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Medicine

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Wir stellen ein Protokoll für die Entwicklung und Verwendung eines oxidativen Stressmodells vor, indemwir retinale Pigmentepithelzellen mit H2O2behandeln und Zellmorphologie, Lebensfähigkeit, Dichte, Glutathion und UCP-2-Spiegel analysieren. Es ist ein nützliches Modell, um die antioxidative Wirkung von Proteinen zu untersuchen, die von Transposon-transfizierten Zellen sezerniert werden, um neuroretinale Degeneration zu behandeln.

Abstract

Oxidativer Stress spielt eine entscheidende Rolle bei mehreren degenerativen Erkrankungen, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Pathologie, von der weltweit etwa 30 Millionen Patienten betroffen sind. Es führt zu einer Abnahme der retinalen Pigmentepithel (RPE) -synthetisierten neuroprotektiven Faktoren, z. B. Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor (PEDF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), gefolgt vom Verlust von RPE-Zellen und schließlich dem Tod von Photorezeptoren und retinalen Ganglienzellen (RGC). Wir stellen die Hypothese auf, dass die Rekonstitution der neuroprotektiven und neurogenen netztinalen Umgebung durch die subretinale Transplantation von transfizierten RPE-Zellen, die PEDF und GM-CSF überexprimieren, das Potenzial hat, die Degeneration der Netzhaut zu verhindern, indem sie die Auswirkungen von oxidativem Stress mildert, Entzündungen hemmt und das Überleben der Zellen unterstützt. Mit dem Sleeping Beauty Transposon-System (SB100X) wurden menschliche RPE-Zellen mit den PEDF- und GM-CSF-Genen transfiziert und zeigten eine stabile Genintegration, langfristige Genexpression und Proteinsekretion mittels qPCR, Western Blot, ELISA und Immunfluoreszenz. Um die Funktionalität und Die Wirksamkeit der von den transfizierten RPE-Zellen sezernierten PEDF und GM-CSF zu bestätigen, haben wir einen In-vitro-Assay entwickelt, um die Reduktion vonH2O2-induziertemoxidativem Stress auf RPE-Zellen in Kultur zu quantifizieren. Der Zellschutz wurde durch die Analyse der Zellmorphologie, der Dichte, des intrazellulären Glutathionspiegels, der UCP2-Genexpression und der Zelllebensfähigkeit bewertet. Sowohl transfizierte RPE-Zellen, die PEDF und/oder GM-CSF überexprimieren, als auch Zellen, die nicht transfiziert, aber mit PEDF und/oder GM-CSF (kommerziell erhältlich oder aus transfizierten Zellen gereinigt) vorbehandelt wurden, zeigten im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen einen signifikanten antioxidativen Zellschutz. Das vorliegendeH2O2-Modellist ein einfacher und effektiver Ansatz zur Bewertung der antioxidativen Wirkung von Faktoren, die zur Behandlung von AMD oder ähnlichen neurodegenerativen Erkrankungen wirksam sein können.

Introduction

Das hier beschriebene Modell bietet einen nützlichen Ansatz, um die Wirksamkeit biopharmazeutischer Wirkstoffe zur Reduzierung von oxidativem Stress in Zellen zu bewerten. Wir haben das Modell verwendet, um die schützenden Wirkungen von PEDF und GM-CSF auf denH2O2-vermitteltenoxidativen Stress auf retinale Pigmentepithelzellen, die hohen Konzentrationen vonO2und sichtbarem Licht ausgesetzt sind, und die Phagozytose von Photorezeptor-Außensegmentmembranen zu untersuchen, wodurch signifikante Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt werden1. (2)Die Mitgliedstaaten sind der Ansicht, Sie gelten als hauptverursacher der Pathogenese der avaskulären altersbedingten Makuladegeneration (aAMD)3,4,5,6,7,8. Außerdem gibt es eine Abnahme der RPE-synthetisierten neuroprotektiven Faktoren, insbesondere des Pigmentepithel-abgeleiteten Faktors (PEDF), der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) und des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF), was zur Dysfunktion und zum Verlust von RPE-Zellen führt, gefolgt vom Tod durch Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC)3,4,5 . AMD ist eine komplexe Erkrankung, die aus der Wechselwirkung zwischen metabolischen, funktionellen, genetischen und Umweltfaktorenresultiert 4. Der Mangel an Behandlungen für aAMD ist die Hauptursache für Blindheit bei Patienten älter als 60 Jahre in Industrieländern9,10. Die Rekonstitution der neuroprotektiven und neurogenen Netzhautumgebung durch die subretinale Transplantation genetisch veränderter RPE-Zellen, die PEDF und GM-CSF überexprimieren, hat das Potenzial, eine Netzhautdegeneration zu verhindern, indem die Auswirkungen von oxidativem Stress gemildert, Entzündungen gehemmt und das Überleben der Zellen unterstütztwerden 11,12,13,14,15,16 . Obwohl es mehrere Methoden gibt, um Gene an Zellen zu liefern, haben wir das nicht-virale hyperaktive Dornröschen-Transposon-System gewählt, um die PEDF- und GM-CSF-Gene an RPE-Zellen zu liefern, aufgrund seines Sicherheitsprofils, der Integration der Gene in das Genom der Wirtszellen und seiner Neigung, die gelieferten Gene in nicht-transkriptionell aktive Stellen zu integrieren, wie wir zuvor gezeigt haben17. 18,19.

Zellulärer oxidativer Stress kann in Zellen induziert werden, die in vitrodurch mehrere oxidative Wirkstoffe kultiviert werden, einschließlich Wasserstoffperoxid(H2O2),4-Hydroynonenal (HNE), Tertbutylhydroperoxid (tBH), hohe Sauerstoffspannungen und sichtbares Licht (Vollspektrum- oder UV-Bestrahlung)20,21. Hohe Sauerstoffspannungen und Licht erfordern spezielle Geräte und Bedingungen, die die Übertragbarkeit auf andere Systeme einschränken. Wirkstoffe wieH2O2,HNE und tBH induzieren überlappende molekulare und zelluläre Veränderungen des oxidativen Stresses. Wir wählten H2O2,um die antioxidative Aktivität von PEDF und GM-CSF zu testen, weil es praktisch und biologisch relevant ist, da es von RPE-Zellen als reaktives Sauerstoffzwischenprodukt während der Photorezeptor-Phagozytose des äußeren Segments22 produziert wird und in Augengewebe in vivo gefunden wird 23. Da die Oxidation von Glutathion teilweise für die Produktion vonH2O2im Auge verantwortlich sein kann, haben wir in unseren Studien die GSH/Glutathion-Spiegel analysiert, die mitH2O2-induziertemoxidativem Stress und der Regenerationsfähigkeit der Zellenzusammenhängen 21,22. Die Analyse des Glutathionspiegels ist besonders relevant, da es an den antioxidativen Schutzmechanismen im Augebeteiligt ist 24. Die Exposition gegenüber H2O2wird häufig als Modell verwendet, um die Anfälligkeit für oxidativen Stress und die antioxidative Aktivität der RPE-Zellen1,25,26,27,28,29,30zuuntersuchen, und zeigt zusätzlich Ähnlichkeiten mit lichtinduzierten oxidativen Stressschäden, einer "physiologischen" Quelle von oxidativem Stress21.

Um die Funktionalität und Wirksamkeit neuroprotektiver Faktoren zu bewerten, haben wir ein In-vitro-Modell entwickelt, das die Analyse ermöglicht, um die antioxidative Wirkung von Wachstumsfaktoren zu quantifizieren, die von Zellen exprimiert werden, die genetisch verändert wurden, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Hier zeigen wir, dass RPE-Zellen, die mit den Genen für PEDF und GM-CSF transfiziert wurden, resistenter gegen die schädlichen Wirkungen von H2O2 sind als nicht-transfizierte Kontrollzellen, wie Zellmorphologie, Dichte, Lebensfähigkeit, intrazellulärer Glutathionspiegel und Expression des UCP2-Gens zeigen, das für das mitochondriale Entkopplungsprotein 2 kodiert, das nachweislich reaktive Sauerstoffspezies (ROS)reduziert 31.

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Protocol

Verfahren zur Entnahme und Verwendung menschlicher Augen wurden von der kantonalen Ethikkommission für Forschung (Nr. 2016-01726) genehmigt.

1. Zellisolierung und Kulturbedingungen

  1. Humane ARPE-19 Zelllinie
    1. Kultur 5 x 105 ARPE-19-Zellen, eine humane RPE-Zelllinie, in Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U/ml Penicillin, 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B (komplettes Medium) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 %CO2 und 95 % Luft in einem T75-Kolben (für andere Zelldichten siehe Tabelle 1).
    2. Wechseln Sie das Medium dreimal pro Woche.
    3. Sobald die Zellen zu etwa 90% Konfluenz gewachsen sind (qualitativ bewertet), aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit sterilem 1x PBS.
    4. Inkubieren Sie die Zellen mit einer 5% igen Trypsin-2% EDTA-Lösung für 7-10 min bei 37 °C (Volumina siehe Tabelle 1). Überwachen Sie die Ablösung visuell.
    5. Stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie ein komplettes Medium mit 10% FBS hinzufügen (für Volumes siehe Tabelle 1).
    6. Transfizieren Sie die Zellen (siehe Schritt 2 des Protokolls), subkultivieren Sie die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 (einmal pro Woche) oder säen Sie in eine 96-Well-Platte, wie unten beschrieben (siehe Schritte 3.3 und 3.4 des Protokolls).
Mittel (ml)
Fläche (cm²) Seeding-Dichte für ARPE-19 Zellen (Zellen/Well) Anwendung Für die Zellkultur So stoppen Sie Trypsin Volumen von Trypsin (ml)
Kolben T75 75 5,00,000 ARPE-19 Zellwachstum 10 7 3
6 Brunnenplatte 9.6 1,00,000 Seeding von transfizierten ARPE-19 Zellen 3 1 0.5
24 Brunnenplatte 2 50,000 Seeding von transfizierten hRPE-Zellen 1 0.8 0.2
96 Brunnenplatte 0.32 5.000 für oxidative Stressexperimente mit transfizierten Zellen (Abb. 1) Experimente mit oxidativem Stress 0.2
3.000 für oxidative Stressexperimente mit nicht-transfizierten Zellen plus Proteinen (Abb. 1)

Tabelle 1: Zellkulturvolumen. Empfohlene Medienvolumina für Zellkulturplatten und Kolben für die Kultur von ARPE-19 und primären menschlichen RPE-Zellen.

  1. Primäre menschliche RPE-Zellen
    1. Isolieren Sie primäre humane RPE-Zellen, wie von Thumann et al.17beschrieben, und kultivieren Sie Zellen in einem vollständigen Medium, das mit 20% FBS ergänzt wird.
    2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche. Sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben (visuell überwacht), reduzieren Sie FBS auf 1%, um ein Überwachsen zu vermeiden.
    3. Transfizieren Sie die Zellen (siehe Schritt 2 des Protokolls) oder setzen Sie sie in eine 96-Well-Platte, wie unten beschrieben (siehe Schritte 3.3 und 3.4 des Protokolls).
      HINWEIS: Die hier vorgestellten Daten stammen aus der Kultur von RPE-Zellen, die aus den Augen von vier menschlichen Spendern gewonnen wurden. Tabelle 2 zeigt die demographischen Daten der Spender der Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Die Augen wurden 12,7 ± 5,7 h (mittlere ± SD) post mortem enukleiert, nachdem die Einverständniserklärung gemäß der Erklärung von Helsinki eingeholt worden war.
Nein Alter Geschlecht Tod bis zur Erhaltung (Stunden) Tod durch Isolation Anbau Anbau Symbol in Der Grafik
(Tage) vor der Transfektion (Tage) nach Transfektion (Tage)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
bedeuten 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabelle 2: Demographie menschlicher Spender für retinale Pigmentepithelzellen.

2. Elektroporation von ARPE-19 und primären menschlichen RPE-Zellen

  1. Trypsinisieren Sie ARPE-19-Zellen oder primäre menschliche RPE-Zellen, wie in den Schritten 1.1.3-1.1.5 des Protokolls beschrieben.
  2. Führen Sie die Elektroporation mit dem handelsüblichen Transfektionskit durch (siehe Materialtabelle).
    1. Zur Transfektion von ARPE-19-Zellen siehe Johnen et al.32 und für primäre hRPE Thumann et al.17. Kurz gesagt, resuspend 1 x 105 ARPE-19 Zellen oder 5 x 104 primäre hRPE-Zellen in 11 μL R-Puffer und fügen Sie 2 μL Plasmidmischung mit 0,03 μg pSB100X Transposase33 und 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His oder pT2-CMV-GMCSF-His Transposon hinzu (Verhältnis Transposase:Transposon 1:16). Verwenden Sie für PEDF- und GM-CSF-Doppeltransfizierte Zellen ein Verhältnis von 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His und 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Verwenden Sie die folgenden Elektroporationsparameter: zwei Impulse von 1.350 V für 20 ms (Pulsbreite) für ARPE-19-Zellen; zwei Impulse von 1.100 V für 20 ms für Primärzellen.
  3. Samen 1 x 105 transfizierte ARPE-19 oder 5 x10 4 transfizierte primäre hRPE-Zellen in 6-Well- bzw. 24-Well-Platten, in Medium, ergänzt mit 10% FBS ohne Antibiotika oder Antimykotika. Fügen Sie Penicillin (80 U / ml), Streptomycin (80 μg / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml) mit dem ersten Medienaustausch 3 Tage nach der Transfektion hinzu.
  4. Bestimmen Sie das Zellwachstum durch wöchentliche mikroskopische Überwachung der Zellen. Die Transfektionseffizienz wird durch die Analyse der Genexpression mittels RT-PCR und der Proteinsekretion durch ELISA und WB (Methoden, die in Supplementary Materialerläutert werden) überwacht.
    HINWEIS: Die Transfektionseffizienz kann zum ersten Mal bewertet werden, sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben, d.h. nach ~ 7 Tagen bzw. 4 Wochen nach der Transfektion für ARPE-19-Zellen bzw. primäre hRPE-Zellen.
  5. Samenzellen in einer 96-Well-Platte, wie unten beschrieben (siehe Schritt 3.5 des Protokolls).

3. Induktion vonoxidativem Stress (H2O2-Behandlung) und Neuroprotektion (PEDF- und/oder GM-CSF-Behandlung)

  1. Herstellung eines konditionierten Mediums aus transfizierten ARPE-19-Zellen
    1. Verwenden Sie ARPE-19-Zellen, die mit den Genen PEDF, GM-CSF oder beidem transfiziert sind (siehe Schritt 2 des Protokolls); Kulturzellen für 28 Tage, wie in Schritt 1.1 des Protokolls beschrieben.
    2. Nach 28 Tagen nach der Transfektion trypsinisieren sie die Zellen (siehe Schritte 1.1.3-1.1.5 des Protokolls), zählen die Zellen unter Verwendung einer Neubauer-Kammer34,35und seeden 5 x 10 5 Zellen in T75-Kolben in vollständigem Medium, wie in Schritt 1.1.1 des Protokolls beschrieben. Tauschen Sie das Medium aus, wenn die Zellkultur zu ca. 80% konfluent ist (ca. nach 1 Woche; qualitativ verifiziert). Sammeln Sie das Medium nach 24 h.
    3. Lagern Sie das Medium bis zum Gebrauch bei -20 °C.
      ANMERKUNG: Die ausreichende Konzentration des rekombinanten PEDF und DES GM-CSF im konditionierten Medium wurde durch WB nachgewiesen und mittels ELISA quantifiziert, wie unter Ergänzendes Materialbeschrieben.
  2. Reinigung von PEDF und GM-CSF aus konditioniertem Medium transfizierter ARPE-19-Zellen
    1. Zentrifugieren Sie das gesammelte Medium aus Schritt 3.1.2 bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
    2. Verwenden Sie den Ni-NTA-Superflow (siehe Materialtabelle)gemäß den Protokollen des Herstellers, um His-markierte Proteine wie unten beschrieben zu reinigen.
      1. 30 μL Ni-NTA-Gemisch in ein 1,5-ml-Röhrchen pipettieren und bei 2.600 x g für 30 s zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 200 μL 1x Inkubationspuffer.
      2. Zentrifugiere bei 2.600 x g für 30 s und entsorge den Durchfluss. Fügen Sie 40 μL 4x Inkubationspuffer hinzu und resuspendieren Sie.
      3. 900 μL zentrifugiertes konditioniertes Medium zugeben und bei 70 U/min (Orbitalschüttler) für 1 h RT inkubieren. Zentrifuge bei 2.600 x g für 1 min und den Discard-Durchfluss.
      4. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 175 μL 1x Inkubationspuffer. Zentrifugiere bei 2.600 x g für 30 s und entsorge den Durchfluss.
      5. Um His-tagged PEDF- und GM-CSF-Proteine zu eluieren, fügen Sie 20 μL Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie bei 70 U / min (Orbital-Shaker) für 20 min bei RT. Zentrifuge bei 2.600 x g für 30 s. Bewahren Sie den Überstand auf, der rekombinantes PEDF oder GM-CSF enthält.
    3. Quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit dem handelsüblichen BCA-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Die Proteinlösung wird bis zur Anwendung bei -20 °C gelagert.
      ANMERKUNG: Inkubationspuffer (4x) enthält 200 mMNaH2PO4,1,2 M NaCl und 40 mM Imidazol; Elutionspuffer enthält 50 mMNaH2PO4,300 mM NaCl und 250 mM Imidazol.
  3. Behandlung von nicht-transfizierten ARPE-19/primären hRPE-Zellen mit konditioniertem Medium plusH2O2(Abbildung 1A)
    1. Säen Sie 3.000 nicht transfizierte ARPE-19 (aus Schritt 1.1.6 des Protokolls) oder primäre hRPE-Zellen (aus Schritt 1.2.3 des Protokolls) pro Vertiefung in 96-Well-Platte und Kultur in 200 μL konditioniertem Medium aus transfizierten ARPE-19-Zellen.
    2. Kultivieren Sie die Zellen für 10 Tage bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 und 95% Luft. Wechseln Sie das konditionierte Medium jeden Tag. Setzen Sie die Zellen 24 h lang 350μMH2O2 aus.
    3. Bewerten Sie oxidative Stressschäden und bestimmen Sie die antioxidative Wirkung von PEDF und GM-CSF durch Quantifizierung der Glutathionspiegel (siehe Schritt 4.1 des Protokolls), der Mikroskopie (siehe Schritt 4.2 des Protokolls) und des Zytotoxizitätstests (siehe Schritt 4.2 des Protokolls).
      HINWEIS: Die Dauer des Experiments beträgt 12 Tage. Klare Mikrotiterplatten mit flachem Boden werden verwendet, um die Lumineszenz sowie die Zellmorphologie zu bewerten. Um den Zytotoxizitäts- und Glutathion-Assay gleichzeitig durchzuführen, müssen zwei Platten am selben Tag mit Zellen ausgesät werden.
  4. Behandlung von nicht-transfizierten ARPE-19/primären hRPE-Zellen mit PEDF- und GM-CSF-Wachstumsfaktoren plusH2O2(Abbildung 1B)
    1. Säen Sie 3.000 nicht transfizierte ARPE-19 (aus Schritt 1.1.6 des Protokolls) oder primäre hRPE-Zellen (aus Schritt 1.2.3 des Protokolls) pro Vertiefung (96-Well-Platten mit einem klaren flachen Boden) in 200 μL vollständigem Kulturmedium mit 500 ng/ml rekombinantem PEDF und/oder 50 ng/ml rekombinantem GM-CSF, gereinigt aus dem Medium transfizierter ARPE-19-Zellen oder kommerziell erhältlich. Kulturzellen für 48 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 und 95% Luft. Erneuern Sie das Medium einschließlich PEDF- und GM-CSF-Wachstumsfaktoren täglich.
      HINWEIS: Fügen Sie die Wachstumsfaktoren frisch zum Medium hinzu.
    2. Nach 48 h Behandlung der Zellen mit den Wachstumsfaktoren wird das Medium entfernt und ein komplettes Medium mit 350 μMH2O2plus 500 ng/mL PEDF und/oder 50 ng/mL GM-CSF zugegeben.
    3. Bewerten Sie oxidative Stressschäden und bestimmen Sie die antioxidative Wirkung von PEDF und GM-CSF durch Quantifizierung der Glutathionspiegel (siehe Schritt 4.1 des Protokolls), der Mikroskopie (siehe Schritt 4.2 des Protokolls) und des Zytotoxizitätstests (siehe Schritt 4.2 des Protokolls).
      HINWEIS: Die Dauer des Experiments beträgt 3 Tage.
  5. Behandlung von transfizierten ARPE-19/primären hRPE-Zellen mitH2O2( Abbildung 1C)
    1. Überprüfung einer ausreichenden Genexpression und Proteinsekretion transfizierter Zellen mittels WB und ELISA, wie im Ergänzungsmaterialbeschrieben.
    2. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen, die die transfizierten Zellen enthalten (siehe Schritt 2 des Protokolls).
    3. Trypsinisieren Sie Zellen wie in den Schritten 1.1.3-1.1.5 des Protokolls beschrieben. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer34,35.
    4. Säen Sie 5.000 transfizierte Zellen / Well in 96-Well-Platte in 200 μL komplettem Medium. Kulturzellen für 24 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 und 95% Luft. Nach 24 h werden die Zellen 24h lang 350 μMH2O2 ausgesetzt.
    5. Bewerten Sie oxidative Stressschäden und bestimmen Sie die antioxidative Wirkung von PEDF und GM-CSF durch Quantifizierung der Glutathionspiegel (siehe Schritt 4.1 des Protokolls), Mikroskopie (siehe Schritt 4.2 des Protokolls), Zytotoxizitätstest (siehe Schritt 4.2 des Protokolls) und Bestimmung der UCP2-Genexpression (siehe Schritt 4.3 des Protokolls).
      HINWEIS: Die Dauer des Experiments beträgt 2 Tage.

Figure 1
Abbildung 1: Zeitlinien des H2O2-Assays in den drei verschiedenen experimentellen Ansätzen. 3.000 nicht transfizierte Zellen, die mit den konditionierten mediums/rekombinanten Proteinen behandelt wurden, oder 5.000 transfizierte Zellen wurden zur Behandlung mitH2O2in 96-Well-Platten ausgesät. Um die Wirkung des konditionierten Mediums zu bestimmen, wurden die Zellen an 10 aufeinanderfolgenden Tagen in 100% kultiviertem Medium kultiviert, wobei das Medium jeden Tag gewechselt wurde. Um die Wirkung rekombinanter Wachstumsfaktoren zu bestimmen, wurden die Zellen kultiviert, indem an 3 aufeinanderfolgenden Tagen täglich die entsprechende Menge an Wachstumsfaktoren hinzugefügt wurde. Beachten Sie, dass nicht transfizierte Zellen mit 3.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät wurden, um ein Überwachsen während der längeren Kulturdauer im Vergleich zu transfizierten Zellen zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Analyse des oxidativen Stressniveaus und der antioxidativen Kapazität

  1. Glutathion-Assay
    1. Messen Sie den Glutathionspiegel (GSH) mit dem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz vorbereiten und entsprechendes Volumen von 1x Reagenzmischung (100 μL Reagenz/Well) anfertigen: Luciferin-NT-Substrat und Glutathion-S-Transferase verdünnt 1:100 im Reaktionspuffer.
      HINWEIS: Eine 96-Well-Platte benötigt 10 ml 1x Reagenzmischung, die durch Zugabe von 100 μL Luciferin-NT-Substrat und 100 μL Glutathion-S-Transferase zu 10 ml Reaktionspuffer hergestellt wird. Bereiten Sie die 1x Reagenzmischung unmittelbar vor Gebrauch vor. Lagern Sie die vorbereitete Reagenzmischung nicht für die zukünftige Verwendung.
    2. Bereiten Sie das Luciferin-Detektionsreagenz vor, indem Sie eine Flasche Rekonstitutionspuffer auf das lyophilisierte Luciferin-Detektionsreagenz geben.
    3. Bereiten Sie eine Standardkurve mit einer Glutathion (GSH) Standardlösung (5 mM) vor. Verdünnen Sie 5 mM GSH-Lösung 1:100 mit dH2O (fügen Sie 10 μL 5 mM GSH-Lösung zu 990 μLdH2O hinzu). 7 serielle 1:1-Verdünnung in 500 μLdH2O durchführen. 10 μL jedes verdünnten Standards in doppelter Duplikation in eine geeignete Vertiefung überführen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von Glutathion liegt zwischen 0,039 μM und 5 μM.
    4. Bereiten Sie den Rohling (1x Reagenzienmischung) vor und geben Sie 10 μL (Duplikate) in die entsprechenden Vertiefungen.
    5. Entfernen Sie diemitH2O2behandelten Zellen aus dem Inkubator.
      HINWEIS: Dokumentieren Sie die Morphologie der H2O2-behandelten Zellen durch Hellfeldmikroskopie (40x).
      Wenn die Zellen oxidiert sind, sehen sie abgerundeter und weniger ausgebreitet aus.
    6. Das Kulturmedium vorsichtig absaugen. Fügen Sie 100 μL vorbereitete 1x Reagenzmischung zu jeder Vertiefung hinzu. Mischen Sie die Zellen mit dem Reagenz für 15 s bei 500 U / min auf einem Orbitalschüttler.
    7. Die Platte bei RT für 30 Min. inkubieren. Zu jeder Vertiefung werden 100 μL rekonstituiertes Luciferin-Detektionsreagenz gegeben.
    8. Mischen Sie die Lösung für 15 s bei 500 U / min auf einem Orbitalschüttler. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT.
    9. Bestimmen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenleser mit einem vorinstallierten Programm ADP-Glo.
      HINWEIS: Legen Sie die Platte ohne Deckel in den Plattenleser.
      1. Klicken Sie auf Layout ändern und wählen Sie die folgenden Einstellungen unter Grundparameter:Costar 96-well Platte; Top-Optik; Positionierungsverzögerung: 0,1; Startzeit der Messung: 0,0; Messintervallzeit: 1,0; Zeit zum Normalisieren der Ergebnisse: 0,0; die Verstärkung wird vom Gerät automatisch angepasst. Definieren Sie Rohlinge, Standards und Muster. Klicken Sie auf Messung starten.
      2. Exportieren Sie die Daten als Excel-Datei. Berechnen Sie die Konzentration von GSH in jeder Probe durch Interpolation der Standardkurve.
  2. Zytotoxizitätstest und mikroskopische Analyse
    1. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und geben Sie 100 μL vollständiges Medium, das 1% FBS enthält, zu jeder Vertiefung hinzu. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück.
      HINWEIS: 1% FBS wird verwendet, da höhere Prozentsätze von FBS die Messung der Lumineszenz stören können, daher wird in diesem Fall 1% FBS verwendet.
    2. Messen Sie die Zelllebensfähigkeit mit dem handelsüblichen Zytotoxizitäts-Assay-Kit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie kurz die Reagenzmischung vor und fügen Sie den Assay-Puffer zum lyophilisierten Substrat hinzu. Bereiten Sie das Lysereagenz vor, indem Sie 33 μL Digitonin zu 5 ml Assay-Puffer (für eine 96-Well-Platte) hinzufügen. Mischen Sie gut, indem Sie nach oben und unten pipettieren, um Homogenität zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für optimale Ergebnisse verwenden Sie frisch zubereitete Reagenzienmischung. Reagenzienmischung kann bei 4 °C bis zu 7 Tage gelagert werden und kann bis zu 7 Tage in Einweg-Aliquots bis zu 4 Monate bei -70 °C gelagert werden. Einfrieren und Auftauen müssen vermieden werden. Das Lysis Reagenz kann bei 4 °C bis zu 7 Tage gelagert werden.
    3. Bereiten Sie eine Standardkurve mit unbehandelten ARPE-19-Zellen vor.
      1. Trypsinisieren Sie die Zellen wie in den Schritten 1.1.3-1.1.5 des Protokolls beschrieben und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer34,35. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 120 g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in DMEM/Hams F12-Medium, das 1% FBS enthält, auf eine Endkonzentration von 1 x 105 Zellen/ml.
      2. 7 serielle 1:1-Verdünnungen in 200 μL Medium mit 1% FBS herstellen. Übertragen Sie 100 μL jedes Standards in die entsprechenden Vertiefungen (Duplikate). Fügen Sie 50 μL Reagenzmischung zu allen Vertiefungen hinzu.
    4. Mischen Sie die Zellen mit dem Reagenz für 15 s bei 500 U / min auf einem Orbitalschüttler. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT. Messen Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, wie in Schritt 4.1.9 des Protokolls beschrieben. 50 μL des Lysereagenzes zugeben und 15 min inkubieren. Messen Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser wie in Schritt 4.1.9 des Protokolls beschrieben.
    5. Berechnen Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen: (100 - % tote Zellen) und den Prozentsatz der toten Zellen = [1. Lumineszenzmessung ((tote Zellen in der Probe))/ 2. Lumineszenzmessung (alle Zellen tot nach Digitoninbehandlung)] x 100.
  3. UCP2-Expressionsanalyse mittels RT-qPCR
    1. Trypsinisieren Sie infizierte Zellen wie oben beschrieben (Schritte 1.1.3-1.1.5 des Protokolls).
    2. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer34,35.
    3. Säen Sie 5.000 transfizierte ARPE-19-Zellen / Well in 96-Well-Platten.
    4. Nach 24 h Kultur werden die Zellen mit 350 μMH2O2für24 h behandelt.
    5. Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einem kommerziellen Kit zur Isolierung von RNA aus einer geringen Anzahl von Zellen (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    6. Führen Sie eine quantitative Real-Time-PCR (RT-qPCR) durch, wie unter Ergänzendes Materialbeschrieben. Kurz gesagt, erzeugen Sie cDNA durch Retrotranskription unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Mischung, die eine optimierte M-MLV Reverse Transkriptase enthält (siehe Tabelle der Materialien).
    7. Für die qPCR ist ein gebrauchsfertiger Reaktionscocktail zu verwenden, der alle Komponenten (einschließlich SYBR Green) mit Ausnahme der Primer (siehe Tabelle S1 des Ergänzungsmaterials)und der DNA-Vorlage enthält. Verwenden Sie die folgenden Thermocycling-Bedingungen: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min, 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 60 °C für 30 s und Dehnung bei 72 °C für 32 s.
    8. Verwenden Sie die 2^(-ΔΔCT)-Methode für die Analyse36.
  4. Herstellung von Zelllysat für die SDS-PAGE- und WB-Analyse von pAkt (Ser473)
    1. Säen Sie 3 x 105 GM-CSF-transfizierte ARPE-19-Zellen/Well in 6-Well-Platten (≥21 Tage nach der Transfektion), um festzustellen, ob GM-CSF RPE-Zellen durch die Aktivierung des Akt-Überlebensweges vor Schäden durchH2O2 schützt15.
    2. Nach 24 h Kultur werden die Zellen 24h lang 350 μMH2O2 ausgesetzt.
    3. Mischen Sie 1 ml RIPA-Puffer mit 10 μL Proteasephosphatase-Inhibitor-Cocktail, 10 μL 0,5 M EDTA und 25 μL 8 M Harnstoff (Volumen, die für eine Vertiefung verwendet werden).
    4. Medium vorsichtig absaugen und die Zellen mit 1x PBS waschen.
    5. Fügen Sie das gesamte Volumen der RIPA-Puffermischung zu den Zellen hinzu.
    6. Pipetten Sie auf und ab.
    7. Sammeln Sie das Lysat in 1,5 ml Röhrchen.
    8. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C.
    9. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-ml-Rohr.
    10. Bestimmen Sie die pAkt-Spiegel in 15 μL unverdünntem Zelllysat durch WB, wie in Ergänzungsmaterialbeschrieben.

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Representative Results

Induktion von oxidativem Stress in menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen
ARPE-19 und primäre hRPE-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen vonH2O2für 24 h behandelt und der intrazelluläre Spiegel des Antioxidans Glutathion quantifiziert (Abbildung 2A,B). H2O2 bei 50 μM und 100 μM hatte keinen Einfluss auf die Glutathionproduktion, während bei 350 μM eine signifikante Abnahme von Glutathion in ARPE-19 und primären hRPE-Zellen zu verzeichnen war. Die Analyse der Zytotoxizität zeigte, dass 350 μM die niedrigste Konzentration vonH2O2ist, die eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit verursacht (Abbildung 2C). Morphologisch erscheinen ARPE-19-Zellen, die mitH2O2behandeltwurden, weniger verbreitet und abgerundeter, Eigenschaften, die mit zunehmenderH2O2-Konzentrationdeutlicher werden ( Abbildung3). Der Effekt war bei PEDF- und GM-CSF-transfizierten Zellen, die mitH2O2behandeltwurden, weniger ausgeprägt (Abbildung 3). Um die Wirkung der Zellzahl aufH2O2-vermitteltenoxidativen Stress zu demonstrieren, wurden 5.000 und 10.000 ARPE-19-Zellen pro Vertiefung in eine weiße 96-Well-Platte gesät; Am Tag danach wurden die Zellen24h lang mit 350μM H2O2 behandelt und die Glutathionspiegel bestimmt. Abbildung 4 zeigt, dass der Glutathionspiegel nur in den Vertiefungen (n = 3) mit 5.000 Zellen erniedrigt wurde. Für Experimente zur Bestimmung der Wirkung von Antioxidantien vonH2O2-erzeugtemROS ist es wichtig, die Anzahl der Zellen zu berücksichtigen; Für das in diesem Bericht vorgestellte spezifische Protokoll sind 3.000-5.000 Zellen/Well (96-Well-Platten), die 24 h mit 350 μMH2O2behandelt wurden, geeignet, signifikante Zellschäden zu zeigen und gleichzeitig die Fähigkeit zu erhalten, eine subakute Reaktion auf oxidativen Stress-induzierte Zellschäden nachzuahmen.

Figure 2
Abbildung 2: Oxidativer Stresslevel, nachgewiesen als Glutathionspiegel und Zelllebensfähigkeit, in menschlichen RPE-Zellen, die mitH2O2behandeltwurden. (A) ARPE-19-Zellen, die bei mehreren Konzentrationen vonH2O2 exponiert wurden, zeigten signifikant erniedrigte Glutathionspiegel (in Klammern) bei 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) und 700 μM (0,002 μM) im Vergleich zuH2O2-unbehandelten Zellen (2,9 μM) (p < 0,0001 für 350, 500 und 700 μMH2O2). (B) Primäre menschliche RPE-Zellen zeigten verminderte Glutathionspiegel; Der Effekt war jedoch weniger ausgeprägt als bei ARPE-19, aber im Vergleich zu den Kontrollen bei 350,500 und 700 μMH2O2immer noch statistisch signifikant. 350 μM war die niedrigsteH2O2-Konzentration,die signifikante oxidative Schäden verursachte, wie verminderte Glutathionspiegel im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollzellen zeigten (p = 0,0022). Der Glutathionspiegel nahmmit steigenden H2O2-Konzentrationen ab (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) Die Zytotoxizitätsanalyse zeigte, dass 350 μMH2O2die niedrigste Konzentration war, die eine signifikante Abnahme des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen bewirkte (p < 0,0001 für 350, 500 und 700 μM). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 Replikate) dargestellt und signifikante Unterschiede sind mit (*) angegeben. Post-hoc-Berechnungen der ANOVA wurden unter Verwendung des Tukey-Multivergleichstests durchgeführt, bei dem C- mit denH2O2-Behandlungsgruppenverglichen wurde. C-:H2O2unbehandelte Zellen. Diese Zahl wurde von Bascuas et al.37modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Morphologie von nicht-transfizierten und PEDF- oder GM-CSF-transfizierten ARPE-19-Zellen, die mitH2O2behandeltwurden. Zellen, die mit steigenden Konzentrationen vonH2O2behandeltwerden, zeigen weniger Zellen in den Kulturtöpfen und zeigen eine abgerundetere, weniger verbreitete Morphologie, ein bekanntes Zeichen von zellulärem Stress. Beachten Sie, dass bei PEDF- oder GM-CSF-transfizierten Zellen der zelluläre Stress weniger ausgeprägt ist und ähnlich wie bei nicht behandelten Kontrollzellen wächst. C-: unbehandelte Kontrollzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Einfluss der Zellzahl auf die Wirkung von H2O2-induziertem oxidativem Stress. 5.000 und 10.000 ARPE-19-Zellen / Well wurden in 96-Well-Platten ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen24h lang mit 350μM H2O2 behandelt. Signifikante Unterschiede in den Glutathionspiegeln wurden in den mit 5.000 Zellen ausgesäten Vertiefungen beobachtet (p = 0,031, t-Test),nicht jedoch in den mit 10.000 Zellen ausgesäten Vertiefungen. C-: unbehandelte Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Analyse der antioxidativen Wirkung von PEDF und GM-CSF durch SB100X-transfiziertemenschliche RPE-Zellen unter oxidativen Stressbedingungen
Als Positivkontrollen wurden ARPE-19 und primäre humane RPE-Zellen mit 5, 50 oder 500 ng/ml kommerziell erhältlichem PEDF oder GM-CSF für 2 Tage vor und während der 24 h H2O2 Behandlung behandelt. ARPE-19-Zellen, die mit 500 ng/ml PEDF oder 50 ng/ml GM-CSF behandelt wurden, produzierten signifikant mehr Glutathion im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen unter oxidativenBedingungen(H2O2-behandelt)(Abbildung 5A); vergleichbare PEDF und GM-CSF, die aus Kulturmedien transfizierter ARPE-19-Zellen gereinigt wurden, zeigten eine ähnliche Wirkung (Abbildung 5B). In primären hRPE-Zellen reduzierte die Zugabe von 500 ng/ml PEDF, 50 ng/ml GM-CSF oder 500 ng/ml PEDF plus 50 ng/ml GM-CSF, ob kommerziell oder gereinigt aus Medien, die durch PEDF- oder GM-CSF-transfizierte ARPE-19-Zellen konditioniert wurden, die Zellschädigung, was sich in einem signifikanten Anstieg der Glutathionspiegel widerspiegelt (Abbildung 5C). Primäre hRPE-Zellen, die 10 Tage lang mit konditioniertem Medium aus transfizierten ARPE-19-Zellen behandelt wurden, zeigten ebenfalls höhere Glutathionspiegel im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 5D). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden weitere Experimente mit 500 ng/ml für PEDF und 50 ng/ml für GM-CSF durchgeführt.

ARPE-19- und primäre hRPE-Zellen wurden mit den Genen, die für PEDF und/oder GM-CSF kodieren, unter Verwendung des Sleeping Beauty Transposon-Systems in Kombination mit Elektroporation transfiziert. Nach Transfektion und Analyse der Genexpression mittels RT-qPCR, WB, ELISA und Immunhistochemie (siehe Ergänzungsmaterial, Abbildung S1und Abbildung S2) zeigten transfizierte ARPE-19-Zellen, die24h lang bei 350 μMH2O2 exponiert wurden, signifikant höhere Glutathionspiegel als nicht transfizierte H2O2-behandelte Zellen(Abbildung 6A ). Für primäre hRPE-Zellen gibt es einen signifikanten Anstieg der Glutathionspiegel in PEDF-transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen, die mit H2O2 behandelt wurden, wenn alle Spender in die Analyse einbezogen wurden. Darüber hinaus zeigen die Spender 2 und 3 einen signifikanten Anstieg der Glutathionspiegel für alle transfizierten Gruppen (PEDF, GM-CSF, PEDF und GM-CSF) (Daten nicht gezeigt).

Die Untersuchung der UCP2-Genexpression vervollständigte die Analyse durch die Untersuchung des mitochondrialen oxidativen Stresses. Eine Proof-of-Concept-Serie wurde in transfizierten ARPE-19-Zellen durchgeführt, die mit 350 μMH2O2für24 h behandelt wurden. Wie in Abbildung 7gezeigt, sind in transfizierten ARPE-19-Zellen die Spiegel der UCP2-Genexpression nachH2O2-Behandlungerhöht, aber der Anstieg ist statistisch nicht signifikant. Abbildung 8 zeigt ein WB von phosphoryliertem Akt (pAkt) aus einem Lysat von GM-CSF-transfizierten Zellen, dieH2O2ausgesetztwaren; Die normalisierten Daten zeigen nur eine geringe Abnahme im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, was darauf hindeutet, dass GM-CSF die Zellen vor oxidativen Stressschäden schützen kann.

Figure 5
Abbildung 5: Glutathionspiegel als Marker für die antioxidative Kapazität von PEDF und GM-CSF. (A) Die Behandlung von ARPE-19-Zellen mit 500 ng/ml PEDF oder 50 ng/ml GM-CSF für 3 Tage vor und während 24 hH2O2-Expositionerhöhte den Glutathionspiegel von 0,83 μM (C) auf 1,83 μM (PEDF) und 1,3 μM (GM-CSF), p = 0,026 bzw. p = 0,031. Bei einer Konzentration von 5 ng / ml wurde kein Anstieg von Glutathion beobachtet; Der Unterschied im Glutathionspiegel zwischen 50 und 500 ng/ml war weder für PEDF noch für GM-CSF signifikant. (B)PEDF (500 ng/ml) und GM-CSF (50 ng/ml), die aus konditionierten Medien transfizierter ARPE-19-Zellen gereinigt wurden, zeigten eine ähnliche Wirkung wie kommerziell erhältliches PEDF oder GM-CSF (p = 0,018, ANOVA). (C) Die Zugabe von 500 ng/ml PEDF, 50 ng/ml GM-CSF oder 500 ng/ml PEDF plus 50 ng/ml GM-CSF für 3 Tage vor und während der 24 hH2O2-Behandlungzum Kulturmedium primärer hRPE-Zellen erhöhte signifikant die Glutathionspiegel in mit PEDF behandelten Zellen (2,6 μM [kommerziell], 2,5 μM [gereinigt]), GM-CSF (2,9 μM [kommerziell], 3,3 μM [gereinigt]) und PEDF plus GM-CSF (3,0 μM [kommerziell], 2,9 μM [gereinigt]) im Vergleich zu unbehandelten Zellen (1,9 μM) (p = 0,006, Kruskal-Wallis-Test). (D) Ein signifikanter Anstieg der Glutathionspiegel wurde für hRPE-Zellen beobachtet, die 10 Tage lang in konditioniertem Medium aus PEDF-, GM-CSF- oder PEDF-GM-CSF-transfizierten ARPE-19-Zellen kultiviert wurden, bevor die Zellen mit H2O2behandelt wurden (p = 0,003, Kruskal-Wallis-Test) (Daten für einen Spender gezeigt). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 Replikate) ausgedrückt. Signifikante Unterschiede sind mit (*) gekennzeichnet; Post-hoc-Berechnungen der Varianzanalysen wurden durchgeführt, indem Tukeys oder Dunnetts Multi-Vergleichstests berechnet wurden, die "C" mit den PEDF-/GM-CSF-behandelten Gruppen verglichen. C: Zellen, die nur mitH2O2behandeltwurden,P: Zellen, die mit PEDF behandelt wurden, G: Zellen, die mit GM-CSF behandelt wurden, P+G: Zellen, die mit PEDF plus GM-CSF behandelt wurden. Diese Zahl wurde von Bascuas et al.37modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Glutathionspiegel als Marker für die antioxidative Kapazität von PEDF- und GM-CSF-transfizierten menschlichen RPE-Zellen. (A) Die Glutathionspiegel transfizierter ARPE-19-Zellen, die24h (56 Tage nach der Transfektion) 350 μM H2O2 ausgesetzt waren, waren im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen (1,9 μM) signifikant höher, d.h. 3,0 μM für PEDF- und GM-CSF-transfizierte Zellen, und 3,4 μM für doppelt transfizierte Zellen (p = 0,0001, ANOVA). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 Replikate) ausgedrückt. (B) Das Punktdiagramm zeigt die mittleren Glutathionwerte für vier verschiedene Donatoren (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), die sich signifikant zwischen nicht-transfizierten und PEDF-transfizierten Zellen unterscheidet (p = 0,028, Post-hoc-Berechnungen der ANOVA wurden mit Tukeys Multi-Vergleichstests durchgeführt, die "C" mit den PEDF-/GM-CSF-behandelten Gruppen verglichen). Wenn die Spender getrennt analysiert werden, zeigen Spender Nr. 2 und Nr. 3 (siehe Tabelle 2 für Symbol in der Grafik) signifikante Unterschiede für alle transfizierten Gruppen im Vergleich zu der nicht-transfizierten Kontrolle (Signifikanzen sind nicht gezeigt), die mitH2O2behandelt wurde. C: nicht-transfizierte Zellen, P: PEDF-transfizierte Zellen, G: GM-CSF-transfizierte Zellen, P+G: PEDF- und GM-CSF-transfizierte Zellen. Diese Zahl wurde von Bascuas et al.37modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: UCP2-Genexpression in transfizierten ARPE-19-Zellen, die mitH2O2behandeltwurden. Da die UCP2-Genexpression zur Untersuchung mitochondrialer oxidativer Schäden verwendet werden kann, untersuchten wir den Effekt der Überexpression von PEDF und GM-CSF durch transfizierte ARPE-19-Zellen. Transfizierte ARPE-19-Zellen, die mitH2O2behandeltwurden,zeigen, obwohl statistisch nicht signifikant, eine erhöhte UCP2-Genexpression im Vergleich zur nicht-transfizierten Kontrolle, was auf eine oxidative Stressreduktion hinweist, der Faltenanstieg betrug 1,57 für PEDF-, 1,51 für GM-CSF- und 2,36 für PEDF- plus GM-CSF-transfizierte Zellen im Vergleich zur nicht-transfizierten Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Western Blot phosphorylierter Akt (Ser473) aus einem Zelllysat von GM-CSF-transfizierten ARPE-19 Zellen. Die WB zeigte, dass GM-CSF die Phosphorylierung von Akt sowohl in unbehandelten als auch inH2O2-behandeltenKulturen verstärkt (UT: 3,32; H2O2: 2,69). Die Werte werden auf nicht-transfizierte nicht-H2O2-behandelteZellen (C/UT) normiert. C: nicht transfizierte, G: GM-CSF-transfizierte Zellen, UT: zellen,die nicht mitH2O2behandeltwurden,H2O2: Zellen, die mitH2O2behandeltwurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle S1: Primerpaarsequenzen und Glühzeit/-temperatur für RT-qPCR. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. 

Abbildung S1: PEDF- und GM-CSF-Genexpressionsanalyse in transfizierten hRPE-Zellen. Die RT-qPCR bestätigte, dass transfizierte primäre hRPE-Zellen einen signifikanten Anstieg der PEDF-Genexpression (p = 0,003, Kruskal-Wallis-Test) und GM-CSF (p = 0,013, Kruskal-Wallis-Test) im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen zeigten. In diesem Fall wurde die 2^(-ΔΔCT)-Methode verwendet36. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 4 Spender) ausgedrückt. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt von drei Replikaten dar. Diese Zahl wurde von Bascuas et al.37modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Proteinsekretion in transfizierten primären hRPE- und ARPE-19-Zellen. (A) Die Quantifizierung sezernierter Proteine mittels ELISA zeigte, dass transfizierte hRPE-Zellen signifikant mehr PEDF und GM-CSF sezernierten als nicht-transfizierte Zellen (p = 0,014 für PEDF und p = 0,006 für GM-CSF, Kruskal-Wallis-Test). Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 4 Spender) dargestellt. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt von drei Replikaten dar. (B) Die PEDF-GM-CSF-Doppelfärbung bestätigte die Co-Sekretion von PEDF und GM-CSF in doppelt transfizierten ARPE-19-Zellen (zusammengeführte Abbildung). Diese Zahl wurde von Bascuas et al.37modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Material. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen Ansatz zur Analyse der antioxidativen und schützenden Funktion von PEDF und GM-CSF, die von transfizierten Zellen produziert werden, die auf Zellen angewendet werden können, die mit jedem vermeintlich vorteilhaften Gen transfiziert sind. Bei gentherapeutischen Strategien, die das Ziel haben, Proteine durch Transplantation genetisch veränderter Zellen an Gewebe abzugeben, ist es wichtig, Informationen über das Niveau der Proteinexpression, die Langlebigkeit der Expression und die Wirksamkeit des exprimierten Proteins in einem Modell der Krankheit zu erhalten. In unserem Labor war das hier vorgestellte Protokoll nützlich, um die Wirksamkeit von PEDF und GM-CSF auf oxidativen Stress zu definieren, der als wichtiges Element in der Pathogenese von aAMD6,7vermutet wurde. Insbesondere haben wir das Protokoll verwendet, um die antioxidative Wirkung von SB100X-vermitteltenPEDF / GM-CSF-transfizierten primären hRPE-Zellen zu definieren. Mehrere Forscher haben gezeigt, dassH2O2signifikante Symptome von oxidativem Stress induziert, aber immer noch die Zellregeneration28,29,38ermöglicht, ähnlich den Ergebnissen unserer Experimente, die gezeigt haben, dass 350 μM für 24 h wirksamen oxidativen Stress in menschlichen ARPE-19- und primären RPE-Zellen induziert, die zur Analyse der Schutzwirkung von PEDF und GM-CSF verwendet werden können. H2O2 als oxidatives Mittel wurde aufgrund seiner physiologischen Präsenz im Auge und entsprechender Abwehrmechanismen, z.B. Glutathionstoffwechsel20,21,für die Studie ausgewählt. Unser Labor hat andere Modelle des oxidativen Stresses untersucht, wie z.B. die Behandlung von Zellen mit tBH, die die Lipidperoxidation in Gegenwart von Redox-aktiven Metallionen1einleitet; Oxidativer Stress war jedoch vernachlässigbar. In den hier vorgestellten Experimenten wurden Zellen24h lang mitH2O2 behandelt, weil wir herausfanden, dass kürzere Behandlungszeiten von 2-6 h ausreichen, um Veränderungen in der Genexpression20zu induzieren, aber nachfolgende Konsequenzen, z. B. Zellproliferation, Zelllebensfähigkeit und Glutathionspiegel, sind möglicherweise noch nicht sichtbar. Andernfalls führt die geringe Größe der Vertiefungen, die für die Zytotoxizitäts- und Glutathionassays notwendig ist, schnell zu einer konfluenten Kulturquelle; dies kann zu einer Kontakthemmung und einer Maskierung der Wirkung des oxidativen Mittels führen. Daher erscheint eine lange Inkubation mitH2O2nicht sinnvoll, obwohl die bei aAMD beobachtete Degeneration durch chronischen oxidativen Stress verursacht wird6, 7.

Eine Einschränkung der hier vorgestellten Experimente besteht darin, dass die Anzahlder ausgesäten Zellen die oxidative Wirkung vonH2O2beeinflusst, d.h. für die gleicheH2O2-Behandlungwurden signifikante Unterschiede in den Glutathionspiegeln zwischen H2O2-behandelten und unbehandelten Zellen beobachtet, wenn 5.000 Zellen, aber nicht, wenn 10.000 Zellen ausgesät wurden (Abbildung 4 ). Das Protokoll, das wir präsentieren, erfordert die Aussaat einer geringen Anzahl von Zellen, d.h. 3.000, wenn Zellen für 3 Tage kultiviert werden, und 5.000, wenn Zellen für 2 Tage kultiviert werden (Abbildung 1). Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Konzentration vonH2O2 mit der Zeit erschöpft ist; Kaczara et al.39 haben in ARPE-19-Zellkulturen über wenige Stunden eine Depletion vonH2O2 gezeigt, was die Entwicklung von Modellen für chronischen oxidativen Stress beeinflusst. Diese Forscher haben eine alternative Methode zur anhaltendenH2O2-Behandlungvorgeschlagen, wobei insbesondereH2O2kontinuierlich aus Glucose in dem Medium unter Verwendung der Glucoseoxidase erzeugt wird, aber eine standardisierte Konzentration von H2O2kann nicht garantiert werden. Auf der anderen Seite hat das Protokoll, das wir mit der Abgabe des Oxidationsmittels in einem einzigen Impuls erstellt haben, den Vorteil, dass es schneller und einfacher durchzuführen ist als bei chronischen Modellen, bei denen dieH2O2-Behandlung für mehrere Tage wiederholt werden muss38.

Die Fähigkeit der Zellen, dem oxidativen Schaden entgegenzuwirken, wird durch das Gleichgewicht zwischen der ROS-Produktion und der Fähigkeit, Antioxidantien zu erzeugen, bestimmt. In der Zelle ist das Tripeptid Glutathion (GSH) das vorherrschende Reduktionsmittel, das zu Glutathiondisulfid (GSSG) oxidiert und durch Glutathionreduktase unter Verwendung von NADPH40regeneriert werden kann. In gesunden Zellen sind mehr als 90% des gesamten Glutathionpools in reduzierter Form vorhanden. Wenn Zellen einem erhöhten Maß an oxidativem Stress ausgesetzt sind, sammelt sich GSSG an und das Verhältnis von GSSG zu GSH steigt. Folglich ist die Überwachung des Glutathion-Redox-Zustands in biologischen Proben für die Beurteilung des Entgiftungsstatus von Zellen und Geweben aus freien Radikalen, die bei oxidativem Stress und Zellverletzungen entstehen, unerlässlich. Das hier beschriebene Protokoll zur Quantifizierung von Glutathion ist empfindlich genug, um die antioxidative Wirkung von PEDF und GM-CSF nachzuweisen, die von genetisch veränderten RPE-Zellen exprimiert werden.

Da oxidativer Stress die mitochondrialen Aktivitätenbeeinflusst 40, ist es besonders interessant, dass die Kontrolle der ROS-Spiegel durch PEDF mit der Regulation des mitochondrialen Entkopplungsproteins 2 (UCP2) zusammenhängt und PEDF die Auswirkungen von oxidativem Stress durch Erhöhung der UCP2-Expression abschwächt11,41. Die Hauptfunktion von UCP2 besteht darin, die von den Mitochondrien abgeleitete ROS zu kontrollieren und als Sensor für mitochondrialen oxidativen Stress zu fungieren41,42. Hier haben wir neben der Untersuchung der Wirkung von PEDF und GM-CSF auf den Glutathionspiegel auch die Genexpression von UCP2 tendenziell erhöht (Abbildung 7); Zusätzliche Studien sind notwendig, um die Rolle von PEDF und GM-CSF auf die UCP2-Genexpression zu belegen.

Insgesamt bietet das vorliegende H2O2-Modelleinen umfassenden Ansatz zur Untersuchung der positiven Wirkung von Transposon-basierten Gentherapien, die darauf abzielen, antioxidative therapeutische Gene an die Zellen des Patienten zu liefern, um neurodegenerative Erkrankungen wie AMD zu behandeln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Gregg Sealy und Alain Conti für die hervorragende technische Unterstützung sowie Prof. Zsuzsanna Izsvák vom Max-Delbrück-Centrum in Berlin für die freundliche Bereitstellung der pSB100X- und pT2-CAGGS- Venus-Plasmide. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds und der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms unterstützt. Z.I wurde gefördert durch den Europäischen Forschungsrat, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Medizin Ausgabe 166 Okuläre Gentherapie altersbedingte Makuladegeneration oxidative Stressschädigung Dornröschentransponition, nicht-virale Genabgabe RPE-Zellen PEDF GM-CSF
Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen <em></em>
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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