Her præsenterer vi en effektiv metode til injektion af halehale med en unikt designet opvarmnings-/fastholdelsesanordning. Ved at strømline indledningen af vasodilation og fastholdelsesprocesser giver denne protokol mulighed for nøjagtige og rettidige intravenøse injektioner af store grupper af dyr med minimal nød.
I gnavermodeller er haleåreindsprøjtninger vigtige metoder til intravenøs administration af eksperimentelle midler. Hale vene injektioner typisk indebærer opvarmning af dyret for at fremme vasodilation, som hjælper med både identifikation af blodkarrene og placering af nålen i fartøjet lumen samtidig sikkert fastholde dyret. Selvom haleåreindsprøjtninger er almindelige procedurer i mange protokoller og ikke betragtes som meget tekniske, hvis de udføres korrekt, er nøjagtige og konsekvente injektioner afgørende for at opnå reproducerbare resultater og minimere variation. Konventionelle metoder til at fremkalde vasodilation før haleåreindsprøjtninger afhænger generelt af brugen af en varmekilde, såsom en varmelampe, elektriske/genopladelige varmepuder eller forvarmet vand ved 37 °C. Selv om disse værktøjer er let tilgængelige i et standardlaboratorium, lider de åbenbart under dårlig/begrænset termoreguleringskapacitet. Selvom forskellige former for fastholdelsesanordninger er kommercielt tilgængelige, skal de også bruges omhyggeligt for at undgå traumer på dyrene. Disse begrænsninger af de nuværende metoder skaber unødvendige variabler i eksperimenter eller resulterer i forskellige resultater mellem eksperimenter og/eller laboratorier.
I denne artikel demonstrerer vi en forbedret protokol ved hjælp af en innovativ enhed, der kombinerer en uafhængig, termisk reguleret opvarmningsenhed med en justerbar fastholdelsesenhed i ét system til effektiv strømlinet haleåreindsprøjtning. Det eksempel, vi bruger, er en intravenøs model af svampeblodbanen infektion, der resulterer i sepsis. Varmeapparatet består af en varmereflekterende akrylkasse installeret med en justerbar automatisk termostat for at opretholde den indre temperatur ved en forudindstillet tærskel. Ligeledes kan bredden og højden af kegletilholdeapparatet justeres for sikkert at rumme forskellige gnaverstørrelser. Med enhedens avancerede og alsidige funktioner kan den teknik, der vises her, blive et nyttigt værktøj på tværs af en række forskningsområder, der involverer gnavermodeller, der anvender haleåreindsprøjtninger.
Brugen af dyremodeller, der involverer gnavere, har været et dagligt syn i biomedicinsk forskning. Talrige indavlede og udavlede stammer samt genetisk modificerede linjer er tilgængelige og bruges rutinemæssigt i laboratorier over hele verden. Hale vene injektion er en af de væsentlige metoder i gnaver modeller, der kræver intravenøs (i.v.) administration af eksperimentelle midler. Generelt har indsprøjtninger store fordele i forhold til andre indgiftsmåder, såsom høje absorbanshastigheder ved at omgå lokale væv og fordøjelseskanalen og høj tolerance over for opløsninger af en lang række koncentrationer eller ikke-fysiologisk pH1,2,3,4. Blandt andre levedygtige i.v. ruter (f.eks saphenous vener, retro-orbital venøs sinus), hale vener betragtes som den sikreste og mest let tilgængelige blodkar i gnavere2,3,5,6. Derfor har hale vene injektion været meget anvendt i en række gnaver modeller, herunder smitsomme sygdomme modeller7,8,9, transplantation af biologiske materialer10,11, evaluering af prækliniske behandling12,13, og toksikologiske analyser14,15.
Konsistens og nøjagtighed af dosering er et afgørende krav i vellykkede hale vene injektioner. Overraskende, kvantitativ og kvalitativ evaluering af hale vene injektioner i litteraturen implicerer hyppige mis-injektioner16,17. En undersøgelse rapporterede, at tolv ud af tredive injektioner udført af uddannede injektorer efterlod mere end 10% af injicerede doser i halen18. Desuden bør sikkerheden og komforten hos det dyr, der modtager haleåreindsprøjtninger, være et primært problem under proceduren. Forkert fastholdelsesanordning kan føre til skader og en række stressrelaterede patologier (f.eks. vægttab, nedsat immunrespons), som kan medføre betydelige variabler i prøvekvalitet19,20. Disse fejl kan forårsage øget variation i data og dårlig reproducerbarhed, hvilket påvirker undersøgelsesresultaterne negativt.
Induktion af vaskulær dilation hos dyret er ofte nødvendig, når der udføres haleåreindsprøjtninger på grund af fartøjets lille diameter, anslået til 300 μm hos mus21. Vasodilation øger synligheden af hale vener og hjælpemidler til at opnå optimal nål-vene tilpasning inden for venøse lumen. En række forskellige metoder er blevet rapporteret af laboratorier som nedsænkning halen i varmt vand22, anvende varme på halen ved hjælp af en varm drapering, lampe eller hårtørrer23,24, eller placere dyret i et varmt miljø ved hjælp af en varmepude, inkubator, eller boks kombineret med en af disse varmekilder25. Enhederne kan enten være selvfremstillede til specifikke formål eller tilgængelige fra kommercielle leverandører. Mange mangler dog termoregulerende egenskaber, og hvis nogen, enhedens temperatur er dårligt vedligeholdt og ofte udsat for variationer i stuetemperatur. På samme måde er brugen af en fastholdelsesanordning nødvendig til haleåreindsprøjtninger, da brugen af anæstesi ikke anbefales26,27. Der er udviklet flere typer laboratoriespecifikke eller kommercielle fastholdelsesanordninger. Typisk er dyret placeret i et engangs 50 ml konisk rør4, slidsede plexiglasvægge, en tunnel eller kegle28, som alle tillader rigelig eksponering af halen, samtidig med at dyrets bevægelser begrænses. De fleste fastholdende har dog størrelsesbegrænsninger på grund af materialernes stivhed. Desuden synes moderne højkompleksitetsanordninger på trods af de praktiske og sofistikerede design ikke at være mulige for injektioner, der involverer store grupper af dyr22.
Musemodeller af blodbanen infektion og tilhørende sepsis er et glimrende eksempel på situationer, der kræver brug af denne teknik. Blandt alle mikrobielle etiologi af svær klinisk sepsis, svampe sepsis er ofte en dødelig tilstand med dødelighed på >40% på trods af svampedræbende behandling29. Faktisk er infektion med Candida albicans blevet rapporteret som den fjerde hyppigste årsag til hospitalserhvervet blodbanen infektion (candidemia)30,31. I intra-abdominal candidiasis kan mikroorganismer i mave-tarmkanalen spredes via blodbanen og forårsage polymikrobiel sepsis med en endnu størredødelighed 32,33,34. Da de fleste nosocomial candidemia tilfælde fremgår af forurenede central line katetre eller iboende medicinsk udstyr35,36, dvs podning med C. albicans ved hale vene injektion kan nøje afspejler menneskelige sepsis udvikling og har været et dagligt syn i en mus model af hematogenously formidles candidiasis37,38. I denne model kan dødelighed, der forekommer i dage, forlænges eller forkortes ved at justere C. albicans i.v. inoculum39,40,41.
For nylig har vores laboratorium udviklet en innovativ protokol til en optimalt strømlinet haleåreindsprøjtning ved hjælp af en innovativ enhed udstyret med en thermoregulated opvarmningsenhed, parret med en justerbar fastholdelsesenhed, i et praktisk system. Denne protokol giver forskere mulighed for at udføre hale vene injektioner på en præcis og rettidig måde, mens dyr kan være sikkert konditioneret og fastholdt for proceduren med minimal nød. De teknikker, der demonstreres her, med brugen af den avancerede opvarmnings- og fastholdelsesanordning, kan tjene som et nyttigt værktøj inden for forskellige forskningsområder, der anvender gnavermodeller.
Konsekvent og nøjagtig dosering er centrale krav til eksperimentel pålidelighed i dyremodeller. Dette er især vigtigt i tilfælde af i.v. administration, hvor den systemiske biotilgængelighed af injicerede stoffer er betydeligt højere/hurtigere end med andre indgiftsveje3. Således kan fejl i hale vene injektion have en skadelig indvirkning på undersøgelsens resultater. Historisk set har intraperitoneal (i.p.) injektion, snarere end i.v., været den mest almindelige metode til systemisk adgang hos gnavere på grund af teknisk enkelhed og bekvemmelighed. Administrationsveje bliver dog mere afgørende, når prækliniske udlæsninger fra dyr oversættes til kliniske miljøer. Derfor er der behov for løbende forbedring i gnaver protokoller, der kan lette en vellykket hale vene injektion.
Det vigtigste fremskridt i denne protokol er den innovative thermoregulated opvarmningsanordning, der muliggør effektiv induktion af vasodilation hos gnavere, hvilket dramatisk forbedrer synligheden af haleårer og nålejustering. Opvarmningsmetoder, der er dårligt de mere regulerede (f.eks. lamper), aktuelle vasodilatorer eller hudirriterende stoffer (f.eks. xylener), er ikke kun upålidelige, men er også usikre for dyret og bør undgås44. I modsætning til andre konventionelle metoder, såsom nedsænkning af halen i varmt vand, kan denne enheds autoreguleringsevne sikkert tilstand flere dyr samtidigt. Derudover styrkes denne protokol yderligere ved at bruge den optimalt designede fastholdelsesanordning og tillade hurtig og sikker immobilisering af dyret i en position, der bedst viser den laterale haleåre.
De gennemsigtige rørformater, der ses i mange nuværende fastholdelsesbegrænsere, men praktisk talt godt designet, kræver mere håndteringstid med hvert dyr, hvilket forlænger fastholdelsesprocessen45. Dette kan være mere problematisk hos gnaverstammer med aggressive træk, der tilbyder begrænset samarbejde46,47. I modsætning hertil tillader fastholdelsesanordningens halvlukkede keglestruktur hurtig placering af dyret og hjælper med at minimere fastholdelsestiden. Sammen fremskynder den strømlinede protokol ved hjælp af det innovative, stærkt optimerede opvarmnings-/fastholdelsessystem injektionsproceduren, hvilket giver mulighed for hurtig og effektiv dosering af store grupper af dyr. I vores laboratorium gennemfører vi typisk en hel injektionsprocedure på 30 mus fra varmebehandling til overvågning efter injektion inden for 1 time ved hjælp af denne protokol.
På trods af de avancerede funktioner har denne enhed nogle tilsyneladende ulemper: den første er omkostningerne ved enheden og rutinemæssig udskiftning af pærer i opvarmningskammeret. Ud over injektionernes effektivitet og hastighed er enheden imidlertid holdbar til gentagen brug og kompatibel med de fleste almindelige desinfektionsmidler, hvilket muliggør grundig rengøring af enheden mellem anvendelser. Tilsammen modregnes startinvesteringen. Second, i situationer med begrænset arbejdsområde, en ulempe ved denne protokol kan være kravet om en dedikeret bænk område stor nok til at placere de to enheder, side om side, mens du udfører injektionen. Men fordi enheden kan bruges bredt på tværs af flere gnaver protokoller, der involverer i.v. injektioner, er det muligt, at enheden kan tjene som et centralt instrument svarende til andre kommunale vivarium udstyr såsom isoflurane vaporizers. Uanset hvad, de to enheder er let bærbare og kan bundtes og stuves, mens de ikke er i brug.
Den i.v. dødelige udfordring model af murine svampe sepsis beskrevet i denne protokol nøje efterligner C. albicans blodbanen infektioner hos mennesker og er blevet flittigt brugt til at studere svampe virulens, test effekt af svampedræbende behandlinger, og karakterisere vært immunrespons på infektion37,39,48. For at opnå en reproducerbar infektion er podning via haleåreinindsprøjtning det mest afgørende skridt i protokollen for at sikre nøjagtig levering af organismerne i blodbanen. Faktisk reagerer dyrene meget forskelligt på forskellige niveauer af Candida i.v. udfordringer; for lave mængder inoculum vil resultere i uønskede spontane inddrivelser, mens dyr, der får for høje doser, vil bukke under for tidligt. Det specifikke vindue af inoculumstørrelser for en given organisme for at fremkalde et ensartet niveau af sepsis / dødelighed afhænger i høj grad af både svampestammer og musestammer.
Den nuværende protokol ved hjælp af schweiziske Webster mus ved inoculum af 1 x 105 vilde type C. albicans reproducerbart induceret starten af sepsis sygelighed inden for 1 dag, efterfulgt af progressiv dødelighed resulterer i 100% dødelighed med 5-7 dage. I modsætning hertil fører inocula højere end 1 x10 5 typisk til accelererede dødsfald (dvs. 1-2 dage ved 1 x 106, 3-4 dage ved 5 x 105), og dem, der er lavere end 1 x 105, er sub-dødelige. I overensstemmelse med talrige rapporter i litteraturen, brugen afikke-albicans Candida arter i stedet for C. albicans resulterer i betydeligt formindsketdødelighed 40,49. Derudover kan valget af musestammer, eller endda koloniernes oprindelse, have en betydelig indvirkning på infektionsresultater på grund af varierende følsomhed mellem musestammer, som rapporteret af andre39,40,41,50,51,52,53,54,55. Derfor bør begge tages i betragtning ved udformningen af eksperimenter.
Efter en dødelig i.v. udfordring spredes svampeceller hurtigt gennem blodbanen og begynder at invadere flere organer, blandt hvilke de hårdest ramte er nyrerne41. Andre berørte organer er hjernen, milten og knoglemarven48,56. Uanset hvad, akut sepsis er den ultimative dødsårsag på det tidlige tidspunkt punkt37. Som det fremgår af de repræsentative resultater, kan sepsis sværhedsgraden kvantitativt vurderes af Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis (M-CASS) baseret på udstillede tegn på en sepsis tilstand hos udfordrede dyr43,57. Blandt de mange surrogat markører for dødbringende sepsis, hypotermi er blevet foreslået som en kritisk prædiktor for forestående død i både kliniske og eksperimentelle sepsis43,58,59.
Selv om der ikke er gennemført formelle undersøgelser for direkte at sammenligne indavlede vs. udavlede mus i denne model, er data fra den nuværende protokol ved hjælp af udavlede schweiziske Webster-mus usædvanligt reproducerbare i forskellige sepsisparametre på trods af den formodede genetiske heterogenitet. Generelt er et mønster af dødelighed, der falder inden for 3-5 dage, en fast model for akut sepsis, som det fremgår af hurtig stigning i sepsis sygelighed og niveauer af inflammatoriske markører inden for få timer efter dødelig udfordring50,51. I længere overlevelsestider (7-10 dage) er dødeligheden sandsynligvis et resultat af mikrobiel byrde, der fører til dødelige vævsskader i målorganer og centralnervesystemet. Valget af sepsis eller mikrobiel byrde kan anvendes efter behov for at evaluere immunforsvar eller reaktioner på antiinflammatoriske regimer eller svampedræbende behandlinger/vacciner, som bestemt af det anvendte inoculum.
Ud over den i.v. dødelige udfordring model, intra-abdominal infektion med C. albicans hos mus via en i.p. udfordring kan også føre til udbredt candidiasis og efterfølgende sepsis, selv om co-podning med bakterielle patogen, Staphylococcus aureus, synergistisk øger dødeligheden i forhold til C. albicans mono-infektion51,60,61. I i.p. dødbringende udfordring model, væsentligt højere mikrobielle inocula (1,75 x 107C. albicans/ 8 x 107S. aureus per mus) er forpligtet til at forårsage polymikrobiel peritonitis og spredning af organismer fra bughulen i blodbanen. Tilsvarende, gastrointestinale infektion med C. albicans hos mus behandlet med immunosuppressive og / eller slimhinde-skadelige stoffer fører til translokation af svampeceller i blodbanen og resulterer i svampe sepsis62,63. På trods af de karakteristiske vaccinationsveje er mekanismen med efterfølgende svampe sepsis stort set analog mellem de tre sygdomsmodeller, der involverer en ukontrolleret systemisk proinflammatorisk reaktion på Candida, der fører til organsvigt37,51,61. Tilsvarende hos mennesker er det denne proces med værtsresponset, ikke blot candidemia, der forårsager den høje sygelighed / dødelighed forbundet med hæmatotogent formidlet candidiasis erhvervet i sundhedsmiljøer64,65.
Ved hjælp af den nuværende svampe sepsis model, viser vi her, at beskyttelse mod dødelige C. albicans infektion kan opnås ved i.v. præ-immunisering / vaccination med C. dubliniensis (avirulent) eller svækket C. albicans mutanter, samtidig med en betydelig reduktion i sepsis sygelighed. Beskyttelsen er medieret af medfødte Gr-1+ myeloid-afledte suppressor celler, der synes at være induceret i knoglemarven som en form for uddannet medfødt immunitet66,67. Der gøres en indsats for at udvide forståelsen af denne nye form for medfødt immunmedieret beskyttelse mod C. albicans blodbanen infektioner.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den innovative anordning til opvarmning/fastholdelse af gnavere har været medvirkende til at fremme vores evne til at udføre i.v. injektioner af store flergruppedyrsundersøgelser på en effektiv måde. Som sådan har vi opfundet udtrykket, Mouse a Minute, for enheden. Enhedsspecifikationerne er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning om indkøb af en lignende enhed. De teknikker, der demonstreres her, kan tjene som et nyttigt redskab i gnavermodeller, der anvender haleåreindsprøjtninger på tværs af en bred vifte af forskningsområder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af LSUHSC Foundation (PLF), og dels af U54 GM104940 fra National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health, som finansierer Louisiana Clinical and Translational Science Center.
Candida albicans strain DAY185 | Carnegie Melon University | N/A | provided by the laboratory of Aaron Mitchell |
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ | University of Tennessee Health Sciences Center | N/A | provided by the laboratory of Glen Palmer |
Candida dubliniensis strain Wü284 | Trinity College, Dublin, Ireland | N/A | provided by the laboratory of Gary Moran |
Mice | Charles River Laboratories | 551NCICr:SW | Female Swiss Webster; 6-8 weeks old |
Mice | Charles River Laboratories | 556NCIC57BL/6 | Female C57BL/6; 6-8 weeks old |
Needles, 27G, ½-in | Becton Dickinson | 305109 | can be substituted from other vendors |
Phosphate buffered saline (PBS) | GE | SH30028.02 | can be substituted from other vendors |
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) | LSU Health | custom order | Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health |
Sabouraud dextrose agar (SDA) | Becton Dickinson | 211584 | can be substituted from other vendors |
Syringes, 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | can be substituted from other vendors |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Yeast peptone dextrose (YPD) broth | Fisher Scientific | BP2469 | can be substituted from other vendors |