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Medicine

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

Abstract

산화 스트레스는 전 세계적으로 3천만 명의 환자에게 영향을 미치는 병리학인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 여러 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 망막 색소 상피(RPE)-합성 신경보호인자, 예를 들어, 안료 상피 유래 인자(PEDF) 및 과립세포-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF)의 감소로 이어지며, 결국 광수용체 및 망막 갱셀(RGC)의 손실로 이어진다. 우리는 PEDF와 GM-CSF를 과발현하는 과발뇌형 RPE 세포의 감속 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성이 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하며 세포 생존을 지원함으로써 망막 변성을 예방할 수 있는 잠재력을 가지고 있다고 가설합니다. 수면미트랜스포손 시스템(SB100X)을이용하여 인간 RPE 세포는 PEDF 및 GM-CSF 유전자에 감염되어 qPCR, 서부 블롯, ELISA 및 면역불률을 이용한 안정적인 유전자 통합, 장기 유전자 발현 및 단백질 분비를 보였다. 전감염된 RPE 세포에 의해 분비된 PEDF 및 GM-CSF의 기능성 및 효능을 확인하기 위해, 배양시 RPE 세포에 대한H2O2-유도산화 스트레스의 감소를 정량화하기 위한 시험관 내 분석서를 개발하였다. 세포 보호는 세포 형태학, 밀도, 글루타티온의 세포 내 수준, UCP2 유전자 발현 및 세포 생존가능성을 분석하여 평가하였다. 둘 다, PEDF 및/또는 GM-CSF 및 세포를 과도하게 발현하는 전감염된 RPE 세포는 비감염되었지만 PEDF 및/또는 GM-CSF(소판 또는 전감염된 세포로부터 정수)로 전처리된 비처리 대조군과 비교하여 상당한 항산화 세포 보호를 보였다. 본H2O2-모델은AMD 또는 이와 유사한 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있는 요인의 항산화 효과를 평가하는 간단하고 효과적인 접근법이다.

Introduction

여기에 설명된 모델은 세포의 산화 스트레스를 줄이기 위한 바이오 의약품 제제의 효율성을 평가하는 유용한 접근법을 제공합니다. 우리는 H2O2-매개산화 용 안료 상피 세포에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 보호 효과를 조사하기 위해 모델을 사용했으며, 이는 높은 수준의 O2에노출되며, 가시광선, 광수용체 외부 세그먼트 멤브레인의 phagocytosis를 통해 반응성 산소 종(ROS)1, 1, 1, 1 2. 그(것)들은 혈관 나이 관련 황반 변성의 병인에 중요한 기여자로 간주됩니다 (aAMD)3,4,5,6,7,8. 게다가, RPE 합성 신경 보호 인자, 특히 안료 상피 유래 인자 (PEDF), 인슐린 과같은 성장 인자 (IGFs), 및 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 RPE 세포의 기능 장애 및 손실로 이어지는후, 광수용체 및 망막 갱셀(R) 세포3,4GC세포(RGC) . AMD는 대사, 기능성, 유전적 및 환경적 요인4사이의 상호 작용에서 발생하는 복잡한 질환이다. aAMD에 대한 치료의 부족은 선진국9,10에서60 세 이상의 환자에서 실명의 주요 원인입니다. PEDF및 GM-CSF를 과도하게 발현하는 유전자 변형 RPE 세포의 피하 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성은 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하고 세포생존11,12,13, 14,14, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15,15,1 . 세포에 유전자를 전달하는 몇 가지 방법론이 있지만, 우리는 그 안전 프로필, 숙주 세포의 게놈에 유전자의 통합, 그리고 우리가이전에보여 준 바와 같이 비 전사 활성 사이트에 전달 된 유전자를 통합하는 성향 때문에 RPE 세포에 PEDF 및 GM-CSF 유전자를 제공하기 위해 비 바이러스 성 활동적인 수면 뷰티 트랜스포슨 시스템을선택했습니다. 18,19.

세포 산화 스트레스는 과산화수소(H2O2),4-하이드로이네날(HNE), 테르부틸하이드로산화물(tBH), 높은 산소 장력, 가시광선(전체 스펙트럼 또는 UV 조사)20,21을포함한 여러 산화제에 의해 시험관내에서 배양되는 세포에서 유도될 수 있다. 높은 산소 장력과 빛은 다른 시스템으로의 전송 가능성을 제한하는 특수 장비 와 조건이 필요합니다. H2O2,HNE 및 tBH와 같은 제제는 겹치는 산화 스트레스 분자 및 세포 변화를 유도한다. 우리는 포토수용체 외부 세그먼트 phagocytosis(22)에서 반응성 산소 중간체로서 RPE 세포에 의해 생성되기 때문에 편리하고 생물학적으로 관련성이 있기 때문에 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 활성을테스트하기 위해 H2O2를 선택했으며 생체내안구 조직에서 발견된다. 글루타티온의 산화는 눈에 H2O2의 생산에 부분적으로 책임이 있을 수 있기 때문에, 우리는 H2 O2-유도산화스트레스및세포의 재생 능력에 연결되는 우리의 연구에서 GSH/글루타티온의 수준을 분석하였다21,22. 글루타티온 수준의 분석은 눈24의산화 방지 메커니즘에 참여하기 때문에 특히 관련이 있다. H2O2에노출되는 것은 RPE 세포의 산화 스트레스 감수성 및 항산화활성을검사하기 위한 모델로 자주 사용되며, 또한, 광유발 산화 스트레스 손상, 산화 스트레스21의"생리적" 원인과 유사성을 나타낸다.

신경 보호 요인의 기능성과 효과를 평가하기 위해, 우리는 분석이 PEDF와 GM-CSF를 과발현하기 위하여 유전자 변형된 세포에 의해 표현된 성장 인자의 산화 효과를 정량화하는 분석을 허용하는 시험관 내 모형을 개발했습니다. 여기서, 우리는 PEDF및 GM-CSF에 대한 유전자와 함께 전염된 RPE 세포가 세포 형태, 밀도, 생존성, 글루타티온의 세포내 수준 및 UCP2 유전자의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 비과감염 대조구 세포보다 H2O2의 유해한 영향에 더 저항력이 있음을 보여주며, 이는 미토콘드리아 분리 단백질(ROS31)에 대한 코드로 인해31종의산소를 감소시키는 것으로 나타났다.

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Protocol

인간의 눈의 수집 및 사용에 대한 절차는 연구를위한 주 윤리위원회에 의해 승인되었다 (아니. 2016-01726).

1. 세포 격리 및 배양 조건

  1. 인간 ARPE-19 세포주
    1. 문화 5 x 105 ARPE-19 세포, 인간 RPE 세포주, 덜벡코의 수정 된 독수리의 중간 / 영양 혼합물 F-12 햄 (DMEM / 햄의 F-12)은 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 80 U / mL 페니실린, 80 U / mL 페니실린으로 보충 80 μg/mL 연쇄상 구균, 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B(전체 매체)에서 37°C에서 T75 플라스크에서 5% CO2 및 95%의 공기가 가습된 대기시(다른 세포 밀도는 표 1참조).
    2. 일주일에 세 번 매체를 변경합니다.
    3. 일단 세포가 약 90%의 합류(질적으로 평가됨)로 성장하면, 배지를 흡기하고 멸균 1x PBS로 세포를 세척한다.
    4. 37°C에서 7-10분 동안 5% 트립신-2% EDTA 용액으로 세포를 배양한다(볼륨의 경우 표 1참조). 분리를 시각적으로 모니터링합니다.
    5. 10% FBS를 포함하는 완전한 매체를 추가하여 트립시닝을 중지합니다(볼륨의 경우 표 1참조).
    6. 세포를 트랜스펙트(프로토콜의 단계 2. 참조), 1:10(주당 1회) 비율로 세포를 서브배양하거나 아래에 자세히 설명된 96웰 플레이트의 종자(프로토콜의 단계 3.3 및 3.4를 참조).
중간(mL)
면적(cm²) ARPE-19 세포에 대한 파종 밀도(세포/웰) 신청 세포 배양용 트립신을 중지하려면 트립신의 부피 (mL)
플라스크 T75 75 5,00,000 ARPE-19 세포 성장 10 7 3
6 웰 플레이트 9.6 1,00,000 감염된 ARPE-19 세포의 파종 3 1 0.5
24 웰 플레이트 2 50,000 전감염된 hRPE 세포의 파종 1 0.8 0.2
96 웰 플레이트 0.32 5,000 전염 된 세포를 가진 산화 스트레스 실험에 대 한 (도 1) 산화 스트레스 실험 0.2
3,000 비 전염 된 세포 플러스 단백질을 가진 산화 스트레스 실험에 대 한 (도 1)

표 1: 세포 배양물. ARPE-19 및 1차 인간 RPE 세포의 배양을 위한 세포 배양 판 및 플라스크에 대한 권장되는 미디어 볼륨.

  1. 1차 인간 RPE 세포
    1. Thumann 외17에의해 기술된 바와 같이 1차 인간 RPE 세포를 분리하고, 20% FBS로 보충된 완전한 배지에서 배양 세포를 분리한다.
    2. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 세포가 수렴성에 도달하면(시각적으로 모니터링됨) FBS를 1%로 줄여 과성장을 방지합니다.
    3. 셀을 변형 (프로토콜의 단계 2 참조), 또는 아래에 자세히 설명된 대로 96 웰 플레이트에서 종자 (프로토콜의 단계 3.3 및 3.4 참조).
      참고: 여기에 제시된 데이터는 4명의 인간 기증자의 눈에서 얻은 RPE 세포의 배양에서 수집되었습니다. 표 2는 시력 눈 은행 (세인트 폴, MN)의 라이온스 선물에서 기증자의 인구 통계를 자세히 설명합니다. 헬싱키 선언에 따라 통보된 동의를 얻은 후 12.7± 5.7h(평균 ± SD) 사후 평가에서 눈이 흘러내렸다.
아니요 연령 성별 보존에 죽음 (시간) 고립으로 의 죽음 경작 경작 그래프의 기호
(일) 일시 전(일) 전환 후(일)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
의미하다 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

표 2: 망막 색소 상피 세포를 위한 인간 기증자의 인구 통계.

2. ARPE-19 및 1 차 인간 RPE 세포의 전기화

  1. 시험분석 ARPE-19 세포 또는 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5에 설명된 바와 같이 1차 인간 RPE 세포.
  2. 시판되는 트랜스페션 키트(재료표참조)로 전기포공을 수행합니다.
    1. ARPE-19 세포의 형질전환은 Johnen외. 32 및 Thumann 외17에대한 1 차 hRPE를 지칭한다. 간략하게, R 버퍼의 11 μL에 1 x 105 ARPE-19 세포 또는 5 x 104 1차 hRPE 세포를 다시 중단하고 0.03 μg pSB100을 포함하는 플라스미드 혼합물 2 μL을 추가합니다 X 트랜스포세아제33 및 0.47 μg pT2-CMV-PEDF-그의 또는 pT2-CMV-GMCSF-그의 트랜스포슨 (비반포세:트랜스포슨 1:16). PEDF 및 GM-CSF 이중 전형 전지의 경우 1:16:16(0.03 μg pSB100X,0.47 μg pT2-CMV-PEDF-HIS, 0.47 μg pT2-CMV-GMCSF-His)의 비율을 사용한다. 다음과 같은 전기기 파라미터를 사용하십시오: ARPE-19 세포에 대해 20ms(펄스 폭)에 대해 1,350V의 두 펄스; 1 차 세포에 대 한 20 ms에 대 한 1,100 V의 두 펄스.
  3. 종자 1 x105 전속 ARPE-19 또는 5 x 104 6-well 및 24-well 플레이트에 각각 1차 hRPE 세포를 감염시켰으며, 항생제 나 항마이코틱스없이 10 % FBS로 보충된 중간 체. 페니실린(80 U/mL), 연쇄상 구균(80 μg/mL), 암포테리신 B(2.5 μg/mL)를 첫 번째 중간 교환3일 후에 추가한다.
  4. 세포의 주간 현미경 모니터링에 의해 세포 성장을 결정합니다. 트랜스포션 효율은 RT-PCR에 의한 유전자 발현 의 분석에 의해 모니터링되며, ELISA 및 WB에 의한 단백질 분비(보충 물질에서설명된 방법).
    참고: 세포가 합류에 도달하면 최초로 경질 효율을 평가할 수 있다, 즉 ARPE-19 세포 및 1차 hRPE 세포에 대한 ~7일 및 4주 후 형질 전환에서 각각.
  5. 아래에 자세히 설명된 대로 96웰 플레이트의 종자 세포(프로토콜의 3.5단계 참조).

3. 산화 스트레스 유도 (H2O2 치료) 및 신경 보호 (PEDF 및 / 또는 GM-CSF 치료)

  1. 감염된 ARPE-19 세포의 조건된 배지 의 준비
    1. 유전자 PEDF, GM-CSF 또는 둘 다와 함께 전관된 ARPE-19 세포를 사용하십시오(프로토콜의 2단계 참조); 프로토콜의 단계 1.1에 기재된 바와 같이 28일 동안 배양 세포.
    2. 28일 에서, 트립시화 세포(프로토콜의 단계 1.1.3-1.5 참조), Neubauer 챔버 를 사용하여 세포를 카운트34,35,및 T75 플라스크에서 종자 5 x 105 세포는 프로토콜의 1.1.1 단계에서 설명된 바와 같이 완전한 매체로 한다. 세포 배양이 약 80% 컨실수(약 1주일 후, 질적으로 검증됨)이 있을 때 배지를 교환한다. 24 시간 후에 매체를 수집합니다.
    3. 사용 전까지 -20°C에 매체를 저장합니다.
      참고: 조건화된 배지에서 재조합 PEDF 및 GM-CSF의 충분한 농도는 WB에 의해 검증되고 보충 물질에설명된 바와 같이 ELISA에 의해 정량화되었다.
  2. 감염된 ARPE-19 세포의 조건된 배지에서 PEDF 및 GM-CSF의 정화
    1. 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 10,000 x g에서 3.1.2 단계에서 수집된 배지를 수집하였다.
    2. 제조업체의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 슈퍼플로우(재료 표참조)를 사용하여 아래에 설명된 대로 태그가 지정된 단백질을 정화합니다.
      1. 파이펫 30 μL 의 Ni-NTA 혼합물은 1.5mL 튜브와 원심분리기의 2,600 x g에서 30초동안 유동을 폐기한다. 1x 인큐베이션 버퍼의 200 μL로 펠릿을 두 번 씻으십시오.
      2. 30s용 2,600 x g의 원심분리기와 흐름스루를 폐기합니다. 4배 인큐베이션 버퍼의 40 μL을 추가하고 다시 일시 중지합니다.
      3. 원심분리형 배지의 900 μL을 추가하고 70rpm(궤도 셰이커)에서 1시간 동안 RT. 원심분리기에서 1분 동안 2,600 x g로 1회, 폐기된 흐름을 통해 첨가한다.
      4. 1x 인큐베이션 버퍼의 175 μL로 펠릿을 두 번 씻으십시오. 30s용 2,600 x g의 원심분리기와 흐름스루를 폐기합니다.
      5. 그의 태그된 PEDF 및 GM-CSF 단백질을 eute하려면 20 μL의 용출 버퍼를 추가하고 70 rpm(궤도 셰이커)에서 20분 동안 RT. 원심분리기에서 30초동안 2,600xg에 배양합니다. 재조합 PEDF 또는 GM-CSF를 포함하는 상체를 유지합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 BCA 단백질 분석 키트(재료표 참조)를사용하여 총 단백질을 정량화합니다.
    4. 단백질 용액을 -20°C에 보관하십시오.
      참고: 인큐베이션 버퍼(4x)에는 200mM NaH2PO4,1.2M NaCl 및 40mM Imidazol이 포함되어 있습니다. 용출 버퍼는 50mM NaH2PO4,300 mM NaCl 및 250 mM Imidazol을 포함합니다.
  3. 비트랜스감염 ARPE-19/1차 hRPE 세포의 조절 배지 플러스H2O2 (도1A)
    1. 종자 3,000 비-전염성 ARPE-19 (프로토콜의 단계 1.1.6에서) 또는 1 차 hRPE (프로토콜의 단계 1.2.3에서) 세포는 96-잘 플레이트 및 배양에서 잘 200 μL에서 감염된 ARPE-19 세포로부터 조건화 된 배지의.
    2. 5% CO2 및 95% 공기의 가습 된 대기에서 37 °C에서 10 일 동안 세포를 배양한다. 매일 조건된 배지를 변경합니다. 세포를 350 μM H2O2O 2에 24h로 노출시다.
    3. 산화 스트레스 손상을 평가하고 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 결정합니다(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 및 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조).
      참고: 실험 기간은 12일입니다. 명확한 평평한 바닥 마이크로웰 플레이트는 세포 형태뿐만 아니라 발광을 평가하는 데 사용됩니다. 세포 독성과 글루타티온 분석기를 동시에 수행하려면 두 개의 플레이트를 같은 날 세포로 시드해야합니다.
  4. PEDF 및 GM-CSF 성장 인자와 H2O 2 (도 1B)를 가진 비감염 된 ARPE-19/1 차 hRPE 세포의 치료
    1. 종자 3,000 비형 감염 ARPE-19 (프로토콜의 단계 1.1.6에서) 또는 1 차 hRPE (프로토콜의 단계 1.2.3에서) 우물 당 세포 (명확한 평평한 바닥96 웰 플레이트) 200 μL에서 500 ng/mL 재조합 PEDF 및 / 또는 50 ng/mL 재조합 전감염된 ARPE-19 세포의 배지로부터 정제되거나 상업적으로 이용 가능. 배양 세포는 37°C에서 37°C에서 5% CO2 및 95%의 공기의 가습된 대기에 대한 배양 세포. 매일 PEDF 및 GM-CSF 성장 요인을 포함한 매체를 갱신하십시오.
      참고: 성장 인자를 매체에 새로 추가합니다.
    2. 48h의 성장 인자를 가진 세포를 치료한 후, 배지를 제거하고 350 μM H2O2 + 500 ng/mL PEDF 및/또는 50 ng/mL GM-CSF를 포함하는 완전한 배지를 추가한다.
    3. 산화 스트레스 손상을 평가하고 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 결정합니다(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 및 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조).
      참고: 실험 기간은 3일입니다.
  5. H 2 O2(도 1C)를 가진 전이 된 ARPE-19/1차 hRPE 세포의 치료
    1. 보충 물질에 설명된 바와 같이 WB 및 ELISA에 의해 전감염된 세포의 충분한 유전자 발현 및 단백질 분비를 확인한다.
    2. 감염된 세포를 포함하는 우물에서 배지를 제거합니다(프로토콜의 2단계 참조).
    3. 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5에 설명된 바와 같이 세포를 트립시인화한다. 노이바우어챔버(34),35를사용하여 세포를 계산한다.
    4. 종자 5,000 완전한 매체의 200 μL에서 96 웰 플레이트에 5,000 개의 전동 세포 / 잘. 배양 세포는 37°C에서 37°C에서 5% CO2 및 95%의 공기의 가습된 대기에 대한 배양 세포. 24시간 후, 세포를 350 μM H2O2에 24h로 노출한다.
    5. 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 평가하고(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조), UCP2 유전자 발현의 결정(프로토콜의 4.3단계 참조).
      참고: 실험 기간은 2일입니다.

Figure 1
그림 1: 세 가지 실험 적 접근 방식에서 H2O2 분석의 타임 라인. 3,000개의 비형감염 세포는 조건부 배지/재조합 단백질 또는 5,000개의 전감염된 세포로 H 2 O2를가진 처리를 위해 96웰 플레이트에서 종자하였다. 조건부 배지의 효과를 결정하기 위해, 세포는 10일 연속 배지100% 배양배지로 배양되어 매일 배지를 변화시켰다. 재조합 성장 인자의 효과를 결정하기 위해 세포는 3일 연속으로 매일 적절한 양의 성장인자를 첨가하여 배양하였다. 비트랜스감염 된 세포는 전균 세포에 비해 더 긴 배양 기간 동안 자라난 것을 피하기 위해 웰 당 3,000 세포에서 시드되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 산화 스트레스 수준 및 항산화 용량 분석

  1. 글루타티온 분석
    1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트(재료 표참조)를 사용하여 글루타티온(GSH) 수준을 측정합니다. 간략하게, 준비 및 1x 시약 믹스의 적절한 부피 (100 μL 시약 / 잘): 루시페린 NT 기판 과 글루타티온 S-Transferase 희석 1:100 반응 버퍼.
      참고: 96웰 플레이트는 10mL의 1x 시약 믹스가 필요하며, 루시페린-NT 기판 100 μL과 글루타티온 S-Transferase 100 μL을 10mL의 반응 버퍼에 추가하여 제조합니다. 사용하기 직전에 1x 시약 믹스를 준비합니다. 향후 사용을 위해 준비된 시약 믹스를 보관하지 마십시오.
    2. 리오필링 루시프레린 검출 시약으로 재헌법 버퍼 1병을 이송하여 루시피린 검출 시약을 준비한다.
    3. 글루타티온(GSH) 표준 용액(5mM)을 사용하여 표준 곡선을 준비합니다. dH2O로 5mM GSH 용액 1:100을 희석하십시오(dH2O의990 μL에 5mM GSH 용액의 10 μL을 추가). dH2O. 희석된 각 표준의 10 μL을 복제하여 500 μL에서 7개의 직렬 1:1 희석을 수행합니다.
      참고: 글루타티온의 최종 농도는 0.039 μM에서 5μM까지 다양합니다.
    4. 빈(1x 시약 믹스)을 준비하고 10 μL(중복)을 적절한 우물로 옮기습니다.
    5. 인큐베이터에서 H2O2-처리된 세포를 제거합니다.
      참고: H2O2-처리된세포의 형태는 브라이트필드 현미경검사(40x)에 의해 문서화합니다.
      세포가 산화될 때, 그(것)들은 더 둥글게 하고 더 적은 퍼짐을 보입니다.
    6. 문화 매체를 주의 깊게 흡인합니다. 각 웰에 준비된 1x 시약 믹스100 μL을 추가합니다. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s에 대한 시약과 세포를 혼합합니다.
    7. 30 분 동안 RT에서 접시를 배양. 재구성된 루시피린 검출 시약 100μL를 각 웰에 추가합니다.
    8. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s용액을 혼합합니다. RT에서 15분 동안 접시를 배양합니다.
    9. 사전 설치된 프로그램 ADP-Glo를 사용하여 플레이트 리더를 사용하여 발광을 결정합니다.
      참고 : 뚜껑없이 플레이트 판독기 안에 접시를 넣습니다.
      1. 레이아웃 변경을 클릭하고 기본 매개 변수에서다음 설정을 선택 : 코스타 96 웰 플레이트; 최고 광학; 위치 처리 지연: 0.1; 측정 시작 시간: 0.0; 측정 간격 시간: 1.0; 결과를 정상화하는 시간: 0.0; 게인은 장치에 의해 자동으로 조정됩니다. 공백, 표준 및 샘플을 정의합니다. 시작 측정을클릭합니다.
      2. 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다. 표준 곡선의 보간을 통해 각 샘플의 GSH 농도를 계산합니다.
  2. 세포 독성 분석 및 현미경 분석
    1. 세포에서 배지를 흡인하고 각 웰에 1% FBS를 포함하는 완전한 배지의 100 μL을 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
      참고: 1% FBS는 FBS의 높은 비율이 발광의 측정을 방해할 수 있기 때문에 사용됩니다, 따라서 1% FBS는 이 경우에 이용됩니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 세포 독성 분석 키트(재료 표참조)를 사용하여 세포 생존 가능성을 측정합니다. 간단히, 리오필기 기판에 분석 버퍼를 추가하는 시약 믹스를 준비한다. 33 μL 디지토닌을 5mL 분석 버퍼(96웰 플레이트 1개)에 추가하여 리시스 시약을 준비합니다. 균일성을 보장하기 위해 위아래로 파이프를 사용하여 잘 섞습니다.
      참고: 최적의 결과를 얻으려면 갓 준비한 시약 믹스를 사용하십시오. RT. 시약 믹스에 저장하면 12 시간 이내에 사용하면 최대 7 일 동안 4 ° C에 저장 될 수 있으며 -70 ° C에서 최대 4 개월 동안 일회용 알리코트에 저장 될 수 있습니다. 동결 및 해빙은 피해야 합니다. 리시스 시약은 최대 7일 동안 4°C에 보관할 수 있습니다.
    3. 치료되지 않은 ARPE-19 셀로 표준 곡선을 준비합니다.
      1. 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5 단계에 설명된 바와 같이 세포를 트립시화하고 노이바우어챔버(34,35)를사용하여 세포를 계산한다. RT에서 120g에서 120g의 세포를 원심분리하고 1% FBS를 함유하는 DMEM/Ham의 F12 배지에서 셀 펠릿을 1 x 105 세포/mL의 최종 농도로 재보선합니다.
      2. 1% FBS를 포함하는 200 μL 배지에 7개의 직렬 1:1 희석을 준비합니다. 각 표준의 100 μL을 적절한 우물(중복)으로 옮기습니다. 모든 우물에 시약 믹스 50 μL을 추가합니다.
    4. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s에 대한 시약과 세포를 혼합합니다. RT에서 플레이트를 15분 동안 배양한다. 용해 시약의 50 μL을 추가하고 15 분 동안 배양합니다. 프로토콜의 4.1.9 단계에서 설명된 바와 같이 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정합니다.
    5. 실행 가능한 세포의 백분율을 계산합니다 : (100 - % 죽은 세포) 및 죽은 세포의 백분율 = [1 차 발광 측정 ((샘플의 죽은 세포)) / 2 차 발광 측정 (digitonin 치료 후 죽은 모든 세포)] x 100.
  3. RT-qPCR에 의한 UCP2 발현 분석
    1. 전술한 바와 같이 감염된 세포를 트립시니화한다(프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5).
    2. 노이바우어챔버(34),35를사용하여 세포를 계산한다.
    3. 종자 5,000 96 웰 플레이트에서 ARPE-19 세포 / 잘 감염.
    4. 배양 24시간 후, 세포를 24시간 동안 350 μM H2O2로 치료한다.
    5. 제조 업체의 지시에 따라 세포의 낮은 수에서 RNA의 절연을 위한 상용 키트를 사용 하 여 총 RNA를 분리 (재료의 표참조) 제조 업체의 지시에 따라.
    6. 보충 재료에설명된 대로 실시간 정량PCR(RT-qPCR)을 수행한다. 간단히, 최적화된 M-MLV 역전사를 포함하는 시판 가능한 혼합을 사용하여 레트로전사에 의해 cDNA를 생성합니다(재료표참조).
    7. qPCR의 경우 프라이머(보충 재료의 표 S1 참조) 및 DNA 템플릿을 제외한 모든 구성 요소(SYBR 그린 포함)가 포함된 즉시 사용 가능한 반응 칵테일을 사용합니다. 다음 열순환 조건을 사용하십시오: 초기 내성 95°C에서 10분 동안, 15초에 95°C에서 40사이클, 60°C에서 32s에 대해 72°C에서 연신.
    8. 분석(36)을위해 2^(-ΔΔCT) 방법을 사용합니다.
  4. SDS-PAGE및 pAkt의 WB 분석을 위한 세포 용액 제제 (Ser473)
    1. 종자 3 x 105 GM-CSF-19 세포/6웰 플레이트(≥21일 사후 트랜스페션)에서 GM-CSF가 Akt 생존경로(15)의활성화를 통해 H2 O2의손상으로부터 RPE 세포를 보호하는지 여부를 판단한다.
    2. 배양 세포의 24시간 후 24h에 대해 350 μM H2O2에 노출된다.
    3. RIPA 버퍼 1mL과 프로테아제 인스파아제 억제제 칵테일 10μL, 0.5M EDTA10 μL, 8M 우레아 25μL(1m 에 사용되는 부피)를 혼합합니다.
    4. 조심스럽게 매체를 흡인하고 1x PBS로 세포를 씻으세요.
    5. RIPA 버퍼 믹스의 전체 볼륨을 셀에 추가합니다.
    6. 파이펫을 위아래로.
    7. 1.5 mL 튜브에서 lysate를 수집합니다.
    8. 4°C에서 30분 동안 20,000 x g의 원심분리기.
    9. 새로운 1.5 mL 튜브로 상체를 전송합니다.
    10. 보충 물질에 설명 된 바와 같이 WB에 의해 희석되지 않은 세포 용액의 15 μL에서 pAkt의 수준을 결정한다.

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Representative Results

인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스유도
ARPE-19 및 1차 hRPE 세포는 24시간 동안H2 O2의다양한 농도로 처리되었고 항산화 글루타티온의 세포내 수준을 정량화하였다(도2A,B). H2O2 앳 50 μM 및 100 μM은 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않았지만 350 μM에서는 ARPE-19 및 1차 hRPE 세포에서 글루타티온이 현저히 감소했습니다. 세포독성 분석 결과 350μM은 세포 생존율이 현저한감소(도 2C)를유발하는H2 O2의가장 낮은 농도를 보였다. 형태학적으로,H2 O2로처리된 ARPE-19 세포는H2O2 농도증가(도3)로더욱 명백해지는 더 적은 확산과 둥근 특성을 나타낸다. 효과는 H 2O 2(도 3)로치료 된 PEDF 및 GM-CSF -cF -에 대한 덜 눈에 띄는했다. H2O2-매개산화 스트레스에 세포 수의 효과를 입증하기 위해, 5,000 및 10,000 ARPE-19 세포당 잘 흰색 96-well 플레이트에 시드하였다; 다음날, 세포는 24시간 동안 350 μM H2O2로 처리되었고 글루타티온의 수준을 결정하였다. 도 4는 5,000개의 세포로 시드된 우물(n=3)에서만 글루타티온 의 수준이 감소되었다는 것을 나타낸다. 실험이H2O2-생성된 ROS의 항산화제의 효과를 결정하는 경우 세포의 수를 고려하는 것이 필수적입니다. 본 보고서에 제시된 특정 프로토콜에 대해 3,000-5,000개의 세포/웰(96-well 플레이트)을 350μM H2 O2로24시간 동안 처리한 경우 산화 스트레스 유발 세포 손상에 대한 급성 반응을 모방하여 회복할 수 있는 능력을 유지하면서 상당한 세포 손상을 표시하는 것이 적절하다.

Figure 2
그림 2: 글루타티온 수준 및 세포 생존가능성으로 입증된 산화 스트레스 수준, H 2 O2로처리된 인간 RPE 세포에서 . (A)ARPE-19 세포는H2 O2의여러 농도에 노출된 350 μM에서 글루타티온 수준(괄호)이 현저히 감소하는것으로 나타났다. (0.66 μM), 500 μM(0.022 μM), 및 700 μM(0.002 μM) 및 H 2 O2-비처리셀(2.9 μM)에 비해 700 μM(0.002 μM)(p < 0.0001 내지 350, 500, 및 700 μM H2O2). (B)1차 인간 RPE 세포는 글루타티온의 감소 수준을 보였다; 그러나, 효과는 ARPE-19에 비해 덜 두드러졌지만 350, 500 및 700 μM H2O2의컨트롤에 비해 여전히 통계적으로 유의했다. 350 μM은 비처리 대조군 세포(p = 0.0022)에 비해 글루타티온 수치가 감소함에 따라 상당한 산화 손상을 일으킨 가장 낮은 H2O2 농도였다. 글루타티온 수준은 H2O2 농도증가(500 μM: p = 0.022; 700 μM: p = 0.0005)로 감소하였다. (C)세포독성 분석은 350 μMH2O2가 생존 셀의 비율에서 현저한 감소를 일으킨 가장 낮은 농도(p< 0.0001for 350, 500 및 700 μM)을 나타냈다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3 복제)로 표시되며 상당한 차이점은 (*)로 표시됩니다. ANOVA의 사후 계산은H2O2-치료그룹과 C-를 비교하는 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었다. C-: H2O2 비처리 된 세포. 이 수치는 바스쿠아스 등37에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: H 2 O2로처리된 비-전감염 및 PEDF-또는 GM-CSF-전감염 ARPE-19 세포의 형태학. H2 O2의농도증가로 치료된 세포는 배양 우물에서 더 적은 세포를 나타내고 더 둥글고 덜 확산형태, 세포 스트레스의 알려진 징후를 표시한다. PEDF-또는 GM-CSF-전염 세포의 경우 세포 스트레스가 덜 두드러지고 비처리 된 제어 세포와 유사하게 증가합니다. C-: 비처리 된 제어 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: H 2 O2-유도산화 스트레스의 효과에 세포 수의 영향. 5,000 및 10,000 ARPE-19 세포/웰은 96웰 플레이트에서 시드하였다. 24시간 후, 세포는 24시간 동안 350 μM H2O2로 처리하였다. 글루타티온 수준에 있는 중요한 다름은 5,000개의 세포 (p = 0.031, t-test)로 시드된 우물에서 관찰되었지만 10,000개의 세포로 시드된 우물에서는 관찰되지 않았다. C-: 처리되지 않은 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SB100X-산화스트레스 조건에서 인간 RPE 세포에 의해 전달된 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과 분석
양성 대조군으로서, ARPE-19 및 1차 인간 RPE 세포는 24시간 H2 O2치료 전과 2일 동안 5, 50, 또는 500 ng/mL의 상용 PEDF 또는 GM-CSF로 처리되었다. ARPE-19 세포는 500 ng/mL PEDF 또는 50 ng/mL GM-CSF로 처리된 산화 조건하에서 처리되지 않은 대조군(H2O2-처리)(도 5A); 유사하게 감염된 ARPE-19 세포의 배양 배지로부터 정제된 유사한 PEDF 및 GM-CSF는 유사한 효과를보였다(도 5B). 1차 hRPE 세포에서는 500 ng/mL GM-CSF, 또는 500 ng/mL GM-CSF, 500 ng/mL PEDF 플러스 50 ng/mL GM-CSF 플러스 50 ng/mL GM-CSF 플러스 50 ng/mLGM-CSF플러스 50 ng/mL GM-CSF의 첨가또는 PEDF 또는 GM-CSF에 의해 조절된 미디어로부터 정제여부 또는 상당한 증가(5C)의 상당한 증가에 의해 반영된 바와 같이 세포 손상감소(5C). 1차 hRPE 세포는 10일 동안 ARPE-19 세포로부터 의전된 배지로 처리된 대조군세포(도 5D)에비해 글루타티온 수치가 더 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, 추가 실험은 PEDF에 대한 500 ng /mL및 GM-CSF에 대한 50 ng / mL로 수행되었습니다.

ARPE-19 및 1차 hRPE 세포는 전기기와 결합된 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템을 사용하여 PEDF 및/또는 GM-CSF를 코딩하는 유전자로 전감염되었다. RT-qPCR, WB, ELISA 및 면역 작용화학(보충 물질, 도S1및 도S2참조)에 의한 유전자 발현의 이식 및 분석에 따른 다음, 24h에 대해 350 μMH2 O2에노출된 ARPE-19 세포가 비-전염성H2O2-처리세포보다현저한 더 높은 글루타티온 수준을 보였다(그림6AA) ). 1차 hRPE 세포의 경우, 모든 기증자가 분석에 포함될 때 H2O2로 치료된 비트랜스감염 된 세포와 비교하여 PEDF-전세포에서 글루타티온 수준이 현저합니다. 더욱이, 기증자 2 와 3은 모든 전과 된 그룹 (PEDF, GM-CSF, PEDF 및 GM-CSF)에 대한 글루타티온 수준이 현저한 증가를 보여줍니다 (데이터는 표시되지 않음).

UCP2 유전자 발현의 연구는 미토콘드리아 산화 스트레스의 검사에 의해 분석을 완료. 개념 증명 시리즈는 24h에 대해 350 μM H2O2로 처리된 형감염된 ARPE-19 세포에서 수행되었다. 도 7에도시된 바와 같이, ARPE-19 세포에서, H2 O2치료 후 UCP2 유전자 발현의 수준이 증가하지만 증가는 통계적으로 유의하지 않다. 도 8은 H2 O2에노출된 GM-CSF-전염세포의 용액으로부터 인광Akt(pAkt)의 WB를나타낸다. 정규화된 데이터는 GM-CSF가 산화 스트레스 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 나타내는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 작은 감소만을 나타낸다.

Figure 5
그림 5: 글루타티온 수준은 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 용량의 마커로서. (A)ARPE-19 세포 500 ng/mL PEDF 또는 50 ng/mL GM-CSF를 3일 전 과 24시간 동안 24시간 동안 NG/mL GM-CSF로 처리하여 글루타티온 의 수준을 0.83 μM(C)에서 1.83 μM(PEDF) 및 1.3μM(GM-CSF)로 증가시켰습니다. p = 0.026 및 p = 0.031, 각각. 농도5 ng/mL글루타티온의 증가가 관찰되지 않았다; 50에서 500 ng/mL 사이의 글루타티온 수준의 차이는 PEDF 또는 GM-CSF에 대해 중요하지 않았습니다. (B)PEDF(500 ng/mL) 및 GM-CSF(50 ng/mL)는 비정형 ARPE-19 세포의 컨디셔닝 된 매체로부터 정제되어 시판되는 PEDF 또는 GM-CSF(p= 0.018, ANOVA)와 유사한 효과를 보였다. (C)500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF, 또는 500 ng/mL PEDF 플러스 500 ng/mL GM-CSF 플러스 500 ng/mL GM-CSF 를 3일 전 과 동안 24h H2 O2치료 중 1차 hRPE 세포의 배양 배지에 첨가하여 PEDF(2.6 μM)로 치료된 세포에서 글루타티온의 수준을 크게 증가시켰습니다.[2.6 μM][ 2.5 μM [정제]), GM-CSF (2.9 μM [상업용], 3.3 μM [정제]), 그리고 PEDF 플러스 GM-CSF (3.0 μM [상업], 2.9 μM [정제]) 비처리 세포에 비해 (p = 0.006, Kruskal-Wallis). (D)글루타티온 수준의 현저한 증가는 PEDF-, GM-CSF-또는 PEDF-GM-CSF-19 세포로부터 의조건 된 배지에서 10일 동안 배양된 hRPE세포에 대해 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3 복제)로 표현됩니다. 상당한 차이점은 (*)로 표시됩니다. 분산 분석의 사후 계산은 PEDF/GM-CSF 처리 그룹과 "C"를 비교하는 Tukey 또는 Dunnett의 다중 비교 테스트를 계산하여 수행되었습니다. C: H 2 O2,P로만 처리된 세포: PEDF, G로 처리된 세포: GM-CSF, P+G로 처리된 세포: PEDF 플러스 GM-CSF로 처리된 세포. 이 수치는 바스쿠아스 등37에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 글루타티온 수준은 PEDF-및 GM-CSF-트랜스페드 인간 RPE 세포의 항산화 용량의 마커로서. (A)24시간(56일 후 형질)에 대해 350 μM H2O2에 노출된 전염된 ARPE-19 세포의 글루타티온 수준은 비트랜스감염 세포(1.9 μM), 즉, PEDF-및 GM-CSF-전세포에 대한 3.0 μM에 비해 상당히 높았다. 이중 전염 된 세포에 대 한 3.4 μM (p = 0.0001, ANOVA). 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다(n = 3 복제). (B)점도는 4개의 다른 기증자에 대한 평균 글루타티온 값을 나타낸다(C: 0.77 μM; P: 1.45 μM; G: 1.16 μM; P+G: 1.2 μM) 비감염 및 PEDF 전염 세포(p = 0.028, ANOVA의 후항 계산은 PEDF-/GM-CSF 처리 된 그룹과 "C"를 비교하는 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다). 기증자를 별도로 분석할 때, 기증자 N°2 및 N°3(그래프내 심볼에 대한 표 2 참조)는 H 2 O2로처리된 비트랜스감염된 대조군에 비해 모든 전과 된 그룹에 대해 상당한 차이를 보여준다. C: 비트랜스감염 된 세포, P: PEDF 전감염 된 세포, G: GM-CSF-전염 된 세포, P+G: PEDF-및 GM-CSF-전염 된 세포. 이 수치는 바스쿠아스 등37에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: H 2 O2로치료된 ARPE-19 세포에서 UCP2 유전자 발현. UCP2 유전자 발현은 미토콘드리아 산화 손상을 검사하는 데 사용될 수 있기 때문에, 우리는 감염된 ARPE-19 세포에 의한 PEDF 및 GM-CSF의 과발현의 효과를 검토하였다. H2O2로처리된 감염된ARPE-19 세포는 통계적으로 유의하지는 않지만, 산화 스트레스 감소를 나타내는 비감염 대조군과 비교하여 UCP2 유전자 발현이 증가했음을 나타내며, 접이식 증가는 PEDF-1.57, GM-CSF-1.51, PEDF 플러스 GM-CSF-트랜스감염 세포에 대한 2.36이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: GM-CSF-전염 ARPE-19 세포의 세포 용액으로부터 인광Akt(Ser473)의 서부 블롯. WB는 GM-CSF가 치료되지 않은 H2O2-치료배양(UT: 3.32) 모두에서 Akt의 인산화를 향상시킨다는 것을 입증했습니다. H2O2: 2.69). 값은 비-H2O 2-처리된세포(C/UT)로 정규화됩니다. C: 비-전염성, G: GM-CSF-전세포, UT: H2O2,H 2O2로 비처리된 세포 : H2O2로처리된 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 S1: RT-qPCR에 사용되는 프라이머 쌍 시퀀스와 어닐링 시간/온도. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

도 S1: 페더기 및 GM-CSF 유전자 발현 분석에서 형질 감염된 hRPE 세포. RT-qPCR은 1차 hRPE 세포가 비감염된 세포와 비교하여 PEDF(p = 0.003, 크루스칼-월리스 테스트) 및 GM-CSF(p = 0.013, Kruskal-Wallis 테스트) 유전자 발현에서 상당한 증가를 보였다는 것을 확인하였다. 2^(-ΔΔCT) 메서드는 이 경우36에서사용되었다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4명의 기부자)로 표현됩니다. 각 점은 세 개의 복제의 평균을 나타냅니다. 이 수치는 바스쿠아스 등37에서수정되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

도 S2: 1차 hRPE 및 ARPE-19 세포에서 단백질 분비. (A)ELISA에 의한 분비 단백질의 정량화는 비형감염 세포(p = 0.014, 및 P =0.006 GM-CSF, Kruskal-Wallis 시험)보다 훨씬 더 많은 PEDF 및 GM-CSF를 분비한 것으로 나타났다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4명의 기부자)로 표시됩니다. 각 점은 세 개의 복제의 평균을 나타냅니다. (B)PEDF-GM-CSF 이중 염색은 이중 형질 감염 ARPE-19 세포(병합된 그림)에서 PEDF 및 GM-CSF의 공동 분비를 확인하였다. 이 수치는 바스쿠아스 등37에서수정되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 재료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 제시된 프로토콜은 어떤 putative 유익한 유전자로 전염되는 세포에 적용될 수 있는 전감염된 세포에 의해 생성된 PEDF 및 GM-CSF의 산화 및 보호 기능을 분석하는 접근법을 제안합니다. 유전자 변형 세포를 이식하여 조직에 단백질을 전달하는 것을 목표로 하는 유전자 치료 전략에서, 단백질 발현의 수준, 발현의 장수 및 질병의 모델에서 발현 된 단백질의 효과에 대한 정보를 얻는 것이 중요하다. 우리의 실험실에서, 여기에서 제시된 프로토콜은 aAMD6의병기발생에 있는 중요한 요소로 가설된 산화 스트레스에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 효과를 정의하는 데 유용했습니다6,7. 구체적으로, 우리는 SB100X-매개 PEDF /GM-CSF-전동 1 차 hRPE 세포의 산화 효과를 정의하는 프로토콜을 사용했다. 몇몇 조사자들은H2O2가 산화 스트레스의 중요한 증상을 유도하지만 여전히 세포재생을허용한다는 것을보여주었으며,24h에 대해 350 μM이 인간 ARPE-19 및 1차 RPE 세포에서 효과적인 산화 스트레스를 유도하는 것으로 나타난 실험결과와 유사하게 PEDF 및 GM-CSF의 보호 효과를 분석하는 데 사용될 수 있다. H2O2는 눈에 생리적인 존재와 그에 상응하는 방어 메커니즘, 예를 들어 글루타티온대사(20,21)로인해 연구를 위해 선택되었다. 우리의 실험실은 백산화 활성 금속 이온1의존재에 지질 과산화를 시작하는 tBH를 가진 세포의 처리와 같은 산화 스트레스의 그밖 모형을 검토했습니다; 그러나, 산화 스트레스는 무시할 수 있었다. 여기서 제시된 실험에서, 세포는 24시간 동안H2 O2로처리되었다24h의 짧은 처리 시간이 유전자 발현(20)의 변화를 유도하기에 충분하다는 것을 발견했기 때문이지만, 세포 증식, 세포 생존가능성 및 글루타티온 수준과 같은 후속 결과는 아직 보이지 않을 수 있다. 그렇지 않으면, 우물의 작은 크기, 세포 독성 및 글루타티온 해석에 필요한, 급속하게 잘 수렴 문화에 이르게; 이 접촉 억제 및 산화 에이전트의 효과의 마스킹으로 이어질 수 있습니다. 따라서,H2 O2를가진 긴 배큐비는 aAMD에서 보인 변성은 만성 산화 스트레스6,7에기인하기 때문에 유용하지 않은 것처럼 보입니다.

여기에 제시된 실험의 한계는 종자 세포의 수가H2 O2의산화효과에 영향을 미친다는 것이다, 즉, 동일한 H 2O2 치료에 대해,H2O2-처리및 비처리 세포 사이의 글루타티온 수준에 있는 중요한 차이는 5,000개의 세포가 종자되었을 때 관찰되었지만 그렇지 않을 때 관찰되었다(그림4 그림 4 그림(그림 4 그림). ). 우리가 제시하는 프로토콜은 세포가 2 일 동안 배양될 때 세포가 3 일 동안 배양될 때 3,000 및 5,000 에 대한 세포가 배양될 때 낮은 수의 세포를 종자하도록 요구한다(그림1). 또 다른 제한은 H2O2의 농도가 시간으로 고갈된다는 것입니다. Kaczara 외.39 는 만성 산화 스트레스 모델의 개발에 영향을 미치는 ARPE-19 세포 배양에서 몇 시간 동안 H2O2의 고갈을 보여 주었다. 이들 연구자들은 혈당 산화를 이용한 배지에서 혈당으로부터H2 O2를지속적으로 생성하는 지속적인H2O2 치료를 위한 대체 방법을 제안했지만,H2 O2의표준화된 농도는 보장할 수 없다. 한편, 하나의 단일 펄스에서 산화제의 전달을 통해 확립된 프로토콜은H2 O2치료가 며칠 동안 반복되어야 하는 만성 모델에 비해 더 빠르고 간단하여 수행되어야 한다는 장점이있다.

산화 손상을 중화하는 세포의 능력은 ROS 생산과 항산화물질을 생성하는 능력 사이의 균형에 의해 결정됩니다. 셀에서 트리펩타이드 글루타티온(GSH)은 주로 환원제이며, 글루타티온 디설파이드(GSSG)로 산화하고 NADPH40을활용한 글루타티온 환원효소에 의해 재생될 수 있다. 건강한 세포에서는 전체 글루타티온 풀의 90% 이상이 감소된 형태로 존재합니다. 세포가 증가된 수준의 산화 스트레스에 노출되면 GSSG가 축적되고 GSSG에서 GSH에 대한 GSSG의 비율이 증가합니다. 따라서 생물학적 샘플에서 글루타티온 레독스 상태를 모니터링하는 것은 산화 스트레스 및 세포 손상 중에 생성된 자유 래디칼로부터 생성된 세포 및 조직의 해독 상태를 평가하는 데 필수적입니다. 글루타티온의 정량화를 위해 여기에 상세히 설명된 프로토콜은 유전자 변형RPE 세포에 의해 발현된 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 검출하기에 충분히 민감하다.

산화 스트레스는 미토콘드리아 활동에 영향을 미치기때문에,PEDF에 의한 ROS 수준의 제어는 미토콘드리아 분리 단백질 2(UCP2)의 조절과 관련이 있으며, PEDF는 UCP2 발현11, 41을증가시킴으로써 산화 스트레스의 효과를 감쇠시키는 것이 특히 흥미롭다. UCP2의 주요 기능은 미토콘드리아 유래 ROS를 제어하고 미토콘드리아 산화응력 41,42의센서역할을 한다. 여기서, 글루타티온 수준에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 효과를 검토하는 것 외에도, UCP2의 유전자 발현이 증가하는 경향이있다(도 7); UCP2 유전자 발현에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 역할을 확립하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.

전반적으로, 본 H2O2-모델은AMD로 신경 퇴행성 질병을 취급하기 위하여 환자의 세포에 항산화방지 치료 유전자를 전달하는 것을 목표로 하는 transposon 기지를 둔 유전자 치료의 유익한 효력을 조사하기 위하여 포괄적인 접근을 제안합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 훌륭한 기술 지원에 대한 그레그 실리와 알레인 콘티와 베를린의 맥스 델브뤼크 센터에서 교수 Zsuzsanna 이즈바크에게 감사하고 싶습니다 pSB100X 및 pT2-CAGGS-비너스 플라스미드를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단과 유럽 위원회가 제7 프레임 워크 프로그램의 맥락에서 지원되었습니다. Z.I는 유럽 연구 위원회, ERC 고급 [ERC-2011-ADG 294742]에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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