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Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Abstract

O estresse oxidativo desempenha um papel crítico em várias doenças degenerativas, incluindo a degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma patologia que afeta ~30 milhões de pacientes em todo o mundo. Leva a uma diminuição no epitélio do pigmento da retina (RPE)-fatores neuroprotetores sintetizados, por exemplo, fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e fator estimulante da colônia granutócito-macrófago (GM-CSF), seguido pela perda de células RPE, e eventualmente fotorreceptor e morte de células gânglios de retina (RGC). Temos a hipótese de que a reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE transfecidas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular. Usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB100X)as células RPE humanas foram transfectadas com os genes PEDF e GM-CSF e mostraram integração genética estável, expressão genética de longo prazo e secreção de proteínas usando qPCR, mancha ocidental, ELISA e imunofluorescência. Para confirmar a funcionalidade e a potência do PEDF e gm-CSF secretados pelas células RPE transfeinadas, desenvolvemos um ensaio in vitro para quantificar a redução do estresse oxidativo induzido por H2O2em células RPE na cultura. A proteção celular foi avaliada pela análise da morfologia celular, densidade, nível intracelular de glutationa, expressão genética UCP2 e viabilidade celular. Ambas as células RPE transfectadas que expressam o FPE e/ou GM-CSF e as células não transfetizadas, mas pré-tratadas com PEDF e/ou GM-CSF (comercialmente disponíveis ou purificadas de células transfetizadas) apresentaram proteção celular antioxidante significativa em comparação com controles não tratados. O atual modelo H2O2é uma abordagem simples e eficaz para avaliar o efeito antioxidante de fatores que podem ser eficazes para tratar a AMD ou doenças neurodegenerativas similares.

Introduction

O modelo descrito aqui, oferece uma abordagem útil para avaliar a eficiência dos agentes biofarmacêuticos para reduzir o estresse oxidativo nas células. Utilizamos o modelo para investigar os efeitos protetores do PEDF e do GM-CSF no estresse oxidativo mediado H2O2nas células epiteliais do pigmento retinal, que estão expostas a altos níveis de O2, luz visível, e a fagocitose das membranas do segmento externo fotoreceptor, gerando níveis significativos de espécies reativas de oxigênio (ROS)1, 2. São considerados um dos principais contribuintes para a patogênese da degeneração macular avascular relacionada à idade (aAMD)3,4,5,6,7,8. Além disso, há uma diminuição nos fatores neuroprotetores sintetizados por RPE, especificamente o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) e fator estimulante da colônia-colônia granucyte (GM-CSF) levando à disfunção e perda de células RPE, seguidos pela morte de células fotorreceptoras e gânglios da retina (RGC)3,4,5 . A AMD é uma doença complexa que resulta da interação entre fatores metabólicos, funcionais, genéticos e ambientais4. A falta de tratamentos para a AAMD é a principal causa de cegueira em pacientes com mais de 60 anos de idade em países industrializados9,10. A reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE geneticamente modificadas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular11,12,13,14,15,16 . Embora existam várias metodologias para entregar genes às células, escolhemos o sistema transposon da Bela Adormecida hiperativo não viral para entregar os genes PEDF e GM-CSF às células RPE por causa de seu perfil de segurança, a integração dos genes no genoma das células hospedeiras e sua propensão a integrar os genes entregues em locais não transcricionalmente, como mostramos anteriormente17, 18,19.

O estresse oxidativo celular pode ser induzido em células cultivadas in vitro por vários agentes oxidativos, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),4-hidroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), altas tensões de oxigênio e luz visível (espectro completo ou irradiação UV)20,21. Altas tensões de oxigênio e luz requerem equipamentos e condições especiais, o que limita a transferência para outros sistemas. Agentes como H2O2,HNE e tBH induzem alterações moleculares e celulares por estresse oxidativo. Escolhemos H2O2 para testar a atividade antioxidante do PEDF e GM-CSF porque é conveniente e biologicamente relevante, pois é produzido por células RPE como um intermediário de oxigênio reativo durante a fagocitose do segmento externo fotoreceptor22 e é encontrado em tecidos oculares in vivo23. Como a oxidação da glutationa pode ser parcialmente responsável pela produção de H2O2 no olho, analisamos os níveis de GSH/glutationa em nossos estudos, que estão ligados ao estresse oxidativo induzido por H2O2e à capacidade regenerativa das células21,22. A análise dos níveis de glutationa é especialmente relevante, pois participa dos mecanismos de proteção antioxidantes no olho24. A exposição a H2O2 é utilizada com frequência como modelo para examinar a suscetibilidade ao estresse oxidativo e a atividade antioxidante das células RPE1,25,26,27,28,29,30, e, além disso, apresenta semelhanças com danos oxidativos induzidos pela luz, fonte "fisiológica" de estresse oxidativo21.

Para avaliar a funcionalidade e a eficácia dos fatores neuroprotetores, desenvolvemos um modelo in vitro que permite que a análise quantifique o efeito antioxidante dos fatores de crescimento expressos por células geneticamente modificadas para superexpressar o PEDF e o GM-CSF. Aqui, mostramos que as células RPE transfeminadas com os genes para PEDF e GM-CSF são mais resistentes aos efeitos nocivos de H2O2 do que são células de controle não transfectadas, como evidenciado pela morfologia celular, densidade, viabilidade, nível intracelular de glutationa e expressão do gene UCP2, que codifica a proteína mitocondrial de desacoplamento 2 que tem sido demonstrada para reduzir espécies reativas de oxigênio (ROS)31.

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Protocol

Os procedimentos de coleta e uso de olhos humanos foram aprovados pela Comissão de Ética Cantonnal de Pesquisa (nº 2016-01726).

1. Condições de isolamento celular e cultura

  1. Linha celular HUMANA ARPE-19
    1. Cultura 5 x 105 células ARPE-19, uma linha celular RPE humana, na mistura de médio/nutrientes da Águia Modificada de Dulbecco F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12) suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina U/mL de 80 U/mL, Estreptomicina de 80 μg/mL, e 2,5 μg/mL de anfotericina B (meio completo) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar em um frasco T75 (para outras densidades ver tabela 1).
    2. Troque o meio três vezes por semana.
    3. Uma vez que as células são cultivadas para aproximadamente 90% de confluência (avaliada qualitativamente), aspirar o meio e lavar as células com 1x PBS estérei.
    4. Incubar as células com uma solução EDTA de 5% de Trypsin-2% para 7-10 min a 37 °C (para volumes ver Tabela 1). Monitore o desprendimento visualmente.
    5. Pare de tentarpsinização adicionando meio completo contendo 10% de FBS (para volumes ver Tabela 1).
    6. Transfeito as células (ver etapa 2. do protocolo), subsulo as células a uma razão de 1:10 (uma vez por semana), ou sementes em uma placa de 96 poços como detalhado abaixo (ver etapas 3.3 e 3.4 do protocolo).
Médio (mL)
Área (cm²) Densidade de semeadura para células ARPE-19 (células/bem) Aplicação Para a cultura celular Para parar a trippsina Volume de trippsina (mL)
Frasco T75 75 5,00,000 Crescimento celular ARPE-19 10 7 3
6 Placa de poço 9.6 1,00,000 Semeadura de células ARPE-19 transfeinadas 3 1 0.5
24 Placa de poço 2 50,000 Semeadura de células hRPE transfectadas 1 0.8 0.2
96 Placa de poço 0.32 5.000 para experimentos de estresse oxidativo com células transfeinadas (Fig. 1) Experimentos de estresse oxidativo 0.2
3.000 para experimentos de estresse oxidativo com células não transfectadas mais proteínas (Fig. 1)

Tabela 1: Volumes de cultura celular. Volumes de mídia recomendados para placas de cultura celular e frascos para a cultura de células ARPE-19 e RPE humanos primários.

  1. Células RPE humanas primárias
    1. Isole as células RPE humanas primárias, como descrito por Thumann et al.17, e as células de cultura em meio completo suplementadas com 20% de FBS.
    2. Troque o meio duas vezes por semana. Uma vez que as células atinjam a confluência (monitorada visualmente), reduza a FBS para 1% para evitar o crescimento excessivo.
    3. Transfeito as células (ver passo 2 do protocolo), ou semente em uma placa de 96 poços como detalhado abaixo (ver etapas 3.3 e 3.4 do protocolo).
      NOTA: Os dados aqui apresentados foram coletados a partir da cultura das células RPE obtidas a partir dos olhos de quatro doadores humanos. A Tabela 2 detalha a demografia dos doadores do Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Os olhos foram enucleados 12,7 ± 5,7 h (média ± SD) após a obtenção de consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque.
Não idade Gênero morte à preservação (horas) morte ao isolamento cultivo cultivo Símbolo em gráfico
(dias) antes da transfecção (dias) após a transfecção (dias)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
significar 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabela 2: Demografia dos doadores humanos para células epiteliais de pigmento retiniano.

2. Eletroporação de células ARPE-19 e RPE humanas primárias

  1. Trippsinize células ARPE-19 ou células RPE humanas primárias, conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo.
  2. Realizar eletroporação com o kit de transfecção comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
    1. Para transfecção de células ARPE-19 consulte Johnen et al.32 e para hRPE primário para Thumann et al.17. Resumidamente, resuspend 1 x 105 células ARPE-19 ou 5 x 104 células primárias hRPE em 11 μL de tampão R e adicionar 2 μL de mistura plasmida contendo 0,03 0μg pSB100X transposase33 e 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His ou pT2-CMV-GMCSF-Seu transposon (razão transposase:transposon 1:16). Para células transfetícias duplas PEDF e GM-CSF, utilize uma razão de 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His, e 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Utilize os seguintes parâmetros de eletroporação: dois pulsos de 1.350 V para 20 ms (largura de pulso) para células ARPE-19; dois pulsos de 1.100 V para 20 ms para células primárias.
  3. Seed 1 x 105 ARPE-19 ou 5 x 104 células hRPE transfectadas em placas de 6-well e 24-well, respectivamente, em médio suplementado com 10% de FBS sem antibióticos ou antimióticos. Adicione penicilina (80 U/mL), estreptomicina (80 μg/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL) com a primeira troca média 3 dias após a transfecção.
  4. Determinar o crescimento celular por monitoramento microscópico semanal das células. A eficiência da transfecção é monitorada pela análise da expressão genética por RT-PCR, e secreção de proteínas por ELISA e WB (métodos explicados em Material Suplementar).
    NOTA: A eficiência da transfecção pode ser avaliada pela primeira vez quando as células atingirem a confluência, ou seja, em ~7 dias e 4 semanas de pós-transfecção para células ARPE-19 e células hRPE primárias, respectivamente.
  5. Células de sementes em uma placa de 96 poços como detalhadas abaixo (ver o passo 3.5 do protocolo).

3. Indução de estresse oxidativo (tratamento H2O2) e neuroproteção (tratamento PEDF e/ou GM-CSF)

  1. Preparação do meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Use células ARPE-19 transfeinadas com os genes PEDF, GM-CSF ou ambas (ver o passo 2 do protocolo); células de cultura por 28 dias como descrito na etapa 1.1 do protocolo.
    2. Aos 28 dias após a transfecção, células de trypsinize (ver passos 1.1.3-1.1.5 do protocolo), contam células usando uma câmara neubauer34,35, e sementes 5 x 105 células em frascos T75 em meio completo, conforme descrito na etapa 1.1.1 do protocolo. Troque o meio quando a cultura celular estiver aproximadamente 80% confluente (aproximadamente após 1 semana; verificada qualitativamente). Colete o meio depois das 24h.
    3. Armazene o meio a -20 °C até usar.
      NOTA: A concentração suficiente do PEDF recombinante e do GM-CSF no meio condicionado foi verificada pela WB e quantificada por ELISA conforme descrito em Material Suplementar.
  2. Purificação de PEDF e GM-CSF a partir de meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Centrifugar o meio coletado da etapa 3.1.2 a 10.000 x g para 15 min a 4 °C.
    2. Use o superfluxo Ni-NTA (ver Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos do fabricante para purificar proteínas marcadas por Sua, conforme descrito abaixo.
      1. Pipeta 30 μL de mistura Ni-NTA em um tubo de 1,5 mL e centrífuga a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo-through. Lave a pelota duas vezes com 200 μL de tampão de incubação de 1x.
      2. Centrifugar a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo. Adicione 40 μL de tampão de incubação 4x e resuspend.
      3. Adicione 900 μL de meio condicionado centrifusado e incubar a 70 rpm (agitador orbital) por 1 h na RT. Centrífuga a 2.600 x g por 1 min e o fluxo de descarte.
      4. Lave a pelota duas vezes com 175 μL de tampão de incubação de 1x. Centrifugar a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo.
      5. Para eluto Suas proteínas PEDF e GM-CSF, adicione 20 μL de tampão de elução e incubar a 70 rpm (agitador orbital) por 20 min na RT. Centrífuga a 2.600 x g por 30 s. Mantenha o supernatante contendo PEDF recombinante ou GM-CSF.
    3. Quantifique a proteína total utilizando o kit de ensaio de proteína BCA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Armazene a solução de proteína a -20 °C até usar.
      NOTA: O buffer de incubação (4x) contém 200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl e 40 mM Imidazol; O buffer de elução contém 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM Imidazol.
  3. Tratamento de células ARPE-19/hRPE não transfectadas com meio condicionado mais H2O2 (Figura1A)
    1. Semente 3.000 células ARPE-19 não transfectadas (a partir da etapa 1.1.6 do protocolo) ou hRPE primário (a partir da etapa 1.2.3 do protocolo) células por poço em placa e cultura de 96 poços em 200 μL de meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas.
    2. Cultura as células por 10 dias a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Mude o meio condicionado todos os dias. Exponha as células a 350 μM H2O2 por 24 h.
    3. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e do GM-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo) e ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 12 dias. Placas de microwell de fundo plano claro são usadas para avaliar a luminescência, bem como a morfologia celular. Para realizar simultaneamente o ensaio de citotoxicidade e glutationa, duas placas devem ser semeadas com células no mesmo dia.
  4. Tratamento de células ARPE-19/hRPE não transfectadas com fatores de crescimento PEDF e GM-CSF mais H2O2 (Figura 1B)
    1. Semente 3.000 células ARPE-19 não transfectadas (a partir da etapa 1.1.6 do protocolo) ou hRPE primário (a partir da etapa 1.2.3 do protocolo) células por poço (placas de 96 poços com fundo plano claro) em 200 μL de cultura completa contendo PEDF recombinante de 500 ng/mL e/ou 50 ng/mL recombinantes GM-CSF, purificados a partir do meio de células ARPE-19 transfectadas ou comercialmente disponíveis. Células de cultura para 48 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Renove diariamente os fatores de crescimento do PEDF e do GM-CSF.
      NOTA: Adicione os fatores de crescimento frescos ao meio.
    2. Após 48h de tratamento das células com os fatores de crescimento, remova o meio médio e adicione o meio completo contendo 350 μM H2O2 mais 500 ng/mL PEDF e/ou 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e do GM-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo) e ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 3 dias.
  5. Tratamento de células ARPE-19/hRPE primárias transfeinadas com H2O2 (Figura 1C)
    1. Verifique a expressão genética suficiente e a secreção proteica das células transfeinadas por WB e ELISA, conforme descrito no Material Suplementar.
    2. Remova o meio dos poços que contêm as células transfeinadas (ver o passo 2 do protocolo).
    3. Células de trypsinize, conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo. Conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35.
    4. Semente 5.000 células transfectadas/bem em placa de 96 poços em 200 μL de meio completo. Células de cultura por 24 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas, exponha as células a 350 μM H2O2 por 24 h.
    5. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e gm-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo), ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo) e determinação da expressão genética UCP2 (ver etapa 4.3 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 2 dias.

Figure 1
Figura 1: Cronogramas do ensaio H2O2 nas três diferentes abordagens experimentais. 3.000 células não transfectadas tratadas com as proteínas médias/recombinantes condicionadas ou 5.000 células transfeinadas foram semeadas em 96 placas de poço para tratamento com H2O2. Para determinar o efeito do meio condicionado, as células foram cultivadas em meio 100% cultivado por 10 dias consecutivos, mudando de meio a cada dia. Para determinar o efeito dos fatores de crescimento recombinantes, as células foram cultivadas adicionando a quantidade adequada de fatores de crescimento todos os dias por 3 dias consecutivos. Observe que as células não transfectadas foram semeadas a 3.000 células por poço para evitar o crescimento excessivo durante a maior duração da cultura em comparação com as células transfeinadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise do nível de estresse oxidativo e capacidade antioxidante

  1. Ensaio de glutationa
    1. Meça os níveis de Glutationa (GSH) utilizando o kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, prepare e desemuente o volume da mistura de reagente 1x (100 reagente/bem): substrato de luciferina-NT e Glutathione S-Transferase diluídos 1:100 no Buffer de Reação.
      NOTA: Uma placa de 96 poços requer 10 mL de mistura de reagente 1x, que é preparada adicionando 100 μL de substrato luciferina-NT e 100 μL de Glutathione S-Transferase a 10 mL de tampão de reação. Prepare a mistura de reagente 1x imediatamente antes de usar. Não armazene o mix de Reagente preparado para uso futuro.
    2. Prepare o Reagente de Detecção de Luciferina transferindo uma garrafa de tampão de reconstituição para o Reagente de Detecção de Lúciferina liofilizada.
    3. Prepare uma curva padrão usando uma solução padrão glutathione (GSH) (5 mM). Diluir solução GSH de 5 mM 1:100 com dH2O (adicione 10 μL de solução GSH de 5 mM a 990 μL de dH2O). Realize 7 diluição serial 1:1 em 500 μL de dH2O. Transfira 10 μL de cada padrão diluído para um poço apropriado em duplicata.
      NOTA: A concentração final de glutationa varia de 0,039 μM a 5 μM.
    4. Prepare o branco (mistura de reagente 1x) e transfira 10 μL (duplicatas) para os poços apropriados.
    5. Remova as células tratadas H2O2da incubadora.
      NOTA: Documente a morfologia das células tratadas H2O2por microscopia de campo brilhante (40x).
      Quando as células são oxidadas, elas parecem mais arredondadas e menos espalhadas.
    6. Aspire cuidadosamente o meio de cultura. Adicione 100 μL de mistura de reagente 1x preparada a cada poço. Misture as células com o reagente por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital.
    7. Incubar a placa em RT por 30 minutos. Adicione 100 μL de reagente de detecção de lúciferina reconstituído a cada poço.
    8. Misture a solução por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital. Incubar a placa por 15 min na RT.
    9. Determine a luminescência usando um leitor de placas usando um programa pré-instalado ADP-Glo.
      NOTA: Coloque a placa dentro do leitor de placas sem a tampa.
      1. Clique em Alterar layout e escolha as seguintes configurações em Parâmetros Básicos: Placa costar de 96 poços; alta óptica; atraso de posicionamento: 0.1; tempo de início da medição: 0.0; tempo de intervalo de medição: 1.0; tempo para normalizar os resultados: 0.0; o ganho é ajustado automaticamente pelo dispositivo. Defina espaços em branco, padrões e amostras. Clique em Iniciar a medição.
      2. Exporte os dados como um arquivo Excel. Calcule a concentração de GSH em cada amostra por interpolação da curva padrão.
  2. Ensaio de citotoxicidade e análise microscópica
    1. Aspire o meio das células e adicione 100 μL de meio completo contendo 1% de FBS a cada poço. Devolva as células para a incubadora.
      NOTA: 1% de FBS é utilizado porque percentuais mais elevados de FBS podem interferir na medição da luminescência, portanto 1% de FBS é utilizado neste caso.
    2. Medir a viabilidade celular usando o kit de ensaio de citotoxicidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, prepare a mistura reagente adicionando o tampão de ensaio ao substrato liofilizado. Prepare o Reagente de Lysis adicionando 33 μL Digitonin a 5 mL Assay buffer (para uma placa de 96 poços). Misture bem por pipetting para cima e para baixo para garantir a homogeneidade.
      NOTA: Para obter resultados ótimos, use a mistura de reagente recém-preparada. Use em até 12 horas se armazenado no RT. A mistura de reagente pode ser armazenada a 4 °C por até 7 dias e pode ser armazenada em alíquotas de uso único por até 4 meses a -70 °C. O congelamento e o descongelamento devem ser evitados. O Reagente de Lise pode ser armazenado a 4 °C por até 7 dias.
    3. Prepare uma curva padrão com células ARPE-19 não tratadas.
      1. Trypsinize as células conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo e conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35. Centrifugar as células a 120 g por 10 min na RT. Aspire o supernasce e resuspenha a pelota celular no meio F12 do DMEM/Ham contendo 1% de FBS a uma concentração final de 1 x 105 células/mL.
      2. Prepare 7 diluições de série 1:1 em 200 μL médio contendo 1% de FBS. Transfira 100 μL de cada padrão para os poços apropriados (duplicatas). Adicione 50 μL de mistura de reagente a todos os poços.
    4. Misture as células com o reagente por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital. Incubar a placa por 15 min na RT. Medir a luminescência usando o leitor de placas conforme descrito na etapa 4.1.9 do protocolo. Adicione 50 μL do reagente de lise e incubar por 15 min. Medir a luminescência usando o leitor de placas conforme descrito na etapa 4.1.9 do protocolo.
    5. Calcule a porcentagem de células viáveis: (100 - % células mortas) e a porcentagem de células mortas = [1ª medição de luminescência ((células mortas na amostra)) / 2ª medida de luminescência (todas as células mortas após o tratamento de digitonina)] x 100.
  3. Análise de expressão UCP2 por RT-qPCR
    1. Tripular células transfetí infectadas conforme descrito acima (etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo).
    2. Conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35.
    3. Sementes 5.000 células ARPE-19 transfectadas/bem em placas de 96 poços.
    4. Após 24 horas de cultura, trate as células com 350 μM H2O2 por 24 h.
    5. Isole o RNA total usando um kit comercial para isolamento do RNA de baixo número de células (ver Tabela de Materiais) seguindo a instrução do fabricante.
    6. Executar PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) conforme descrito em Material Suplementar. Brevemente, gere cDNA por retrotrancriação usando um mix comercialmente disponível contendo uma Transcriptase Reversa M-MLV otimizada (ver Tabela de Materiais).
    7. Para qPCR, utilize um coquetel de reação pronto para uso contendo todos os componentes (incluindo O Verde SYBR), exceto primers (ver Tabela S1 de Material Suplementar) e modelo de DNA. Use as seguintes condições de termociclismo: denaturação inicial a 95 °C para 10 min, 40 ciclos com denaturação a 95 °C para 15 s, ressarcimento a 60 °C para 30 s e alongamento a 72 °C para 32 s.
    8. Use o método 2^(-ΔΔCT) para análise36.
  4. Preparação de lise celular para análise de SDS-PAGE e WB de pAkt (Ser473)
    1. Seed 3 x 105 GM-CSF-transfectdam arpe-19 células/poço em placas de 6 poços (≥21 dias após transfecção) para determinar se o GM-CSF protege as células RPE contra danos por H2O2 através da ativação da via de sobrevivência Akt15.
    2. Após 24 h de células culturais são expostas a 350 μM H2O2 por 24 h.
    3. Misture 1 mL de tampão RIPA com 10 μL de coquetel inibidor de fosfatase protease, 10 μL de 0,5 M EDTA e 25 μL de 8 M de ureia (volumes usados para um poço).
    4. Aspire cuidadosamente o meio e lave as células com 1x PBS.
    5. Adicione todo o volume da mistura de buffer RIPA às células.
    6. Pipeta para cima e para baixo.
    7. Colete o lysate em tubos de 1,5 mL.
    8. Centrifugar a 20.000 x g por 30 min a 4 °C.
    9. Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL.
    10. Determine os níveis de pAkt em 15 μL de lise celular não diluída por WB, conforme descrito em Material Suplementar.

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Representative Results

Indução do estresse oxidativo nas células epiteliais do pigmento da retina humana
As células ARPE-19 e hRPE primária foram tratadas com concentrações variadas de H2O2 por 24 h e o nível intracelular da glutationa antioxidante foi quantificado(Figura 2A,B). H2O2 a 50 μM e 100 μM não afetaram a produção de glutationa, enquanto em 350 μM houve uma diminuição significativa da glutationa nas células ARPE-19 e hRPE primária. A análise da citotoxicidade mostrou que 350 μM é a menor concentração de H2O2 que causa uma diminuição significativa na viabilidade celular(Figura 2C). Morfologicamente, as células ARPE-19 tratadas com H2O2 aparecem menos difundidas e mais arredondadas, características que se tornam mais óbvias com o aumento da concentração de H2O2 (Figura 3). O efeito foi menos proeminente para as células transfetícias PEDF e GM-CSF tratadas com H2O2 (Figura 3). Para demonstrar o efeito do número celular no estresse oxidativo H2O2mediado, 5.000 e 10.000 células ARPE-19 por poço foram semeadas em uma placa branca de 96 poços; no dia seguinte, as células foram tratadas com 350 μM H2O2 por 24 h e os níveis de glutationa foram determinados. A Figura 4 mostra que o nível de glutationa foi diminuído apenas nos poços (n = 3) semeados com 5.000 células. Para experimentos para determinar o efeito de antioxidantes de ROS gerados por H2O2,é essencial considerar o número de células; para o protocolo específico apresentado neste relatório 3.000-5.000 células/poço (96-well plates) tratadas por 24 horas com 350 μM H2O2 são apropriadas para mostrar danos celulares significativos, mantendo a capacidade de recuperação imitando uma resposta sub-aguda a danos celulares induzidos pelo estresse oxidativo.

Figure 2
Figura 2: Nível de estresse oxidativo evidenciado como nível de glutationa e viabilidade celular, em células RPE humanas tratadas com células H2O2. (A) ARPE-19 expostas a várias concentrações de H2O2 apresentaram redução significativa dos níveis de glutationa (entre parênteses) a 350 μM (0,0m 66 μM), 500 μM (0,022 μM) e 700 μM (0,002 μM) em comparação com células H2O2-não tratadas (2,9 μM) (p < 0,0001 para 350, 500, e 700 μM H2O2). (B) As células RPE humanas primárias apresentaram níveis reduzidos de glutationa; no entanto, o efeito foi menos proeminente do que para ARPE-19, mas ainda estatisticamente significativo em comparação com os controles em 350, 500 e 700 μM H2O2. 350 μM foi a menor concentração H2O2 que produziu danos oxidativos significativos, como mostrado pela diminuição dos níveis de glutationa em comparação com as células de controle não tratadas (p = 0,0022). Os níveis de glutationa diminuíram com o aumento das concentrações de H2O2 (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) A análise da citotoxicidade mostrou que 350 μM H2O2 foi a menor concentração que produziu uma diminuição significativa no percentual de células viáveis (p < 0,0001 para 350, 500 e 700 μM). Os dados são apresentados como média ± SD (n = 3 réplicas) e diferenças significativas são indicadas com (*); Os cálculos pós-hoc da ANOVA foram realizados utilizando-se o teste de multi-comparação de Tukey comparando C- com os grupos de tratamento H2O2. C-: H2O2 células não tratadas. Este número foi modificado a partir de Bascuas et al.37. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Morfologia de células ARPE-19 não transfeinadas e não transfeinadas ou PEDF ou GM-CSF tratadas com H2O2. As células tratadas com concentrações crescentes de H2O2 mostram menos células nos poços de cultura e exibem uma morfologia mais arredondada e menos difundida, um sinal conhecido de estresse celular. Observe que para células transfeinadas PEDF ou GM-CSF, o estresse celular é menos proeminente e cresce semelhante às células de controle não tratadas. C-: células de controle não tratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Influência do número celular no efeito do estresse oxidativo induzido por H2O2. 5.000 e 10.000 células ARPE-19/poço foram semeadas em placas de 96 poços. Após 24 h, as células foram tratadas com 350 μM H2O2 por 24 h. Diferenças significativas nos níveis de glutationa foram observadas nos poços semeados com 5.000 células (p = 0,031, t-teste), mas não nos poços semeados com 10.000 células. C-: células não tratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise do efeito antioxidante do PEDF e GM-CSF fornecida por células RPE humanas transfectadas SB100Xem condições de estresse oxidativo
Como controles positivos, as células ARPE-19 e RPE humanas primárias foram tratadas com 5, 50 ou 500 ng/mL comercialmente disponíveis PEDF ou GM-CSF durante 2 dias antes e durante o tratamento24h H 2 O2. Arpe-19 células tratadas com 500 ng/mL PEDF ou 50 ng/mL GM-CSF produziram significativamente mais glutationa em comparação com controles não tratados em condições oxidativas (H2O2-tratado)(Figura 5A); PEDF e GM-CSF comparáveis purificados a partir de meios culturais de células ARPE-19 transfectadas apresentaram um efeito semelhante(Figura 5B). Em células hRPE primárias, a adição de 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF, ou 500 ng/mL PEDF mais 50 ng/mL GM-CSF, seja comercial ou purificado de mídia condicionado por células ARPE-19 transfectadas pedf-19, reduziu os danos celulares, conforme refletido por um aumento significativo nos níveis de glutathe(Figura 5C). As células primárias de hRPE tratadas durante 10 dias com meio condicionado a partir de células ARPE-19 transfectadas também apresentaram maiores níveis de glutationa em comparação com as células de controle(Figura 5D). Com base nesses resultados, outros experimentos foram feitos com 500 ng/mL para PEDF e 50 ng/mL para GM-CSF.

As células ARPE-19 e hRPE primária foram transfeinadas com a codificação de genes para PEDF e/ou GM-CSF usando o sistema transposon da Bela Adormecida combinado com eletroporação. Após a transfecção e análise da expressão genética por RT-qPCR, WB, ELISA e imunohistoquímica (ver Material Suplementar, Figura S1e Figura S2), células ARPE-19 transfectadas expostas a 350 μM H2O2 por 24 h apresentaram níveis significativos de glutationa do que células não transfectadas H2O2-tratadas (Figura 6A ). Para as células primárias de hRPE, há um aumento significativo nos níveis de glutationa em células transfeinadas pelo PEDF em comparação com células não transfeinadas tratadas com H2O2 quando todos os doadores foram incluídos na análise. Além disso, os doadores 2 e 3 apresentam um aumento significativo nos níveis de glutationa para todos os grupos transfilitos (PEDF, GM-CSF, PEDF e GM-CSF) (dados não apresentados).

O estudo da expressão genética UCP2 concluiu a análise por exame de estresse oxidativo mitocondrial. Uma série de prova de conceito foi realizada em células ARPE-19 transfectadas tratadas com 350 μM H2O2 por 24 h. Como mostrado na Figura 7, em células ARPE-19 transfectadas, os níveis de expressão genética UCP2 após o tratamento H2O2 são aumentados, mas o aumento não é estatisticamente significativo. A Figura 8 mostra um WB de Akt fosfoilado (pAkt) de um lysate de células GM-CSF transfectadas expostas a H2O2; os dados normalizados mostram apenas uma pequena diminuição em relação ao controle não tratado, indicando que o GM-CSF pode proteger as células contra danos ao estresse oxidativo.

Figure 5
Figura 5: Nível de glutationa como marcador da capacidade antioxidante de PEDF e GM-CSF. (A) Tratamento de células ARPE-19 com 500 ng/mL PEDF ou 50 ng/mL GM-CSF por 3 dias antes e durante 24 h H 2 O2A exposição a2 aumentou o nível de glutationa de 0,83 μM (C) para 1,83 μM (PEDF) e 1,3 μM (GM-CSF), p = 0,026 e p = 0,031, respectivamente. Em uma concentração de 5ng/mL não foi observado aumento na glutationa; a diferença no nível de glutationa entre 50 e 500 ng/mL não foi significativa nem para pedf ou GM-CSF. (B) PEDF (500 ng/mL) e GM-CSF (50 ng/mL) purificados a partir de mídias condicionadas de células ARPE-19 transfectadas apresentaram efeito semelhante ao PEDF ou GM-CSF disponíveis comercialmente (p = 0,018, ANOVA). (C) A adição de 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF, ou 500 ng/mL PEDF mais 50 ng/mL GM-CSF por 3 dias antes e durante 24 h H2O2 tratamento para o meio de cultura das células primárias hRPE aumentou significativamente os níveis de glutathione em células tratadas com PEDF (2,6 μM [comercial], 2,5 μM [purificado]), GM-CSF (2,9 μM [comercial], 3,3 μM [purificado]) e PEDF mais GM-CSF (3,0 μM [comercial], 2,9 μM [purificado]) em comparação com células não tratadas (1,9 μM) (p = 0,006, teste de Kruskal-Wallis). (D) Observou-se um aumento significativo nos níveis de glutationa para as células hRPE cultivadas durante 10 dias em meio condicionado a células PEDF-, GM-CSF-ou PEDF-GM-CSF-transfectadas ARPE-19 antes que as células fossem tratadas com H2O2 (p = 0,003, teste de Kruskal-Wallis) (dados apresentados para um doador). Os dados são expressos como ± médiaS SD (n = 3 réplicas). Diferenças significativas são indicadas com (*); Os cálculos pós-hoc das análises de variância foram realizados através do cálculo dos testes multi-comparativos de Tukey ou Dunnett comparando "C" com os grupos tratados com PEDF-/GM-CSF. C: células tratadas apenas com H2O2, P: células tratadas com PEDF, G: células tratadas com GM-CSF, P+G: células tratadas com PEDF mais GM-CSF. Este número foi modificado a partir de Bascuas et al.37. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Nível de glutationa como marcador da capacidade antioxidante das células RPE humanas transfectadas pelo PEDF e GM-CSF. (A) Os níveis de glutationa de células ARPE-19 transfectadas expostas a 350 μM H2O2 por 24 h (56 dias pós-transfecção) foram significativamente maiores em comparação com células não transfeccionadas (1,9 μM), ou seja, 3,0 μM para células transfecidas pedf e GM-CSF-transfecteds, e 3,4 μM para células transfeinadas duplas (p = 0,0001, ANOVA). Os dados são expressos como ± média SD (n = 3 réplicas). (B) O gráfico de pontos mostra os valores médios de glutationa para quatro doadores diferentes (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), que difere significativamente entre células não transfectadas e transfectadas de PEDF (p = 0,028, cálculos pós-hoc do ANOVA foram realizados utilizando-se testes multi-comparativos de Tukey comparando "C" com os grupos tratados com PEDF-/GM-CSF). Quando os doadores são analisados separadamente, o doador N°2 e N°3 (ver Tabela 2 para símbolo no gráfico) apresentam diferenças significativas para todos os grupos transfeinados em comparação com o controle não transfectado (as significâncias não são mostradas) tratadas com H2O2. C: células não transfectadas, P: células transfetícias pedf, G: células gm-CSF transfectadas, P+G: PEDF- e GM-CSF-transfected cells. Este número foi modificado a partir de Bascuas et al.37. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Expressão genética UCP2 em células ARPE-19 transfectadas tratadas com H2O2. Como a expressão genética UCP2 pode ser usada para examinar danos oxidativos mitocondriais, examinamos o efeito da superexpressão de PEDF e GM-CSF por células ARPE-19 transfeminadas. Células ARPE-19 transfectadas tratadas com H2O2, embora não estatisticamente significantes, mostram aumento da expressão genética UCP2 em comparação com o controle não transfectado indicando redução oxidativa do estresse, o aumento do fold foi de 1,57 para PEDF-, 1,51 para GM-CSF-, e 2,36 para células transfetícias PEDF-plus GM-CSF em comparação com o controle não transfectado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Mancha ocidental de akt fosforilado (Ser473) de uma célula lysate de células ARPE-19 transfectadas GM-CSF. O WB demonstrou que o GM-CSF aumenta a fosforilação da Akt em ambas as culturas não tratadas e H2O2(UT: 3.32; H2O2: 2,69). Os valores são normalizados para células não transfectadas não-H2O2(C/UT). C: células transfeinadas não transfetadas, G: GM-CSF-transfected, UT: células não tratadas com H2O2, H2O2: células tratadas com H2O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela S1: Sequências de par de primer e tempo de ressaramento/temperatura usado para RT-qPCR. Clique aqui para baixar esta tabela. 

Figura S1: Análise de expressão genética PEDF e GM-CSF em células hRPE transfectadas. O RT-qPCR verificou que as células hRPE primárias transfectadas apresentaram um aumento significativo na expressão genética pedf (p = 0,003, teste de Kruskal-Wallis) e GM-CSF (p = 0,013, teste de Kruskal-Wallis) em comparação com células não transfetícias. 2^(-ΔΔCT) método foi utilizado neste caso36. Os dados são expressos como ± SD (n = 4 doadores). Cada ponto representa a média de três réplicas. Este número foi modificado a partir de Bascuas et al.37. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S2: Secreção de proteínas em células primárias transfectadas de HRPE e ARPE-19. (A) A quantificação das proteínas secretadas pela ELISA mostrou que as células hRPE transfectadas secretaram significativamente mais PEDF e GM-CSF do que células não transfectadas (p = 0,014 para PEDF, e p = 0,006 para GM-CSF, teste de Kruskal-Wallis). Os dados são apresentados como média ± SD (n = 4 doadores). Cada ponto representa a média de três réplicas. (B) A coloração dupla PEDF-GM-CSF confirmou a co-secreção do PEDF e do GM-CSF em células ARPE-19 duplamente transfectadas (figura mesclada). Este número foi modificado a partir de Bascuas et al.37. Clique aqui para baixar este arquivo.

Material suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O protocolo aqui apresentado oferece uma abordagem para analisar a função antioxidante e protetora do PEDF e GM-CSF produzido por células transfeinadas, que podem ser aplicadas a células transfeinadas com qualquer gene benéfico putativo. Em estratégias terapêuticas genéticas que têm o objetivo de fornecer proteínas ao tecido por meio do transplante de células geneticamente modificadas, é fundamental obter informações quanto ao nível de expressão proteica, à longevidade da expressão e à eficácia da proteína expressa em um modelo da doença. Em nosso laboratório, o protocolo aqui apresentado tem sido útil para definir a eficácia do PEDF e do GM-CSF sobre o estresse oxidativo, que tem sido hipótese como elemento importante na patogênese da AAMD6,7. Especificamente, utilizamos o protocolo para definir o efeito antioxidante das células primárias de HRPE transfectadas pelo SB100X/GM-CSF. Vários pesquisadores mostraram que h2O2 induz sintomas significativos de estresse oxidativo, mas ainda permite a regeneração celular28,29,38, semelhante aos resultados de nossos experimentos que mostraram que 350 μM para 24 h induz estresse oxidativo efetivo em células humanas ARPE-19 e RPE primárias que podem ser usadas para analisar o efeito protetor do PEDF e GM-CSF. H2O2 como agente oxidativo foi escolhido para o estudo devido à sua presença fisiológica no olho e mecanismos de defesa correspondentes, por exemplo, metabolismo de glutationa20,21. Nosso laboratório analisou outros modelos de estresse oxidativo, como o tratamento de células com tBH, que inicia a peroxidação lipídica na presença de íons metálicos ativosavermelhados 1; no entanto, o estresse oxidativo foi insignificante. Nos experimentos aqui apresentados, as células foram tratadas com H2O2 por 24 h porque descobrimos que tempos de tratamento mais curtos de 2-6 h são suficientes para induzir alterações na expressão genética20, mas consequências subsequentes, por exemplo, proliferação celular, viabilidade celular e níveis de glutathione, podem não ser visíveis ainda. Caso contrário, o pequeno tamanho dos poços, necessário para os ensaios de citotoxicidade e glutationa, leva rapidamente a uma cultura confluente bem; isso pode levar à inibição de contato e a um mascaramento do efeito do agente oxidativo. Portanto, uma longa incubação com H2O2 parece não ser útil, embora a degeneração observada na AAMD seja causada pelo estresse oxidativo crônico6,7.

Uma limitação dos experimentos aqui apresentados é que o número de células semeadas influencia o efeito oxidativo de H2O2, ou seja, para o mesmo tratamento H2O2, diferenças significativas nosníveisde glutationa entre células tratadas e não tratadas H2foram observadas quando 5.000 células, mas não quando 10.000 células foram semeadas (Figura 4 ). O protocolo que apresentamos requer semeadura de um baixo número de células, ou seja, 3.000 quando as células são cultivadas por 3 dias e 5.000 quando as células são cultivadas por 2 dias(Figura 1). Outra limitação é que a concentração de H2O2 está esgotada com o tempo; Kaczara et al.39 mostraram esgotamento de H2O2 ao longo de algumas horas nas culturas celulares ARPE-19, o que afeta o desenvolvimento de modelos crônicos de estresse oxidativo. Estes pesquisadores propuseram um método alternativo para o tratamento sustentado de H2O2, especificamente gerando continuamente H2O2 a partir da glicose no meio usando a glicose oxidase, mas uma concentração padronizada de H2O2 não pode ser garantida. Por outro lado, o protocolo que estabelecemos com a entrega do agente oxidante em um único pulso, tem a vantagem de ser mais rápido e simples de realizar em comparação com modelos crônicos em que o tratamento H2O2 deve ser repetido por vários dias38.

A capacidade das células de neutralizar o dano oxidativo é determinada pelo equilíbrio entre a produção de ROS e a capacidade de gerar antioxidantes. Na célula, o glutationa tripeptídeo (GSH) é o agente redutor predominante, que pode ser oxidado ao dissulfeto de glutationa (GSSG) e regenerado pela reductase de glutationa utilizando NADPH40. Em células saudáveis, mais de 90% da piscina total de glutationa está presente na forma reduzida. Quando as células são expostas a um aumento do nível de estresse oxidativo, o GSSG se acumula e a razão de GSSG para GSH aumenta. Consequentemente, o monitoramento do estado de glutationo redox em amostras biológicas é essencial para a avaliação do estado de desintoxicação de células e tecidos de radicais livres gerados durante o estresse oxidativo e lesão celular. O protocolo aqui detalhado para a quantificação da glutationa é sensível o suficiente para detectar o efeito antioxidante do PEDF e gm-CSF expresso por células RPE geneticamente modificadas.

Uma vez que o estresse oxidativo afeta as atividades mitocondriais40,é particularmente interessante que o controle dos níveis de ROS pelo PEDF esteja relacionado à regulação da proteína desacoplamento mitocondrial 2 (UCP2), e o PEDF atenua os efeitos do estresse oxidativo aumentando a expressão UCP211,41. A principal função do UCP2 é controlar a ROS derivada das mitocôndrias e atuar como um sensor de estresse oxidativo mitocondrial41,42. Aqui, além de examinar o efeito do PEDF e do GM-CSF nos níveis de glutationa, temos a expressão genética de UCP2 tendem a aumentar (Figura 7); estudos adicionais são necessários para estabelecer o papel do PEDF e do GM-CSF na expressão genética UCP2.

No geral, o atual modelo H2O2oferece uma abordagem abrangente para investigar o efeito benéfico das terapias genéticas baseadas em transposon que visam fornecer genes terapêuticos antioxidantes às células do paciente para tratar a doença neurodegenerativa como AMD.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Gregg Sealy e Alain Conti pela excelente assistência técnica e prof. Zsuzsanna Izsvák do Centro Max-Delbrück em Berlim por fornecer gentilmente os plasmídeos pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências suíça e pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro. Z.I foi financiado pelo European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da <em>Bela Adormecida</em>
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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