Summary
我们提出了一种开发和使用氧化应激模型的方案，方法是用H2O2处理视网膜色素上皮细胞，分析细胞形态，活力，密度，谷胱甘肽和UCP-2水平。它是研究转座子转染细胞分泌的蛋白质治疗神经视网膜变性的抗氧化作用的有用模型。
Abstract
氧化应激在几种退行性疾病中起着关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种影响全球约3000万患者的病理。它导致视网膜色素上皮 （RPE） 合成的神经保护因子减少，例如色素上皮衍生因子 （PEDF） 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF），随后 RPE 细胞丢失，最终导致光感受器和视网膜神经节细胞 （RGC） 死亡。我们假设通过转染的RPE细胞过表达PEDF和GM-CSF的视网膜下移植来重建神经保护性和神经源性视网膜环境，有可能通过减轻氧化应激的影响，抑制炎症和支持细胞存活来预防视网膜变性。使用 睡美人 转座子系统（SB100X），人RPE细胞已经转染了 PEDF 和 GM-CSF 基因，并使用qPCR，蛋白质印迹，ELISA和免疫荧光显示出稳定的基因整合，长期基因表达和蛋白质分泌。为了确认转染的RPE细胞分泌的 PEDF 和 GM-CSF 的功能和效力，我们开发了一种体外测定法来量化培养物中H2O2诱导的氧化应激对RPE细胞的减少。通过分析细胞形态、密度、谷胱甘肽的细胞内水平 、UCP2 基因表达和细胞活力来评估细胞保护。与未处理的对照相比，转染的RPE细胞过度表达PEDF和/或GM-CSF以及未转染但用PEDF和/或GM-CSF（市售或从转染细胞中纯化）预处理的细胞显示出显着的抗氧化细胞保护。目前的H2O2模型是一种简单有效的方法来评估可能有效治疗AMD或类似神经退行性疾病的因子的抗氧化作用。
Introduction
这里描述的模型为评估生物制药剂减少细胞氧化应激的效率提供了一种有用的方法。我们利用该模型研究了PEDF和GM-CSF对H2O2介导的氧化应激对视网膜色素上皮细胞的保护作用，这些细胞暴露于高水平的O2和可见光，以及光感受器外段膜的吞噬作用，产生显着水平的活性氧（ROS）1， 2.它们被认为是缺血性年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制的主要贡献者3，4，5，6，7，8。此外，RPE合成的神经保护因子减少，特别是色素上皮衍生因子（PEDF），胰岛素样生长因子（IGF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）导致RPE细胞的功能障碍和丢失，其次是光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）死亡3，4，5.AMD是一种复杂的疾病，由代谢，功能，遗传和环境因素之间的相互作用引起4。缺乏对aAMD的治疗是工业化国家60岁以上患者失明的主要原因9，10。通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的转基因RPE细胞重建神经保护性和神经源性视网膜环境，有可能通过减轻氧化应激的影响，抑制炎症和支持细胞存活来预防视网膜变性11，12，13，14，15，16.尽管有几种方法将基因递送到细胞，但我们选择了非病毒性过度活跃的睡美人转座子系统将PEDF和GM-CSF基因递送到RPE细胞，因为它的安全性，基因整合到宿主细胞的基因组中，以及它倾向于将递送的基因整合到非转录活性位点中，正如我们之前所展示的那样17， 18，19.
细胞氧化应激可以通过几种氧化剂在体外培养的细胞中诱导，包括过氧化氢（H2O 2），4-氢炔诺（HNE），过氧化氢叔丁酯（tBH），高氧张力和可见光（全光谱或紫外线照射）20，21。高氧张力和光需要特殊的设备和条件，这限制了向其他系统的可转移性。H 2 O2、HNE和 tBH 等试剂可诱导重叠的氧化应激分子和细胞变化。我们选择H2O2来测试PEDF和GM-CSF的抗氧化活性，因为它方便且具有生物学相关性，因为它是由RPE细胞在光感受器外段吞噬作用22期间作为活性氧中间体产生的，并且存在于体内的眼组织中23。由于谷胱甘肽的氧化可能是眼睛中H2O2产生部分原因，因此我们在研究中分析了GSH / 谷胱甘肽的水平，这与H2O2诱导的氧化应激和细胞的再生能力有关21，22。谷胱甘肽水平的分析特别相关，因为它参与眼睛的抗氧化保护机制24。暴露于H2O2经常被用作模型来检查RPE细胞1，25，26，27，28，29，30的氧化应激敏感性和抗氧化活性，此外，它显示出与光诱导的氧化应激损伤的相似性，氧化应激损伤是氧化应激21的"生理"来源。
为了评估神经保护因子的功能和有效性，我们开发了一种体外模型，该模型允许分析以量化由基因修饰以过度表达PEDF和GM-CSF的细胞表达的生长因子的抗氧化作用。在这里，我们表明，与PEDF和GM-CSF基因转染的RPE细胞比未转染的对照细胞更能抵抗H2O2的有害影响，如细胞形态学，密度，活力，谷胱甘肽的细胞内水平和UCP2基因的表达所证明的那样，UCP2基因编码线粒体解偶联蛋白2，已被证明可以减少活性氧（ROS）31。
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Protocol
收集和使用人眼的程序由州伦理研究委员会批准（编号：2016-01726）。
1. 细胞分离和培养条件
- 人 ARPE-19 细胞系
- 在Dulbecco的改良鹰培养基/营养混合物F-12火腿（DMEM / Ham's F-12）中培养5 x 105 个ARPE-19细胞，这是一种人RPE细胞系，在37°C下在T75烧瓶中加入10%胎牛血清（FBS），80 U / mL青霉素，80μg/ mL链霉素B（完整培养基）在5%CO2 和95%空气的加湿气氛中（其他细胞密度见表1）。
- 每周更换三次介质。
- 一旦细胞生长到约90%汇合（定性评估），吸出培养基并用无菌的1x PBS洗涤细胞。
- 用5%胰蛋白酶-2%EDTA溶液在37°C下孵育细胞7-10分钟（体积见 表1）。直观地监视分离。
- 通过添加含有10%FBS的完整培养基来停止胰蛋白酶消化（体积见表1）。
- 转染细胞（见方案的步骤2），以1：10的比例（每周一次）亚培养细胞，或接种在96孔板中，详见下文（参见方案的步骤3.3和3.4）。
| 中等容量（毫升） | ||||||
| 面积（平方厘米） | ARPE-19细胞（细胞/孔）的接种密度 | 应用 | 用于细胞培养 | 停用胰蛋白酶 | 胰蛋白酶体积 （mL） | |
| 烧瓶 T75 | 75 | 5,00,000 | ARPE-19细胞生长 | 10 | 7 | 3 |
| 6 孔板 | 9.6 | 1,00,000 | 转染ARPE-19细胞的接种 | 3 | 1 | 0.5 |
| 24 孔板 | 2 | 50,000 | 转染hRPE细胞的接种 | 1 | 0.8 | 0.2 |
| 96 孔板 | 0.32 | 5，000用于转染细胞的氧化应激实验（图1） | 氧化应激实验 | 0.2 | ||
| 3，000用于非转染细胞加蛋白质的氧化应激实验（图1） | ||||||
表1：细胞培养体积。推荐用于培养ARPE-19和原代人RPE细胞的细胞培养板和烧瓶的培养基体积。
- 原代人 RPE 细胞
- 分离出Thumann等人17所描述的原代人RPE细胞，并在补充有20%FBS的完整培养基中培养细胞。
- 每周更换两次培养基。一旦细胞达到汇合（目视监测），将FBS降低到1%以避免过度生长。
- 转染细胞（参见方案的步骤2），或在96孔板中接种，详见下文（参见方案的步骤3.3和3.4）。
注：此处提供的数据是从四名人类供体的眼睛获得的RPE细胞培养物中收集的。 表2 详细介绍了狮子会视力礼物眼库（明尼苏达州圣保罗）捐赠者的人口统计数据。根据《赫尔辛基宣言》获得知情同意后，眼睛在死后12.7±5.7小时（平均±SD）进行眼科检查。
| 不 | 年龄 | 性 | 死亡到保存（小时） | 死亡至孤立 | 培养 | 培养 | 图形中的符号 | |
| （天） | 转染前（天） | 转染后（天） | ||||||
| 2 | 80 | M | 20.7 | 8 | 140 | 36 |  |
|
| 3 | 86 | F | 12.8 | 8 | 85 | 45 |  |
|
| 4 | 86 | F | 8.5 | 5 | 26 | 133 |  |
|
| 8 | 83 | F | 8.9 | 6 | 18 | 27 |  |
|
| 意味 着 | 83.8 | 12.7 | 6.8 | 67.3 | 60.3 | |||
| 标清 | 2.9 | 5.7 | 1.5 | 57.0 | 49.1 |
表2：视网膜色素上皮细胞的人类供体人口统计。
2. ARPE-19和原代人RPE细胞的电穿孔
- 胰蛋白酶消化ARPE-19细胞或原代人RPE细胞，如方案的步骤1.1.3-1.1.5中所述。
- 使用市售转染试剂盒进行电穿孔（见 材料表）。
- 对于ARPE-19细胞的转染，请参阅Johnen等人32，对于原代hRPE，请参阅Thumann等人17。简而言之，将1 x 105 ARPE-19细胞或5 x 104原代hRPE细胞重悬于11μLR缓冲液中，并加入2μL含有0.03μgpSB100X转座酶33和0.47μgpT2-CMV-PEDF -His或pT2-CMV-GMCSF -其转座子的质粒混合物（转座酶比例：转座子1：16）。对于PEDF和GM-CSF双转染细胞，使用1：16：16的比例（0.03μgp SB100X，0.47μgpT2-CMV-PEDF-His和0.47μgpT2-CMV-GMCSF-His）。使用以下电穿孔参数：ARPE-19电池的两个脉冲为1，350 V，持续20 ms（脉冲宽度）;原代电池的两个1，100 V脉冲持续20 ms。
- 种子1 x 105 转染ARPE-19或5 x10 4 转染原代hRPE细胞分别在6孔和24孔板中，在补充10%FBS的培养基中，不含抗生素或抗真菌剂。在转染后 3 天，加入青霉素 （80 U/mL）、链霉素 （80 μg/mL） 和两性霉素 B （2.5 μg/mL），首次置换培养基。
- 通过每周显微镜监测细胞来确定细胞生长。通过RT-PCR分析基因表达以及ELISA和WB的蛋白质分泌来监测转染效率（方法在 补充材料中解释）。
注意：一旦细胞达到汇合，即分别在转染后约7天和4周对ARPE-19细胞和原代hRPE细胞进行转染后，可以首次评估转染效率。 - 96孔板中的种子细胞如下所述（参见方案的步骤3.5）。
3. 氧化应激诱导（H2O2 治疗）和神经保护（PEDF和/或GM-CSF治疗）
- 转染ARPE-19细胞的条件培养基的制备
- 使用转染有PEDF，GM-CSF或两者基因的ARPE-19细胞（参见方案的步骤2）;按照方案的步骤1.1所述培养细胞28天。
- 在转染后28天，胰蛋白酶消化细胞（参见方案的步骤1.1.3-1.1.5），使用Neubauer室34，35和种子5×105个细胞在T75烧瓶中完全培养基中，如方案步骤1.1.1所述。当细胞培养物汇合度约为80%时（约1周后;定性验证）交换培养基。24小时后收集培养基。
- 将培养基储存在-20°C直至使用。
注：重组PEDF和GM-CSF在条件培养基中的足够浓度由WB验证，并由ELISA定量，如 补充材料中所述。
- 从转染ARPE-19细胞的调节培养基中纯化PEDF和GM-CSF
- 将步骤3.1.2中收集的培养基在4°C下以10，000×g离心15分钟。
- 根据制造商的协议使用Ni-NTA超级流（见 材料表）来纯化Hi-NTA标记的蛋白质，如下所述。
- 将30μLNi-NTA混合物移液到1.5mL管中，以2，600×g离心30s并丢弃流出物。用200μL1x孵育缓冲液洗涤沉淀两次。
- 以2，600 x g 离心30 s，丢弃流出物。加入40μL4x孵育缓冲液并重悬。
- 加入900μL离心条件培养基，并在室温下以70rpm（轨道振荡器）孵育1小时。
- 用175μL1x孵育缓冲液洗涤沉淀两次。以2，600 x g 离心30 s，丢弃流出物。
- 为了洗脱His标记的PEDF和GM-CSF蛋白，加入20μL洗脱缓冲液，并在室温下以70rpm（轨道振荡器）孵育20分钟。 保持含有重组PEDF或GM-CSF的上清液。
- 根据制造商的说明，使用市售的BCA蛋白测定试剂盒（见 材料表）定量总蛋白。
- 将蛋白质溶液储存在-20°C直至使用。
注意：孵育缓冲液（4x）含有200 mM NaH2PO 4，1.2 M NaCl和40 mM咪唑;洗脱缓冲液含有50 mM NaH2PO 4，300 mM NaCl和250 mM咪唑。
- 用调节培养基加H 2 O 2处理未转染的ARPE-19 /原代hRPE细胞（图1A）
- 在96孔板中每孔接种3，000个未转染的ARPE-19（来自方案的步骤1.1.6）或原代hRPE（来自方案的步骤1.2.3）细胞，并在来自转染ARPE-19细胞的200μL调节培养基中培养。
- 将细胞在37°C下在5%CO2 和95%空气的加湿气氛中培养10天。每天更换调理培养基。将细胞暴露于350μM H2O2 中24小时。
- 通过定量谷胱甘肽水平（见方案的步骤4.1），显微镜检查（见方案的步骤4.2）和细胞毒性测定（见方案的步骤4.2），评估氧化应激损伤并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
注意：实验的持续时间为 12 天。透明平底微孔板用于评估发光和细胞形态。为了同时进行细胞毒性和谷胱甘肽测定，必须在同一天用细胞接种两个板。
- 用PEDF和GM-CSF生长因子加H 2 O2处理未转染的ARPE-19 /原代hRPE细胞（图1B）
- 将3，000个未转染的ARPE-19（来自方案的步骤1.1.6）或原代hRPE（来自方案的步骤1.2.3）细胞每孔（96孔板，具有透明平底）接种在含有500ng / mL重组PEDF和/或50ng / mL重组GM-CSF的完整培养基中，从转染ARPE-19细胞培养基中纯化或市售。在37°C下在5%CO2 和95%空气的加湿气氛中培养细胞48小时。每天更新培养基，包括PEDF和GM-CSF生长因子。
注意：将新鲜的生长因子加入培养基中。 - 用生长因子处理细胞48小时后，除去培养基并加入含有350μM H2O2 加500 ng / mL PEDF和/或50 ng / mL GM-CSF的完整培养基。
- 通过定量谷胱甘肽水平（见方案的步骤4.1），显微镜检查（见方案的步骤4.2）和细胞毒性测定（见方案的步骤4.2），评估氧化应激损伤并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
注意：实验的持续时间为 3 天。
- 将3，000个未转染的ARPE-19（来自方案的步骤1.1.6）或原代hRPE（来自方案的步骤1.2.3）细胞每孔（96孔板，具有透明平底）接种在含有500ng / mL重组PEDF和/或50ng / mL重组GM-CSF的完整培养基中，从转染ARPE-19细胞培养基中纯化或市售。在37°C下在5%CO2 和95%空气的加湿气氛中培养细胞48小时。每天更新培养基，包括PEDF和GM-CSF生长因子。
- 用H 2 O 2处理转染的ARPE-19/原代hRPE细胞（图1C）
- 通过WB和ELISA验证转染细胞的充分基因表达和蛋白质分泌，如 补充材料中所述。
- 从含有转染细胞的孔中取出培养基（参见方案的步骤2）。
- 胰蛋白酶消化细胞如方案的步骤1.1.3-1.1.5中所述。使用Neubauer室34，35对细胞进行计数。
- 将5，000转染细胞/孔接种在96孔板中，加入200μL完整培养基中。在37°C下在5%CO 2和95%空气的加湿气氛中培养细胞24 小时。24小时后，将细胞暴露于350μM H2O2 中24小时。
- 通过定量谷胱甘肽水平（见方案的步骤4.1），显微镜检查（见方案的步骤4.2），细胞毒性测定（见方案的步骤4.2）和确定 UCP2 基因表达（见方案的步骤4.3），评估氧化应激损伤并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
注意：实验的持续时间为 2 天。
图1：三种不同实验方法中H2O2测定的时间表。将用条件培养基/重组蛋白处理的3，000个未转染细胞或5，000个转染细胞接种在96孔板中，用于H2O2处理。为了确定条件培养基的效果，将细胞在100%培养基中连续培养10天，每天更换培养基。为了确定重组生长因子的作用，通过每天添加适量的生长因子连续3天来培养细胞。请注意，与转染细胞相比，未转染的细胞接种在每孔3，000个细胞，以避免在更长的培养持续时间内过度生长。请点击此处查看此图的放大版本。
4. 氧化应激水平和抗氧化能力分析
- 谷胱甘肽测定
- 按照制造商的说明，使用市售试剂盒（见 材料表）测量谷胱甘肽（GSH）水平。简而言之，制备和适当体积的1x试剂混合物（100μL试剂/孔）：荧光素-NT底物和谷胱甘肽S-转移酶在反应缓冲液中以1：100稀释。
注意：96孔板需要10 mL的1x试剂混合物，这是通过将100μL荧光素-NT底物和100μL谷胱甘肽S-转移酶加入10mL反应缓冲液来制备的。使用前立即准备1x试剂混合物。不要储存准备好的试剂混合物以备将来使用。 - 通过将一瓶复原缓冲液转移到冻干的荧光素检测试剂中来制备荧光素检测试剂。
- 使用谷胱甘肽（GSH）标准溶液（5mM）准备标准曲线。用dH2O以1：100稀释5mM GSH溶液（将10μL5mM GSH溶液加入990μLdH2O）。在500μL的dH 2 O中进行7次连续1：1稀释，将每种稀释的标准品的10μL转移到一式两份的适当孔中。
注意：谷胱甘肽的最终浓度范围为0.039μM至5μM。 - 准备空白（1x试剂混合物）并将10μL（重复）转移到适当的孔中。
- 从培养箱中取出H2O2处理的细胞。
注意：通过明场显微镜（40x）记录H2O2处理细胞的形态。
当细胞被氧化时，它们看起来更圆润，扩散更少。 - 小心地吸出培养基。向每个孔中加入100μL制备的1x试剂混合物。将细胞与试剂在轨道振荡器上以500rpm混合15秒。
- 将板在室温下孵育30分钟。向每个孔中加入100μL复构的荧光素检测试剂。
- 在轨道振荡器上以500 rpm的速度将溶液混合15秒。将板在室温下孵育15分钟。
- 使用预安装程序ADP-Glo的读板器确定发光。
注：将板放入不带盖子的读板器内。- 单击 "更改布局"， 然后在 "基本参数"中选择以下设置：Costar 96孔板;顶级光学;定位延迟：0.1;测量开始时间：0.0;测量间隔时间：1.0;规范化结果的时间：0.0;增益由设备自动调节。定义空白、标准品和样品。单击 开始测量。
- 将数据导出为 Excel 文件。通过标准曲线的插值计算每个样品中GSH的浓度。
- 按照制造商的说明，使用市售试剂盒（见 材料表）测量谷胱甘肽（GSH）水平。简而言之，制备和适当体积的1x试剂混合物（100μL试剂/孔）：荧光素-NT底物和谷胱甘肽S-转移酶在反应缓冲液中以1：100稀释。
- 细胞毒性测定和显微分析
- 从细胞中吸出培养基，并向每个孔中加入100μL含有1%FBS的完整培养基。将细胞返回培养箱。
注意：使用1%的FBS，因为较高百分比的FBS会干扰发光的测量，因此在这种情况下使用1%的FBS。 - 按照制造商的说明，使用市售的细胞毒性测定试剂盒（见 材料表）测量细胞活力。简而言之，制备试剂混合物，将测定缓冲液加入冻干底物中。通过将33μL洋地黄素加入5mL测定缓冲液（用于一个96孔板）来制备裂解试剂。通过上下移液充分混合，以确保均匀性。
注意：为获得最佳效果，请使用新鲜制备的试剂混合物。试剂混合物可以在4°C下储存长达7天，并且可以在-70°C下以一次性等分试样储存长达4个月。 必须避免冷冻和解冻。裂解试剂可以在4°C下储存长达7天。 - 用未经处理的ARPE-19细胞制备标准曲线。
- 按照方案的步骤1.1.3-1.1.5所述对细胞进行胰蛋白酶消化，并使用Neubauer室34，35对细胞进行计数。在室温下以120g离心细胞10分钟，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于含有1%FBS的DMEM / Ham的F12培养基中至终浓度为1 x 105个细胞/ mL。
- 在含有1%FBS的200μL培养基中制备7个连续1：1稀释液。将每种标准品的100μL转移到适当的孔中（重复）。向所有孔中加入50μL试剂混合物。
- 将细胞与试剂在轨道振荡器上以500rpm混合15秒。在室温下孵育板15分钟，使用读板器测量发光，如方案的步骤4.1.9中所述。加入50μL裂解试剂并孵育15分钟。使用读板器测量发光，如协议的步骤4.1.9中所述。
- 计算活细胞的百分比：（100 - %死细胞）和死细胞的百分比=[第一次发光测量（（样品中的死细胞））/第二次发光测量（所有细胞在地黄素处理后死亡）] x 100。
- 从细胞中吸出培养基，并向每个孔中加入100μL含有1%FBS的完整培养基。将细胞返回培养箱。
- 通过RT-qPCR进行UCP2表达分析
- 如上所述对转染的细胞进行胰蛋白酶消化（方案的步骤1.1.3-1.1.5）。
- 使用Neubauer室34，35对细胞进行计数。
- 在96孔板中播种5，000转染的ARPE-19细胞/孔。
- 培养24小时后，用350μM H2O2 处理细胞24小时。
- 按照制造商的说明，使用商业试剂盒从少量细胞中分离RNA总RNA（见 材料表）。
- 执行实时定量荧光定量 PCR （RT-qPCR），如 补充材料中所述。简而言之，使用含有优化的M-MLV逆转录酶的市售混合物通过反转录产生cDNA（见 材料表）。
- 对于qPCR，采用即用型反应混合物，其中包含除引物（参见补充材料表S1）和DNA模板之外的所有组分（包括SYBR Green）。使用以下热循环条件：在95°C下初始变性10分钟，在95°C下变性40次，15秒，在60°C下退火30秒，在72°C下伸长32秒。
- 使用2^（-ΔΔCT）方法进行分析36。
- 用于pAkt的SDS-PAGE和WB分析的细胞裂解物的制备（Ser473）
- 种子3×105 GM-CSF转染的ARPE-19细胞/孔在6孔板中（转染后≥21天），以确定GM-CSF是否通过激活Akt生存途径15保护RPE细胞免受H2O2的损害。
- 培养24小时后，将细胞暴露于350μM H2O2 中24小时。
- 将1 mL RIPA缓冲液与10μL蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，10μL0.5 M EDTA和25μL8M尿素混合（体积用于一个孔）。
- 小心地吸出培养基并用1x PBS洗涤细胞。
- 将整个体积的RIPA缓冲液混合物加入细胞中。
- 上下移液。
- 将裂解物收集在1.5 mL管中。
- 在4°C下以20，000×g离心30分钟。
- 将上清液转移到新的1.5 mL管中。
- 通过WB测定15μL未稀释的细胞裂解物中pAkt的水平，如 补充材料中所述。
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Representative Results
诱导人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激
ARPE-19和原代hRPE细胞用不同浓度的H2O2处理24小时，并定量抗氧化剂谷胱甘肽的细胞内水平（图2A，B）。H2O2在50μM和100μM不影响谷胱甘肽的产生，而在350μM时，ARPE-19和原代hRPE细胞中的谷胱甘肽显着降低。细胞毒性分析表明，350μM是H2O2的最低浓度，导致细胞活力显着降低（图2C）。从形态学上讲，用H 2 O2处理的ARPE-19细胞看起来扩散更少，更圆润，随着H 2 O2浓度的增加，特征变得更加明显（图3）。对于用H2O2处理的PEDF-和GM-CSF转染细胞，效果不太突出（图3）。为了证明细胞数对H2O2介导的氧化应激的影响，将每孔5，000和10，000个ARPE-19细胞接种在白色96孔板中;第二天，用350μM H2O2处理细胞24小时，测定谷胱甘肽的水平。图4显示谷胱甘肽的水平仅在接种了5，000个细胞的孔（n = 3）中降低。对于确定H 2O2产生的ROS的抗氧化剂作用的实验，必须考虑细胞的数量;对于本报告中提出的特定方案，用350μM H 2 O 2处理24小时的3，000-5，000个细胞/孔（96孔板）适合显示显着的细胞损伤，同时保留恢复能力，模仿对氧化应激诱导的细胞损伤的亚急性反应。
图2：在用H 2 O 2处理的人RPE细胞中，作为谷胱甘肽水平和细胞活力的氧化应激水平证明.（A）ARPE-19细胞暴露于几种浓度的H 2 O 2的细胞中，与H 2O2相比，在350μM（0.66μM），500μM（0.022μM）和700μM（0.002μM）的谷胱甘肽水平（括号中）显示出显着降低谷胱甘肽水平（括号中）（p<0.0001为350， 500 和 700 μM H2O2）。（B） 原代人RPE细胞显示谷胱甘肽水平下降;然而，与ARPE-19相比，效果不那么突出，但与350，500和700μM H2O2的对照组相比，仍然具有统计学意义。350μM是最低的H2O2浓度，产生显着的氧化损伤，如谷胱甘肽水平与未处理的对照细胞相比降低（p = 0.0022）。谷胱甘肽水平随着H2O2浓度的增加而降低（500μM：p = 0.022;700μM：p = 0.0005）。（C）细胞毒性分析表明，350μM H2O2是产生活细胞百分比显着降低的最低浓度（350，500和700μM的p<0.0001）。数据以SD±平均值表示（n = 3次重复），显著差异表示为（*）;使用Tukey的多重比较测试对C-与H 2 O2-处理组进行比较，对方差分析进行事后计算。C-：H2O2未处理的细胞。该图已从Bascuas等人37修改而来。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：用H 2 O2处理的非转染和PEDF或GM-CSF转染ARPE-19细胞的形态学。用增加浓度的H2O2处理的细胞在培养孔中显示出较少的细胞，并显示出更圆润，更少的扩散形态，这是细胞应激的已知迹象。请注意，对于PEDF或GM-CSF转染的细胞，细胞应激不那么突出，并且生长类似于未处理的对照细胞。C-：未经处理的对照细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：细胞数量对H2O2诱导的氧化应激的影响。将5，000和10，000个ARPE-19细胞/孔接种在96孔板中。24小时后，用350μM H2O2处理细胞24小时。在接种了5，000个细胞（p = 0.031，t-test）的孔中观察到谷胱甘肽水平的显着差异，但在接种了10，000个细胞的孔中却没有观察到谷胱甘肽水平的显着差异。C-：未经处理的细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
SB100X转染人RPE细胞在氧化应激条件下对PEDF和GM-CSF的抗氧化作用分析
作为阳性对照，ARPE-19和原代人RPE细胞在24小时H 2 O 2处理之前和期间用5，50或500ng / mL市售PEDF或GM-CSF处理2天。与在氧化条件下（H 2O2处理）下未经处理的对照相比，用500ng / mL PEDF或50 ng / mL GM-CSF处理的ARPE-19细胞产生显着更多的谷胱甘肽（图5A）;从转染ARPE-19细胞的培养基中纯化的PEDF和GM-CSF显示出类似的效果（图5B）。在原代hRPE细胞中，加入500 ng / mL PEDF，50 ng / mL GM-CSF或500 ng / mL PEDF加50 ng / mL GM-CSF，无论是商业的还是从PEDF或GM-CSF转染的ARPE-19细胞调节的培养基中纯化的，都减少了细胞损伤，这反映在谷胱甘肽水平显着增加（图5C）。与对照细胞相比，用转染ARPE-19细胞的调节培养基处理10天的原代hRPE细胞也显示出更高的谷胱甘肽水平（图5D）。基于这些结果，已经进行了进一步的实验，PEDF为500 ng / mL，GM-CSF为50 ng / mL。
ARPE-19和原代hRPE细胞使用 睡美人 转座子系统结合电穿孔转染PEDF和/或GM-CSF的基因。通过RT-qPCR，WB，ELISA和免疫组织化学（参见 补充材料， 图S1和 图S2）转染并分析基因表达后，转染的ARPE-19细胞暴露于350μM H2O2 24 小时后，谷胱甘肽水平明显高于未转染的H2O2处理细胞（图6A).对于原代hRPE细胞，当所有供体都包括在分析中时，与用H2O2 处理的非转染细胞相比，PEDF转染细胞中的谷胱甘肽水平显着增加。此外，供体2和3显示所有转染组（PEDF，GM-CSF，PEDF和GM-CSF）的谷胱甘肽水平显着增加（数据未显示）。
UCP2基因表达的研究通过检查线粒体氧化应激完成了分析。在转染的ARPE-19细胞中进行了概念验证系列，用350μM H2O2处理24小时。如图7所示，在转染的ARPE-19细胞中，H 2 O2处理后UCP2基因表达水平升高，但增加不显著。图8显示了暴露于H2O2的GM-CSF转染细胞裂解物的磷酸化Akt（pAkt）的WB;归一化数据显示，与未处理的对照相比，仅略有下降，表明GM-CSF可以保护细胞免受氧化应激损伤。
图5：谷胱甘肽水平作为PEDF和GM-CSF抗氧化能力的标志物（A）在24小时H2O 2暴露之前和期间用500 ng / mL PEDF或50 ng / mL GM-CSF处理ARPE-19细胞3天，将谷胱甘肽水平从0.83μM（C）增加到1.83μM（PEDF）和1.3μM（GM-CSF）， p = 0.026 和 p = 0.031。在5 ng / mL的浓度下，没有观察到谷胱甘肽的增加;对于PEDF或GM-CSF，谷胱甘肽水平在50至500ng / mL之间的差异均不显着。（B） 从转染 ARPE-19 细胞的条件培养基中纯化的 PEDF （500 ng/mL） 和 GM-CSF （50 ng/mL） 显示出与市售 PEDF 或 GM-CSF 相似的效果（p = 0.018，方差分析）。（C） 在 24 小时 H 2 O 2 处理之前和期间，向原代 hRPE 细胞培养基中加入 500 ng/mL PEDF、50 ng/mL GM-CSF 或 500 ng/mL PEDF 加50 ng/mL GM-CSF，显著提高了用 PEDF 处理的细胞中谷胱甘肽的水平（2.6 μM [商业]， 2.5μM [纯化]），GM-CSF（2.9μM [商业]，3.3μM [纯化]）和PEDF加GM-CSF（3.0μM [商业]，2.9μM [纯化]）与未处理的细胞（1.9μM）相比（p = 0.006，Kruskal-Wallis测试）。（D）在用H 2 O2处理细胞之前，在PEDF，GM-CSF或PEDF-GM-CSF转染的ARPE-19细胞的调节培养基中培养10天的hRPE细胞观察到谷胱甘肽水平显着增加（p =0.003，Kruskal-Wallis测试）（数据显示为一个供体）。数据表示为 SD ±平均值（n = 3 次重复）。显著差异用 （*） 表示;通过计算Tukey或Dunnett的多重比较测试来执行方差分析的事后计算，将"C"与PEDF-/GM-CSF处理组进行比较。C：仅用H2O2处理的细胞，P：用PEDF处理的细胞，G：用GM-CSF处理的细胞，P + G：用PEDF加GM-CSF处理的细胞。该图已从Bascuas等人37修改而来。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：谷胱甘肽水平作为PEDF和GM-CSF转染的人RPE细胞的抗氧化能力的标志物显着高于非转染细胞（1.9μM），即PEDF和GM-CSF转染细胞的3.0μM，转染的ARPE-19细胞的谷胱甘肽水平暴露于350μM H2O 24小时（转染后56天）， 和3.4μM用于双转染细胞（p = 0.0001，方差分析）。数据表示为 SD ±平均值（n = 3 次重复）。（B） 点阵图显示了四种不同供体的平均谷胱甘肽值（C： 0.77 μM;P： 1.45 μM;G： 1.16 μM;P + G：1.2μM），这在未转染和PEDF转染的细胞之间显着差异（p = 0.028，使用Tukey的多重比较测试进行方差分析的事后计算，比较"C"与PEDF-/GM-CSF处理组）。当单独分析供体时，供体N°2和N°3（参见图中符号的表2）与用H2O2处理的非转染对照组（未显示显著性）相比，所有转染组均显示出显着差异。C：非转染细胞，P：PEDF转染细胞，G：GM-CSF转染细胞，P+G：PEDF和GM-CSF转染细胞。该图已从Bascuas等人37修改而来。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：用H 2 O 2处理的转染ARPE-19细胞中的UCP2基因表达。由于UCP2基因表达可用于检查线粒体氧化损伤，因此我们检查了转染ARPE-19细胞对PEDF和GM-CSF的过表达的影响。与未转染的对照组相比，用H2O 2处理的转染ARPE-19细胞虽然没有统计学意义，但与未转染的对照相比，UCP2基因表达增加，表明氧化应激降低，PEDF-为1.57，GM-CSF-为1.51，PEDF-加GM-CSF转染细胞为2.36。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：来自GM-CSF转染ARPE-19细胞裂解物的磷酸化Akt（Ser473）的蛋白质印迹。WB证明，GM-CSF在未经处理和H2O2处理的培养物中增强Akt的磷酸化（UT：3.32;H2O2： 2.69）.这些值归一化为未转染的非H2O2处理的细胞（C / UT）。C：未转染，G：GM-CSF转染细胞，UT：未用H2O2处理的细胞，H2O2：用H2O2处理的细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
表S1：用于RT-qPCR的引物对序列和退火时间/温度。 请点击此处下载此表格。
图S1：转染hRPE细胞中的 PEDF 和 GM-CSF 基因表达分析。 RT-qPCR证实，与未转染的细胞相比，转染原代hRPE细胞的 PEDF（p = 0.003，Kruskal-Wallis试验）和 GM-CSF（p = 0.013，Kruskal-Wallis试验）基因表达显着增加。2^（-ΔΔCT）方法在本例中使用36。数据表示为SD±平均值（n = 4个供体）。每个点表示三个重复的平均值。该图已从Bascuas等人37修改而来。请点击此处下载此文件。
图S2：转染原代hRPE和ARPE-19细胞中的蛋白质分泌。 （A）ELISA对分泌蛋白的定量表明，转染的hRPE细胞比未转染的细胞分泌更多的PEDF和GM-CSF（PEDF为p = 0.014，GM-CSF为p = 0.006，Kruskal-Wallis测试）。数据以SD±平均值表示（n = 4个供体）。每个点表示三个重复的平均值。（B） PEDF-GM-CSF双重染色证实了PEDF和GM-CSF在双转染ARPE-19细胞中的共分泌（合并图）。该图已从Bascuas等人37修改而来。请点击此处下载此文件。
补充材料。请点击此处下载此文件。
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Discussion
这里提出的方案提供了一种分析转染细胞产生的PEDF和GM-CSF的抗氧化和保护功能的方法，可以应用于任何假定有益基因转染的细胞。在以通过移植转基因细胞将蛋白质递送到组织的基因治疗策略中，获得有关蛋白质表达水平，表达寿命以及表达蛋白质在疾病模型中的有效性的信息至关重要。在我们的实验室中，这里提出的方案可用于确定PEDF和GM-CSF对氧化应激的有效性，氧化应激已被假设为aAMD6，7发病机制中的重要元素。具体而言，我们使用该协议来定义SB100X介导的PEDF / GM-CSF转染的原代hRPE细胞的抗氧化作用。一些研究人员已经证明，H2O2诱导明显的氧化应激症状，但仍然允许细胞再生28，29，38，类似于我们的实验结果，该实验结果表明，350μM持续24小时在人ARPE-19和原代RPE细胞中诱导有效的氧化应激，可用于分析PEDF和GM-CSF的保护作用。H2O2作为氧化剂已被选择用于研究，因为它在眼睛中的生理存在和相应的防御机制，例如谷胱甘肽代谢20，21。我们的实验室已经检查了氧化应激的其他模型，例如用tBH处理细胞，其在氧化还原活性金属离子1的存在下启动脂质过氧化;然而，氧化应激可以忽略不计。在这里提出的实验中，细胞用H2O2处理24小时，因为我们发现2-6小时的较短处理时间足以诱导基因表达20的变化，但随后的后果，例如，细胞增殖，细胞活力和谷胱甘肽水平，可能还不可见。否则，细胞毒性和谷胱甘肽测定所需的小孔尺寸迅速导致汇合培养井;这可能导致接触抑制和氧化剂作用的掩盖。因此，与H2O2长期孵育似乎没有用，尽管在aAMD中看到的变性是由慢性氧化应激6，7引起的。
这里提出的实验的局限性是，接种的细胞数量会影响H 2O2的氧化作用，即对于相同的H2O2处理，当5，000个细胞接种时，观察到H2O2处理和未处理细胞之间谷胱甘肽水平的显着差异，而当10，000个细胞接种时则不然（图4).我们提出的方案需要接种少量细胞，即当细胞培养3天时为3，000个，当细胞培养2天时为5，000个（图1）。另一个限制是H2O2的浓度随着时间的推移而耗尽;Kaczara等人39已经表明，在ARPE-19细胞培养物中，H2O2在几个小时内会耗尽，这会影响慢性氧化应激模型的发展。这些研究人员提出了一种持续H2O2处理的替代方法，特别是使用葡萄糖氧化酶从培养基中的葡萄糖连续产生H 2 O2，但不能保证H 2 O2的标准化浓度。另一方面，我们建立的在单个脉冲中递送氧化剂的方案，与H2O2治疗必须重复数天的慢性模型相比，具有更快，更简单的优点38。
细胞抵消氧化损伤的能力取决于ROS产生和产生抗氧化剂的能力之间的平衡。在细胞中，三肽谷胱甘肽（GSH）是主要的还原剂，其可以被氧化成谷胱甘肽二硫化物（GSSG）并通过利用NADPH40的谷胱甘肽还原酶再生。在健康细胞中，超过90%的总谷胱甘肽池以还原形式存在。当细胞暴露于增加的氧化应激水平时，GSSG积累并且GSSG与GSH的比例增加。因此，监测生物样品中的谷胱甘肽氧化还原状态对于评估氧化应激和细胞损伤期间产生的自由基的细胞和组织的解毒状态至关重要。这里详述的谷胱甘肽定量方案足够灵敏，可以检测由RPE细胞转基因表达的PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
由于氧化应激影响线粒体活动40，特别有趣的是，PEDF对ROS水平的控制与线粒体解偶联蛋白2（UCP2）的调节有关，PEDF通过增加UCP2表达11，41来减弱氧化应激的影响。UCP2的主要功能是控制线粒体衍生的ROS并充当线粒体氧化应激的传感器41，42。在这里，除了检查PEDF和GM-CSF对谷胱甘肽水平的影响外，我们还具有UCP2的基因表达趋于增加（图7）;需要进一步的研究来确定PEDF和GM-CSF对UCP2基因表达的作用。
总体而言，目前的H2O2模型提供了一种全面的方法来研究基于转座子的基因疗法的有益效果，这些疗法旨在向患者的细胞提供抗氧化治疗基因，以将神经退行性疾病作为AMD进行治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢Gregg Sealy和Alain Conti的出色技术援助，以及柏林Max-Delbrück中心的Zsuzsanna Izsvák教授慷慨地提供了pSB100X和pT2-CAGGS-Venus质粒。这项工作得到了瑞士国家科学基金会和欧盟委员会在第七个框架方案的范围内的支持。Z.I由欧洲研究委员会ERC Advanced资助[ERC-2011-ADG 294742]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 6-well plates | Greiner | 7657160 | |
| 96-well culture plate white with clear flat bottom | Costar | 3610 | Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay) |
| 96-well plates | Corning | 353072 | |
| Acrylamid 40% | Biorad | 161-0144 | |
| Amphotericin B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| Antibody anti-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
| Antibody anti-PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| Antibody anti-penta-His | Qiagen | 34660 | |
| Antibody anti-phospho-Akt | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Antibody goat anti-mouse Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 cell line | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| chamber culture glass slides | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Duo Set ELISA kit | R&D Systems | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism software (version 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Merck | 107209 | |
| ImageJ software (image processing program) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014 | ||
| Imidazol | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B microscope | Leica Microsystems | ||
| LightCycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 software | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
| Nitrocellulose | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Gel Imaging System | Aplegen Life Science | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Primers | Invitrogen | See Table 1 in Supplementary Materials | |
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
| recombinant hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| recombinant hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA Cell Miniprep System | Promega | Z6011 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase-free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| Semi-dry transfer system for WB | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP substrate | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman nitrocellulose membrane | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
References
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