Summary
Här beskriver vi en bioassay med användning av 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) för att testa tidigare syntetiserade spirocykliska oximer.
Abstract
Spirocykliska heterocykler har nyligen rapporterats i litteraturen vara potentiella läkemedel för cancerbehandling. Syntesen av dessa nya ortogonala ringsystem är utmanande. En effektiv metod för att syntetisera dessa föreningar publicerades nyligen som beskrev den fasta fassyntesen i fyra steg snarare än de tidigare rapporterade fem stegen. Fördelen med denna kortare syntes är eliminering av användningen av giftiga reagenser. Låglastande regenererande Michael (REM) länkbaserat harts visade sig vara avgörande för syntesen eftersom höglastande versioner förhindrade tillsats av reagenser som innehöll skrymmande fenyl och aromatiska sidokedjor. Den kolorimetriska 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen användes för att undersöka cytotoxiciteten hos mikromolära koncentrationer av dessa nya spirocykliska molekyler in vitro. MTT är lättillgängligt kommersiellt och ger relativt snabba, tillförlitliga resultat, vilket gör denna analys idealisk för dessa spirocykliska heterocykler. Ortogonala ringstrukturer samt furfurylamin (en föregångare i syntesmetoden innehållande ett liknande 5-manna ringmotiv) testades.
Introduction
Småmolekylär hämning av interaktionen mellan E3 ubiquitin-ligas mus dubbel minut 2 homolog (MDM2) med p53 är känd för att återställa p53-medierad induktion av tumörcellsapoptos 1,2,3. MDM2 är en negativ regulator av p53-vägen och är ofta överuttryckt i cancerceller 4,5,6,7,8,9. Nya kristallografiska och biokemiska studier har visat att små molekyler som innehåller ett spirocykliskt ramverk effektivt kan hämma MDM2-p53-interaktioner10. Den spirocykliska ramen (figur 1, skuggad i blått) anses vara ett privilegierat motiv eftersom derivatisering av detta styva ortogonala ringsystem har lett till upptäckten av nya terapeutiska läkemedel. Att få tillgång till denna intressanta arkitektur utgör en utmaning när man använder traditionella organiska syntestekniker. Även om de terapeutiska effekterna av spirocykliska molekyler i biologiska system har undersökts, är syntesen av dessa molekyler fortfarande en besvärlig process. Oönskade sidoprodukter, med hårda förhållanden och farliga övergångsmetaller är ofta problematiska.
Den potentiella användningen av det spirocykliska motivet i läkemedelsutveckling ledde till utvecklingen av ett protokoll som använder fastfassyntes för att generera ett bibliotek av molekyler med motivet utöver andra utbytbara funktionella grupper11,12. Separationen av produkter och reaktanter mellan steg kan uppnås genom att helt enkelt använda en REM-länkare fäst vid en hartspärla och ett fastfasfilterkärl. Detta skulle minska stegen och potentiellt öka avkastningen. Detta syntetiska tillvägagångssätt skulle kunna ge upphov till ett stort antal potentiella läkemedelskandidater. Effektiviteten hos dessa molekyler i ett biologiskt system skulle dock kräva ytterligare undersökning.
För att bestämma cytotoxiciteten hos dessa spirocykliska föreningar användes MTT-analys13,14. Denna metod mäter cellviabilitet och kan användas för att indirekt bestämma cellcytotoxicitet. Olika koncentrationer av hämmarna tillsattes till odlade celler i en 96-brunnsplatta, och andelen levande celler mättes genom kolorimetrisk analys av omfattningen av reduktionen av gul MTT med mitokondriella dehydrogenaser till den lila formazanföreningen (figur 2). Aktiviteten rapporteras oftast som ett IC 50-värde - den koncentration vid vilken celltillväxt hämmas med50% i förhållande till en obehandlad kontroll. Detta dokument beskriver protokollet för MTT-analysen och de preliminära resultaten av dessa nya spirocykliska molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Flera kemikalier och biologiska reagenser som används i detta protokoll är giftiga och cancerframkallande. Konsultera relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd lämpliga personliga skyddsutrustningar (skyddsglasögon som godkänts av Occupational Safety and Health Administration, ordentliga handskar, labbrockar, byxor i full längd och skor med stängd tå) innan du startar experimentet. Dessutom anta lämpliga säkerhetsrutiner vid syntes och hantering av giftiga kemikalier och reagenser (dragskåp).
1. Fast fassyntes av spirocykliska heterocykler 6 och 7
OBS: Syntesen baserades på tidigare publicerat arbete11,12. Det uppdaterade protokollet avslöjar att den tetrabutylammoniumfluoridkatalyserade ringöppningen av den tricykliska heterocykeln inte behövdes, och därmed förkortar dess eliminering det syntetiska förfarandet.
- Utför Michael tillägg av furfurylamin till REM-länkaren (varaktighet: 25 min inställning + 24 h reaktionstid).
- Tillsätt 1 g (1 ekvivalent [motsvarande]) REM-harts, 20 ml (20 motsvarande) dimetylformamid (DMF) och 2,4 ml furfurylamin till ett 25 ml fastfasreaktionskärl. Agitera reaktionskärlet vid rumstemperatur i 24 timmar efter reaktionsinitieringen.
OBS: Se till att blanda noggrant så att hartset inte sitter i botten av kärlet. - Tvätta hartset med DMF 1x efter att reaktionen är klar. Tvätta sedan 4x, alternerande mellan diklormetan (DCM) och metanol. Torka hartset noggrant i reaktionskärlet efter tvätt.
- Tillsätt 1 g (1 ekvivalent [motsvarande]) REM-harts, 20 ml (20 motsvarande) dimetylformamid (DMF) och 2,4 ml furfurylamin till ett 25 ml fastfasreaktionskärl. Agitera reaktionskärlet vid rumstemperatur i 24 timmar efter reaktionsinitieringen.
- Utför tandem Michael addition/1,3-dipolär cykloaddition (varaktighet: 25 min inställning + 48 h reaktionstid).
- Till det torra hartset, tillsätt 1,48 ml (5 ekv.) trietylamin (TEA), 0,637 g (2 ekv.) nitroolefin och 10 ml torr toluen till reaktionskärlet.
- Tillsätt sedan 1,085 ml (4 ekv.) trimetylsilylklorid (TMSCl) till reaktionskärlet i en välventilerad dragskåp.
OBS: Eftersom denna reaktion producerar HCl-gas, täck inte reaktionskärlet förrän gasen har släppts ut under en dragskåp. - Täck reaktionskärlet ordentligt och rör om vid rumstemperatur i 48 timmar.
OBS: Se till att hartset blandas noggrant med reagenserna. - Använd 5 ml metanol för att släcka reaktionen.
- Töm kärlet för att ta bort lösningen och tvätta sedan 4x, alternerande mellan DCM och metanol. Torka hartset noggrant i reaktionskärlet efter tvätt.
- Utför N-alkylering av den hartsbundna heterocykeln för att bilda den kvartära aminen (varaktighet: 10 min inställning + 24 h reaktionstid).
- Till det torra hartset i reaktionskärlet, tillsätt 5 ml DMF och 10 ekvivalenter alkylhalogenid och agitera vid rumstemperatur i 24 timmar.
OBS: Se till att reagenserna blandas noggrant med hartset. - Tvätta hartset med DMF 1x efter att reaktionen är klar. Använd sedan DCM och metanol växelvis för att tvätta 4x. Torka hartset i reaktionskärlet efter tvätt.
- Till det torra hartset i reaktionskärlet, tillsätt 5 ml DMF och 10 ekvivalenter alkylhalogenid och agitera vid rumstemperatur i 24 timmar.
- Utför β-eliminering av den kvartära aminen för klyvning från polymerstödet (varaktighet: 15 min inställning + 24 h reaktionstid).
- Till det torra hartset i reaktionskärlet, tillsätt 3 ml DCM och 1,49 ml (5 motsvarande) TEA för att klyva heterocykeln från polymerstödet.
- Agitera reaktionsblandningen i 24 timmar för att säkerställa noggrann blandning av hartset med lösningen. Tvätta 4x, alternerande mellan DCM och metanol. Samla elueringen från alla tvättar och koncentrera dig via roterande avdunstning.
- Triturate med metanol för att rena det spirocykliska oximet. Torka hartset noggrant i reaktionskärlet efter tvättar för återanvändning i framtida experiment.
2. Cytotoxicitetsanalys med MTT 14
- Bered 20 ml av en 5 mg/ml MTT-lösning med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,9 % NaCl i vatten) som spädningsmedel. Filtrera och förvara vid -20 °C. Bered sedan en 1:1-utspädning av MTT-lösningen från steg 2.1 i serumfritt cellodlingsmedium (DMEM).
- Bered 1 ml vardera stamlösningar i 1,5 ml mikrocentrifugrör på 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM och 0,01 μM testföreningar i dimetylsulfoxid (DMSO). Förvaras vid -20 °C. Bered 200 μl per dos av arbetslösningarna av testföreningar genom att späda ut stamkoncentrationerna 1:1000 i serumfritt medium i 1,5 ml rör.
- I vävnadsodlingshuven, frö COS-7-celler (afrikanska gröna apa njurceller, Cercopithecus aethiops njure) i komplett medium [DMEM med 10% fosterbovint serum (FBS)] på platta, vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnsplattor i en koncentration av 4 × 103 celler / 200 μL per brunn med hjälp av en flerkanalig pipettor. COS-7-celler valdes eftersom (1) dessa är vanliga celler för cytotoxicitetsanalyser och (2) dessa redan fanns tillgängliga på institutionen.
- Inkubera COS-7-celler i 24 timmar vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 %CO2.
- Aspirera supernatanten från brunnarna med en pasteurpipett av glas fäst vid en vakuumpump. Dosera cellerna i tre exemplar med testföreningarna med hjälp av de arbetslösningar som beretts i steg 2.2 (se tabell 1). Inkubera celler enligt beskrivningen i steg 2.4.
- Aspirera supernatanten från brunnarna. Tillsätt 200 μl MTT-lösning till varje brunn. Inkubera vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 %CO2 i 4 timmar.
- Aspirera försiktigt supernatanten från brunnarna utan att störa de lila formazankristallerna. Tillsätt 200 μl DMSO till varje brunn för att lösa upp de lila formazankristallerna. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
- Mät absorbansen vid 590 nm14 eller 600 nm för varje brunn med en 96-brunns plattläsare. Använd brunnar utan celler som bakgrund och medelvärde för absorbansvärdet. Subtrahera det genomsnittliga absorbansbakgrundsvärdet från absorbansvärdet för varje behandlad brunn. Normalisera data som en procentandel av det genomsnittliga nolldoseringsvärdet (medelvärde för de tre nolldosvärdena). Plottdata på y-axeln: linjär (% relativ cellviabilitet); x-axel: log (koncentration). Rita upp varje serie som en individuell kurva (t.ex. bör tredubbla data ha 3 kurvor)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spirocykliska oximer 6 och 7 syntetiserades med användning av ett modifierat protokoll (Figur 1). Michael tillägg av furfurylamin till en REM-linker 1b gav polymerbundet harts 2. Reaktionens framsteg övervakades genom infraröd (IR) spektroskopi genom att detektera försvinnandet av den α,β-omättade estern vid 1722 cm-1 (figur 3). Spirocykliskt bundet harts 4 bildades från 2 via en övergående mellanliggande 3. Metanolhydrolys av 4 producerade 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-fenyl-3-hydroxiimino 4-hydroximetyl-pyrrolidin-1-yl]-propionsyrametylester 7, medan alkylering följt av β-eliminering gav (3E)-(2S, 4R)-4-hydroximetyl-1-metyl-2-fenyl-3-pyrrolidinoxim 6. Identiteten hos de spirocykliska oximerna bestämdes genom 1H och 13C kärnmagnetisk resonansspektroskopisk analys och renheten genom masspektroskopi baserat på våra tidigare resultat11.
MTT-analysen är en välkänd kolorimetrisk analys för bestämning av cellviabilitet12. Som framgår av figur 2 omvandlar mitokondriella reduktaser som finns i levande celler det gula tetrazoliumet av MTT till ett olösligt lila formazanfast ämne. Med hjälp av en spektrofotometer kvantifieras formazanbildningen genom att mäta absorbansen vid 600 nm. Cisplatin, som är känt för att inducera celldöd vid höga koncentrationer, användes som en positiv kontroll (figur 4). Som förväntat, ju högre koncentrationen av cisplatin, desto lägre cellviabilitet. Därefter användes MTT-analysen för att testa de spirocykliska föreningarna 6 och 7 och furfurylamin. Furfurylamin användes för att bestämma effekten av furanringen ensam jämfört med den spirocykliska ramen. Som visas i figur 5 visade furfurylamin och spirocyklisk oxim 6 liknande cytotoxicitet. Toxiciteten hos spirocyklisk förening 7 var emellertid märkbart större än för furfurylamin och 6. Ett bibliotek av spirocykliska oximer kommer att syntetiseras för att fullständigt undersöka cytotoxiciteten såväl som de andra anticancereffekterna av dessa heterocykler.
Figur 1: Konstruktion av spirocykliska föreningar med hjälp av en uppdaterad fastfassyntes. Den ortogonala spirocyceciska ramen är skuggad i blått. Observera att steg (c) inte behövs, vilket undviker att använda det giftiga reagenset TBAF. Reaktionsbetingelserna är följande: (a) furfurylamin, DMF, (b) β-nitrostyren, TMSCl, TEA, toluen, (c) TBAF, (d) alkylhalogenid, DMF och (e) TEA, DCM. Förkortningar: TBAF = tetrabutylammoniumfluorid; DMF = dimetylformamid; TMSCl = trimetylsylklorid; TEA = trietylamin; DCM = diklormetan; ISOC = intramolekylär silyoxiolefincykloaddition. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mekanism för MTT-analysen. Synligt gult tetrazoliumsalt av MTT reduceras av mitokondriella reduktaser i levande COS-7-celler för att bilda lila olöslig formazan. Förkortning: MTT = 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Övervakning av framstegen för varje fastfasreaktionssteg med infraröd spektroskopi. Sträckningsfrekvensen vid 1717 cm-1 indikerade närvaron av en omättad ester, 1733 cm-1 avbildade en mättad ester och signal runt 3300-3500 cm-1 indikerade närvaron av en hydroxylgrupp. Detekterbara sträckningsfrekvenser för polystyren visas också. Förkortningar: REM = Regenererande Michael; ISOC = intramolekylär silyoxiolefincykloaddition. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekter av cisplatin på COS-7-cellviabilitet i en modifierad MTT-analys. Koncentrationerna av cisplatin varierade från 0 μM till 60 μM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Testföreningarnas effekter på cellviabiliteten hos COS-7 i en modifierad MTT-analys. Koncentrationerna varierade från 0 μM till 100 μM och plottades på en loggskala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Layout av 96-brunnsplattan. Alla testdatarader var i tre exemplar. Brunnar som endast innehöll COS-7-celler och medium användes som kontroller. För att säkerställa att DMSO inte var orsaken till cytotoxicitet i de cisplatindoserade cellerna användes brunnar som endast innehöll DMSO som lösningsmedelskontroller. Brunnar som innehåller COS-7-celler markeras. Förkortningar: DMSO = dimetylsulfoxid; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntesen av de spirocykliska föreningarna baserades på tidigare forskning utförd av detta laboratorium, men med vissa modifieringar (Figur 1)11,12. Förloppet för varje reaktionssteg övervakades med IR-spektroskopi. Michael tillägg av REM-länkaren 1 med furfurylamin som gav polymerbunden 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Från föregående rapport producerade ISOC av 2 den tricykliska heterocykliska föreningen 3, vilket bekräftades av detekteringen av TMS-gruppen (IR 1214 cm-1). Detta är ett kritiskt steg i syntesen eftersom ISOC tillhandahöll den nödvändiga regio- och stereoselektiviteten hos produkterna. En hydroxylgruppssträckningsfrekvens på 3500 cm-1 observerades istället för frekvensen för TMS-funktionsgruppen. Detta kan bero på att den tricykliska föreningen är en övergående mellanprodukt som leder till det spirocykliska systemet.
Olika typer av REM-harts visade sig begränsa syntesen. Högbelastande polymer (1,00 mmol/g) förhindrade syntesen av spirocykliska föreningar innehållande skrymmande R2-sidokedjor. På grund av likheterna i de funktionella grupperna i hartser 4 och 5 var resultaten av IR ofullständiga. Framgången för detta steg kunde endast avgöras genom att försöka regenerera REM-länkaren (5 → 1). Regenerering inträffade inte i fall då en skrymmande R2-grupp tillsattes. Hartser med låg belastning (0,5 mmol/g eller lägre) rekommenderas för framgångsrik syntes. Denna syntesmetod överensstämmer med förfaranden som beskrivs i litteraturen.
Som ett preliminärt test utvecklades ett protokoll för en cytotoxicitetsanalys med användning av MTT. Under flera försök upptäcktes kritiska steg och begränsningar. För att resultaten skulle normaliseras över alla brunnar måste cellerna vara jämnt sådda över brunnar, vilket krävde mätning av cellkoncentrationen före sådd. Analysen krävde plattor med flatbottnade brunnar, eftersom absorbansen inte kunde läsas exakt från rundbottnade brunnar. Dessutom måste överskott av MTT som kvarstod efter inkubation avlägsnas för att förhindra störningar i avläsningarna utan att störa den olösliga formazan.
Absorbansen hos den upplösta formazanen bör läsas vid 590 nm. Nuvarande instrumentering i labbet krävde dock att man tog avläsningar vid 600 nm istället. Förvaring vid 0 °C visade sig vara viktigt för de kemikalier som används i testet (cisplatin, spirocykliska molekyler, furfurylamin). DMSO-en kemikalie med känd cytotoxicitet-användes som lösningsmedel för testföreningarna och användes för att göra utspädningar för testet. MTT-reagenset i sig måste framställas, eftersom det lagrades som ett pulver som behövde lösas och filtreras, eftersom olösliga partiklar störde avläsningarna.
Sammantaget är resultaten för denna analys avsedda att vara preliminära, eftersom endast ett litet antal molekyler testades. Ett uttömmande test med ett batteri av molekyler planeras, och ett fullständigt manuskript kommer att komma. Dessutom kan syntesen vara tillämplig för aminer härledda från pyrrol-2-karbaldehyd. I detta fall kan spirocykliska pyrrolidiner syntetiseras och testas för cytotoxiska effekter på cancercellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett bidrag från fakultetsforskningsrådet till K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. och J.F.M. är mottagare av Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. och B.M.R. är mottagare av STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi är tacksamma mot Dr. Matthew Berezuk och Dr. Philip Cox för vägledning om bioassays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
