Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Vi presenterer en protokoll for utvikling og bruk av en oksidativ stressmodell ved å behandle retinal pigment epitelceller med H2O2, analysere cellemorfologi, levedyktighet, tetthet, glutathione og UCP-2 nivå. Det er en nyttig modell for å undersøke antioksidanteffekten av proteiner utskilt av transposon-transfekerte celler for å behandle nevroretinal degenerasjon.

Abstract

Oksidativt stress spiller en kritisk rolle i flere degenerative sykdommer, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en patologi som påvirker ~ 30 millioner pasienter over hele verden. Det fører til en reduksjon i retinal pigment epitel (RPE)-syntetisert neuroprotective faktorer, for eksempel pigment epitel-avledet faktor (PEDF) og granulocyte-makrophage kolonistimulerende faktor (GM-CSF), etterfulgt av tap av RPE celler, og til slutt fotoreseptor og retinal ganglion celle (RGC) død. Vi hypoteser at rekonstituering av nevrobeskyttende og nevrogen retinal miljø ved subretinal transplantasjon av transfected RPE celler overekspresserende PEDF og GM-CSF har potensial til å forhindre retinal degenerasjon ved å redusere effekten av oksidativt stress, hemme betennelse, og støtte celle overlevelse. Ved hjelp av Sleeping Beauty transposon-systemet (SB100X) har menneskelige RPE-celler blitt transfektet med PEDF- og GM-CSF-genene og vist stabil genintegrasjon, langsiktig genuttrykk og proteinsekresjon ved hjelp av qPCR, vestlig blot, ELISA og immunfluorescence. For å bekrefte funksjonaliteten og styrken til PEDF og GM-CSF utskilt av de transfekterte RPE-cellene, har vi utviklet en in vitro-analyse for å kvantifisere reduksjonen av H2O2-indusert oksidativt stress på RPE-celler i kultur. Cellebeskyttelse ble evaluert ved å analysere cellemorfologi, tetthet, intracellulært nivå av glutathione, UCP2 genuttrykk og celle levedyktighet. Begge, transfekerte RPE-celler som overekspresserte PEDF og/eller GM-CSF og celler som ikke var transfekterte, men forbehandlet med PEDF og/eller GM-CSF (kommersielt tilgjengelig eller renset fra transfekterte celler) viste betydelig antioksidantcellebeskyttelse sammenlignet med ikke-behandlede kontroller. Den nåværende H2O2-modellener en enkel og effektiv tilnærming for å evaluere antioksidanteffekten av faktorer som kan være effektive for å behandle AMD eller lignende nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

Modellen beskrevet her, tilbyr en nyttig tilnærming for å evaluere effektiviteten avbiofarmaceutiske midler for å redusere oksidativt stress i celler. Vi har brukt modellen til å undersøke de beskyttende effektene av PEDF og GM-CSF på H2O2-mediertoksidativt stress på retinal pigment epitelceller, som er utsatt for høye nivåer av O2, og synlig lys, og fagocytose av fotoreseptor ytre segmentmembraner, genererer betydelige nivåer av reaktive oksygenarter (ROS)1, 2. De regnes som en stor bidragsyter til patogenesen av avascular aldersrelatert makuladegenerasjon (aAMD)3,4,5,6,7,8. Dessuten er det en reduksjon i RPE-syntetiserte nevrobeskyttende faktorer, spesielt pigment epitel-avledet faktor (PEDF), insulin-lignende vekstfaktorer (IGFer), og granulocytt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) som fører til dysfunksjon og tap av RPE-celler, etterfulgt av fotoreseptor og retinal ganglion celle (RGC) død3,4 , 4 ,4, . AMD er en kompleks sykdom som skyldes samspillet mellom metabolske, funksjonelle, genetiske og miljømessige faktorer4. Mangelen på behandlinger for aAMD er hovedårsaken til blindhet hos pasienter eldre enn 60 år i industrialiserte land9,10. Rekonstitueringen av det nevrobeskyttende og nevrogene netthinnemiljøet ved subretinal transplantasjon av genetisk modifiserte RPE-celler som overekspresserer PEDF og GM-CSF har potensial til å forhindre retinal degenerasjon ved å redusere effekten av oksidativt stress, hemme betennelse og støtte celleoverlevelse11,12,13,14,15,16 . Selv om det er flere metoder for å levere gener til celler, har vi valgt det ikke-virale hyperaktive Sleeping Beauty transposon-systemet for å levere PEDF- og GM-CSF-genene til RPE-celler på grunn av sikkerhetsprofilen, integreringen av genene i vertscellenes genom, og dets tilbøyelighet til å integrere de leverte genene på ikke-transkripsjonsaktive steder som vi tidligere har vist17, 18,19.

Cellulært oksidativt stress kan induseres i celler dyrket in vitro av flere oksidative midler, inkludert hydrogenperoksid(H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), høye oksygenspenninger og synlig lys (fullspektret eller UV-bestråling)20,21. Høye oksygenspenninger og lys krever spesialutstyr og forhold, noe som begrenser overførbarheten til andre systemer. Agenter som H2O2, HNE og tBH induserer overlappende oksidativt stressmolekylære og cellulære endringer. Vi valgte H2O2 for å teste antioksidantaktiviteten til PEDF og GM-CSF fordi den er praktisk og biologisk relevant siden den produseres av RPE-celler som et reaktivt oksygen mellomliggende under fotoreseptor ytre segment fagocytose22 og det finnes i okulært vev in vivo23. Siden oksidasjonen av glutathione kan være delvis ansvarlig for produksjonen av H2O2 i øyet, har vi analysert nivåene av GSH / glutathione i våre studier, som er knyttet til H2O2-indusert oksidativt stress og den regenerative kapasiteten til cellene21,22. Analysen av glutathione nivåer er spesielt relevant siden den deltar i antioksidative beskyttelsesmekanismer i øyet24. Eksponering for H2O2 brukes ofte som modell for å undersøke oksidativ stressfølsomhet og antioksidantaktivitet i RPE-celler1,25,26,27,28,29,30, og i tillegg viser den likheter med lysindusert oksidativ stressskade, en "fysiologisk" kilde til oksidativt stress21.

For å evaluere funksjonaliteten og effektiviteten av nevrobeskyttende faktorer har vi utviklet en in vitro-modell som gjør det mulig for analysen å kvantifisere den antioksidative effekten av vekstfaktorer uttrykt av celler genetisk modifisert for å overekspressere PEDF og GM-CSF. Her viser vi at RPE-celler transfektert med genene for PEDF og GM-CSF er mer motstandsdyktige mot de skadelige effektene av H2O2 enn ikke-transfekerte kontrollceller, som det fremgår av cellemorfologi, tetthet, levedyktighet, intracellulært nivå av glutathione og uttrykk for UCP2-gen, som koder for mitokondrie-frakoblingsprotein 2 som har vist seg å redusere reaktive oksygenarter (ROS)31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer for innsamling og bruk av menneskelige øyne ble godkjent av Cantonal Ethical Commission for Research (nr. 2016-01726).

1. Celleisolasjon og kulturforhold

  1. Menneskelig ARPE-19-cellelinje
    1. Kultur 5 x 105 ARPE-19 celler, en menneskelig RPE celle linje, i Dulbecco's Modified Eagle medium / næringsblanding F-12 Skin (DMEM / Hams F-12) supplert med 10% fetal bovine serum (FBS), 80 U / ml penicillin, 80 μg/ml streptomycin og 2,5 μg/ml amfotericin B (komplett medium) ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2 og 95 % luft i en T75-kolbe (for andre celletettheter se tabell 1).
    2. Endre medium tre ganger i uken.
    3. Når cellene er vokst til ca. 90% samløp (evaluert kvalitativt), aspirerer du mediet og vasker cellene med steril 1x PBS.
    4. Inkuber cellene med en 5% Trypsin-2% EDTA-løsning i 7-10 min ved 37 °C (for volumer se tabell 1). Skjermavløsning visuelt.
    5. Stopp trypsinisering ved å legge til et komplett medium som inneholder 10 % FBS (for volumer, se tabell 1).
    6. Transfekter cellene (se trinn 2. i protokollen), delkulter cellene i forholdet 1:10 (en gang i uken), eller frø i en 96-brønnsplate som beskrevet nedenfor (se trinn 3.3 og 3.4 i protokollen).
Middels (ml)
Areal (cm²) Såing tetthet for ARPE-19 celler (celler / brønn) Søknad For cellekultur Slik stopper du trypsin Volumet av trypsin (ml)
Kolbe T75 75 5,00,000 ARPE-19-cellevekst 10 7 3
6 Brønnplate 9.6 1,00,000 Såing av transfekterte ARPE-19 celler 3 1 0.5
24 Brønnplate 2 50,000 Såing av transfekterte hRPE-celler 1 0.8 0.2
96 Brønnplate 0.32 5000 for oksidativt stresseksperimenter med transfekterte celler (fig. 1) Oksidative stresseksperimenter 0.2
3000 for oksidative stresseksperimenter med ikke-transfekterte celler pluss proteiner (fig. 1)

Tabell 1: Cellekulturvolumer. Anbefalte medievolumer for cellekulturplater og kolber for kulturen til ARPE-19 og primære menneskelige RPE-celler.

  1. Primære humane RPE-celler
    1. Isoler primære menneskelige RPE-celler som beskrevet av Thumann et al.17, og kulturceller i komplett medium supplert med 20% FBS.
    2. Endre medium to ganger i uken. Når cellene når samløp (overvåkes visuelt), reduser FBS til 1% for å unngå overvekst.
    3. Transfekt cellene (se trinn 2 i protokollen), eller frø i en 96-brønnsplate som beskrevet nedenfor (se trinn 3.3 og 3.4 i protokollen).
      MERK: Data presentert her ble samlet inn fra kulturen til RPE-celler hentet fra øynene til fire menneskelige givere. Tabell 2 beskriver givernes demografi fra Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Øynene ble utdannet 12,7 ± 5,7 h (gjennomsnittlig ± SD) post-mortem etter at informert samtykke ble innhentet i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Nei alder kjønn død for bevaring (timer) død til isolasjon dyrking dyrking Symbol i graf
(dager) før transfeksjon (dager) etter transfeksjon (dager)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
bety 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabell 2: Demografi av humane donorer for retinal pigment epitelceller.

2. Elektroporasjon av ARPE-19 og primære humane RPE-celler

  1. Prøv å insinosere ARPE-19-celler eller primære humane RPE-celler som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.5 i protokollen.
  2. Utfør elektroporasjon med det kommersielt tilgjengelige transfeksjonssettet (se Materialfortegnelse).
    1. For transfeksjon av ARPE-19 celler se Johnen et al.32 og for primær hRPE til Thumann et al.17. Kort sagt, resuspend 1 x 105 ARPE-19 celler eller 5 x 104 primære hRPE celler i 11 μL R buffer og tilsett 2 μL plasmid blanding som inneholder 0,03 μg pSB100X transposase33 og 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-Hans eller pT2-CMV-GMCSF-Hans transposon (forholdet transposase:transposon 1:16). For PEDF og GM-CSF doble transfekerte celler, bruk et forhold på 1:16:16 (0.03 μg pSB100X, 0.47 μg pT2-CMV-PEDF-His, og 0.47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Bruk følgende elektroporasjonsparametere: to pulser på 1350 V i 20 ms (pulsbredde) for ARPE-19 celler; to pulser på 1100 V i 20 ms for primærceller.
  3. Frø 1 x 105 transfekterte ARPE-19 eller 5 x 104 transfected primære hRPE-celler i henholdsvis 6-brønns og 24-brønnsplater, i medium supplert med 10% FBS uten antibiotika eller antimykotika. Tilsett penicillin (80 U/ml), streptomycin (80 μg/ml) og amfotericin B (2,5 μg/ml) med første middels utveksling 3 dager etter transfeksjon.
  4. Bestem cellevekst ved ukentlig mikroskopisk overvåking av cellene. Transfeksjonseffektivitet overvåkes ved analyse av genuttrykk av RT-PCR, og proteinsekresjon av ELISA og WB (metoder forklart i tilleggsmateriale).
    MERK: Transfeksjonseffektivitet kan evalueres for første gang når cellene når konfluens, det vil si ved henholdsvis ~ 7 dager og 4 uker etter transfeksjon for ARPE-19-celler og primære hRPE-celler.
  5. Frøceller i en 96-brønnsplate som beskrevet nedenfor (se trinn 3.5 i protokollen).

3. Oksidativ stressinduksjon (H2O2-behandling) og nevrobeskyttelse (PEDF- og/eller GM-CSF-behandling)

  1. Fremstilling av kondisjonert medium for transfekerte ARPE-19 celler
    1. Bruk ARPE-19 celler transfektert med genene PEDF, GM-CSF eller begge deler (se trinn 2 i protokollen); kulturceller i 28 dager som beskrevet i trinn 1.1 i protokollen.
    2. Ved 28 dager etter transfeksjon teller du celler ved hjelp av et Neubauer-kammer34,35og frø 5 x 105 celler i T75-kolber i fullstendig medium som beskrevet i trinn 1.1.1 i protokollen. Bytt medium når cellekulturen er ca. 80 % sammenfallende (omtrent etter 1 uke, verifisert kvalitativt). Samle mediet etter 24 timer.
    3. Oppbevar mediet ved -20 °C til bruk.
      MERK: Tilstrekkelig konsentrasjon av rekombinant PEDF og GM-CSF i det kondisjonerte mediet ble verifisert av WB og kvantifisert av ELISA som beskrevet i Tilleggsmateriale.
  2. Rensing av PEDF og GM-CSF fra kondisjonert medium av transfected ARPE-19 celler
    1. Sentrifuger det innsamlede mediet fra trinn 3.1.2 ved 10.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    2. Bruk Ni-NTA-superstrømmen (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens protokoller for å rense hismerkede proteiner som beskrevet nedenfor.
      1. Pipette 30 μL Ni-NTA-blanding i et 1,5 ml rør og sentrifuge ved 2600 x g i 30 s og kast gjennomstrømningen. Vask pelletsen to ganger med 200 μL 1x inkubasjonsbuffer.
      2. Sentrifuge ved 2600 x g i 30 s og kast gjennomstrømningen. Tilsett 40 μL 4x inkubasjonsbuffer og resuspend.
      3. Tilsett 900 μL sentrifugert kondisjonert medium og inkuber ved 70 rpm (orbital shaker) i 1 t ved RT. Sentrifuge ved 2600 x g i 1 min og kast gjennomstrømningen.
      4. Vask pelletsen to ganger med 175 μL 1x inkubasjonsbuffer. Sentrifuge ved 2600 x g i 30 s og kast gjennomstrømningen.
      5. For å unngå Hans taggede PEDF- og GM-CSF-proteiner, tilsett 20 μL Elution buffer og inkuber ved 70 rpm (orbital shaker) i 20 minutter ved RT. Sentrifuge ved 2600 x g i 30 s. Oppbevar supernatanten som inneholder rekombinant PEDF eller GM-CSF.
    3. Kvantifisere det totale proteinet ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige BCA proteinanalysesettet (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Oppbevar proteinoppløsningen ved -20 °C til bruk.
      MERK: Inkubasjonsbufferen (4x) inneholder 200 mM NaH2PO4,1,2 M NaCl og 40 mM Imidazol; Elution buffer inneholder 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl og 250 mM Imidazol.
  3. Behandling av ikke-transfekerte ARPE-19/primære hRPE-celler med betinget medium pluss H2O2 (figur 1A)
    1. Frø 3000 ikke-transfekterte ARPE-19 (fra trinn 1.1.6 i protokollen) eller primær hRPE (fra trinn 1.2.3 i protokollen) celler per brønn i 96-brønns plate og kultur i 200 μL kondisjonert medium fra transfekterte ARPE-19 celler.
    2. Kultur cellene i 10 dager ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5% CO2 og 95% luft. Endre det kondisjonerte mediet hver dag. Utsett cellene for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    3. Evaluer oksidativ stressskade og bestem antioksidanteffekten av PEDF og GM-CSF ved kvantifisering av glutathionenivåer (se trinn 4.1 i protokollen), mikroskopi (se trinn 4.2 i protokollen) og cytotoksisitetsanalyse (se trinn 4.2 i protokollen).
      MERK: Varigheten av eksperimentet er 12 dager. Klare flate bunnmikrowellplater brukes til å evaluere luminescens så vel som cellemorfologi. For samtidig å utføre cytotoksisitet og glutathioneanalyse, må to plater frøes med celler på samme dag.
  4. Behandling av ikke-transfekerte ARPE-19/primære hRPE-celler med PEDF- og GM-CSF-vekstfaktorer pluss H2O2 (figur 1B)
    1. Frø 3000 ikke-transfekterte ARPE-19 (fra trinn 1.1.6 i protokollen) eller primær hRPE (fra trinn 1.2.3 i protokollen) celler per brønn (96-brønnsplater med klar flat bunn) i 200 μL komplett kulturmedium som inneholder 500 ng/ml rekombinant PEDF og/eller 50 ng/ml rekombinant GM-CSF, renset fra mediet av transfiserte ARPE-19 celler eller kommersielt tilgjengelig. Kulturceller i 48 timer ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2 og 95 % luft. Forny mediet inkludert PEDF og GM-CSF vekstfaktorer daglig.
      MERK: Legg vekstfaktorene friske til mediet.
    2. Etter 48 h å behandle cellene med vekstfaktorene, fjern mediet og legg til komplett medium som inneholder 350 μM H2O2 pluss 500 ng / ml PEDF og / eller 50 ng / ml GM-CSF.
    3. Evaluer oksidativ stressskade og bestem antioksidanteffekten av PEDF og GM-CSF ved kvantifisering av glutathionenivåer (se trinn 4.1 i protokollen), mikroskopi (se trinn 4.2 i protokollen) og cytotoksisitetsanalyse (se trinn 4.2 i protokollen).
      MERK: Varigheten av eksperimentet er 3 dager.
  5. Behandling av transfekerte ARPE-19/primære hRPE-celler med H2O2 (figur 1C)
    1. Kontroller tilstrekkelig genuttrykk og proteinsekresjon av transfiserte celler av WB og ELISA som beskrevet i tilleggsmaterialet.
    2. Fjern mediet fra brønnene som inneholder de transfiserte cellene (se trinn 2 i protokollen).
    3. Prøv celler som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.5 i protokollen. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer34,35.
    4. Frø 5000 transfekterte celler/brønn i 96-brønnsplate i 200 μL komplett medium. Kulturceller i 24 timer ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2 og 95 % luft. Etter 24 timer, utsett cellene for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    5. Evaluer oksidativ stressskade og bestem antioksidanteffekten av PEDF og GM-CSF ved kvantifisering av glutathionenivåer (se trinn 4.1 i protokollen), mikroskopi (se trinn 4.2 i protokollen), cytotoksisitetsanalyse (se trinn 4.2 i protokollen) og bestemmelse av UCP2-genuttrykk (se trinn 4.3 i protokollen).
      MERK: Varigheten av eksperimentet er 2 dager.

Figure 1
Figur 1: Tidslinjer for H2O2-analysen i de tre forskjellige eksperimentelle tilnærmingene. 3000 ikke-transfekerte celler behandlet med de betingede middels/rekombinante proteinene eller 5000 transfekterte celler ble sådd i 96-brønnsplater for behandling med H2O2. For å bestemme effekten av betinget medium ble celler dyrket i 100% dyrket medium i 10 påfølgende dager, og endret medium hver dag. For å bestemme effekten av rekombinante vekstfaktorer ble cellene dyrket ved å legge til riktig mengde vekstfaktorer hver dag i 3 påfølgende dager. Legg merke til at ikke-transfekterte celler ble sådd ved 3000 celler per brønn for å unngå overvekst under lengre kulturvarighet sammenlignet med transfekterte celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Analyse av oksidativt stressnivå og antioksidantkapasitet

  1. Glutathione analyse
    1. Mål Glutathione-nivåene (GSH) ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige settet (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens anvisninger. Kort, forberede og passende volum av 1x reagensblanding (100 μL reagens / brønn): Luciferin-NT substrat og Glutathione S-Transferase fortynnet 1:100 i reaksjonsbuffer.
      MERK: En 96-brønns plate krever 10 ml 1x reagensblanding, som fremstilles ved å tilsette 100 μL Luciferin-NT-substrat og 100 μL Glutathione S-Transferase til 10 ml reaksjonsbuffer. Klargjør 1x reagensblandingen umiddelbart før bruk. Ikke oppbevar klargjort reagensblanding til senere bruk.
    2. Klargjør Luciferin Detection-reagenset ved å overføre en flaske rekonstitueringsbuffer til det lyofiliserte Luciferin Detection-reagenset.
    3. Forbered en standardkurve ved hjelp av en Glutathione (GSH) standardløsning (5 mM). Fortynn 5 mM GSH-oppløsning 1:100 med dH2O (tilsett 10 μL 5 mM GSH-oppløsning til 990 μL dH2O). Utfør 7 seriell 1:1 fortynning i 500 μL dH2O. Overfør 10 μL av hver fortynnet standard til en passende brønn i duplikat.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av glutathione vil variere fra 0,039 μM til 5 μM.
    4. Forbered det tomme (1x reagensblandingen) og overfør 10 μL (duplikater) til de aktuelle brønnene.
    5. Fjern H2O2-behandledeceller fra inkubatoren.
      MERK: Dokumenter morfologien til H2O2-behandledeceller ved brightfield-mikroskopi (40x).
      Når cellene oksideres, ser de mer avrundede og mindre spredt ut.
    6. Aspirer kulturmediet forsiktig. Tilsett 100 μL tilberedt 1x reagensblanding til hver brønn. Bland cellene med reagenset i 15 s ved 500 o/min på en orbital shaker.
    7. Inkuber platen på RT i 30 min. Tilsett 100 μL rekonstituert Luciferin Detection Reagens til hver brønn.
    8. Bland løsningen i 15 s ved 500 o/min på en orbital shaker. Inkuber platen i 15 min på RT.
    9. Bestem luminescens ved hjelp av en plateleser ved hjelp av et forhåndsinstallert program ADP-Glo.
      MERK: Sett platen inne i plateleseren uten lokket.
      1. Klikk på Endre layout og velg følgende innstillinger i Grunnleggende parametere: Costar 96-brønnsplate; toppoptikk; posisjoneringsforsinkelse: 0,1; starttid for måling: 0,0; måleintervall tid: 1.0; tid til å normalisere resultatene: 0,0; forsterkningen justeres automatisk av enheten. Definer emner, standarder og eksempler. Klikk Start måling.
      2. Eksporter dataene som en Excel-fil. Beregn konsentrasjonen av GSH i hver prøve ved interpolering av standardkurven.
  2. Cytotoksisitetsanalyse og mikroskopisk analyse
    1. Aspirer mediet fra cellene og tilsett 100 μL komplett medium som inneholder 1% FBS til hver brønn. Returner cellene til inkubatoren.
      MERK: 1% FBS brukes fordi høyere prosentandeler av FBS kan forstyrre målingen av luminescensen, derfor brukes 1% FBS i dette tilfellet.
    2. Mål celle levedyktigheten ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige cytotoksisitetsanalysesettet (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, forbered reagensblandingen og legg analysebufferen til det lyofiliserte substratet. Forbered Lysis Reagens ved å tilsette 33 μL Digitonin til 5 ml analysebuffer (for en 96-brønnsplate). Bland godt ved å pipettere opp og ned for å sikre homogenitet.
      MERK: For optimale resultater, bruk nylaget reagensblanding. Brukes innen 12 timer hvis det oppbevares ved RT. Reagensblanding kan oppbevares ved 4 °C i opptil 7 dager og kan oppbevares i engangs aliquots i opptil 4 måneder ved -70 °C. Frysing og opptining må unngås. Lysis reagens kan oppbevares ved 4 °C i opptil 7 dager.
    3. Klargjør en standardkurve med ubehandlede ARPE-19-celler.
      1. Prøv cellene som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.5 i protokollen, og tell cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer34,35. Sentrifuger cellene ved 120 g i 10 minutter ved RT. Aspirer supernatanten og resuspend cellepelleten i DMEM/ Hams F12-medium som inneholder 1% FBS til en endelig konsentrasjon på 1 x 105 celler / ml.
      2. Forbered 7 serielle 1:1 fortynninger i 200 μL medium som inneholder 1% FBS. Overfør 100 μL av hver standard til de aktuelle brønnene (duplikater). Tilsett 50 μL reagensblanding til alle brønnene.
    4. Bland cellene med reagenset i 15 s ved 500 o/min på en orbital shaker. Inkuber platen i 15 min ved RT. Mål luminescens ved hjelp av plateleseren som beskrevet i trinn 4.1.9 i protokollen. Tilsett 50 μL av lysisreagenset og inkuber i 15 min. Mål luminescens ved hjelp av plateleseren som beskrevet i trinn 4.1.9 i protokollen.
    5. Beregn prosentandelen av levedyktige celler: (100 - % døde celler) og prosentandelen døde celler = [første luminescensmåling ((døde celler i prøven))/ andre luminescensmåling (alle celler døde etter digitoninbehandling)] x 100.
  3. UCP2-uttrykksanalyse av RT-qPCR
    1. Prøv transfiserte celler som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.3-1.1.5 i protokollen).
    2. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer34,35.
    3. Frø 5000 transfekterte ARPE-19 celler/brønn i 96-brønnsplater.
    4. Etter 24 timers kultur, behandle cellene med 350 μM H2O2 i 24 timer.
    5. Isoler total RNA ved hjelp av et kommersielt sett for isolering av RNA fra lavt antall celler (se Materialliste) etter produsentens instruksjon.
    6. Utfør sanntids kvantitativ PCR (RT-qPCR) som beskrevet i Tilleggsmateriale. Kort sagt, generer cDNA ved retrotranscription ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig blanding som inneholder en optimalisert M-MLV Reverse Transcriptase (se Tabell over materialer).
    7. For qPCR bruk en reaksjonscocktail som er klar til bruk som inneholder alle komponenter (inkludert SYBR Green) unntatt primere (se tabell S1 i tilleggsmateriale) og DNA-mal. Bruk følgende termosycling forhold: innledende denaturering ved 95 °C i 10 min, 40 sykluser med denaturering ved 95 °C i 15 s, gløding ved 60 °C i 30 s og forlengelse ved 72 °C i 32 s.
    8. Bruk 2^(-ΔΔCT)-metoden for analyse36.
  4. Fremstilling av cellelys for SDS-PAGE og WB analyse av pAkt (Ser473)
    1. Frø 3 x 105 GM-CSF-transfekterte ARPE-19 celler / brønn i 6-brønnsplater (≥21 dager etter transfeksjon) for å avgjøre om GM-CSF beskytter RPE-celler mot skade av H2O2 gjennom aktiveringen av Akt overlevelsesvei15.
    2. Etter 24 h kulturceller er utsatt for 350 μM H2O2 i 24 timer.
    3. Bland 1 ml RIPA-buffer med 10 μL protease fosfatasehemmercocktail, 10 μL 0,5 M EDTA og 25 μL 8 M urea (volumer som brukes til en brønn).
    4. Aspirer forsiktig medium og vask cellene med 1x PBS.
    5. Legg til hele volumet av RIPA-bufferblanding i cellene.
    6. Pipette opp og ned.
    7. Samle lysate i 1,5 ml rør.
    8. Sentrifuge ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    9. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør.
    10. Bestem nivåene av pAkt i 15 μL ufortynnet cellelysat av WB som beskrevet i Tilleggsmateriale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induksjon av oksidativt stress i humane retinal pigment epitelceller
ARPE-19 og primære hRPE-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av H2O2 i 24 timer og det intracellulære nivået av antioksidantglutseksjonen ble kvantifisert (Figur 2A,B). H2O2 ved 50 μM og 100 μM påvirket ikke glutathioneproduksjonen, mens ved 350 μM var det en signifikant reduksjon av glutathione i ARPE-19 og primære hRPE-celler. Analyse av cytotoksisitet viste at 350 μM er den laveste konsentrasjonen av H2O2 som forårsaker en betydelig reduksjon i celle levedyktighet (Figur 2C). Morfologisk virker ARPE-19 celler behandlet med H2O2 mindre spredt og mer avrundet, egenskaper som blir tydeligere med økende H2O2-konsentrasjon (Figur 3). Effekten var mindre fremtredende for PEDF- og GM-CSF-transfekerte celler behandlet med H2O2 (figur 3). For å demonstrere effekten av cellenummer på H2O2-mediert oksidativt stress, ble 5000 og 10.000 ARPE-19 celler per brønn sådd i en hvit 96-brønnsplate; dagen etter ble celler behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer og nivåene av glutathione ble bestemt. Figur 4 viser at glutathionnivået bare ble redusert i brønnene (n = 3) frø med 5000 celler. For eksperimenter for å bestemme effekten av antioksidanter av H2O2-generert ROS, er det viktig å vurdere antall celler; for den spesifikke protokollen som presenteres i denne rapporten, er 3000-5000 celler/brønn (96-brønnsplater) behandlet i 24 timer med 350 μM H2O2 hensiktsmessig å vise betydelig celleskade samtidig som kapasiteten til å gjenopprette etterligning av en sub-akutt respons på oksidativ stressindusert celleskade.

Figure 2
Figur 2: Oksidativt stressnivå vist som glutathionenivå og celle levedyktighet, i humane RPE-celler behandlet med H2O2. (A) ARPE-19 celler eksponert for flere konsentrasjoner av H2O2 viste signifikant reduserte glutathione nivåer (i parentes) ved 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) og 700 μM (0,002 μM) sammenlignet med H2O2-ikke-behandlede celler (2,9 μM) (p < 0,0001 for 350, 500 og 700 μM H2O2). (B) Primære humane RPE-celler viste reduserte nivåer av glutathione; Effekten var imidlertid mindre fremtredende enn for ARPE-19, men likevel statistisk signifikant sammenlignet med kontrollene ved 350, 500 og 700 μM H2O2. 350 μM var den laveste H2O2-konsentrasjonen som forårsaket betydelig oksidativ skade som vist ved reduserte glutathionenivåer sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller (p = 0,0022). Glutathione nivåer redusert med økende H2O2 konsentrasjoner (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) Cytotoksisitetsanalyse viste at 350 μM H2O2 var den laveste konsentrasjonen som ga en signifikant reduksjon i prosentandelen levedyktige celler (p < 0,0001 for 350, 500 og 700 μM). Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD (n = 3 replikerer) og signifikante forskjeller er indikert med (*); post-hoc-beregninger av ANOVA ble utført ved hjelp av Tukeys multisammenligningstest som sammenlignet C- med H2O 2-behandlingsgruppene. C-: H2O2 ikke-behandlede celler. Denne figuren er endret fra Bascuas et al.37. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Morfologi av ikke-transfekerte og PEDF- eller GM-CSF-transfekerte ARPE-19-celler behandlet med H2O2. Celler behandlet med økende konsentrasjoner av H2O2 viser færre celler i kulturbrønnene og viser en mer avrundet, mindre spredt morfologi, et kjent tegn på cellulær stress. Merk at for PEDF- eller GM-CSF-transfekterte celler er cellulær stress mindre fremtredende og vokser lik ikke-behandlede kontrollceller. C-: ikke-behandlede kontrollceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Påvirkning av cellenummer på effekten av H2O2-indusert oksidativt stress. 5.000 og 10.000 ARPE-19 celler/brønn ble sådd i 96 brønnplater. Etter 24 timer ble celler behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer. Signifikante forskjeller i glutathionenivåer ble observert i brønnene sådd med 5000 celler (p = 0,031, t-test), men ikke i brønnene frøet med 10.000 celler. C-: ikke-behandlede celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analyse av antioksidanteffekten av PEDF og GM-CSF levert av SB100X-transfected humane RPE-celler i oksidative stressforhold
Som positive kontroller ble ARPE-19 og primære humane RPE-celler behandlet med 5, 50 eller 500 ng/ml kommersielt tilgjengelig PEDF eller GM-CSF i 2 dager før og under 24 h H2O2-behandlingen. ARPE-19 celler behandlet med 500 ng/ml PEDF eller 50 ng/ml GM-CSF produserte betydelig mer glutathione sammenlignet med ubehandlede kontroller under oksidative forhold (H2O2-behandlet) (Figur 5A); sammenlignbare PEDF- og GM-CSF-renset fra kulturmedier av transfekterte ARPE-19-celler viste en lignende effekt (Figur 5B). I primære hRPE-celler er tilsetningen av 500 ng/ml PEDF, 50 ng/ml GM-CSF, eller 500 ng/ml PEDF pluss 50 ng/ml GM-CSF, uansett om kommersielle eller rensede medier som er betinget av PEDF- eller GM-CSF-transfekerte ARPE-19-celler, reduserte celleskaden som reflektert av en betydelig økning i glutathionenivåer (Figur 5C). Primære hRPE-celler behandlet i 10 dager med betinget medium fra transfiserte ARPE-19-celler viste også høyere glutathionenivåer sammenlignet med kontrollceller (Figur 5D). Basert på disse resultatene er det gjort ytterligere eksperimenter med 500 ng/ml for PEDF og 50 ng/ml for GM-CSF.

ARPE-19 og primære hRPE-celler ble transfektert med genkoding for PEDF og/eller GM-CSF ved hjelp av Sleeping Beauty transposon-systemet kombinert med elektroporasjon. Etter transfeksjon og analyse av genuttrykk ved RT-qPCR, WB, ELISA og immunhiistokjemi (se Tilleggsmateriale, Figur S1og Figur S2), viste transfiserte ARPE-19-celler eksponert for 350 μM H2O2 i 24 timer signifikant høyere glutathionenivåer enn ikke-transfekterte H2O2-behandledeceller (Figur 6A ). For primære hRPE-celler er det en betydelig økning i glutathionenivåer i PEDF-transfekerte celler sammenlignet med ikke-transfiserte celler behandlet med H2O2 når alle donorer ble inkludert i analysen. Videre viser donor 2 og 3 en betydelig økning i glutathione nivåer for alle transfected grupper (PEDF, GM-CSF, PEDF, og GM-CSF) (data ikke vist).

Studien av UCP2-genuttrykket fullførte analysen ved undersøkelse av mitokondrie oksidativt stress. En konseptgodkjenningsserie ble utført i transfekterte ARPE-19 celler behandlet med 350 μM H2O2 i 24 timer. Som vist i figur 7, i transfekerte ARPE-19 celler, økes nivåene av UCP2 genuttrykk etterH2O2-behandling, men økningen er ikke statistisk signifikant. Figur 8 viser en WB av fosforylatert Akt (pAkt) fra et lysat av GM-CSF-transfekerte celler eksponert for H2O2; de normaliserte dataene viser bare en liten reduksjon sammenlignet med den ubehandlede kontrollen, noe som indikerer at GM-CSF kan beskytte cellene mot oksidativ stressskade.

Figure 5
Figur 5: Glutathione nivå som en markør for antioksidantkapasiteten til PEDF og GM-CSF. (A) Behandling av ARPE-19 celler med 500 ng/ml PEDF eller 50 ng/ml GM-CSF i 3 dager før og under 24 h H2O2 eksponering økte nivået av glutathione fra 0,83 μM (C) til 1,83 μM (PEDF) og 1,3 μM (GM-CF), p = henholdsvis 0,026 og p = 0,031. Ved en konsentrasjon på 5 ng/ml ble det ikke observert noen økning i glutathione; forskjellen i nivået av glutathione mellom 50 og 500 ng/ml var ikke signifikant for verken PEDF eller GM-CSF. (B) PEDF (500 ng/ml) og GM-CSF (50 ng/ml) renset fra betingede medier av transfekterte ARPE-19 celler viste en effekt som ligner kommersielt tilgjengelig PEDF eller GM-CSF (p = 0,018, ANOVA). (C) Tilsetning av 500 ng/ml PEDF, 50 ng/ml GM-CSF, eller 500 ng/ml PEDF pluss 50 ng/ml GM-CSF i 3 dager før og under 24 timer H2O2 behandling til kulturmediet til primære hRPE-celler økte nivåene av glutathione i celler behandlet med PEDF (2,6 μM [kommersiell], 2,5 μM [renset]), GM-CSF (2,9 μM [kommersiell], 3,3 μM [renset]) og PEDF pluss GM-CSF (3,0 μM [kommersiell], 2,9 μM [renset]) sammenlignet med ikke-behandlede celler (1,9 μM) (p = 0,006, Kruskal-Wallis test). (D) En signifikant økning i glutathione nivåer ble observert for hRPE celler dyrket i 10 dager i betinget medium fra PEDF-, GM-CSF-, eller PEDF-GM-CSF-transfected ARPE-19 celler før cellene ble behandlet med H2O2 (p = 0.003, Kruskal-Wallis test) (data vist for en donor). Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n = 3 replikerer). Signifikante forskjeller er indikert med (*); post-hoc-beregninger av variansanalysene ble utført ved å beregne Tukeys eller Dunnetts multisammenligningstester som sammenlignet "C" med PEDF-/GM-CSF-behandlede grupper. C: celler behandlet bare med H2O2, P: celler behandlet med PEDF, G: celler behandlet med GM-CSF, P + G: celler behandlet med PEDF pluss GM-CSF. Denne figuren er endret fra Bascuas et al.37. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Glutathione-nivå som en markør for antioksidantkapasiteten til PEDF- og GM-CSF-transfekerte humane RPE-celler. (A) Nivåene av glutathione av transfekterte ARPE-19 celler eksponert for 350 μM H2O2 i 24 timer (56 dager etter transfeksjon) var signifikant høyere sammenlignet med ikke-transfekerte celler (1,9 μM), dvs. og 3,4 μM for doble transfekterte celler (p = 0,0001, ANOVA). Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n = 3 replikerer). (B) Prikkplottet viser gjennomsnittlige glutathione verdier for fire forskjellige givere (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), som varierer betydelig mellom ikke-transfekerte og PEDF-transfected celler (p = 0,028, post-hoc beregninger av ANOVA ble utført ved hjelp av Tukeys multi-sammenligningstester som sammenlignet "C" med PEDF-/GM-CSF-behandlede grupper). Når giverne analyseres separat, viser donor N°2 og N°3 (se tabell 2 for symbol i grafen) signifikante forskjeller for alle transfekterte grupper sammenlignet med ikke-transfektert kontroll (signifikanser vises ikke) behandlet medH2O2. C: ikke-transfekerte celler, P: PEDF-transfekerte celler, G: GM-CSF-transfekerte celler, P +G: PEDF- og GM-CSF-transfekerte celler. Denne figuren er endret fra Bascuas et al.37. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: UCP2-genuttrykk i transfekerte ARPE-19-celler behandlet med H2O2. Siden UCP2 genuttrykk kan brukes til å undersøke mitokondrie oksidativ skade, undersøkte vi effekten av overekspressering av PEDF og GM-CSF ved transfekterte ARPE-19 celler. Transfekerte ARPE-19-celler behandlet med H2O2, selv om de ikke er statistisk signifikante, viser økt UCP2 genuttrykk sammenlignet med ikke-transfektert kontroll som indikerer oksidativ stressreduksjon, var foldeøkningen 1,57 for PEDF-, 1,51 for GM-CSF- og 2,36 for PEDF- pluss GM-CSF-transfected celler sammenlignet med ikke-transfektert kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Western Blot av fosforylatert Akt (Ser473) fra et cellelys av GM-CSF-transfekerte ARPE-19 celler. WB viste at GM-CSF forbedrer fosforylering av Akt i både ubehandlede og H2O2-behandledekulturer (UT: 3,32; H2O2: 2,69). Verdiene normaliseres til ikke-transfekterte ikke-H2O2-behandlede celler (C/UT). C: ikke-transfekerte, G: GM-CSF-transfekerte celler, UT: celler ikke-behandlet med H2O2, H2O2: celler behandlet med H2O2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell S1: Primerparsekvenser og glødetid/-temperatur som brukes til RT-qPCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen. 

Figur S1: PEDF- og GM-CSF-genuttrykksanalyse i transfekterte hRPE-celler. RT-qPCR bekreftet at transfekterte primære hRPE-celler viste en betydelig økning i PEDF (p = 0,003, Kruskal-Wallis-test) og GM-CSF (p = 0,013, Kruskal-Wallis test) genuttrykk sammenlignet med ikke-transfekterte celler. 2^(-ΔΔCT)-metoden ble brukt i dette tilfellet36. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n = 4 givere). Hver prikk representerer gjennomsnittet av tre replikeringer. Denne figuren er endret fra Bascuas et al.37. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S2: Proteinsekresjon i transfekerte primære hRPE- og ARPE-19-celler. (A) Kvantifiseringen av utskilte proteiner av ELISA viste at transfekterte hRPE-celler utskilte betydelig mer PEDF og GM-CSF enn ikke-transfected celler (p = 0,014 for PEDF, og p = 0,006 for GM-CSF, Kruskal-Wallis test). Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD (n = 4 givere). Hver prikk representerer gjennomsnittet av tre replikeringer. (B) PEDF-GM-CSF dobbel farging bekreftet co-sekresjonen av PEDF og GM-CSF i dobbelttransfekterte ARPE-19 celler (sammenslått figur). Denne figuren er endret fra Bascuas et al.37. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmateriale. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her tilbyr en tilnærming for å analysere den antioksidative og beskyttende funksjonen til PEDF og GM-CSF produsert av transfected celler, som kan brukes på celler transfektert med ethvert putativt gunstig gen. I genterapeutiske strategier som har som mål å levere proteiner til vev ved å transplantere genetisk modifiserte celler, er det viktig å skaffe informasjon om nivået av proteinuttrykk, uttrykkslevelighet og effektiviteten av det uttrykte proteinet i en modell av sykdommen. I vårt laboratorium har protokollen som presenteres her vært nyttig for å definere effektiviteten av PEDF og GM-CSF på oksidativt stress, som har blitt hypoteset som et viktig element i patogenesen av aAMD6,7. Spesielt har vi brukt protokollen til å definere den antioksidative effekten av SB100X-medierte PEDF / GM-CSF-transfected primære hRPE-celler. Flere etterforskere har vist at H2O2 induserer betydelige symptomer på oksidativtstress,men tillater fortsatt celleregenerering28,29,38, som ligner resultatene av våre eksperimenter som har vist at 350 μM i 24 h induserer effektiv oksidativt stress hos humane ARPE-19 og primære RPE-celler som kan brukes til å analysere den beskyttende effekten av PEDF og GM-CSF. H2O2 som oksidativt middel er valgt for studien på grunn av sin fysiologiske tilstedeværelse i øyet og tilsvarende forsvarsmekanismer, for eksempel glutathione metabolisme20,21. Vårt laboratorium har undersøkt andre modeller for oksidativt stress som behandling av celler med tBH, som initierer lipidperoksidasjon i nærvær av redoksaktive metallioner1; Oksidativt stress var imidlertid ubetydelig. I forsøkene som presenteres her, ble celler behandlet medH2O2 i 24 timer fordi vi fant at kortere behandlingstider på 2-6 timer er tilstrekkelig til å indusere endringer i genuttrykk20, men påfølgende konsekvenser, for eksempel celleproliferasjon, celle levedyktighet og glutathione nivåer, er kanskje ikke synlige ennå. Ellers fører den lille størrelsen på brønnene, som er nødvendig for cytotoksisitet og glutathioneanalyser, raskt til en sammenfallende kulturbrønn; Dette kan føre til kontakthemming og maskering av effekten av oksidativt middel. Derfor virker en lang inkubasjon med H2O2 ikke nyttig, selv om degenerasjonen sett i aAMD er forårsaket av kronisk oksidativt stress6,7.

En begrensning av forsøkene som presenteres her er at antall celler sådd påvirker den oksidative effekten av H2O2, det vil si for samme H2O2-behandling, signifikante forskjeller i glutathionenivåene mellom H2O2-behandlede og ikke-behandlede celler ble observert når 5000 celler, men ikke når 10.000 celler ble sådd (Figur 4 ). Protokollen vi presenterer krever såing av et lavt antall celler, det vil si 3000 når celler dyrkes i 3 dager og 5000 når celler dyrkes i 2 dager (figur 1). En annen begrensning er at konsentrasjonen av H2O2 er utarmet med tiden; Kaczara et al.39 har vist uttømming av H2O2 over noen timer i ARPE-19 cellekulturer, noe som påvirker utviklingen av kroniske oksidative stressmodeller. Disse etterforskerne har foreslått en alternativ metode for vedvarende H2O2-behandling, spesielt kontinuerlig generering av H2O2 fra glukose i mediet ved hjelp av glukoseoksidase, men en standardisert konsentrasjon på H2O2 kan ikke garanteres. På den annen side har protokollen vi etablerte med levering av oksidantmiddelet i en enkelt puls, fordelen av å være raskere og enklere å utføre sammenlignet med kroniske modeller der H2O2-behandlingen må gjentas i flere dager38.

Cellenes evne til å motvirke oksidativ skade bestemmes av balansen mellom ROS-produksjon og kapasiteten til å generere antioksidanter. I cellen er tripeptidglutathionen (GSH) det dominerende reduksjonsmiddelet, som kan oksideres til glutathione disulfid (GSSG) og regenereres ved glutathione reduktase ved hjelp av NADPH40. I friske celler er mer enn 90% av det totale glutathione bassenget til stede i redusert form. Når celler utsettes for økt oksidativt stressnivå, akkumuleres GSSG og forholdet mellom GSSG og GSH øker. Følgelig er overvåking av glutathione redokstilstanden i biologiske prøver avgjørende for evalueringen av avgiftningsstatusen til celler og vev fra frie radikaler generert under oksidativt stress og celleskade. Protokollen som er beskrevet her for kvantifisering av glutathione er følsom nok til å oppdage antioksidanteffekten av PEDF og GM-CSF uttrykt av RPE-celler genetisk modifisert.

Siden oksidativt stress påvirker mitokondrieaktiviteter40, er det spesielt interessant at kontrollen av ROS-nivåer av PEDF er relatert til reguleringen av mitokondrie-frakoblingsprotein 2 (UCP2), og PEDF demper effekten av oksidativt stress ved å øke UCP2-uttrykket11,41. Hovedfunksjonen til UCP2 er å kontrollere mitokondrier-avledet ROS og fungere som en sensor av mitokondrie oksidativt stress41,42. Her, i tillegg til å undersøke effekten av PEDF og GM-CSF på glutathione nivåer, har vi genuttrykket til UCP2 har en tendens til å øke (Figur 7); ytterligere studier er nødvendige for å etablere PEDF og GM-CSFs rolle på UCP2 genuttrykk.

Totalt sett tilbyr den nåværende H2O2-modellenen omfattende tilnærming for å undersøke den gunstige effekten av transposonbaserte genterapier som tar sikte på å levere antioksidantterapeutiske gener til pasientens celler for å behandle nevrodegenerativ sykdom som AMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Gregg Sealy og Alain Conti for utmerket teknisk assistanse og prof. Zsuzsanna Izsvák fra Max-Delbrück Center i Berlin for vennlig å gi pSB100X og pT2-CAGGS-Venus plasmider. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Sciences Foundation og EU-kommisjonen i sammenheng med det syvende rammeprogrammet. Z.I ble finansiert av European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Medisin utgave 166 okulær genterapi aldersrelatert makuladegenerasjon oksidativ stressskade Sleeping Beauty transposon ikke-viral genlevering RPE-celler PEDF GM-CSF
Induksjon og analyse av oksidativt stress i <em>sovende skjønnhet</em> transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter