteten av mikromolære konsentrasjoner av disse nye spirocykliske molekylene in vitro. MTT er lett tilgjengelig kommersielt og gir relativt raske, pålitelige resultater, noe som gjør denne analysen ideell for disse spirocykliske heterocyklene. Ortogonale ringstrukturer samt furfurylamin (en forløper i syntesemetoden som inneholder et lignende 5-medlems ringmotiv) ble testet.
Introduction
Småmolekylær hemming av interaksjonen mellom E3 ubiquitin-ligase mus dobbelt minutt 2 homolog (MDM2) med p53 er kjent for å gjenopprette p53-mediert induksjon av tumorcelleapoptose 1,2,3. MDM2 er en negativ regulator av p53-banen og er ofte overuttrykket i kreftceller 4,5,6,7,8,9. Nylige krystallografiske og biokjemiske studier har vist at små molekyler som inneholder et spirocyklisk rammeverk, effektivt kan hemme MDM2-p53-interaksjoner10. Det spirocykliske rammeverket (figur 1, skyggelagt i blått) regnes som et privilegert motiv da avledning av dette stive ortogonale ringsystemet har ført til oppdagelsen av nye terapeutiske legemidler. Å få tilgang til denne interessante arkitekturen utgjør en utfordring ved bruk av tradisjonelle organiske synteseteknikker. Selv om de terapeutiske effektene av spirocykliske molekyler i biologiske systemer har blitt undersøkt, er syntese av disse molekylene fortsatt en tungvint prosess. Uønskede sideprodukter, under tøffe forhold og farlige overgangsmetaller er ofte problematiske.
Den potensielle bruken av spirocyklisk motiv i legemiddelutvikling førte til utvikling av en protokoll som benytter fastfasesyntese for å generere et bibliotek av molekyler med motivet i tillegg til andre utskiftbare funksjonelle grupper11,12. Separasjonen av produkter og reaktanter mellom trinn kan oppnås ved ganske enkelt å bruke en REM-kobling festet til en harpiksperle og en solidfasefilterbeholder. Dette vil kutte ned trinnene og potensielt øke utbyttet. Denne syntetiske tilnærmingen kan produsere et stort utvalg av potensielle narkotikakandidater. Imidlertid vil effektiviteten av disse molekylene i et biologisk system kreve ytterligere undersøkelser.
For å bestemme cytotoksisiteten til disse spirocykliske forbindelsene, ble MTT-analysen13,14 ansatt. Denne metoden måler cellens levedyktighet og kan brukes til indirekte å bestemme cellecytotoksisitet. Ulike konsentrasjoner av hemmerne ble tilsatt dyrkede celler i en 96-brønnsplate, og andelen levende celler ble målt ved kolorimetrisk analyse av graden av reduksjon av gul MTT av mitokondrielle dehydrogenaser til den lilla formazanforbindelsen (figur 2). Aktiviteten rapporteres oftest som en IC 50-verdi - konsentrasjonen der celleveksten hemmes med50% i forhold til en ubehandlet kontroll. Dette papiret beskriver protokollen for MTT-analysen og de foreløpige resultatene av disse nye spirocykliske molekylene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Flere kjemikalier og biologiske reagenser som brukes i denne protokollen er giftige og kreftfremkallende. Rådfør deg med relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Bruk passende personlig verneutstyr (sikkerhetsbriller godkjent av Arbeids- og helsedirektoratet, riktige hansker, laboratoriefrakker, bukser i full lengde og sko med lukket tå) før du starter eksperimentet. I tillegg vedta passende sikkerhetspraksis når du utfører syntese og håndtering av giftige kjemikalier og reagenser (avtrekksvifte).
1. Fastfasesyntese av spirocykliske heterocykliske sykluser 6 og 7
MERK: Syntesen var basert på tidligere publisert arbeid11,12. Den oppdaterte protokollen avslører at tetrabutylammoniumfluorid-katalysert ringåpning av den trisykliske heterocykelen ikke var nødvendig, og dermed forkorter elimineringen den syntetiske prosedyren.
- Utfør Michael tillegg av furfurylamin til REM linker (varighet: 25 min oppsett + 24 timers reaksjonstid).
- Tilsett 1 g (1 ekvivalenter [equiv.]) REM-harpiks, 20 ml (20 ekvival.) dimetylformamid (DMF) og 2,4 ml furfurylamin til en 25 ml fastfasereaksjonsbeholder. Agiter reaksjonsbeholderen ved romtemperatur i 24 timer etter reaksjonsstart.
NOTAT: Sørg for grundig blanding slik at harpiksen ikke sitter i bunnen av karet. - Vask harpiksen med DMF 1x etter at reaksjonen er fullført. Vask deretter 4x, vekslende mellom diklormetan (DCM) og metanol. Tørk harpiksen grundig i reaksjonsbeholderen etter vask.
- Tilsett 1 g (1 ekvivalenter [equiv.]) REM-harpiks, 20 ml (20 ekvival.) dimetylformamid (DMF) og 2,4 ml furfurylamin til en 25 ml fastfasereaksjonsbeholder. Agiter reaksjonsbeholderen ved romtemperatur i 24 timer etter reaksjonsstart.
- Utfør tandem Michael addisjon / 1,3-dipolar cycloaddition (varighet: 25 min oppsett + 48 timers reaksjonstid).
- Til den tørre harpiksen, tilsett 1,48 ml (5 equiv.) trietylamin (TEA), 0,637 g (2 equiv.) nitro-olefin og 10 ml tørr toluen til reaksjonsbeholderen.
- Tilsett deretter 1.085 ml (4 equiv.) trimetylsilylklorid (TMSCl) til reaksjonsbeholderen i en godt ventilert avtrekkshette.
MERK: Siden denne reaksjonen produserer HCl-gass, må du ikke dekke reaksjonsbeholderen før gassen er frigjort under en avtrekksvifte. - Dekk reaksjonsbeholderen sikkert, og berør ved romtemperatur i 48 timer.
NOTAT: Sørg for grundig blanding av harpiksen med reagensene. - Bruk 5 ml metanol for å slukke reaksjonen.
- Tøm beholderen for å fjerne løsningen, og vask deretter 4x, vekslende mellom DCM og metanol. Tørk harpiksen grundig i reaksjonsbeholderen etter vask.
- Utfør N-alkylering av harpiksbundet heterocykel for å danne kvartær amin (varighet: 10 min oppsett + 24 timers reaksjonstid).
- Til den tørre harpiksen i reaksjonsbeholderen, tilsett 5 ml DMF og 10 equiv. av alkylhalogenid, og omrør ved romtemperatur i 24 timer.
MERK: Sørg for grundig blanding av reagensene med harpiksen. - Vask harpiksen med DMF 1x etter at reaksjonen er fullført. Bruk deretter DCM og metanol vekselvis for å vaske 4x. Tørk harpiksen i reaksjonsbeholderen etter vask.
- Til den tørre harpiksen i reaksjonsbeholderen, tilsett 5 ml DMF og 10 equiv. av alkylhalogenid, og omrør ved romtemperatur i 24 timer.
- Utfør β-eliminering av kvartær amin for spaltning fra polymerstøtten (varighet: 15 min oppsett + 24 timers reaksjonstid).
- Til den tørre harpiksen i reaksjonsbeholderen, tilsett 3 ml DCM og 1,49 ml (5 equiv.) TEA for å spalte heterocykelen fra polymerstøtten.
- Omrør reaksjonsblandingen i 24 timer for å sikre grundig blanding av harpiksen med løsningen. Vask 4x, vekslende mellom DCM og metanol. Samle eluering fra alle vaskene, og konsentrer deg via roterende fordampning.
- Triturat med metanol for å rense spirocyklisk oksim. Tørk harpiksen grundig i reaksjonsbeholderen etter vask for gjenbruk i fremtidige eksperimenter.
2. Cytotoksisitetsanalyse ved bruk av MTT 14
- Klargjør 20 ml av en 5 mg/ml MTT-oppløsning ved bruk av sterilt fosfatbufret saltvann (PBS, 0,9 % NaCl i vann) som fortynningsmiddel. Filtrer og oppbevar ved -20 °C. Forbered deretter en 1:1-fortynning av MTT-løsningen fra trinn 2.1 i serumfritt cellekulturmedium (DMEM).
- Forbered 1 ml hver av stamløsninger i 1,5 ml mikrosentrifugerør på 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM og 0,01 μM testforbindelser i dimetylsulfoksid (DMSO). Oppbevares ved -20 °C. Forbered 200 μL per dose av arbeidsløsningene til testforbindelser ved å fortynne stamstoffkonsentrasjoner 1:1000 i serumfritt medium i 1,5 ml rør.
- I vevskulturhetten, frø COS-7-celler (afrikanske grønne ape nyreceller, Cercopithecus aethiops nyre) i komplett medium [DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS)] på flatbunn, vevskulturbehandlede 96-brønnplater i en konsentrasjon på 4 × 103 celler / 200 μL per brønn ved bruk av en flerkanals pipetter. COS-7-celler ble valgt fordi (1) disse er vanlige celler for cytotoksisitetsanalyser og (2) disse allerede var tilgjengelige i institusjonen.
- Inkuber COS-7-celler i 24 timer ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Aspirer supernatanten fra brønnene ved hjelp av en pasteurpipette i glass festet til en vakuumpumpe. Doser cellene i tre eksemplarer med testforbindelsene ved bruk av arbeidsløsningene fremstilt i trinn 2.2 (se tabell 1). Inkuber celler som beskrevet i trinn 2.4.
- Aspirer supernatanten fra brønnene. Tilsett 200 μL MTT-løsning til hver brønn. Inkuber ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2 i 4 timer.
- Aspirer supernatanten forsiktig fra brønnene uten å forstyrre de lilla formazankrystallene. Tilsett 200 μL DMSO til hver brønn for å oppløse de lilla formazankrystallene. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Mål absorbans ved 590 nm14 eller 600 nm for hver brønn ved hjelp av en plateleser med 96 brønner. Bruk brønner uten celler som bakgrunn og gjennomsnittlig absorbansverdi. Trekk den gjennomsnittlige absorbansbakgrunnsverdien fra absorbansverdien til hver behandlet brønn. Normaliser dataene som en prosentandel av den gjennomsnittlige nulldoseringsverdien (gjennomsnitt de tre nulldoseverdiene). Plott data på y-aksen: lineær (% relativ celle levedyktighet); x-akse: logg (konsentrasjon). Plott hver serie som en individuell kurve (f.eks. bør tredoble data ha 3 kurver)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spirocykliske oksimer 6 og 7 ble syntetisert ved hjelp av en modifisert protokoll (figur 1). Michael tillegg av furfurylamin til en REM linker 1b gitt polymer-bundet harpiks 2. Fremdriften av reaksjonen ble overvåket ved infrarød (IR) spektroskopi ved å oppdage forsvinningen av den α β-umettede esteren ved 1722 cm-1 (figur 3). Spirocyklisk bundet harpiks 4 ble dannet fra 2 via et forbigående mellomprodukt 3. Metanolisk hydrolyse av 4 produsert 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-fenyl-3-hydroksyimino 4-hydroksymetyl-pyrrolidin-1-yl]-propionsyremetylester 7, mens alkylering etterfulgt av β-eliminasjon ga (3E)-(2S, 4R)-4-hydroksymetyl-1-metyl-2-fenyl-3-pyrrolidinfosim 6. Identiteten til spirocykliske oksimer ble bestemt ved 1H og 13C kjernemagnetisk resonansspektroskopisk analyse og renheten ved massespektroskopi basert på våre tidligere resultater11.
MTT-analysen er en velkjent kolorimetrisk analyse for å bestemme cellens levedyktighet12. Som vist i figur 2, konverterer mitokondrielle reduktaser tilstede i levende celler det gule tetrazoliet av MTT til et uoppløselig lilla formazan-fast stoff. Ved hjelp av et spektrofotometer kvantifiseres formazanformasjonen ved å måle absorbansen ved 600 nm. Cisplatin, som er kjent for å indusere celledød ved høye konsentrasjoner, ble brukt som positiv kontroll (figur 4). Som forventet, jo høyere konsentrasjonen av cisplatin, desto lavere er cellens levedyktighet. Deretter ble MTT-analysen brukt til å teste spirocykliske forbindelser 6 og 7 og furfurylamin. Furfurylamin ble brukt til å bestemme effekten av furanringen alene sammenlignet med spirocyklisk rammeverk. Som vist i figur 5 viste furfurylamin og spirocyklisk oksim 6 lignende cytotoksisitet. Imidlertid var toksisiteten av spirocyklisk forbindelse 7 merkbart større enn for furfurylamin og 6. Et bibliotek med spirocykliske oksimer vil bli syntetisert for å undersøke cytotoksisiteten fullt ut, så vel som de andre krefteffektene av disse heterocyklene.
Figur 1: Konstruksjon av spirocykliske forbindelser ved hjelp av en oppdatert fastfasesyntese. Den ortogonale spirocycic-rammen er skyggelagt i blått. Vær oppmerksom på at trinn (c) ikke er nødvendig, noe som unngår bruk av det giftige reagenset TBAF. Reaksjonsbetingelsene er som følger: (a) furfurylamin, DMF, (b) β-nitrostyren, TMSCl, TEA, toluen, (c) TBAF, (d) alkylhalogenid, DMF og (e) TEA, DCM. Forkortelser: TBAF = tetrabutylammoniumfluorid; DMF = dimetylformamid; TMSCl = trimetylsilylklorid; TEA = trietylamin; DCM = diklormetan; ISOC = intramolekylær silyoxy olefin cykloaddisjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mekanisme for MTT-analysen. Synlig gult tetrazoliumsalt av MTT reduseres av mitokondrielle reduktaser i levende COS-7-celler for å danne lilla uoppløselig formazan. Forkortelse: MTT = 3- (4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Overvåking av fremdriften av hvert fast fasereaksjonstrinn ved infrarød spektroskopi. Strekkfrekvensen ved 1717 cm-1 indikerte tilstedeværelsen av en umettet ester, 1733 cm-1 avbildet en mettet ester, og signal rundt 3300-3500 cm-1 indikerte tilstedeværelsen av en hydroksylgruppe. Detekterbare strekkfrekvenser for polystyren vises også. Forkortelser: REM = Regenererende Michael; ISOC = intramolekylær silyoxy olefin cykloaddisjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekter av cisplatin på COS-7 celle levedyktighet i en modifisert MTT-analyse. Konsentrasjonene av cisplatin varierte fra 0 μM til 60 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av testforbindelser på COS-7 celle levedyktighet i en modifisert MTT-analyse. Konsentrasjonene varierte fra 0 μM til 100 μM og ble plottet på en loggskala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Oppsett av platen med 96 brønner. Alle testdatarader var i tre eksemplarer. Brønner som bare inneholdt COS-7-celler og medium ble brukt som kontroller. For å sikre at DMSO ikke var årsaken til cytotoksisitet i cisplatindoserte celler, ble brønner som kun inneholdt DMSO brukt som løsningsmiddelkontroller. Brønner som inneholder COS-7-celler er uthevet. Forkortelser: DMSO = dimetylsulfoksid; PBS = fosfatbufret saltvann. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntesen av spirocykliske forbindelser var basert på tidligere forskning utført av dette laboratoriet, men med noen modifikasjoner (figur 1) 11,12. Fremdriften for hvert reaksjonstrinn ble overvåket av IR-spektroskopi. Michael tillegg av REM linker 1 med furfurylamin gitt polymer-bundet 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Fra forrige rapport produserte ISOC på 2 den trisykliske heterocykliske forbindelsen 3, som bekreftet ved påvisning av TMS-gruppen (IR 1214 cm-1). Dette er et kritisk trinn i syntesen da ISOC ga den nødvendige regio- og stereoselektiviteten til produktene. En hydroksylgruppestrekkfrekvens på 3500 cm-1 ble observert i stedet for frekvensen til TMS-funksjonsgruppen. Dette kan skyldes at den trisykliske forbindelsen er et forbigående mellomprodukt som fører til det spirocykliske systemet.
Ulike typer REM-harpiks ble funnet å begrense syntesen. Høylastende polymer (1,00 mmol / g) forhindret syntesen av spirocykliske forbindelser som inneholder store R2 sidekjeder. På grunn av likhetene i de funksjonelle gruppene i harpiks 4 og 5, var resultatene av IR ufullstendige. Suksessen til dette trinnet kunne bare bestemmes ved å forsøke å regenerere REM-linkeren (5 → 1). Regenerering skjedde ikke i tilfeller der en klumpete R2-gruppe ble lagt til. Lavlastende harpikser (0,5 mmol / g eller lavere) anbefales for vellykket syntese. Denne syntesemetoden er i samsvar med prosedyrer beskrevet i litteraturen.
Som en foreløpig test ble det utviklet en protokoll for en cytotoksisitetsanalyse ved bruk av MTT. I løpet av flere forsøk ble det oppdaget kritiske trinn og begrensninger. For at resultatene skulle normaliseres på tvers av alle brønner, måtte cellene sås jevnt over brønner, noe som nødvendiggjorde måling av cellekonsentrasjonen før såing. Analysen krevde plater med flatbunnede brønner, da absorbansen ikke kunne leses nøyaktig fra rundbunnede brønner. I tillegg måtte overflødig MTT som ble igjen etter inkubasjon fjernes for å forhindre forstyrrelser i avlesningene uten å forstyrre den uoppløselige formazanen.
Absorbansen av oppløst formazan bør leses ved 590 nm. Imidlertid gjorde dagens instrumentering i laboratoriet det nødvendig å ta avlesninger ved 600 nm i stedet. Lagring ved 0 °C ble funnet å være viktig for kjemikaliene som ble brukt i analysen (cisplatin, spirocykliske molekyler, furfurylamin). DMSO - et kjemikalie med kjent cytotoksisitet - ble brukt som løsningsmiddel for testforbindelsene og ble brukt til å lage fortynninger for analysen. MTT-reagenset selv måtte fremstilles, da det ble lagret som et pulver som måtte oppløses og filtreres, da uoppløselige partikler forstyrret avlesningene.
Samlet sett er resultatene for denne analysen ment å være foreløpige, da bare et lite antall molekyler ble testet. En uttømmende test med et batteri av molekyler er planlagt, og et fullstendig manuskript vil komme. I tillegg kan syntesen være anvendelig for aminer avledet fra pyrrol-2-karbaldehyd. I dette tilfellet kan spirocykliske pyrrolidiner syntetiseres og testes for cytotoksiske effekter på kreftcellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra fakultetets forskningsråd til K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. og J.F.M. er mottakere av Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. og B.M.R. er mottakere av STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi er takknemlige for Dr. Matthew Berezuk og Dr. Philip Cox for veiledning om bioassays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
