Summary
Hier beschrijven we een bioassay met behulp van 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) om eerder gesynthetiseerde spirocyclische oximen te testen.
Abstract
Spirocyclische heterocycli zijn onlangs in de literatuur gemeld als potentiële geneesmiddelen voor kankertherapie. De synthese van deze nieuwe orthogonale ringsystemen is een uitdaging. Een efficiënte methodologie om deze verbindingen te synthetiseren werd onlangs gepubliceerd die de vaste fasesynthese in vier stappen beschreef in plaats van de eerder gerapporteerde vijf stappen. Het voordeel van deze kortere synthese is de eliminatie van het gebruik van toxische reagentia. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-gebaseerde hars bleek cruciaal te zijn in de synthese, omdat hoogbelastende versies de toevoeging van reagentia met omvangrijke fenyl- en aromatische zijketens verhinderden. De colorimetrische 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van micromolaire concentraties van deze nieuwe spirocyclische moleculen in vitro te onderzoeken. MTT is direct in de handel verkrijgbaar en produceert relatief snelle, betrouwbare resultaten, waardoor deze test ideaal is voor deze spirocyclische heterocycli. Orthogonale ringstructuren en furfurylamine (een voorloper in de synthesemethode met een vergelijkbaar 5-lids ringmotief) werden getest.
Introduction
Van kleinmolecuulremming van de interactie van E3 ubiquitine-ligase muis dubbele minuut 2 homoloog (MDM2) met p53 is bekend dat het p53-gemedieerde inductie van tumorcelapoptoseherstelt 1,2,3. MDM2 is een negatieve regulator van de p53-route en wordt vaak overexpressie in kankercellen 4,5,6,7,8,9. Recente kristallografische en biochemische studies hebben aangetoond dat kleine moleculen die een spirocyclisch raamwerk bevatten, MDM2-p53-interacties effectief kunnen remmen10. Het spirocyclische raamwerk (figuur 1, blauw gearceerd) wordt beschouwd als een geprivilegieerd motief omdat derivatisatie van dit rigide orthogonale ringsysteem heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe therapeutische geneesmiddelen. Toegang tot deze interessante architectuur vormt een uitdaging bij het gebruik van traditionele organische synthesetechnieken. Hoewel de therapeutische effecten van spirocyclische moleculen in biologische systemen zijn onderzocht, is de synthese van deze moleculen nog steeds een omslachtig proces. Ongewenste bijproducten, het gebruik van zware omstandigheden en gevaarlijke overgangsmetalen zijn vaak problematisch.
Het potentiële gebruik van het spirocyclische motief bij de ontwikkeling van geneesmiddelen leidde tot de ontwikkeling van een protocol dat gebruik maakt van vaste-fasesynthese om een bibliotheek van moleculen met het motief te genereren naast andere uitwisselbare functionele groepen11,12. De scheiding van producten en reactanten tussen stappen kan worden bereikt door simpelweg gebruik te maken van een REM-linker bevestigd aan een harskraal en een solid-phase filtervat. Dit zou de stappen verminderen en mogelijk de opbrengsten verhogen. Deze synthetische aanpak zou een groot aantal potentiële kandidaat-geneesmiddelen kunnen opleveren. De effectiviteit van deze moleculen in een biologisch systeem zou echter verder onderzoek vereisen.
Om de cytotoxiciteit van deze spirocyclische verbindingen te bepalen, werd de MTT-assay 13,14 gebruikt. Deze methode meet de levensvatbaarheid van cellen en kan worden gebruikt om indirect de cytotoxiciteit van cellen te bepalen. Verschillende concentraties van de remmers werden toegevoegd aan gekweekte cellen in een 96-well plaat, en het aandeel levende cellen werd gemeten door colorimetrische analyse van de mate van reductie van gele MTT door mitochondriale dehydrogenasen tot de paarse formazanverbinding (figuur 2). De activiteit wordt meestal gerapporteerd als een IC50-waarde - de concentratie waarbij de celgroei met 50% wordt geremd ten opzichte van een onbehandelde controle. Dit artikel beschrijft het protocol voor de MTT-test en de voorlopige resultaten van deze nieuwe spirocyclische moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Verschillende chemicaliën en biologische reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Raadpleeg relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Gebruik geschikte persoonlijke beschermende kleding (door de Occupational Safety and Health Administration goedgekeurde veiligheidsbril, goede handschoenen, laboratoriumjassen, broeken over de volledige lengte en schoenen met gesloten teen) voordat u aan het experiment begint. Hanteer bovendien passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van synthese en het hanteren van giftige chemicaliën en reagentia (zuurkast).
1. Vaste fasesynthese van spirocyclische heterocycli 6 en 7
OPMERKING: Synthese was gebaseerd op eerder gepubliceerd werk 11,12. Het bijgewerkte protocol onthult dat de tetrabutylammoniumfluoride-gekatalyseerde ringopening van de tricyclische heterocyclus niet nodig was, en dus verkort de eliminatie ervan de synthetische procedure.
- Voer Michael toevoeging van furfurylamine aan de REM-linker uit (duur: 25 minuten setup + 24 h reactietijd).
- Voeg 1 g (1 equivalenten [equiv.]) REM-hars, 20 ml (20 equiv.) dimethylformamide (DMF) en 2,4 ml furfurylamine toe aan een 25 ml vastefasereactievat. Roer het reactievat bij kamertemperatuur gedurende 24 uur na de start van de reactie.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging, zodat de hars niet op de bodem van het vat zit. - Was de hars met DMF 1x nadat de reactie is voltooid. Was vervolgens 4x, afwisselend dichloormethaan (DCM) en methanol. Droog de hars grondig in het reactievat na het wassen.
- Voeg 1 g (1 equivalenten [equiv.]) REM-hars, 20 ml (20 equiv.) dimethylformamide (DMF) en 2,4 ml furfurylamine toe aan een 25 ml vastefasereactievat. Roer het reactievat bij kamertemperatuur gedurende 24 uur na de start van de reactie.
- Voer tandem Michael additie/1,3-dipolaire cycloadditie uit (duur: 25 min setup + 48 h reactietijd).
- Voeg aan de droge hars 1,48 ml (5 equiv.) triethylamine (THEE), 0,637 g (2 equiv.) nitro-olefine en 10 ml droog tolueen toe aan het reactievat.
- Voeg vervolgens 1,085 ml (4 equiv.) trimethylsilylchloride (TMSCl) toe aan het reactievat in een goed geventileerde zuurkast.
OPMERKING: Aangezien deze reactie HCl-gas produceert, moet u het reactievat niet afdekken totdat het gas onder een zuurkast is vrijgegeven. - Sluit het reactievat stevig af en roer gedurende 48 uur op kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van de hars met de reagentia. - Gebruik 5 ml methanol om de reactie te doven.
- Giet het vat af om de oplossing te verwijderen en was vervolgens 4x, afwisselend DCM en methanol. Droog de hars grondig in het reactievat na het wassen.
- Voer N-alkylering van de harsgebonden heterocyclus uit om het quaternaire amine te vormen (duur: 10 minuten setup + 24 uur reactietijd).
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 5 ml DMF en 10 equiv. alkylhalogenide toe en roer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van de reagentia met de hars. - Was de hars met DMF 1x nadat de reactie is voltooid. Gebruik vervolgens afwisselend DCM en methanol om 4x te wassen. Droog de hars in het reactievat na het wassen.
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 5 ml DMF en 10 equiv. alkylhalogenide toe en roer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
- Voer β-eliminatie van het quaternaire amine uit voor splitsing van de polymeerondersteuning (duur: 15 minuten setup + 24 uur reactietijd).
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 3 ml DCM en 1,49 ml (5 equiv.) TEA toe om de heterocyclus van de polymeerondersteuning te splitsen.
- Roer het reactiemengsel gedurende 24 uur om een grondige menging van de hars met de oplossing te garanderen. Was 4x, afwisselend DCM en methanol. Verzamel de elutie van alle wasbeurten en concentreer je via rotatieverdamping.
- Trituraat met methanol om het spirocyclische oxime te zuiveren. Droog de hars grondig in het reactievat na wasbeurten voor hergebruik in toekomstige experimenten.
2. Cytotoxiciteitstest met MTT 14
- Bereid 20 ml van een MTT-oplossing van 5 mg/ml met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl in water) als verdunningsmiddel. Filtreer en bewaar bij -20 °C. Bereid vervolgens een 1:1 verdunning van de MTT-oplossing uit stap 2.1 in serumvrij celkweekmedium (DMEM).
- Bereid 1 ml elk van de stamoplossingen in 1,5 ml microcentrifugebuizen van 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM en 0,01 μM testverbindingen in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaren bij -20 °C. Bereid 200 μL per dosis van de werkoplossingen van teststoffen door de voorraadconcentraties 1:1000 in serumvrij medium in buizen van 1,5 ml te verdunnen.
- In de weefselkweekkap, zaad COS-7 cellen (Afrikaanse groene aap niercellen, Cercopithecus aethiops nier) in volledig medium [DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS)] op platbodem, weefselkweek behandelde 96-well platen in een concentratie van 4 × 103 cellen/200 μL per put met behulp van een meerkanaals pipettor. COS-7-cellen werden gekozen omdat (1) dit veelgebruikte cellen zijn voor cytotoxiciteitstests en (2) deze al beschikbaar waren in de instelling.
- Incubeer COS-7-cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer die 5% CO2 bevat.
- Adem het supernatant uit de putten met behulp van een glazen Pasteur-pipet die aan een vacuümpomp is bevestigd. Doseer de cellen in drievoud met de teststoffen met behulp van de in stap 2.2 bereide werkoplossingen (zie tabel 1). Incubeer cellen zoals beschreven in stap 2.4.
- Haal het supernatant uit de putten. Voeg 200 μL MTT-oplossing toe aan elk putje. Incubeer bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Haal het supernatant voorzichtig uit de putten zonder de paarse formazankristallen te verstoren. Voeg 200 μL DMSO toe aan elk putje om de paarse formazankristallen op te lossen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Meet de absorptie bij 590 nm14 of 600 nm voor elke put met behulp van een 96-well plaatlezer. Gebruik putten zonder cellen als achtergrond en gemiddelde de absorptiewaarde. Trek de gemiddelde absorptieachtergrondwaarde af van de absorptiewaarde van elke behandelde put. Normaliseer de gegevens als een percentage van de gemiddelde nuldoseringswaarde (gemiddeld de drie nuldosiswaarden). Plotgegevens op de y-as: lineair (% relatieve levensvatbaarheid van de cel); x-as: log (concentratie). Plot elke reeks als een individuele curve (bijvoorbeeld drievoudsgegevens moeten 3 curven hebben)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spirocyclische oximen 6 en 7 werden gesynthetiseerd met behulp van een aangepast protocol (figuur 1). Michael toevoeging van furfurylamine aan een REM linker 1b biedt polymeergebonden hars 2. De voortgang van de reactie werd gevolgd door infrarood (IR) spectroscopie door het detecteren van het verdwijnen van de α,β-onverzadigde ester bij 1722 cm-1 (figuur 3). Spirocyclisch gebonden hars 4 werd gevormd uit 2 via een transiënt tussenproduct 3. Methanolische hydrolyse van 4 produceerde 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-fenyl-3-hydroxyimino 4-hydroxymethyl-pyrroliline-1-yl]-propionzuurmethylester 7, terwijl alkylering gevolgd door β-eliminatie (3E)-(2S, 4R)-4-hydroxymethyl-1-methyl-2-fenyl-3-pyrrolidineoxime 6. De identiteit van de spirocyclische oximen werd bepaald door 1H en 13C kernspinresonantie spectroscopische analyse en de zuiverheid door massaspectroscopie op basis van onze eerdere resultaten11.
De MTT-test is een bekende colorimetrische test voor het bepalen van de levensvatbaarheid van cellen12. Zoals te zien is in figuur 2, zetten mitochondriale reductasen in levende cellen het gele tetrazolium van MTT om in een onoplosbare paarse formazan vaste stof. Met behulp van een spectrofotometer wordt de formazanvorming gekwantificeerd door de absorptie bij 600 nm te meten. Cisplatine, waarvan bekend is dat het celdood induceert bij hoge concentraties, werd gebruikt als een positieve controle (figuur 4). Zoals verwacht, hoe hoger de concentratie cisplatine, hoe lager de levensvatbaarheid van de cel. Vervolgens werd de MTT-test gebruikt om de spirocyclische verbindingen 6 en 7 en furfurylamine te testen. Furfurylamine werd gebruikt om het effect van de furaanring alleen te bepalen in vergelijking met het spirocyclische raamwerk. Zoals weergegeven in figuur 5 vertoonden furfurylamine en spirocyclisch oxime 6 een vergelijkbare cytotoxiciteit. De toxiciteit van spirocyclische verbinding 7 was echter merkbaar groter dan die van furfurylamine en 6. Een bibliotheek van spirocyclische oximen zal worden gesynthetiseerd om de cytotoxiciteit en de andere antikankereffecten van deze heterocycli volledig te onderzoeken.
Figuur 1: Constructie van spirocyclische verbindingen met behulp van een bijgewerkte vaste fasesynthese. Het orthogonale spirocycic raamwerk is blauw gearceerd. Merk op dat stap (c) niet nodig is, waardoor het gebruik van het toxische reagens TBAF wordt vermeden. De reactieomstandigheden zijn als volgt: (a) furfurylamine, DMF, (b) β-nitrostyreen, TMSCl, TEA, tolueen, (c) TBAF, (d) alkylhalogenide, DMF en (e) TEA, DCM. Afkortingen: TBAF = tetrabutylammonium fluoride; DMF = dimethylformamide; TMSCl = trimethylsilylchloride; THEE = triethylamine; DCM = dichloormethaan; ISOC = intramoleculaire silyoxy olefin cycloadditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mechanisme van de MTT-test. Zichtbaar geel tetrazoliumzout van MTT wordt gereduceerd door mitochondriale reductasen in levende COS-7-cellen om paars onoplosbare formazan te vormen. Afkorting: MTT = 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monitoring van de voortgang van elke vaste fase reactiestap door infrarood spectroscopie. De rekfrequentie bij 1717 cm-1 duidde op de aanwezigheid van een onverzadigde ester, 1733 cm-1 toonde een verzadigde ester en signaal rond 3300-3500 cm-1 duidde op de aanwezigheid van een hydroxylgroep. Detecteerbare rekfrequenties voor polystyreen worden ook getoond. Afkortingen: REM = Regenerating Michael; ISOC = intramoleculaire silyoxy olefin cycloadditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van cisplatine op de levensvatbaarheid van COS-7-cellen in een gemodificeerde MTT-test. De concentraties cisplatine varieerden van 0 μM tot 60 μM. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5: Effecten van teststoffen op de levensvatbaarheid van COS-7-cellen in een gemodificeerde MTT-test. De concentraties varieerden van 0 μM tot 100 μM en werden uitgezet op een logschaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Indeling van de 96-well plaat. Alle rijen met testgegevens waren in drievoud. Putten met alleen COS-7-cellen en -medium werden gebruikt als controles. Om ervoor te zorgen dat DMSO niet de oorzaak was van cytotoxiciteit in de cisplatine-gedoseerde cellen, werden putten met alleen DMSO gebruikt als oplosmiddelcontroles. Putten met COS-7-cellen worden gemarkeerd. Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De synthese van de spirocyclische verbindingen was gebaseerd op eerder onderzoek van dit laboratorium, maar met enkele wijzigingen (figuur 1)11,12. De voortgang van elke reactiestap werd gevolgd door IR-spectroscopie. Michael toevoeging van de REM linker 1 met furfurylamine voorzien van polymeer gebonden 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Uit het vorige rapport produceerde ISOC van 2 de tricyclische heterocyclische verbinding 3, zoals bevestigd door de detectie van de TMS-groep (IR 1214 cm-1). Dit is een cruciale stap in de synthese, aangezien ISOC voor de nodige regio- en stereoselectiviteit van de producten zorgde. Een hydroxylgroeprekfrequentie van 3500 cm-1 werd waargenomen in plaats van de frequentie van de TMS-functionele groep. Dit kan zijn omdat de tricyclische verbinding een voorbijgaand tussenproduct is dat leidt tot het spirocyclische systeem.
Verschillende soorten REM-hars bleken de synthese te beperken. Hoogbelastend polymeer (1,00 mmol/g) verhinderde de synthese van spirocyclische verbindingen die omvangrijke R 2-zijketens bevatten. Vanwege de overeenkomsten in de functionele groepen in harsen 4 en 5, waren de resultaten van IR niet overtuigend. Het succes van deze stap kon alleen worden bepaald door te proberen de REM-linker te regenereren (5 → 1). Regeneratie trad niet op in gevallen waarin een omvangrijke R2-groep werd toegevoegd. Laagbelastende harsen (0,5 mmol/g of lager) worden aanbevolen voor een succesvolle synthese. Deze synthesemethode is consistent met procedures die in de literatuur worden beschreven.
Als voorlopige test werd een protocol ontwikkeld voor een cytotoxiciteitstest met behulp van MTT. In de loop van verschillende onderzoeken werden kritieke stappen en beperkingen ontdekt. Om de resultaten over alle putten te normaliseren, moesten cellen gelijkmatig over putten worden gezaaid, waardoor de celconcentratie voorafgaand aan het zaaien moest worden gemeten. De test vereiste platen met putten met platte bodem, omdat de absorptie niet nauwkeurig kon worden afgelezen van putten met ronde bodems. Bovendien moest overtollige MTT die overbleef na incubatie worden verwijderd om interferentie in de metingen te voorkomen zonder de onoplosbare formazan te verstoren.
De absorptie van de opgeloste formazan moet worden afgelezen bij 590 nm. De huidige instrumentatie in het lab vereiste echter het nemen van metingen bij 600 nm in plaats daarvan. Opslag bij 0 °C bleek belangrijk te zijn voor de chemicaliën die in de test worden gebruikt (cisplatine, spirocyclische moleculen, furfurylamine). DMSO - een chemische stof met bekende cytotoxiciteit - werd gebruikt als oplosmiddel voor de testverbindingen en werd gebruikt om verdunningen voor de test te maken. Het MTT-reagens zelf moest worden bereid, omdat het werd opgeslagen als een poeder dat moest worden opgelost en gefilterd, omdat onoplosbare deeltjes de metingen verstoorden.
Over het algemeen zijn de resultaten voor deze test bedoeld als voorlopig, omdat slechts een klein aantal moleculen werd getest. Een uitputtende test met een batterij moleculen is gepland en een volledig manuscript zal verschijnen. Bovendien kan de synthese van toepassing zijn op amines afgeleid van pyrrool-2-carbaldehyde. In dit geval kunnen spirocyclische pyrrolidines worden gesynthetiseerd en getest op cytotoxische effecten op kankercellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Faculty Research Council aan K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. en J.F.M. zijn ontvangers van de Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. en B.M.R. zijn ontvangers van de STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). We zijn Dr. Matthew Berezuk en Dr. Philip Cox dankbaar voor hun begeleiding bij de bioassays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
