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Biology

कार्यात्मक स्पाइरोसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल संश्लेषण और साइटोटॉक्सिसिटी परख

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/61950
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

Summary

यहां, हम पहले संश्लेषित स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम का परीक्षण करने के लिए 3-(4', 5'-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2'-yl)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) का उपयोग करके एक बायोसेसे का वर्णन करते हैं।

Abstract

स्पाइरोसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल को हाल ही में साहित्य में कैंसर चिकित्सा के लिए संभावित दवाएं बताया गया है। इन उपन्यास ऑर्थोगोनल रिंग सिस्टम का संश्लेषण चुनौतीपूर्ण है। इन यौगिकों को संश्लेषित करने के लिए एक कुशल पद्धति हाल ही में प्रकाशित की गई थी जिसने पहले रिपोर्ट किए गए पांच चरणों के बजाय चार चरणों में ठोस चरण संश्लेषण का वर्णन किया था। इस छोटे संश्लेषण का लाभ विषाक्त अभिकर्मकों के उपयोग का उन्मूलन है। कम-लोडिंग रीजेनरेटिंग माइकल (आरईएम) लिंकर-आधारित राल को संश्लेषण में महत्वपूर्ण पाया गया क्योंकि उच्च-लोडिंग संस्करणों ने भारी फिनाइल और सुगंधित साइड चेन वाले अभिकर्मकों को जोड़ने से रोक दिया। इन नए स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के माइक्रोमोलर सांद्रता की साइटोटॉक्सिसिटी की जांच करने के लिए कलरिमेट्रिक 3-(4', 5'-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2'-यल)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख का उपयोग किया गया था। एमटीटी व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत तेज, विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करता है, जिससे यह परख इन स्पाइरोसाइक्लिक हेटरोसाइकिल के लिए आदर्श हो जाती है। ऑर्थोगोनल रिंग संरचनाओं के साथ-साथ फरफ्यूरिलमाइन (संश्लेषण विधि में एक अग्रदूत जिसमें एक समान 5-सदस्यीय रिंग मोटिफ होता है) का परीक्षण किया गया था।

Introduction

पी 53 के साथ ई 3 यूबिकिटिन-लिगेज माउस डबल मिनट 2 होमोलॉग (एमडीएम 2) की बातचीत के छोटे-अणु अवरोध को ट्यूमर सेल एपोप्टोसिस 1,2,3 के पी 53-मध्यस्थता प्रेरण को बहाल करने के लिए जाना जाता है। एमडीएम 2 पी 53 मार्ग का एक नकारात्मक नियामक है और अक्सर कैंसर कोशिकाओं 4,5,6,7,8,9 में अतिरंजित होता है। हाल के क्रिस्टलोग्राफिक और जैव रासायनिक अध्ययनों से पता चला है कि स्पाइरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क वाले छोटे अणु एमडीएम 2-पी 53 इंटरैक्शन को प्रभावी ढंग से रोकसकते हैं। स्पाइरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क (चित्रा 1, नीले रंग में छायांकित) को एक विशेषाधिकार प्राप्त आकृति माना जाता है क्योंकि इस कठोर ऑर्थोगोनल रिंग सिस्टम के व्युत्पन्नीकरण ने नई चिकित्सीय दवाओं की खोज की है। पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण तकनीकों का उपयोग करते समय इस दिलचस्प वास्तुकला तक पहुंचना एक चुनौती है। यद्यपि जैविक प्रणालियों में स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के चिकित्सीय प्रभावों की जांच की गई है, इन अणुओं का संश्लेषण अभी भी एक बोझिल प्रक्रिया है। अवांछित पक्ष उत्पाद, कठोर परिस्थितियों का उपयोग करते हुए, और खतरनाक संक्रमण धातुएं अक्सर समस्याग्रस्त होती हैं।

दवा के विकास में स्पाइरोसाइक्लिक मोटिफ के संभावित उपयोग ने अन्य विनिमेय कार्यात्मक समूहों11,12 के अलावा आकृति के साथ अणुओं की एक लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए ठोस-चरण संश्लेषण का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का विकास किया। चरणों के बीच उत्पादों और अभिकारकों का पृथक्करण केवल राल मोती और एक ठोस-चरण फिल्टर पोत से जुड़े आरईएम लिंकर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह कदमों में कटौती करेगा और संभावित रूप से पैदावार में वृद्धि करेगा। यह सिंथेटिक दृष्टिकोण संभावित दवा उम्मीदवारों की एक बड़ी सरणी का उत्पादन कर सकता है। हालांकि, जैविक प्रणाली में इन अणुओं की प्रभावशीलता को आगे की जांच की आवश्यकता होगी।

इन स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करने के लिए, एमटीटी परख13,14 को नियोजित किया गया था। यह विधि सेल व्यवहार्यता को मापती है और अप्रत्यक्ष रूप से सेल साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जा सकती है। अवरोधकों की विभिन्न सांद्रता को 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ा गया था, और जीवित कोशिकाओं के अनुपात को माइटोकॉन्ड्रियल डिहाइड्रोजनेज द्वारा बैंगनी फॉर्माज़ान यौगिक (चित्रा 2) में पीले एमटीटी की कमी की सीमा के वर्णमिति विश्लेषण द्वारा मापा गया था। गतिविधि को अक्सर आईसी50 मूल्य के रूप में रिपोर्ट किया जाता है- एकाग्रता जिस पर कोशिका वृद्धि अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष 50% तक बाधित होती है। यह पेपर एमटीटी परख के लिए प्रोटोकॉल और इन उपन्यास स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के प्रारंभिक परिणामों का वर्णन करता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कई रसायन और जैविक अभिकर्मक विषाक्त और कार्सिनोजेनिक हैं। उपयोग करने से पहले प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। प्रयोग शुरू करने से पहले उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक गियर (व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य प्रशासन-अनुमोदित सुरक्षा चश्मे, उचित दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट और बंद पैर की अंगुली के जूते) का उपयोग करें। इसके अलावा, संश्लेषण करते समय और विषाक्त रसायनों और अभिकर्मकों (फ्यूम हुड) को संभालते समय उचित सुरक्षा प्रथाओं को अपनाएं।

1. स्पाइरोसाइक्लिक हेटरोसाइकिल 6 और 7 का ठोस चरण संश्लेषण

नोट: संश्लेषण पहले प्रकाशित काम11,12 पर आधारित था। अद्यतन प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ट्राइसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल के टेट्राब्यूटाइलमोनियम फ्लोराइड-उत्प्रेरित रिंग खोलने की आवश्यकता नहीं थी, और इस प्रकार इसका उन्मूलन सिंथेटिक प्रक्रिया को छोटा करता है।

  1. आरईएम लिंकर (अवधि: 25 मिनट सेटअप + 24 घंटे प्रतिक्रिया समय) में फरफ्यूरिलमाइन के माइकल जोड़ का प्रदर्शन करें।
    1. आरईएम राल के 1 ग्राम (1 समकक्ष [इक्विव]), डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ) के 20 एमएल (20 इक्विव) और 25 एमएल ठोस-चरण प्रतिक्रिया पोत में 2.4 एमएल फरफ्यूरिलमाइन जोड़ें। प्रतिक्रिया शुरू होने के बाद 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया पोत को उत्तेजित करें।
      नोट: पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें ताकि राल बर्तन के निचले हिस्से में न बैठे।
    2. प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद राल को डीएमएफ 1 एक्स से धो लें। फिर, डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) और मेथनॉल के बीच बारी-बारी से 4x धो लें। धोने के बाद प्रतिक्रिया पोत में राल को अच्छी तरह से सुखाएं।
  2. 1,3-द्विध्रुवीय साइक्लोडिशन (अवधि: 25 मिनट सेटअप + 48 घंटे प्रतिक्रिया समय) का प्रदर्शन करें।
    1. शुष्क राल में, प्रतिक्रिया पोत में ट्राइथिलमाइन (टीईए) के 1.48 एमएल (5 इक्विव), नाइट्रो-ओलेफिन के 0.637 ग्राम (2 इक्विव) और 10 एमएल सूखे टोल्यूनि जोड़ें।
    2. फिर, एक अच्छी तरह से हवादार फ्यूम हुड में प्रतिक्रिया पोत में ट्राइमिथाइलसिल क्लोराइड (टीएमएससीएल) के 1.085 एमएल (4 इक्विव) जोड़ें।
      नोट: चूंकि यह प्रतिक्रिया एचसीएल गैस का उत्पादन करती है, प्रतिक्रिया पोत को तब तक कैप न करें जब तक कि गैस को फ्यूम हुड के नीचे जारी नहीं किया जाता है।
    3. प्रतिक्रिया पोत को सुरक्षित रूप से कैप करें, और 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर आंदोलन करें।
      नोट: अभिकर्मकों के साथ राल का पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें।
    4. प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए 5 एमएल मेथनॉल का उपयोग करें।
    5. घोल को हटाने के लिए बर्तन को छान लें, और फिर डीसीएम और मेथनॉल के बीच बारी-बारी से 4 गुना धो लें। धोने के बाद प्रतिक्रिया पोत में राल को अच्छी तरह से सुखाएं।
  3. चतुर्धातुक अमाइन बनाने के लिए राल-बाध्य हेटेरोसाइकिल का एन-अल्काइलेशन करें (अवधि: 10 मिनट सेटअप + 24 घंटे प्रतिक्रिया समय)।
    1. प्रतिक्रिया पोत में सूखे राल में, डीएमएफ के 5 एमएल और एल्काइल हलाइड के 10 इक्विव जोड़ें, और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर आंदोलन करें।
      नोट: राल के साथ अभिकर्मकों का पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें।
    2. प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद राल को डीएमएफ 1 एक्स से धो लें। फिर, 4x धोने के लिए वैकल्पिक रूप से डीसीएम और मेथनॉल का उपयोग करें। धोने के बाद प्रतिक्रिया पोत में राल को सुखाएं।
  4. बहुलक समर्थन से दरार के लिए चतुर्धातुक अमाइन का β-उन्मूलन करें (अवधि: 15 मिनट सेटअप + 24 घंटे प्रतिक्रिया समय)।
    1. प्रतिक्रिया पोत में सूखे राल में, बहुलक समर्थन से हेटेरोसाइकिल को छोड़ने के लिए डीसीएम के 3 एमएल और टीईए के 1.49 एमएल (5 इक्विव) जोड़ें।
    2. समाधान के साथ राल के पूरी तरह से मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को 24 घंटे के लिए उत्तेजित करें। डीसीएम और मेथनॉल के बीच बारी-बारी से 4x धोएं। सभी धोने से क्षालन एकत्र करें, और रोटेटरी वाष्पीकरण के माध्यम से ध्यान केंद्रित करें।
    3. स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम को शुद्ध करने के लिए मेथनॉल के साथ ट्राइट्यूरेट करें। भविष्य के प्रयोगों में पुन: उपयोग के लिए धोने के बाद प्रतिक्रिया पोत में राल को अच्छी तरह से सुखाएं।

2. एमटीटी 14 का उपयोग कर साइटोटॉक्सिसिटी परख

  1. 5 मिलीग्राम / एमएल एमटीटी समाधान के 20 एमएल को बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पानी में 0.9% एनएसीएल) का उपयोग करके तैयार करें। फ़िल्टर करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फिर, सीरम-मुक्त सेल संस्कृति माध्यम (डीएमईएम) में चरण 2.1 से एमटीटी समाधान का 1: 1 कमजोर पड़ना तैयार करें।
  2. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1.5 एमएल ट्यूबों में सीरम मुक्त माध्यम में स्टॉक सांद्रता 1: 1000 को पतला करके परीक्षण यौगिकों के कामकाजी समाधानों की प्रति खुराक 200 μL तैयार करें।
  3. टिशू कल्चर हुड में, बीज सीओएस -7 कोशिकाएं (अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे की कोशिकाएं, सेर्कोपिथेकस एथियोप्स किडनी) पूर्ण माध्यम [10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ डीएमईएम] में फ्लैट-बॉटम, ऊतक-संस्कृति-उपचारित 96-वेल प्लेटों पर 4 × 103 कोशिकाओं / 200 μL प्रति कुएं की एकाग्रता पर मल्टी-चैनल पाइपेटर का उपयोग करके। सीओएस -7 कोशिकाओं को चुना गया था क्योंकि (1) ये साइटोटॉक्सिसिटी परख के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं हैं और (2) ये पहले से ही संस्थान में उपलब्ध थीं।
  4. COS-7 कोशिकाओं को 5% CO2 वाले वातावरण में 37 °C पर24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. वैक्यूम पंप से जुड़े ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कुओं से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। चरण 2.2 में तैयार किए गए कामकाजी समाधानों का उपयोग करके परीक्षण यौगिकों के साथ कोशिकाओं को तीन प्रतियों में खुराक दें (तालिका 1 देखें)। चरण 2.4 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. कुओं से सतह पर तैरने वाले को बाहर निकालें। प्रत्येक कुएं में 200 μL MTT समाधान जोड़ें। 4 घंटे के लिए 5%CO2 वाले वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
  7. बैंगनी फॉर्माज़ान क्रिस्टल को परेशान किए बिना कुओं से धीरे-धीरे सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। बैंगनी फॉर्माज़ान क्रिस्टल को भंग करने के लिए प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ का 200 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  8. 96-वेल प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के लिए 590 एनएम14 या 600 एनएम पर अवशोषण मापें। पृष्ठभूमि के रूप में बिना कोशिकाओं वाले कुओं का उपयोग करें और अवशोषण मूल्य का औसत निकालें। अच्छी तरह से इलाज किए गए प्रत्येक के अवशोषण मूल्य से औसत अवशोषण पृष्ठभूमि मूल्य घटाएं। डेटा को औसत शून्य खुराक मूल्य (औसत तीन शून्य खुराक मूल्यों) के प्रतिशत के रूप में सामान्य करें। वाई-अक्ष पर प्लॉट डेटा: रैखिक (% सापेक्ष सेल व्यवहार्यता); एक्स-अक्ष: लॉग (एकाग्रता)। प्रत्येक श्रृंखला को एक व्यक्तिगत वक्र के रूप में प्लॉट करें (उदाहरण के लिए, तीन प्रतियों के डेटा में 3 वक्र होने चाहिए)

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Representative Results

स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम 6 और 7 को एक संशोधित प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। एक आरईएम लिंकर 1 बी में फरफ्यूरिलमाइन के माइकल ने बहुलक-बाध्य राल 2 को जोड़ा। 1722 सेमी -1 (चित्रा 3) पर α,β-असंतृप्त एस्टर के गायब होने का पता लगाकर इन्फ्रारेड (आईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी की गई थी। स्पाइरोसाइक्लिक-बाउंड राल 4 का गठन क्षणिक मध्यवर्ती 3 के माध्यम से 2 से किया गया था। 4 के मेथनॉलिक हाइड्रोलिसिस ने 3-[(3ई)-(2एस, 4आर)-2-फिनाइल-3-हाइड्रॉक्सीमिनो 4-हाइड्रॉक्सीमिथाइल-पाइरोलिडिन-1-वाईएल]-प्रोपियोनिक एसिड मिथाइल एस्टर 7 का उत्पादन किया, जबकि β-उन्मूलन के बाद एल्काइलेशन (3ई)-(2एस, 4आर)-4-हाइड्रॉक्सीमिथाइल-1-मिथाइल-2-फिनाइल-3-पाइरोलिडाइन ऑक्सीम 6 का उत्पादन किया। स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम की पहचान 1 एच और 13सी परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण और हमारे पिछले परिणामोंके आधार पर द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्धता द्वारा निर्धारित की गई थी।

एमटीटी परख सेल व्यवहार्यता12 का निर्धारण करने के लिए एक प्रसिद्ध रंगीन परख है। जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है, जीवित कोशिकाओं में मौजूद माइटोकॉन्ड्रियल रिडक्टेस एमटीटी के पीले टेट्राज़ोलियम को एक अघुलनशील बैंगनी फॉर्माज़ान ठोस में परिवर्तित करते हैं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, फॉर्माज़ान गठन को 600 एनएम पर अवशोषण को मापकर निर्धारित किया जाता है। सिस्प्लैटिन, जो उच्च सांद्रता में कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था (चित्रा 4)। जैसा कि अपेक्षित था, सिस्प्लाटिन की सांद्रता जितनी अधिक होगी, सेल व्यवहार्यता उतनी ही कम होगी। इसके बाद, एमटीटी परख का उपयोग स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों 6 और 7 और फरफ्यूरिलमाइन का परीक्षण करने के लिए किया गया था। स्पिरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क की तुलना में अकेले फुरान रिंग के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए फरफ्यूरिलमाइन का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्र 5 में दर्शाया गया है, फरफ्यूरिलमाइन और स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम 6 ने समान साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई। हालांकि, स्पाइरोसाइक्लिक यौगिक 7 की विषाक्तता फरफ्यूरिलमाइन और 6 की तुलना में काफी अधिक थी। साइटोटॉक्सिसिटी के साथ-साथ इन हेटेरोसाइकिल के अन्य एंटीकैंसर प्रभावों की पूरी तरह से जांच करने के लिए स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम की एक लाइब्रेरी को संश्लेषित किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: एक अद्यतन ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग करके स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों का निर्माण। ऑर्थोगोनल स्पाइरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क नीले रंग में छायांकित है। ध्यान दें कि चरण (सी) की आवश्यकता नहीं है, जो विषाक्त अभिकर्मक टीबीएएफ का उपयोग करने से बचता है। प्रतिक्रिया की स्थिति इस प्रकार है: (ए) फरफ्यूरिलमाइन, डीएमएफ, (बी) β-नाइट्रोस्टाइनिन, टीएमएससीएल, टीईए, टोल्यूनि, (सी) टीबीएएफ, (डी) एल्काइल हैलाइड, डीएमएफ, और (ई) टीईए, डीसीएम। संक्षेप: टीबीएएफ = टेट्राब्यूटाइलामोनियम फ्लोराइड; डीएमएफ = डाइमिथाइलफॉर्मामाइड; टीएमएससीएल = ट्राइमिथाइलसिल क्लोराइड; टीईए = ट्राइथिलमाइन; डीसीएम = डाइक्लोरोमेथेन; आईएसओसी = इंट्रामोलेक्यूलर सिलीऑक्सी ओलेफिन साइक्लोडेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एमटीटी परख का तंत्र। एमटीटी के स्पष्ट पीले टेट्राज़ोलियम नमक को जीवित सीओएस -7 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल रिडक्टेस द्वारा बैंगनी अघुलनशील फॉर्माज़ान बनाने के लिए कम किया जाता है। संक्षिप्त नाम: एमटीटी = 3-(4', 5'-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2'-yl)-2,5- डिफेनिल्टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक ठोस चरण प्रतिक्रिया चरण की प्रगति की निगरानी। 1717 सेमी -1 पर स्ट्रेचिंग आवृत्ति ने एक असंतृप्त एस्टर की उपस्थिति का संकेत दिया, 1733 सेमी -1 ने एक संतृप्त एस्टर को चित्रित किया, और 3300-3500 सेमी -1 के आसपास संकेत ने हाइड्रॉक्सिल समूह की उपस्थिति का संकेत दिया। पॉलीस्टाइनिन के लिए पता लगाने योग्य स्ट्रेचिंग आवृत्तियों को भी दिखाया गया है। संक्षिप्तरूप: आरईएम = माइकल को पुनर्जीवित करना; आईएसओसी = इंट्रामोलेक्यूलर सिलीऑक्सी ओलेफिन साइक्लोडेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक संशोधित एमटीटी परख में सीओएस -7 सेल व्यवहार्यता पर सिस्प्लैटिन का प्रभाव। सिस्प्लैटिन की सांद्रता 0 μM से 60 μM तक थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एक संशोधित एमटीटी परख में सीओएस -7 सेल व्यवहार्यता पर परीक्षण यौगिकों का प्रभाव। सांद्रता 0 μM से 100 μM तक थी और लॉग स्केल पर प्लॉट की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Table 1
तालिका 1: 96-वेल प्लेट का लेआउट। सभी परीक्षण डेटा पंक्तियाँ तीन प्रतियों में थीं। केवल सीओएस -7 कोशिकाओं और माध्यम वाले कुओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएमएसओ सिस्प्लाटिन-खुराक कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिसिटी का कारण नहीं था, केवल डीएमएसओ युक्त कुओं को विलायक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। सीओएस -7 कोशिकाओं वाले कुओं पर प्रकाश डाला गया है। संक्षेप: डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फोक्साइड; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों का संश्लेषण इस प्रयोगशाला द्वारा किए गए पिछले शोध पर आधारित था, लेकिन कुछ संशोधनों के साथ (चित्रा 1)11,12)। आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक प्रतिक्रिया चरण की प्रगति की निगरानी की गई थी। फरफ्यूरिलमाइन के साथ आरईएम लिंकर 1 के माइकल ने बहुलक-बाध्य 2 (आईआर 1722 सेमी -1 → 1731 सेमी -1) प्रदान किया। पिछली रिपोर्ट से, आईएसओसी ऑफ 2 ने ट्राइसाइक्लिक हेट्रोसाइक्लिक यौगिक 3 का उत्पादन किया, जैसा कि टीएमएस समूह (आईआर 1214 सेमी -1) का पता लगाने से पुष्टि की गई है। यह संश्लेषण का एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि आईएसओसी ने उत्पादों की आवश्यक रेजियो- और स्टीरियोचयनात्मकता प्रदान की है। टीएमएस कार्यात्मक समूह की आवृत्ति के बजाय 3500 सेमी -1 की एक हाइड्रॉक्सिल समूह स्ट्रेचिंग आवृत्ति देखी गई थी। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि ट्राइसाइक्लिक यौगिक एक क्षणिक मध्यवर्ती है जो स्पाइरोसाइक्लिक सिस्टम की ओर जाता है।

संश्लेषण को सीमित करने के लिए विभिन्न प्रकार के आरईएम राल पाए गए। उच्च-लोडिंग बहुलक (1.00 mmol / g) ने भारी आर2 साइड चेन वाले स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों के संश्लेषण को रोका। रेजिन 4 और 5 में कार्यात्मक समूहों में समानता के कारण, आईआर के परिणाम अनिश्चित थे। इस चरण की सफलता केवल आरईएम लिंकर (5 → 1) को पुनर्जीवित करने का प्रयास करके निर्धारित की जा सकती है। पुनर्जनन उन उदाहरणों में नहीं हुआ जब एक भारी आर2 समूह जोड़ा गया था। सफल संश्लेषण के लिए कम-लोडिंग रेजिन (0.5 mmol / g या उससे कम) की सिफारिश की जाती है। यह संश्लेषण विधि साहित्य में वर्णित प्रक्रियाओं के अनुरूप है।

प्रारंभिक परीक्षण के रूप में, एमटीटी का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी परख के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। कई परीक्षणों के दौरान, महत्वपूर्ण कदमों और सीमाओं की खोज की गई। सभी कुओं में परिणामों को सामान्यीकृत करने के लिए, कोशिकाओं को कुओं में समान रूप से बीजित किया जाना था, जिससे बीज बोने से पहले सेल एकाग्रता के माप की आवश्यकता होती थी। परख को सपाट तल वाले कुओं के साथ प्लेटों की आवश्यकता थी, क्योंकि अवशोषण को गोल-तल वाले कुओं से सटीक रूप से नहीं पढ़ा जा सकता था। इसके अतिरिक्त, इनक्यूबेशन के बाद बने अतिरिक्त एमटीटी को अघुलनशील फॉर्माज़ान को परेशान किए बिना रीडिंग में हस्तक्षेप को रोकने के लिए हटा दिया जाना था।

घुलित फॉर्माज़ान के अवशोषण को 590 एनएम पर पढ़ा जाना चाहिए। हालांकि, प्रयोगशाला में वर्तमान इंस्ट्रूमेंटेशन ने इसके बजाय 600 एनएम पर रीडिंग लेने की आवश्यकता थी। परख में उपयोग किए जाने वाले रसायनों (सिस्प्लैटिन, स्पाइरोसाइक्लिक अणु, फरफ्यूरिलमाइन) के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण महत्वपूर्ण पाया गया था। डीएमएसओ-ज्ञात साइटोटॉक्सिसिटी के साथ एक रसायन- परीक्षण यौगिकों के लिए विलायक के रूप में इस्तेमाल किया गया था और परख के लिए कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एमटीटी अभिकर्मक को स्वयं तैयार किया जाना था, क्योंकि इसे एक पाउडर के रूप में संग्रहीत किया गया था जिसे भंग और फ़िल्टर करने की आवश्यकता थी, क्योंकि अघुलनशील कण रीडिंग में हस्तक्षेप करते थे।

कुल मिलाकर, इस परख के परिणाम प्रारंभिक होने का इरादा है, क्योंकि केवल थोड़ी संख्या में अणुओं का परीक्षण किया गया था। अणुओं की एक बैटरी के साथ एक संपूर्ण परीक्षण की योजना बनाई गई है, और एक पूर्ण पांडुलिपि आने वाली है। इसके अलावा, संश्लेषण पाइरोल -2-कार्बाल्डिहाइड से प्राप्त अमाइन के लिए लागू हो सकता है। इस मामले में, कैंसर सेल लाइनों पर साइटोटोक्सिक प्रभाव के लिए स्पाइरोसाइक्लिक पाइरोलिडाइन को संश्लेषित और परीक्षण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को केएसएच (अनुसंधान और अनुदान कार्यालय, अज़ुसा पैसिफिक यूनिवर्सिटी-यूएसए) को संकाय अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ए.एन.जी. और जे.एफ.एम. विद्वानों के स्नातक अनुसंधान अनुभव (SURE) फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। एस.के.एम. और बी.एम.आर. एसटीईएम रिसर्च फैलोशिप अनुदान (सेंटर फॉर रिसर्च इन साइंस, अज़ुसा पैसिफिक यूनिवर्सिटी-यूएसए) के प्राप्तकर्ता हैं। हम बायोएस पर मार्गदर्शन के लिए डॉ मैथ्यू बेरेजुक और डॉ फिलिप कॉक्स के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane Sigma-Aldrich 152951 Alkyl-halide
Allylbromide Sigma-Aldrich 337528 Alkyl-halide
Benzylbromide Sigma-Aldrich B17905 Alkyl-halide
Cisplatin Cayman Chemical 13119 Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997 Solvent
Dimethylformamide (DMF) Sigma-Aldrich 227056 Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855 Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine Genesee Scientific 25-500 Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum) Sigma-Aldrich F4135 Cell culture media
Furfurylamine Acros Organics 119800050 reagent 
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566 Alkyl-halide
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) EMD Millipore Calbiochem 475989-1GM Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) Genesee Scientific 25-507 Cell culture media
REM Resin Nova Biochem 8551010005 Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene Sigma-Aldrich N26806 Nitro-olefin reagent
Toluene Sigma-Aldrich 244511 Solvent
Triethylamine (TEA) Sigma-Aldrich T0886 Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) Sigma-Aldrich 386529 Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel Chemglass CG-1861-02 Glassware with filter
96 Well plate reader Promega (Turner Biosystems) 9310-011 Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer Bruker N/A Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5 Thermo Scientific IQLAADGAAGFAHDMAZA Instrument
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific 757950819 Instrument

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References

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जीव विज्ञान अंक 168 एमटीटी परख स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम हेटेरोसाइकिल साइटोटॉक्सिसिटी ठोस-चरण संश्लेषण सेल व्यवहार्यता वर्णमिति परख
कार्यात्मक स्पाइरोसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल संश्लेषण और साइटोटॉक्सिसिटी परख
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Gray, A. N., Ramirez, B. M., Mawugbe, S. K., Mar, J. F., Wong, Y. L. C., Huang, K. S. Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay. J. Vis. Exp. (168), e61950, doi:10.3791/61950 (2021).

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