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Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Presentamos un protocolo para el desarrollo y uso de un modelo de estrés oxidativo mediante el tratamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina con H2O2,analizando la morfología celular, la viabilidad, la densidad, el glutatión y el nivel de UCP-2. Es un modelo útil para investigar el efecto antioxidante de las proteínas secretadas por las células transfectadas por transposones para tratar la degeneración neurorretiniana.

Abstract

El estrés oxidativo juega un papel crítico en varias enfermedades degenerativas, incluida la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una patología que afecta a ~ 30 millones de pacientes en todo el mundo. Conduce a una disminución de los factores neuroprotectores sintetizados por el epitelio pigmentario de la retina (EPR), por ejemplo, el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), seguido de la pérdida de células RPE y, finalmente, la muerte de células fotorreceptoras y ganglionares retinianas (RGC). Planteamos la hipótesis de que la reconstitución del ambiente retiniano neuroprotector y neurogénico mediante el trasplante subretiniano de células RPE transfectadas que sobreexpresan PEDF y GM-CSF tiene el potencial de prevenir la degeneración retiniana al mitigar los efectos del estrés oxidativo, inhibir la inflamación y apoyar la supervivencia celular. Utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB100X),las células RPE humanas se han transfectado con los genes PEDF y GM-CSF y han demostrado una integración génica estable, expresión génica a largo plazo y secreción de proteínas utilizando qPCR, western blot, ELISA e inmunofluorescencia. Para confirmar la funcionalidad y la potencia del PEDF y GM-CSF secretados por las células RPE transfectadas, hemos desarrollado un ensayo in vitro para cuantificar la reducción del estrés oxidativo inducido por H2O2en células RPE en cultivo. La protección celular se evaluó mediante el análisis de la morfología celular, la densidad, el nivel intracelular de glutatión, la expresión del gen UCP2 y la viabilidad celular. Tanto las células RPE transfectadas que sobreexpresan PEDF y/o GM-CSF como las células no transfectadas pero pretratadas con PEDF y/o GM-CSF (disponibles comercialmente o purificadas a partir de células transfectadas) mostraron una protección celular antioxidante significativa en comparación con los controles no tratados. El presente modelo H2O2es un enfoque simple y efectivo para evaluar el efecto antioxidante de factores que pueden ser efectivos para tratar la DMAE o enfermedades neurodegenerativas similares.

Introduction

El modelo descrito aquí, ofrece un enfoque útil para evaluar la eficiencia de los agentes biofarmacéuticos para reducir el estrés oxidativo en las células. Hemos utilizado el modelo para investigar los efectos protectores del PEDF y GM-CSF sobre el estrés oxidativo mediado por H2O2sobre las células epiteliales pigmentarias de la retina, que están expuestas a altos niveles de O2y luz visible, y la fagocitosis de las membranas del segmento externo fotorreceptor, generando niveles significativos de especies reactivas de oxígeno (ROS)1, 2. Se consideran un importante contribuyente a la patogénesis de la degeneración macular avascular relacionada con la edad (aAMD)3,4,5,6,7,8. Además, hay una disminución en los factores neuroprotectores sintetizados por RPE, específicamente el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) que conducen a la disfunción y pérdida de células RPE, seguidos de la muerte de células fotorreceptoras y ganglionares de la retina (RGC)3,4,5 . La DMAE es una enfermedad compleja que resulta de la interacción entre factores metabólicos, funcionales, genéticos y ambientales4. La falta de tratamientos para la AAMD es la principal causa de ceguera en pacientes mayores de 60 años en países industrializados9,10. La reconstitución del ambiente retiniano neuroprotector y neurogénico mediante el trasplante subretiniano de células RPE modificadas genéticamente que sobreexpresan PEDF y GM-CSF tiene el potencial de prevenir la degeneración retiniana al mitigar los efectos del estrés oxidativo, inhibir la inflamación y apoyar la supervivencia celular11,12,13,14,15,16 . A pesar de que existen varias metodologías para entregar genes a las células, hemos elegido el sistema de transposones de la Bella Durmiente hiperactiva no viral para entregar los genes PEDF y GM-CSF a las células RPE debido a su perfil de seguridad, la integración de los genes en el genoma de las células huésped y su propensión a integrar los genes entregados en sitios no transcripcionalmente activos como hemos demostrado anteriormente17, 18,19.

El estrés oxidativo celular puede ser inducido en células cultivadas in vitro por varios agentes oxidativos, incluyendo peróxido de hidrógeno (H2O2),4-hidroinonenal (HNE), tertbututilhidroperóxido (tBH), altas tensiones de oxígeno y luz visible (espectro completo o irradiación UV)20,21. Las altas tensiones de oxígeno y la luz requieren equipos y condiciones especiales, lo que limita la transferibilidad a otros sistemas. Agentes como H2O2,HNE y tBH inducen cambios moleculares y celulares superpuestos de estrés oxidativo. Elegimos H2O2 para probar la actividad antioxidante de PEDF y GM-CSF porque es conveniente y biológicamente relevante ya que es producido por las células RPE como un intermedio reactivo de oxígeno durante la fagocitosis del segmento externo fotorreceptor22 y se encuentra en los tejidos oculares in vivo23. Dado que la oxidación del glutatión puede ser parcialmente responsable de la producción de H2O2 en el ojo, hemos analizado los niveles de GSH/glutatión en nuestros estudios, que están relacionados con el estrés oxidativo inducido por H2O2y la capacidad regenerativa de las células21,22. El análisis de los niveles de glutatión es especialmente relevante ya que participa en los mecanismos de protección antioxidante en el ojo24. La exposición a H2O2 se utiliza con frecuencia como modelo para examinar la susceptibilidad al estrés oxidativo y la actividad antioxidante de las células RPE1,25,26,27,28,29,30, y, además, muestra similitudes con el daño por estrés oxidativo inducido por la luz, una fuente "fisiológica" de estrés oxidativo21.

Para evaluar la funcionalidad y la eficacia de los factores neuroprotectores, hemos desarrollado un modelo in vitro que permite cuantificar el efecto antioxidante de los factores de crecimiento expresados por células modificadas genéticamente para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. Aquí, mostramos que las células RPE transfectadas con los genes para PEDF y GM-CSF son más resistentes a los efectos nocivos de H2O2 que las células de control no transfectadas, como lo demuestra la morfología celular, la densidad, la viabilidad, el nivel intracelular de glutatión y la expresión del gen UCP2, que codifica para la proteína de desacoplamiento mitocondrial 2 que se ha demostrado que reduce las especies reactivas de oxígeno (ROS)31.

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Protocol

Los procedimientos para la recolección y el uso de los ojos humanos fueron aprobados por la Comisión Ética Cantonal para la Investigación (no. 2016-01726).

1. Aislamiento celular y condiciones de cultivo

  1. Línea celular arpe-19 humana
    1. Cultivo 5 x 105 células ARPE-19, una línea celular de EPR humano, en la mezcla de medio/nutriente F-12 ham (DMEM/Ham's F-12) de Dulbecco suplementada con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina U/mL, estreptomicina de 80 μg/mL y 2,5 μg/ml de anfotericina B (medio completo) a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire en un matraz T75 (para otras densidades celulares ver Tabla 1).
    2. Cambie el medio tres veces por semana.
    3. Una vez que las células crecen a aproximadamente el 90% de confluencia (evaluada cualitativamente), aspire el medio y lave las células con 1x PBS estéril.
    4. Incubar las células con una solución de TRIPSINA-2% de EDTA al 5% durante 7-10 min a 37 °C (para volúmenes ver Tabla 1). Monitoree el desprendimiento visualmente.
    5. Detenga la tripsinización agregando un medio completo que contenga un 10% de FBS (para volúmenes, consulte la Tabla 1).
    6. Transfectar las células (ver paso 2. del protocolo), subcultivar las células en una proporción de 1:10 (una vez por semana), o sembrar en una placa de 96 pocillos como se detalla a continuación (ver pasos 3.3 y 3.4 del protocolo).
Medio (ml)
Superficie (cm²) Densidad de siembra para células ARPE-19 (células/pozo) Aplicación Para cultivo celular Para detener la tripsina Volumen de tripsina (ml)
Matraz T75 75 5,00,000 Crecimiento celular de ARPE-19 10 7 3
Placa de 6 pozos 9.6 1,00,000 Siembra de células ARPE-19 transfectadas 3 1 0.5
Placa de 24 pocillos 2 50,000 Siembra de células hRPE transfectadas 1 0.8 0.2
Placa de 96 pozos 0.32 5.000 para experimentos de estrés oxidativo con células transfectadas (Fig. 1) Experimentos de estrés oxidativo 0.2
3.000 para experimentos de estrés oxidativo con células no transfectadas más proteínas (Fig. 1)

Tabla 1: Volúmenes de cultivo celular. Volúmenes de medios recomendados para placas de cultivo celular y matraces para el cultivo de ARPE-19 y células RPE humanas primarias.

  1. Células RPE humanas primarias
    1. Aislar células RPE humanas primarias según lo descrito por Thumann et al.17, y células de cultivo en medio completo suplementado con 20% FBS.
    2. Cambie el medio dos veces por semana. Una vez que las células alcanzan la confluencia (monitoreadas visualmente), reduzca el FBS al 1% para evitar el crecimiento excesivo.
    3. Transfectar las células (ver paso 2 del protocolo), o sembrar en una placa de 96 pocillos como se detalla a continuación (ver pasos 3.3 y 3.4 del protocolo).
      NOTA: Los datos aquí presentados fueron recolectados del cultivo de células RPE obtenidas de los ojos de cuatro donantes humanos. La Tabla 2 detalla la demografía de los donantes del Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Los ojos se enuclearon 12,7 ± 5,7 h (media ± SD) post mortem después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
No edad género muerte a preservación (horas) muerte al aislamiento cultivo cultivo Símbolo en el gráfico
(días) antes de la transfección (días) después de la transfección (días)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
significar 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabla 2: Demografía de donantes humanos para células epiteliales pigmentarias de la retina.

2. Electroporación de ARPE-19 y células primarias de EPR humano

  1. Tripsinizar células ARPE-19 o células RPE humanas primarias como se describe en los pasos 1.1.3-1.1.5 del protocolo.
  2. Realice la electroporación con el kit de transfección disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).
    1. Para la transfección de células ARPE-19 consulte Johnen et al.32 y para hRPE primario a Thumann et al.17. Brevemente, resuspenda 1 x 105 células ARPE-19 o 5 x 104 células primarias de hRPE en 11 μL de tampón R y añadir 2 μL de mezcla de plásmidos que contenga 0,03 μg pSB100X transposasa33 y 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His o pT2-CMV-GMCSF-Su transposón (relación transposasa:transposón 1:16). Para las células dobles transfectadas de PEDF y GM-CSF, utilice una relación de 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His,y 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Utilice los siguientes parámetros de electroporación: dos pulsos de 1.350 V para 20 ms (ancho de pulso) para celdas ARPE-19; dos pulsos de 1.100 V para 20 ms para células primarias.
  3. Semilla 1 x 105 ARPE-19 transfectado o 5 x 104 células primarias de hRPE transfectadas en placas de 6 pocillos y 24 pocillos, respectivamente, en medio suplementado con 10% fbS sin antibióticos ni antimicóticos. Agregue penicilina (80 U/mL), estreptomicina (80 μg/mL) y anfotericina B (2,5 μg/mL) con el primer intercambio medio 3 días después de la transfección.
  4. Determinar el crecimiento celular mediante el monitoreo microscópico semanal de las células. La eficacia de la transfección se controla mediante el análisis de la expresión génica mediante RT-PCR, y la secreción de proteínas mediante ELISA y WB (métodos explicados en Material complementario).
    NOTA: La eficiencia de la transfección se puede evaluar por primera vez una vez que las células alcanzan la confluencia, es decir, a ~ 7 días y 4 semanas después de la transfección para las células ARPE-19 y las células primarias de hRPE, respectivamente.
  5. Células de semilla en una placa de 96 pocillos como se detalla a continuación (ver paso 3.5 del protocolo).

3. Inducción del estrés oxidativo (tratamiento H2O2) y neuroprotección (tratamiento PEDF y/o GM-CSF)

  1. Preparación del medio acondicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Utilizar células ARPE-19 transfectadas con los genes PEDF, GM-CSF, o ambos (ver paso 2 del protocolo); células de cultivo durante 28 días como se describe en el paso 1.1 del protocolo.
    2. A los 28 días después de la transfección, tripsinizar las células (ver pasos 1.1.3-1.1.5 del protocolo), contar las células utilizando una cámara de Neubauer34,35y sembrar 5 x 105 células en matraces T75 en medio completo como se describe en el paso 1.1.1 del protocolo. Intercambiar el medio cuando el cultivo celular sea aproximadamente 80% confluente (aproximadamente después de 1 semana; verificado cualitativamente). Recoger el medio después de 24 h.
    3. Conservar el medio a -20 °C hasta su uso.
      NOTA: La concentración suficiente del PEDF recombinante y gm-CSF en el medio acondicionado fue verificada por WB y cuantificada por ELISA como se describe en Material suplementario.
  2. Purificación de PEDF y GM-CSF a partir de medio acondicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Centrifugar el medio recogido del paso 3.1.2 a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    2. Utilice el superflujo Ni-NTA (consulte la Tabla de materiales) deacuerdo con los protocolos del fabricante para purificar las proteínas marcadas con His como se describe a continuación.
      1. Pipetear 30 μL de mezcla de Ni-NTA en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2.600 x g durante 30 s y desechar el flujo a través. Lave el pellet dos veces con 200 μL de tampón de incubación 1x.
      2. Centrifugar a 2.600 x g durante 30 s y desechar el flujo. Añadir 40 μL de tampón de incubación 4x y resuspend.
      3. Añadir 900 μL de medio acondicionado centrifugado e incubar a 70 rpm (agitador orbital) durante 1 h a RT. Centrifugar a 2.600 x g durante 1 min y el flujo de descarte.
      4. Lave el pellet dos veces con 175 μL de tampón de incubación 1x. Centrifugar a 2.600 x g durante 30 s y desechar el flujo.
      5. Para eludir las proteínas PEDF y GM-CSF marcadas con His, agregue 20 μL de tampón de elución e incube a 70 rpm (agitador orbital) durante 20 min en RT. Centrífuga a 2.600 x g durante 30 s. Mantenga el sobrenadante que contenga PEDF recombinante o GM-CSF.
    3. Cuantificar la proteína total utilizando el kit de ensayo de proteína BCA disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Guarde la solución proteica a -20 °C hasta su uso.
      NOTA: El tampón de incubación (4x) contiene 200 mM NaH2PO4,1.2 M NaCl y 40 mM Imidazol; El tampón de elución contiene 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 250 mM Imidazol.
  3. Tratamiento de células ARPE-19/hRPE primarias no transfectadas con medio acondicionado más H2O2 (Figura 1A)
    1. Sembrar 3.000 células ARPE-19 no transfectadas (a partir de la etapa 1.1.6 del protocolo) o hRPE primario (a partir de la etapa 1.2.3 del protocolo) por pozo en placa de 96 pocillos y cultivo en 200 μL de medio acondicionado a partir de células ARPE-19 transfectadas.
    2. Cultive las células durante 10 días a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire. Cambie el medio acondicionado todos los días. Exponer las células a 350 μM H2O2 durante 24 h.
    3. Evaluar el daño por estrés oxidativo y determinar el efecto antioxidante de PEDF y GM-CSF mediante la cuantificación de los niveles de glutatión (ver paso 4.1 del protocolo), microscopía (ver paso 4.2 del protocolo) y ensayo de citotoxicidad (ver paso 4.2 del protocolo).
      NOTA: La duración del experimento es de 12 días. Las placas de micropocillos de fondo plano transparente se utilizan para evaluar la luminiscencia y la morfología celular. Para realizar simultáneamente el ensayo de citotoxicidad y glutatión, se deben sembrar dos placas con células el mismo día.
  4. Tratamiento de células ARPE-19/hRPE primarias no transfectadas con factores de crecimiento PEDF y GM-CSF más H2O2 (Figura 1B)
    1. Sembrar 3.000 células ARPE-19 no transfectadas (a partir de la etapa 1.1.6 del protocolo) o hRPE primario (a partir de la etapa 1.2.3 del protocolo) por pocillo (placas de 96 pocillos con un fondo plano transparente) en 200 μL de medio de cultivo completo que contenga 500 ng/mL de PEDF recombinante y/o 50 ng/mL de GM-CSF recombinante, purificado a partir del medio de células de ARPE-19 transfectadas o disponible comercialmente. Células de cultivo durante 48 h a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire. Renovar diariamente el medio, incluidos los factores de crecimiento PEDF y GM-CSF.
      NOTA: Agregue los factores de crecimiento frescos al medio.
    2. Después de 48 h de tratar las células con los factores de crecimiento, retire el medio y agregue el medio completo que contenga 350 μM H2O2 más 500 ng / ml PEDF y / o 50 ng / mL GM-CSF.
    3. Evaluar el daño por estrés oxidativo y determinar el efecto antioxidante de PEDF y GM-CSF mediante la cuantificación de los niveles de glutatión (ver paso 4.1 del protocolo), microscopía (ver paso 4.2 del protocolo) y ensayo de citotoxicidad (ver paso 4.2 del protocolo).
      NOTA: La duración del experimento es de 3 días.
  5. Tratamiento de células ARPE-19/hRPE primarias transfectadas con H2O2 (Figura 1C)
    1. Verificar la suficiente expresión génica y la secreción de proteínas de las células transfectadas por WB y ELISA como se describe en el Material Suplementario.
    2. Retire el medio de los pocillos que contienen las células transfectadas (consulte el paso 2 del protocolo).
    3. Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3-1.1.5 del protocolo. Contar las células usando una cámara de Neubauer34,35.
    4. Sembrar 5.000 células transfectadas/pozo en placa de 96 pocillos en 200 μL de medio completo. Células de cultivo durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire. Después de 24 h, exponer las células a 350 μM H2O2 durante 24 h.
    5. Evaluar el daño por estrés oxidativo y determinar el efecto antioxidante del PEDF y el GM-CSF mediante la cuantificación de los niveles de glutatión (ver paso 4.1 del protocolo), microscopía (ver paso 4.2 del protocolo), ensayo de citotoxicidad (ver paso 4.2 del protocolo) y determinación de la expresión génica de UCP2 (ver paso 4.3 del protocolo).
      NOTA: La duración del experimento es de 2 días.

Figure 1
Figura 1: Líneas de tiempo del ensayo H2O2 en los tres enfoques experimentales diferentes. Se sembraron 3.000 células no transfectadas tratadas con el medio acondicionado/proteínas recombinantes o 5.000 células transfectadas en placas de 96 pocillos para su tratamiento con H2O2. Para determinar el efecto del medio condicionado, las células se cultivaron en medio 100% cultivado durante 10 días consecutivos, cambiando de medio todos los días. Para determinar el efecto de los factores de crecimiento recombinantes, las células se cultivaron agregando la cantidad adecuada de factores de crecimiento cada día durante 3 días consecutivos. Tenga en cuenta que las células no transfectadas se sembraron a 3.000 células por pozo para evitar el crecimiento excesivo durante la mayor duración del cultivo en comparación con las células transfectadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Análisis del nivel de estrés oxidativo y capacidad antioxidante

  1. Ensayo de glutatión
    1. Mida los niveles de glutatión (GSH) utilizando el kit disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, prepare y asigne el volumen de 1x mezcla de reactivos (reactivo de 100 μL/pozo): sustrato de luciferina-NT y glutatión S-transferasa diluido 1:100 en Reaction Buffer.
      NOTA: Una placa de 96 pocillos requiere 10 ml de mezcla de reactivo 1x, que se prepara agregando 100 μL de sustrato de Luciferin-NT y 100 μL de glutatión S-transferasa a 10 mL de tampón de reacción. Prepare la mezcla de reactivos 1x inmediatamente antes de usarla. No almacene la mezcla de reactivos preparada para su uso futuro.
    2. Prepare el reactivo de detección de luciferina transfiriendo una botella de tampón de reconstitución al reactivo de detección de luciferina liofilizado.
    3. Preparar una curva estándar utilizando una solución estándar de glutatión (GSH) (5 mM). Diluir 5 mM de solución de GSH 1:100 con dH2O (añadir 10 μL de solución de GSH de 5 mM a 990 μL de dH2O). Realizar 7 diluciones seriadas 1:1 en 500 μL de dH2O. Transferir 10 μL de cada estándar diluido a un pozo apropiado por duplicado.
      NOTA: La concentración final de glutatión oscilará entre 0,039 μM y 5 μM.
    4. Prepare el espacio en blanco (1x mezcla de reactivos) y transfiera 10 μL (duplicados) a los pozos apropiados.
    5. Retire las células tratadas con H2O2de la incubadora.
      NOTA: Documentar la morfología de las células tratadas con H2O2mediante microscopía de campo brillante (40x).
      Cuando las células se oxidan, se ven más redondeadas y menos dispersas.
    6. Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo. Agregue 100 μL de mezcla de reactivos 1x preparada a cada pocillo. Mezcle las celdas con el reactivo durante 15 s a 500 rpm en un agitador orbital.
    7. Incubar la placa en RT durante 30 min. Agregue 100 μL de reactivo de detección de luciferina reconstituido a cada pozo.
    8. Mezcle la solución durante 15 s a 500 rpm en un agitador orbital. Incubar la placa durante 15 min en RT.
    9. Determine la luminiscencia utilizando un lector de placas utilizando un programa preinstalado ADP-Glo.
      NOTA: Coloque la placa dentro del lector de placas sin la tapa.
      1. Haga clic en Cambiar diseño y elija la siguiente configuración en Parámetros básicos:Placa Costar de 96 pocillos; óptica superior; retraso de posicionamiento: 0.1; hora de inicio de la medición: 0.0; tiempo de intervalo de medición: 1.0; tiempo para normalizar los resultados: 0.0; la ganancia es ajustada automáticamente por el dispositivo. Defina espacios en blanco, estándares y ejemplos. Haga clic en Iniciar medición.
      2. Exporte los datos como un archivo de Excel. Calcular la concentración de GSH en cada muestra mediante interpolación de la curva estándar.
  2. Ensayo de citotoxicidad y análisis microscópico
    1. Aspire el medio de las células y agregue 100 μL de medio completo que contenga 1% de FBS a cada pozo. Devuelva las células a la incubadora.
      NOTA: Se utiliza un 1% de FBS porque los porcentajes más altos de FBS pueden interferir con la medición de la luminiscencia, por lo tanto, se utiliza un 1% de FBS en este caso.
    2. Mida la viabilidad celular utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, prepare la mezcla de reactivos agregando el tampón de ensayo al sustrato liofilizado. Prepare el reactivo de lisis agregando 33 μL de digitonina a un tampón de ensayo de 5 ml (para una placa de 96 pocillos). Mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, use una mezcla de reactivos recién preparada. Úselo dentro de las 12 h si se almacena en RT. La mezcla de reactivos se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 7 días y puede almacenarse en alícuotas de un solo uso durante un máximo de 4 meses a -70 °C. Debe evitarse la congelación y la descongelación. El reactivo de lisis se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 7 días.
    3. Prepare una curva estándar con células ARPE-19 no tratadas.
      1. Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3-1.1.5 del protocolo y contar las células utilizando una cámara de Neubauer34,35. Centrifugar las células a 120 g durante 10 min en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en el medio F12 de DMEM/Ham que contiene 1% de FBS a una concentración final de 1 x 105 células/ml.
      2. Preparar 7 diluciones seriales 1:1 en medio de 200 μL que contengan 1% de FBS. Transfiera 100 μL de cada estándar a los pozos apropiados (duplicados). Añadir 50 μL de mezcla de reactivos a todos los pocillos.
    4. Mezcle las celdas con el reactivo durante 15 s a 500 rpm en un agitador orbital. Incubar la placa durante 15 min en RT. Mida la luminiscencia utilizando el lector de placas como se describe en el paso 4.1.9 del protocolo. Añadir 50 μL del reactivo de lisis e incubar durante 15 min. Mida la luminiscencia utilizando el lector de placas como se describe en el paso 4.1.9 del protocolo.
    5. Calcule el porcentaje de células viables: (100 - % de células muertas) y el porcentaje de células muertas = [1ª medición de luminiscencia ((células muertas en la muestra))/ 2ª medición de luminiscencia (todas las células muertas después del tratamiento con digitoninas)] x 100.
  3. Análisis de expresión de UCP2 mediante RT-qPCR
    1. Tripsinizar las células transfectadas como se describió anteriormente (pasos 1.1.3-1.1.5 del protocolo).
    2. Contar las células usando una cámara de Neubauer34,35.
    3. Sembra 5.000 células/pozo ARPE-19 transfectados en placas de 96 pocillos.
    4. Después de 24 h de cultivo, tratar las células con 350 μM H2O2 durante 24 h.
    5. Aislar el ARN total utilizando un kit comercial para el aislamiento del ARN de un bajo número de células (ver Tabla de Materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante.
    6. Realizar PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) como se describe en Material suplementario. Brevemente, genere ADNc por retrotranscripción utilizando una mezcla disponible comercialmente que contenga una transcriptasa inversa M-MLV optimizada (ver Tabla de materiales).
    7. Para qPCR emplear un cóctel de reacción listo para usar que contenga todos los componentes (incluido SYBR Green) excepto los cebadores (ver Tabla S1 de Material Suplementario)y la plantilla de ADN. Utilice las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, 40 ciclos con desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 60 °C durante 30 s y alargamiento a 72 °C durante 32 s.
    8. Utilice el método 2^(-ΔΔCT) para el análisis36.
  4. Preparación de lisado celular para análisis SDS-PAGE y WB de pAkt (Ser473)
    1. Sembrar 3 x 105 células ARPE-19 transfectadas GM-CSF/pozo en placas de 6 pocillos (≥21 días después de la transfección) para determinar si GM-CSF protege a las células RPE del daño por H2O2 a través de la activación de la vía de supervivencia Akt15.
    2. Después de 24 h de cultivo las células se exponen a 350 μM H2O2 durante 24 h.
    3. Mezclar 1 ml de tampón RIPA con 10 μL de cóctel inhibidor de la proteasa fosfatasa, 10 μL de 0,5 M de EDTA y 25 μL de 8 M de urea (volúmenes utilizados para un pocillo).
    4. Aspire cuidadosamente el medio y lave las células con 1x PBS.
    5. Agregue todo el volumen de la mezcla de búfer RIPA a las celdas.
    6. Pipeta arriba y abajo.
    7. Recoger el lisado en tubos de 1,5 ml.
    8. Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
    9. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    10. Determinar los niveles de pAkt en 15 μL de lisado celular sin diluir por WB como se describe en Material suplementario.

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Representative Results

Inducción de estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias retinianas humanas
Las células ARPE-19 y hRPE primarias fueron tratadas con concentraciones variables de H2O2 durante 24 h y se cuantificó el nivel intracelular del antioxidante glutatión(Figura 2A,B). H2O2 a 50 μM y 100 μM no afectaron la producción de glutatión, mientras que a 350 μM hubo una disminución significativa de glutatión en ARPE-19 y células primarias de hRPE. El análisis de la citotoxicidad mostró que 350 μM es la concentración más baja de H2O2 que causa una disminución significativa en la viabilidad celular (Figura 2C). Morfológicamente, las células ARPE-19 tratadas con H2O2 aparecen menos diseminadas y más redondeadas, características que se hacen más evidentes con el aumento de la concentración de H2O2 (Figura 3). El efecto fue menos prominente para las células transfectadas por PEDF y GM-CSF tratadas con H2O2 (Figura 3). Para demostrar el efecto del número de células sobre el estrés oxidativo mediado porH2 O2,se sembraron 5.000 y 10.000 células ARPE-19 por pozo en una placa blanca de 96 pocillos; al día siguiente, las células fueron tratadas con 350 μM H2O2 durante 24 h y se determinaron los niveles de glutatión. La Figura 4 muestra que el nivel de glutatión disminuyó solo en los pocillos (n = 3) sembrados con 5.000 células. Para los experimentos para determinar el efecto de los antioxidantes de H2O2-ROS generadas, es esencial considerar el número de células; para el protocolo específico presentado en este informe, 3.000-5.000 células/pocillo (placas de 96 pocillos) tratadas durante 24 h con 350 μM H2O2 son apropiadas para mostrar un daño celular significativo al tiempo que conservan la capacidad de recuperación imitando una respuesta subaguda al daño celular inducido por el estrés oxidativo.

Figure 2
Figura 2: Nivel de estrés oxidativo evidenciado como nivel de glutatión y viabilidad celular, en células RPE humanas tratadas con H2O2. (A) Las células ARPE-19 expuestas a varias concentraciones de H2O2 mostraron una disminución significativa de los niveles de glutatión (entre paréntesis) a 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) y 700 μM (0,002 μM) en comparación con H2O2-células no tratadas (2,9 μM) (p < 0,0001 para 350, 500, y 700 μM H2O2). (B) Las células RPE humanas primarias mostraron una disminución de los niveles de glutatión; sin embargo, el efecto fue menos prominente que para ARPE-19, pero aún estadísticamente significativo en comparación con los controles a 350, 500 y 700 μM H2O2. 350 μM fue la concentración más baja de H2O2 que produjo un daño oxidativo significativo, como lo demuestra la disminución de los niveles de glutatión en comparación con las células de control no tratadas (p = 0,0022). Los niveles de glutatión disminuyeron con el aumento de las concentraciones de H2O2 (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) El análisis de citotoxicidad mostró que 350 μM H2O2 fue la concentración más baja que produjo una disminución significativa en el porcentaje de células viables (p < 0,0001 para 350, 500 y 700 μM). Los datos se presentan como media ± de la DE (n = 3 réplicas) y se indican diferencias significativas con (*); Los cálculos post-hoc del ANOVA se realizaron utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey comparando C- con los grupos de tratamiento H2O2. C-: H2O2 células no tratadas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Bascuas et al.37. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Morfología de células ARPE-19 no transfectadas y transfectadas por PEDF o GM-CSF tratadas con H2O2. Las células tratadas con concentraciones crecientes de H2O2 muestran menos células en los pozos de cultivo y muestran una morfología más redondeada y menos diseminada, un signo conocido de estrés celular. Tenga en cuenta que para las células transfectadas por PEDF o GM-CSF, el estrés celular es menos prominente y crece de manera similar a las células de control no tratadas. C-: células control no tratadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Influencia del número de células en el efecto del estrés oxidativo inducido por H2O2. Se sembraron 5.000 y 10.000 células/pozo ARPE-19 en placas de 96 pocillos. Después de 24 h, las células se trataron con 350 μM H2O2 durante 24 h. Se observaron diferencias significativas en los niveles de glutatión en los pocillos sembrados con 5.000 células (p = 0,031, prueba t)pero no en los pocillos sembrados con 10.000 células. C-: células no tratadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis del efecto antioxidante de PEDF y GM-CSF entregado por células RPE humanas transfectadas SB100Xen condiciones de estrés oxidativo
Como controles positivos, arpe-19 y células primarias de EPR humano se trataron con 5, 50 o 500 ng/ml de PEDF o GM-CSF disponibles comercialmente durante 2 días antes y durante el tratamiento de 24 h H2O2. Las células ARPE-19 tratadas con 500 ng/mL PEDF o 50 ng/mL GM-CSF produjeron significativamente más glutatión en comparación con los controles no tratados en condiciones oxidativas (H2O2-treated) (Figura 5A); PEDF y GM-CSF comparables purificados a partir de medios de cultivo de células arpe-19 transfectadas mostraron un efecto similar (Figura 5B). En las células primarias de hRPE, la adición de 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF o 500 ng/mL PEDF más 50 ng/mL GM-CSF, ya sean comerciales o purificados a partir de medios condicionados por células ARPE-19 transfectadas por PEDF o GM-CSF, redujo el daño celular como se refleja en un aumento significativo en los niveles de glutatión (Figura 5C). Las células primarias de hRPE tratadas durante 10 días con medio acondicionado de células ARPE-19 transfectadas también mostraron niveles más altos de glutatión en comparación con las células de control(Figura 5D). Sobre la base de estos resultados, se han realizado más experimentos con 500 ng/mL para PEDF y 50 ng/mL para GM-CSF.

Las células ARPE-19 y hRPE primarias fueron transfectadas con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente combinado con electroporación. Después de la transfección y el análisis de la expresión génica por RT-qPCR, WB, ELISA e inmunohistoquímica (ver Material Suplementario, Figura S1y Figura S2),las células transfectadas de ARPE-19 expuestas a 350 μM H2O2 durante 24 h mostraron niveles de glutatión significativamente más altos que las células tratadas con H2O2no transfectadas(Figura 6A ). Para las células primarias de hRPE, hay un aumento significativo en los niveles de glutatión en las células transfectadas por PEDF en comparación con las células no transfectadas tratadas con H2O2 cuando se incluyeron todos los donantes en el análisis. Además, los donantes 2 y 3 muestran un aumento significativo en los niveles de glutatión para todos los grupos transfectados (PEDF, GM-CSF, PEDF y GM-CSF) (datos no mostrados).

El estudio de la expresión del gen UCP2 completó el análisis mediante el examen del estrés oxidativo mitocondrial. Se realizó una serie de prueba de concepto en células ARPE-19 transfectadas tratadas con 350 μM H2O2 durante 24 h. Como se muestra en la Figura 7,en las células ARPE-19 transfectadas, los niveles de expresión del gen UCP2 después del tratamiento con H2O2 aumentan, pero el aumento no es estadísticamente significativo. La Figura 8 muestra un WB de Akt fosforilado (pAkt) de un lisado de células transfectadas gm-CSF expuestas a H2O2; los datos normalizados muestran solo una pequeña disminución en comparación con el control no tratado, lo que indica que GM-CSF puede proteger a las células del daño por estrés oxidativo.

Figure 5
Figura 5: Nivel de glutatión como marcador de la capacidad antioxidante de PEDF y GM-CSF. (A) El tratamiento de células ARPE-19 con 500 ng/mL PEDF o 50 ng/mL GM-CSF durante 3 días antes y durante 24 h H2O2 exposición aumentó el nivel de glutatión de 0,83 μM (C) a 1,83 μM (PEDF) y 1,3 μM (GM-CSF), p = 0,026 y p = 0,031, respectivamente. A una concentración de 5 ng/ml no se observó aumento del glutatión; la diferencia en el nivel de glutatión entre 50 y 500 ng/ml no fue significativa ni para el PEDF ni para el GM-CSF. (B) PEDF (500 ng/mL) y GM-CSF (50 ng/mL) purificados a partir de medios acondicionados de células transfectadas de ARPE-19 mostraron un efecto similar al PEDF o GM-CSF disponible comercialmente (p = 0,018, ANOVA). (C) La adición de 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF, o 500 ng/mL PEDF más 50 ng/mL GM-CSF durante 3 días antes y durante 24 h H2O2 tratamiento al medio de cultivo de células primarias de hRPE aumentó significativamente los niveles de glutatión en células tratadas con PEDF (2,6 μM [comercial], 2,5 μM [purificado]), GM-CSF (2,9 μM [comercial], 3,3 μM [purificado]) y PEDF más GM-CSF (3,0 μM [comercial], 2,9 μM [purificado]) en comparación con las células no tratadas (1,9 μM) (p = 0,006, prueba de Kruskal-Wallis). (D) Se observó un aumento significativo en los niveles de glutatión para las células hRPE cultivadas durante 10 días en medio acondicionado a partir de células ARPE-19 transfectadas por PEDF-, GM-CSF-o PEDF-GM-CSF antes de que las células fueran tratadas con H2O2 (p = 0,003, prueba de Kruskal-Wallis) (datos mostrados para un donante). Los datos se expresan como media ± de SD (n = 3 réplicas). Las diferencias significativas se indican con (*); Los cálculos post-hoc de los análisis de varianza se realizaron mediante el cálculo de las pruebas de comparación múltiple de Tukey o Dunnett comparando "C" con los grupos tratados con PEDF-/GM-CSF. C: células tratadas únicamente con H2O2, P: células tratadas con PEDF, G: células tratadas con GM-CSF, P+G: células tratadas con PEDF más GM-CSF. Esta cifra ha sido modificada a partir de Bascuas et al.37. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Nivelde glutatión como marcador de la capacidad antioxidante de las células RPE humanas transfectadas por PEDF y GM-CSF. (A) Los niveles de glutatión de las células ARPE-19 transfectadas expuestas a 350 μM H2O2 durante 24 h (56 días después de la transfección) fueron significativamente más altos en comparación con las células no transfectadas (1,9 μM), es decir, 3,0 μM para las células transfectadas por PEDF y GM-CSF, y 3,4 μM para células dobles transfectadas (p = 0,0001, ANOVA). Los datos se expresan como media ± DE (n = 3 réplicas). (B) El diagrama de puntos muestra los valores medios de glutatión para cuatro donantes diferentes (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P+G: 1,2 μM), que difiere significativamente entre células no transfectadas y transfectadas por PEDF (p = 0,028, los cálculos post-hoc del ANOVA se realizaron utilizando las pruebas de comparación múltiple de Tukey comparando "C" con los grupos tratados con PEDF-/GM-CSF). Cuando los donantes se analizan por separado, el donante N°2 y N°3 (ver Tabla 2 para símbolo en el gráfico) muestran diferencias significativas para todos los grupos transfectados en comparación con el control no transfectado (no se muestran significancias) tratado con H2O2. C: células no transfectadas, P: células transfectadas por PEDF, G: células transfectadas por GM-CSF, P+G: células transfectadas por PEDF y GM-CSF. Esta cifra ha sido modificada a partir de Bascuas et al.37. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Expresión del gen UCP2 en células ARPE-19 transfectadas tratadas con H2O2. Dado que la expresión del gen UCP2 se puede utilizar para examinar el daño oxidativo mitocondrial, examinamos el efecto de la sobreexpresión de PEDF y GM-CSF por células ARPE-19 transfectadas. Las células ARPE-19 transfectadas tratadas con H2O2,aunque no son estadísticamente significativas, muestran un aumento de la expresión génica de UCP2 en comparación con el control no transfectado que indica reducción del estrés oxidativo, el aumento del pliegue fue de 1,57 para PEDF-, 1,51 para GM-CSF-, y 2,36 para PEDF- más células transfectadas gm-CSF en comparación con el control no transfectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Western Blot de Akt fosforilado (Ser473) de un lisado celular de células ARPE-19 transfectadas gm-CSF. El WB demostró que GM-CSF mejora la fosforilación de Akt tanto en cultivos no tratados como en H2O2-tratados (UT: 3.32; H2O2: 2.69). Los valores se normalizan a células no transfectadas no tratadas con H2O2(C/UT). C: no transfectadas, G: células transfectadas gm-CSF, UT: células no tratadas con H2O2, H2O2: células tratadas con H2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla S1: Secuencias de pares de imprimación y tiempo/temperatura de recocido utilizados para RT-qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 

Figura S1: Análisis de expresión génica PEDF y GM-CSF en células hRPE transfectadas. El RT-qPCR verificó que las células primarias transfectadas de hRPE mostraron un aumento significativo en la expresión génica de PEDF (p = 0,003, prueba de Kruskal-Wallis) y GM-CSF (p = 0,013, prueba de Kruskal-Wallis) en comparación con las células no transfectadas. En este caso se utilizó el método 2^(-ΔΔCT)36. Los datos se expresan como media ± DE (n = 4 donantes). Cada punto representa el promedio de tres réplicas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Bascuas et al.37. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S2: Secreción de proteínas en células primarias transfectadas de hRPE y ARPE-19. (A) La cuantificación de proteínas secretadas por ELISA mostró que las células hRPE transfectadas secretaron significativamente más PEDF y GM-CSF que las células no transfectadas (p = 0,014 para PEDF, y p = 0,006 para GM-CSF, prueba de Kruskal-Wallis). Los datos se presentan como media ± de des (n = 4 donantes). Cada punto representa el promedio de tres réplicas. (B) La doble tinción PEDF-GM-CSF confirmó la cosecreción de PEDF y GM-CSF en células ARPE-19 de doble transfección (figura fusionada). Esta cifra ha sido modificada a partir de Bascuas et al.37. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Material complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El protocolo presentado aquí ofrece un enfoque para analizar la función antioxidante y protectora de PEDF y GM-CSF producidos por células transfectadas, que se puede aplicar a células transfectadas con cualquier gen beneficioso putativo. En las estrategias terapéuticas génicas que tienen el objetivo de entregar proteínas al tejido mediante el trasplante de células modificadas genéticamente, es fundamental obtener información sobre el nivel de expresión de proteínas, la longevidad de la expresión y la efectividad de la proteína expresada en un modelo de la enfermedad. En nuestro laboratorio, el protocolo aquí presentado ha sido útil para definir la eficacia del PEDF y GM-CSF sobre el estrés oxidativo, que ha sido hipotetizado como un elemento importante en la patogénesis de la AAMD6,7. Específicamente, hemos utilizado el protocolo para definir el efecto antioxidante de las células primarias de hRPE transfectadas por PEDF/GM-CSF mediadas por SB100X. Varios investigadores han demostrado que H2O2 induce síntomas significativos de estrés oxidativo pero aún permite la regeneración celular28,29,38,similar a los resultados de nuestros experimentos que han demostrado que 350 μM durante 24 h induce estrés oxidativo efectivo en células humanas ARPE-19 y RPE primarias que se pueden utilizar para analizar el efecto protector del PEDF y GM-CSF. H2O2 como agente oxidativo ha sido elegido para el estudio debido a su presencia fisiológica en el ojo y los mecanismos de defensa correspondientes, por ejemplo, el metabolismo del glutatión20,21. Nuestro laboratorio ha examinado otros modelos de estrés oxidativo como el tratamiento de células con tBH, que inicia la peroxidación lipídica en presencia de iones metálicos redox-activos1; sin embargo, el estrés oxidativo fue insignificante. En los experimentos presentados aquí, las células fueron tratadas con H2O2 durante 24 h porque encontramos que los tiempos de tratamiento más cortos de 2-6 h son suficientes para inducir cambios en la expresióngénica 20,pero las consecuencias posteriores, por ejemplo, la proliferación celular, la viabilidad celular y los niveles de glutatión, podrían no ser visibles todavía. De lo contrario, el pequeño tamaño de los pocillos, necesario para los ensayos de citotoxicidad y glutatión, conduce rápidamente a un pozo de cultivo confluente; esto podría conducir a la inhibición del contacto y a un enmascaramiento del efecto del agente oxidativo. Por lo tanto, una incubación larga con H2O2 no parece útil, aunque la degeneración observada en aAMD es causada por el estrés oxidativo crónico6,7.

Una limitación de los experimentos presentados aquí es que el número de células sembradas influye en el efecto oxidativo de H2O2,es decir, para el mismo tratamiento de H2O2, se observaron diferencias significativas en los niveles de glutatión entre H2O2-células tratadas y no tratadas cuando se sembraron 5.000 células pero no cuando se sembraron 10.000 células (Figura 4 ). El protocolo que presentamos requiere sembrar un número bajo de células, es decir, 3.000 cuando las células se cultivan durante 3 días y 5.000 cuando las células se cultivan durante 2 días(Figura 1). Otra limitación es que la concentración de H2O2 se agota con el tiempo; Kaczara et al.39 han mostrado agotamiento de H2O2 en pocas horas en cultivos celulares de ARPE-19, lo que afecta el desarrollo de modelos de estrés oxidativo crónico. Estos investigadores han propuesto un método alternativo para el tratamiento sostenido de H2O2, específicamente generando continuamente H2O2 a partir de glucosa en el medio utilizando la glucosa oxidasa, pero no se puede garantizar una concentración estandarizada de H2O2. Por otro lado, el protocolo que establecimos con la administración del agente oxidante en un solo pulso, tiene la ventaja de ser más rápido y sencillo de realizar en comparación con los modelos crónicos en los que el tratamiento H2O2 tiene que repetirse durante varios días38.

La capacidad de las células para contrarrestar el daño oxidativo está determinada por el equilibrio entre la producción de ROS y la capacidad de generar antioxidantes. En la célula, el tripéptido glutatión (GSH) es el agente reductor predominante, que puede ser oxidado a disulfuro de glutatión (GSSG) y regenerado por glutatión reductasa utilizando NADPH40. En las células sanas, más del 90% de la reserva total de glutatión está presente en la forma reducida. Cuando las células están expuestas a un mayor nivel de estrés oxidativo, GSSG se acumula y la proporción de GSSG a GSH aumenta. En consecuencia, el monitoreo del estado redox de glutatión en muestras biológicas es esencial para la evaluación del estado de desintoxicación de células y tejidos de radicales libres generados durante el estrés oxidativo y la lesión celular. El protocolo detallado aquí para la cuantificación del glutatión es lo suficientemente sensible como para detectar el efecto antioxidante del PEDF y gm-CSF expresado por células RPE modificadas genéticamente.

Dado que el estrés oxidativo afecta a las actividades mitocondriales40,es particularmente interesante que el control de los niveles de ROS por PEDF esté relacionado con la regulación de la proteína de desacoplamiento mitocondrial 2 (UCP2), y PEDF atenúa los efectos del estrés oxidativo al aumentar la expresión de UCP211,41. La función principal de UCP2 es controlar las ROS derivadas de las mitocondrias y actuar como un sensor de estrés oxidativo mitocondrial41,42. Aquí, además de examinar el efecto del PEDF y GM-CSF sobre los niveles de glutatión, tenemos que la expresión génica de UCP2 tiende a aumentar (Figura 7); se necesitan estudios adicionales para establecer el papel del PEDF y el GM-CSF en la expresión del gen UCP2.

En general, el presente modelo H2O2ofrece un enfoque integral para investigar el efecto beneficioso de las terapias génicas basadas en transposones que tienen como objetivo entregar genes terapéuticos antioxidantes a las células del paciente para tratar enfermedades neurodegenerativas como la DMAE.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Gregg Sealy y Alain Conti por su excelente asistencia técnica y a la Prof. Zsuzsanna Izsvák del Centro Max-Delbrück en Berlín por proporcionar amablemente los plásmidos pSB100X y pT2-CAGGS-Venus. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza de Ciencias y la Comisión Europea en el contexto del Séptimo Programa Marco. Z.I fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
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Medicina Número 166 terapia génica ocular degeneración macular relacionada con la edad daño por estrés oxidativo transposón de la Bella Durmiente, entrega de genes no virales células RPE PEDF GM-CSF
Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de <em>la bella durmiente</em>
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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