Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

جهاز الاحترار / تقييد المعاصرة لحقن الوريد الذيل كفاءة في نموذج الإنتان الفطرية مورين

Published: November 6, 2020 doi: 10.3791/61961
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

Summary

هنا، نقدم طريقة فعالة وفعالة لحقن الوريد ذيل القوارض باستخدام جهاز الاحترار / تقييد مصممة بشكل فريد. من خلال تبسيط بدء عمليات توسع الأوعية وتقييدها ، يسمح هذا البروتوكول بحقن دقيقة وفي الوقت المناسب عن طريق الوريد لمجموعات كبيرة من الحيوانات بأقل قدر من الضيق.

Abstract

في نماذج القوارض ، تعد حقن الوريد الذيل طرقا مهمة لإدارة العوامل التجريبية عن طريق الوريد. حقن الوريد الذيل عادة ما تنطوي على ارتفاع درجة حرارة الحيوان لتعزيز توسع الأوعية، والذي يساعد في كل من تحديد الأوعية الدموية ووضع الإبرة في تجويف السفينة مع تقييد الحيوان بشكل آمن. على الرغم من أن حقن الوريد الذيل هي إجراءات شائعة في العديد من البروتوكولات ولا تعتبر تقنية للغاية إذا أجريت بشكل صحيح, حقن دقيقة ومتسقة حاسمة للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ وتقليل التباين. تعتمد الطرق التقليدية لتحفيز توسع الأوعية قبل حقن الوريد الذيل بشكل عام على استخدام مصدر حراري مثل مصباح حراري أو منصات حرارية كهربائية / قابلة لإعادة الشحن أو مياه مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية. ورغم أن هذه الأدوات يمكن الوصول إليها بسهولة في إطار مختبري قياسي، فإنها تعاني بوضوح من ضعف/محدودية القدرة التنظيمية الحرارية. وبالمثل، على الرغم من أن أشكالا مختلفة من أجهزة التقييد متاحة تجاريا، إلا أنه يجب استخدامها بعناية لتجنب الصدمات التي يتعرض لها الحيوانات. هذه القيود المفروضة على الأساليب الحالية تخلق متغيرات غير ضرورية في التجارب أو تؤدي إلى نتائج متفاوتة بين التجارب و / أو المختبرات.

في هذه المقالة، ونحن نظهر بروتوكول تحسين باستخدام جهاز مبتكر يجمع بين مستقل، ينظم حراريا، جهاز الاحترار مع وحدة تقييد قابل للتعديل في نظام واحد لحقن الوريد الذيل مبسطة فعالة. المثال الذي نستخدمه هو نموذج وريدي لالتهاب مجرى الدم الفطري الذي يؤدي إلى الإنتان. يتكون جهاز الاحترار من صندوق أكريليك عاكس للحرارة مثبت مع منظم حرارة أوتوماتيكي قابل للتعديل للحفاظ على درجة الحرارة الداخلية عند عتبة محددة مسبقا. وبالمثل ، يمكن ضبط عرض وارتفاع جهاز تقييد المخروط لاستيعاب أحجام القوارض المختلفة بأمان. مع الميزات المتقدمة ومتعددة الاستخدامات للجهاز ، يمكن أن تصبح التقنية الموضحة هنا أداة مفيدة عبر مجموعة من مجالات البحث التي تنطوي على نماذج القوارض التي تستخدم حقن الوريد الذيل.

Introduction

كان استخدام النماذج الحيوانية التي تنطوي على القوارض عنصرا أساسيا في البحوث الطبية الحيوية. تتوفر العديد من السلالات الأصيلة والمبررة، وكذلك الخطوط المعدلة وراثيا، وتستخدم بشكل روتيني في المختبرات في جميع أنحاء العالم. حقن الوريد الذيل هو واحد من الطرق الأساسية في نماذج القوارض التي تتطلب عن طريق الوريد (أي) إعطاء العوامل التجريبية. عموما, أي الحقن لها مزايا كبيرة على طرق أخرى للإدارة مثل ارتفاع معدلات الامتصاص عن طريق تجاوز الأنسجة المحلية والجهاز الهضمي والتسامح عالية لحلول مجموعة واسعة من التركيزات أو درجة الحموضة غير الفسيولوجية1,2,3,4. من بين طرق أخرى قابلة للحياة (مثل الأوردة السابهينية ، الجيوب الوريدية المدارية الرجعية) ، تعتبر عروق الذيل الأوعية الدموية الأكثر أمانا وسهولة الوصول إليها في القوارض2و3و5و6. ومن ثم، تم استخدام حقن الوريد الذيل على نطاق واسع في مجموعة من نماذج القوارض بما في ذلك نماذج الأمراض المعدية7،8،9، زرع المواد البيولوجية10،11، تقييم العلاجات قبل السريرية12،13، والتحليلات السامة14،15.

اتساق ودقة ال دوس شرط حاسم في حقن الوريد الذيل ناجحة. والمثير للدهشة، والتقييم الكمي والنوعي للحقن الوريد الذيل في الأدب تورط متكررة سوء الحقن16،17. وأفادت دراسة أن اثني عشر من أصل ثلاثين حقنة يقوم بها حاقنون مدربون تركت أكثر من 10٪ من الجرعات المحقونة داخل الذيل18. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون سلامة وراحة الحيوان الذي يتلقى حقن الوريد الذيل مصدر قلق رئيسي أثناء الإجراء. ضبط النفس غير السليم يمكن أن يؤدي إلى إصابات ومجموعة من الأمراض المرتبطة بالإجهاد (على سبيل المثال، فقدان الوزن، ضعف الاستجابات المناعية) التي يمكن أن تدخل متغيرات كبيرة في جودة العينة19،20. ويمكن أن تتسبب هذه الأخطاء في زيادة التباين في البيانات وضعف إمكانية الاستنساخ، مما يؤثر سلبا على نتائج الدراسة.

تحريض تمدد الأوعية الدموية في الحيوان غالبا ما يكون ضروريا عند إجراء حقن الوريد الذيل بسبب القطر الصغير للوعاء، ويقدر أن يكون 300 ميكرومتر في الفئران21. يعزز توسع الأوعية رؤية الأوردة الذيلية والمساعدات في تحقيق المحاذاة المثلى للأبرة الوريدية داخل التجويف الوريدي. وقد تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الطرق من قبل مختبرات مثل غمر الذيل في الماء الدافئ22، وتطبيق الحرارة على الذيل باستخدام ستارة دافئة ، مصباح ، أو مجفف الشعر23،24، أو وضع الحيوان في بيئة دافئة باستخدام وسادة التدفئة ، حاضنة ، أو مربع جنبا إلى جنب مع واحد من هذه المصادر الحرارية25. ويمكن أن تكون هذه الأجهزة إما ذاتية الصنع لأغراض محددة أو متاحة من الموردين التجاريين. ومع ذلك، يفتقر العديد منها إلى قدرات التنظيم الحراري، وإذا وجد، فإن درجة حرارة الجهاز سيئة الصيانة وغالبا ما تخضع لاختلافات في درجة حرارة الغرفة. وبالمثل ، فإن استخدام جهاز تقييد ضروري لحقن الوريد الذيل حيث لا ينصح باستخدامالتخدير 26،27. وقد تم تطوير عدة أنواع من أجهزة التقييد الخاصة بالمختبرات أو التجارية. عادة ، يتم وضع الحيوان في أنبوب مخروطي 50 مل المتاح4، جدران زجاج شبكي مشقوق ، نفق ، أومخروط 28، وكلها تسمح بالتعرض وافرة من الذيل مع تقييد تحركات الحيوان. ومع ذلك ، فإن معظم المقيدين لديهم قيود على الحجم بسبب صلابة المواد. وعلاوة على ذلك، لا يبدو أن الأجهزة الحديثة عالية التعقيد، على الرغم من التصاميم العملية والمتطورة، مجدية للحقن التي تنطوي على مجموعات كبيرة منالحيوانات 22.

نماذج الماوس من عدوى مجرى الدم والإنتان المرتبطة بها هي مثال رئيسي على الحالات التي تتطلب استخدام هذه التقنية. من بين جميع المسببات الميكروبية لتعفن الدم السريري الحاد ، غالبا ما يكون الإنتان الفطري حالة قاتلة مع معدلات وفيات تبلغ >40٪ على الرغم من العلاج المضاد للفطريات29. في الواقع, وقد تم الإبلاغ عن العدوى من قبل المبيضات albicans كرابع سبب رئيسي للعدوى مجرى الدم المكتسبة في المستشفى (المبيضات)30,31. في المبيضات داخل البطن ، يمكن للكائنات الحية الدقيقة في الجهاز الهضمي أن تنشر عبر مجرى الدم وتسبب تعفن الدم متعدد الميكروبات مع معدل وفيات أكبر32و33و34. كما تظهر معظم حالات المبيضات nosocomial من القسطرة الخط المركزي الملوثة أو الأجهزة الطبية indwelling35،36، أي التطعيم مع C. albicans عن طريق حقن الوريد الذيل يمكن أن تعكس عن كثب تطور الإنتان البشري وكان وسيلة أساسية في نموذج الماوس من داء المبيضات المنتشرة بشكل دموي37،38. في هذا النموذج، يمكن تمديد الوفيات التي تحدث في أيام أو تقصير عن طريق ضبط C. albicans i.v. inoculum39،40،41.

في الآونة الأخيرة، طور مختبرنا بروتوكول مبتكر لحقن الوريد الذيل مبسطة على النحو الأمثل باستخدام جهاز مبتكر مجهز بوحدة الاحترار الحرارية، يقترن وحدة تقييد قابل للتعديل، في نظام واحد مناسب. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإجراء حقن الوريد الذيل بطريقة دقيقة وفي الوقت المناسب ، في حين يمكن تكييف الحيوانات بأمان وتقييدها لإجراء الحد الأدنى من الضيق. ويمكن للتقنيات التي أظهرت هنا، باستخدام جهاز الاحترار والتقييم المتقدم، أن تكون أداة مفيدة في مختلف مجالات البحوث التي تستخدم نماذج القوارض.

Protocol

وقد استعرضت اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية الحيوانات جميع البروتوكولات الحيوانية التي تنطوي على حقن الأوردة الذيلية واستخدام جهاز الاحترار/التقييد ووافقت عليها.

1. إعداد

  1. تأقلم الحيوانات في البيئة السكنية لمدة أسبوع واحد على الأقل، والسماح للأغذية والمياه الإعلانية libitum.
    ملاحظة: بالنسبة لمعظم المستخدمين الجدد لتقنية الحقن هذه ، قد تكون السلالات الحيوانية ذات الفراء الأبيض أو الفاتح اللون أفضل لأن عروق الذيل مرئية بسهولة من خلال الجلد. سلالات داكنة اللون من الفئران (على سبيل المثال، C57BL/6) أو الفئران (على سبيل المثال، براون النرويج) لها ذيول مصطبغة بعمق، مما أدى إلى تباين لون ضعيف ضد الوريد. ويوصى بشدة بأن يتلقى المستخدمون الجدد تدريبا كافيا إلى أن يتم تحقيق الكفاءة.
  2. عوامل لحقن الوريد الذيل
    1. إعداد كافة عوامل الاختبار والحلول بشكل مطهر. عند إدارة الكائنات الحية أو المواد الخلوية، واتخاذ الاحتياطات اللازمة خلال جميع خطوات المعالجة للحفاظ على ظروف خالية من بيروجين.
    2. استخدم فقط المالحة العادية (0.9٪ ث / v كلوريد الصوديوم) أو حلول الملح المتوازنة مثل المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) كمركبات لحقن الوريد الذيل.
      تنبيه: لا تستخدم أبدا الماء أو الزيت أو الحلول اللزجة بسبب المخاطر المحتملة للتلف الوعائي. مجموعة واسعة من الحموضة (4.5-8.0) مقبولة بسبب تأثير التخزين المؤقت للدم ومعدلات تدفق الدم السريعة في القوارض. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي المحاليل الحمضية أو القلوية العالية إلى تلف الأنسجة غير الضروري في موقع الحقن ويجب تجنبها.
    3. الحد من حجم وتواتر الحقن إلى أدنى حد ممكن. استخدام وحدات التخزين الموصى بها للفئران والجرذان (≤200 ميكرولتر و ≤500 ميكرولتر، على التوالي) في درجة حرارة الجسم قبل الحقن لتقليل الإجهاد إلى الحيوان3.
    4. تأكد من أن كل إعداد للمحقنة والإبرة خال من فقاعات الهواء في المحلول؛ إذا كانت الفقاعات موجودة، قم بتطهيرها تماما لمنع خطر الانسداد.
      ملاحظة: عادة، 1 مل المحاقن مع 27 G، 1/2 في الإبر كافية لمعظم حقن الوريد الذيل.
    5. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) المطلوبة من قبل IACUC المحلية مع الحد الأدنى من العباءات المتاح أو مخصصة والقفازات اللاتكس أو النتريل. ينصح بشدة باستخدام نظارات السلامة عند إجراء حقن الوريد الذيل.
  3. جهاز الاحترار وضبط النفس
    1. فحص جميع المكونات بعناية قبل استخدامها للتأكد من أن الجهاز خال من أي عيوب (الشكل 1).
    2. تهيئة الجهاز الاحترار (الشكل 2A)
      1. ضع وحدة الاحترار على سطح مقعد مسطح نظيف، وقم بتشغيل الجهاز. تأكد من إضاءة مصباح مؤشر الطاقة الحرارة باللون الأخضر. ضع مواد الفراش داخل غرفة الاحترار للحفاظ على المنطقة جافة والاحتفاظ بالحرارة.
    3. ضبط النفس جهاز الإعداد (الشكل 2B)
      1. ضع وحدة ضبط النفس جنبا إلى جنب مع وحدة الاحترار، وتحديد أحجام المخروط المناسبة للحيوان. إذا لزم الأمر، ضبط يدويا عرض قاعدة من مخروط الألومنيوم مرن لتوفير ضبط النفس كافية للحيوان. بدلا من ذلك، استبدال المخروط مع نماذج مخصصة لاستيعاب الفئران أو الفئران من أحجام الجسم متفاوتة.

2. حقن الوريد الذيل

  1. تعديلات الجهاز
    1. ضبط درجة الحرارة الداخلية
      1. باستخدام قرص التحكم، قم بضبط منظم الحرارة عند درجة الحرارة المطلوبة. تأكد من إضاءة مؤشر المدفأة باللون الأحمر، وأن يضيء المصباح الكهربائي. مراقبة عرض درجة الحرارة الداخلية بعناية أثناء إضاءة المصباح (التدفئة). يقوم منظم الحرارة بتعطيل المصباح تلقائيا بمجرد وصول درجة الحرارة المستهدفة ، في غضون 10-15 دقيقة تقريبا.
        ملاحظة: يؤدي ضبط درجة حرارة أعلى من درجة الحرارة المحيطة إلى تنشيط المدفأة. بشكل عام ، تختلف درجة حرارة السكن الموصى بها في ظروف vivarium القياسية ، وتتراوح بين 20 إلى 26 درجة مئوية ، في حين تعتبر درجة الحرارة المحايدة (أي مريحة) للفئران المختبرية بين 30 و 32 درجة مئوية42. لذلك ، يوصى برفع درجة الحرارة الداخلية للغرفة الدافئة أعلى قليلا من درجة الحرارة ، عند 32-36 درجة مئوية تقريبا. لم تقم أبدا بتعيين الحرارة فوق درجة حرارة الجسم.
    2. وضع منصة ضبط النفس
      1. باستخدام مقبض تعديل الارتفاع، قم بضبط ارتفاع المخروط إلى المستوى الأمثل للمستخدم.
  2. المعالجة الحرارية (الشكل 3A)
    1. بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المستهدفة (32-36 درجة مئوية) ، قم بنقل الحيوانات بلطف من قفص الإسكان إلى غرفة الاحترار.
      ملاحظة: العلاج الحراري لمدة 5-10 دقيقة يكفي للحث على توسع الأوعية وتعزيز رؤية الأوردة الذيل. ومع ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالحيوانات بأمان في الغرفة المنظمة حراريا طوال مدة الإجراء (عادة 20-30 دقيقة دون أي علامة على ارتفاع الحرارة). يمكن أن تحتوي غرفة الاحترار بأمان على 4-6 فئران أو فأر واحد.
    2. مراقبة الحيوان لأي علامات الإجهاد الحراري الحاد (على سبيل المثال، التنفس السريع، الخمول، والقفز سلوك الهروب).
      تنبيه: يجب إعادة الحيوانات التي تظهر عليها علامات ارتفاع الحرارة إلى قفصها ومراقبتها حتى تستأنف نشاطها الطبيعي قبل إعادة استخدامها. إذا كان هذا بسبب درجة الحرارة الداخلية التي تتجاوز النطاق الأمثل، فتأكد من إيقاف تشغيل جهاز الاحترار.
  3. خطوات الحقن
    1. رفع الحيوان من قاعدة الذيل، وإزالتها من غرفة الاحترار. أدخل الحيوان على فتحة المخروط لوحدة التقييد.
      تحذير: لا ترفع الفئران أبدا من نهاية الذيل؛ وهذا يمكن أن يؤدي إلى إصابات خطيرة. وينبغي استخدام طرق بديلة للتعامل مع الفئران البدينة أو الحوامل28.
    2. كما يمسك الحيوان على الحافة البعيدة من المخروط مع المصابيح الأمامية، وسحب بلطف الذيل إلى الوراء وتمرير الذيل من خلال فتحة مفتوحة. تأمين الطرف الخلفي من الحيوان في قاعدة المخروط مع ساق واحدة الخلفي جاحظ من المخروط بحيث يظهر الوريد الجانبي في موقف من الساعة 12. يمكن أن تبرز إما الساق الخلفية كما أن هناك اثنين من الأوردة الجانبية، واحد على كل جانب(الشكل 3B).
    3. فهم الذيل في منتصف إلى ثلثي طول مع اليد غير المهيمنة بين الإبهام والسبابة، ووضع توتر طفيف على الوريد الجانبي للحفاظ على تحديد المواقع الذيل وعائي.
      ملاحظة: تعزيز الرؤية من الأوردة المتوسعة عن طريق المعالجة الحرارية تمكن المستخدم من تحديد موقع الحقن بسرعة للحصول على أفضل النتائج (الشكل 4).
    4. مسح الجلد من موقع الحقن مع اسفنجة الشاش أو وسادة مبللة مع الكحول 70٪. تنظيف بلطف وبأسرع وقت ممكن لتجنب تهيج في الذيل.
      ملاحظة: يمكن حذف هذا الإجراء وفقا لتقدير IACUC المؤسسي.
    5. عقد المحاقن مع اليد المهيمنة، ووضع الإبرة موازية للذيل. أدخل الإبرة باتجاه اتجاه تدفق الدم، واسحبها بزاوية 10-15 درجة(الشكل 5A-B)،وتقدم أكثر إلى تجويف الوريد عن طريق اختراق 2-4 مم(الشكل 5C-D). حقن ببطء الحل.
      ملاحظة: إذا كان الحقن ناجحا، لا ينبغي أن يشعر أي مقاومة على المكبس، ويمكن رؤية السائل تتحرك من خلال الوريد. في حالة المقاومة أو ظهور بثور بيضاء فوق موقع الحقن، قم بإزالة الإبرة وحاول الحقن مرة ثانية في موقع أعلى موضع الإبرة الأصلي. لا تحاول الحقن أسفل موقع الحقن الأولي حيث أن السائل سيفرج عن طريق الموقع الأولي. إذا لم ينجح حقن وريد جانبي واحد، فإعادة وضع الحيوان إلى الجانب الآخر وإجراء المزيد من المحاولات على الوريد المضاد. يعتمد الحد الأقصى لعدد المحاولات على المكان الذي يبدأ فيه الشخص محاولة الحقن على طول الوريد والتورم الذي قد يحدث مع المحاولات الفائتة. راجع اللوائح المؤسسية ل IACUC بشأن الحقن الخاطئ والإصابات المرتبطة به.
    6. إزالة الإبرة، واضغط بقوة مع الإبهام لمنع التدفق الخلفي للمحلول حقن و / أو الدم. استمر في تطبيق الضغط اللطيف باستخدام شاش/مسح نظيف أو نسيج حتى يتوقف النزيف(الشكل 6).
    7. إعادة الحيوان إلى قفصه، ورصد لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الحيوان يستأنف نشاطه الطبيعي دون مزيد من النزيف.

3. نموذج مورين من عدوى مجرى الدم الفطرية والإنتان

  1. سلالات الماوس
    1. التأقلم مع الفئران السويسرية ويبستر الإناث في 6 أسابيع من العمر لكل المبادئ التوجيهية الموصى بها مؤسسيا. بدلا من ذلك، استخدم سلالات أصيلة/معدلة وراثيا (مثل خلفية C57BL/6) لهذا البروتوكول مع إينولا معدلة (انظر NOTE).
      ملاحظة (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل): غالبا ما تكون عروق الذيل للفئران ذات الفراء الداكن أقل وضوحا من تلك التي بها فراء أخف بسبب الذيل المصطبغ بعمق(الشكل 4). هناك قابلية متفاوتة لتعفن الدم الفطري / الفتك بين سلالات الفئران المختلفة. قد يتطلب استخدام سلالات الماوس بخلاف Swiss Webster تحسين البروتوكول الإضافي من خلال النظر في العوامل ذات الصلة (على سبيل المثال ، الخلفية الوراثية والعمر والجنس وحجم الجسم) التي يمكن أن تؤثر على الحالة المناعية للمضيف. على سبيل المثال، يتطلب التحدي القاتل في فئران C57BL/6 عادة زيادة في الوسوكولا (حتى 10 أضعاف) لتحقيق مستوى الوفيات الذي شوهد في فئران ويبستر السويسرية.
  2. الكائنات الدقيقه
    1. لتحدي قاتل (الإنتان) ، سلسلة من المخزونات المجمدة من المبيضات albicans سلالة DAY185 (أو سلالات من الاختيار) على أجار Sabouraud dextrose واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    2. نقل مستعمرة واحدة إلى 10 مل الخميرة استخراج- peptone-dextrose مرق, والثقافة إلى مرحلة ثابتة من النمو لمدة 18 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز.
  3. حلول إنكولوم
    1. في يوم التحدي القاتل، وجمع ثقافة مرق، وغسل بيليه 3 مرات عن طريق الطرد المركزي (800 × ز) في برنامج تلفزيوني عقيم.
    2. تحديد خلايا الخميرة قابلة للحياة عن طريق استبعاد صبغة زرقاء تريبان، ونعدد باستخدام مقياس الدم. ضبط تركيز الخلية إلى 1 × 106 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني معقم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: سيحصل كل على 100 ميكرولتر من محلول inoculum. إعداد حجم زائد من inoculum (>500 ميكرولتر) للسماح للخسارة المحتملة أثناء إجراء الحقن. و inoculum النهائي هو 1 × 105 خلايا لكل فأر. يمكن زيادة حجم ال inoculum حتى 200 ميكرولتر عن طريق ضبط تركيز الخلية وفقا لذلك.
      تنبيه: يجب الاحتفاظ محلول inoculum الفطرية في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. ارتفاع درجة حرارة محلول inoculum لدرجة حرارة الجسم قد يؤدي إلى تغيير مورفولوجي من خلايا الخميرة إلى الهيجا. على العكس من ذلك ، يمكن إدارة bolus i.v من المحاليل الباردة خفض درجة حرارة الجسم بسرعة للحيوان وينبغي تجنبها.
  4. التلقيح الوريدي
    1. تدفئة الحيوانات، والحث على توسع الأوعية باتباع الإجراءات في القسم 2.
    2. حقن 100 ميكرولتر من محلول إينكولوم في الوريد الذيل باستخدام حقنة 1 مل مع 27 G, 1/2-في إبرة.
  5. مراقبة ما بعد التطعيم
    1. مراقبة الحيوانات بحثا عن العلامات التالية للمراضة الناجمة عن الإنتان: '1' جانب الفراء (على سبيل المثال، السلس، تكدرت)، 2) النشاط (على سبيل المثال، تتحرك بحرية، غيرستجيب)، 3) الموقف (على سبيل المثال، حدب، قاسية)، 4) السلوك (على سبيل المثال، بطيئة، لا نقل)، v) حركات الصدر (على سبيل المثال، التنفس الطبيعي، ضيق التنفس)، 6) الجفون (على سبيل المثال، مفتوحة، مغلقة)43.
  6. تسجيل الإنتان
    1. تسجيل المراضة الملاحظة وفقا لدرجة تقييم الماوس السريري المعدلة لتعفن الدم (M-CASS) في مقياس الدرجات من أربع نقاط من 0 إلى 3 في كل فئة: 0، طبيعي؛ 1, معتدل; 2، معتدلة؛ 3، شديد43.
  7. البروتوكول الاختياري: التطعيم ضد الإنتان الفطري
    1. قبل أربعة عشر يوما من التحدي القاتل ، تلقيح الفئران مع سلالة المبيضات دبلن Wü284 أو سلالات C. albicans المخففة ، مثل Δefg1/ Δcph1 متحولة (1x105 خلايا لكل فأر) ، كما هو موضح في الأقسام 3.2-3.4 بدلا من C. albicans DAY185.
    2. إجراء تحد قاتل في الفئران الملقحة، كما هو موضح في الأقسام 3.2-3.4، ورصد علامات المراضة الناجمة عن الإنتان الموصوفة في الأقسام 3.5-3.6.

Representative Results

يتم الكشف عن درجة الحرارة داخل غرفة الاحترار باستمرار من قبل جهاز الاستشعار الداخلي والسيارات التي ينظمها الحرارة. أولا، تم وضع قرص التحكم في منظم الحرارة عند 78 أو 85 أو 90 أو 95 درجة فهرنهايت (26 أو 29 أو 32 أو 95 درجة مئوية) لتحديد درجات الحرارة المحددة. بمجرد تنشيط المدفأة(الشكل 7، النقاط الصفراء) ، زادت انبعاثات الحرارة بواسطة المصباح الكهربائي بسرعة درجة الحرارة الداخلية خلال أول 5-15 دقيقة ، اعتمادا على درجة الحرارة المحددة. قام المدفأة بعطل المصباح الكهربائي إذا تجاوزت درجة الحرارة الداخلية المكتشفة درجة الحرارة المحددة (النقاط الرمادية). وينبغي أن ترتفع درجات الحرارة القصوى الأولية إلى 5-7 درجات مئوية فوق درجات الحرارة المحددة في جميع المجموعات لتعويض فقدان درجة الحرارة أثناء نقل الحيوانات. في وقت لاحق، يستمر الجهاز في تكرار دورة الحرارة تلقائيا ويحافظ على غرفة الاحترار في درجة الحرارة المحددة.

مثال على البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها عن طريق حقن الوريد الذيل الناجح باستخدام البروتوكول الحالي هو مبين في الشكل 8. في نموذج الماوس من داء المبيضات مجرى الدم مما أدى إلى تعفن الدم، وهو التحدي ضد ضد المبيضات albicans (1 × 105 خلايا لكل فأر) في الفئران ويبستر السويسرية تسبب بداية سريعة من الإنتان ونشر الكائنات الحية، مما أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات في غضون 3-4 أيام (النقاط المفتوحة) (الشكل 8A). في المقابل ، يمكن حماية الحيوانات من الإنتان عن طريق التلقيح المسبق / التطعيم باستخدام سلالة خميرة أفيرولنت ، المبيضات دبلنينسيس، وتحقيق بقاء >95٪ بعد تحدي i.v. القاتل مع albicans C. الخبيثة (النقاط الصلبة). وقد تم الحصول على هذه النتائج في الوفيات التدريجية مقابل الحماية بوساطة اللقاح بشكل مستنسخ في أربع تجارب مستقلة(الشكل التكميلي 1). ويمكن تحقيق حماية مماثلة باستخدام سلالات الخميرة avirulent أخرى مثل المسوخ الموهنة C. albicans (Δefg1/ Δcph1) (البيانات غير مبينة). ويمكن رصد الإنتان أيضا وربطه بالوفيات؛ وكان لدى الحيوانات غير المطعمة التي تعاني من عدوى قاتلة زيادة كبيرة في المراضة الناجمة عن الإنتان، في حين أظهرت المجموعة الملقحة أعراضا طفيفة في أعقاب التحدي القاتل(الشكل 8ب).

Figure 1
الشكل 1: وصف الاحترار القوارض وجهاز تقييد. (أ) يظهر المنظر الخارجي لجهاز الاحترار، والذي يتكون من:

  1. غطاء الحرارة – رفع صعودا من المقبض لفضح الحرارة
  2. حاوية كهربائية – مختومة بشكل دائم للحماية
  3. غطاء الغرفة – رفع صعودا أثناء نقل الحيوانات إلى / من
  4. غرفة الاحترار – قابلة للإزالة, تغطية الأرض مع الفراش قبل الاستخدام
  5. جهاز ضبط النفس – قابلة للاختباء مع جهاز التدفئة في حين لا تستخدم
  6. مفتاح الطاقة – مفتاح الروك المضمن للوظائف الرئيسية على / إيقاف
  7. سلك الطاقة – الجهد / التيار: 120V/10A

(ب) يظهر الداخلية للجهاز الاحترار:

  1. مصباح الإضاءة المتوهجة – إخراج الضوء في 100 واط
  2. درع واقي للمصباح الكهربائي – قابل للإزالة لاستبدال المصباح
  3. مسبار استشعار درجة الحرارة – تقع داخل الغرفة
  4. ميزان الحرارة الداخلي – مكان داخل الغرفة لرصد درجة الحرارة

(ج) يظهر مكونات الحرارة جهاز الاحترار:

  1. ميزان الحرارة الداخلي
  2. الحرارة – السيارات ينظم سخان
  3. ذراع التحكم في نقطة التعيين - الحد الأدنى/الحد الأقصى: 78 درجة فهرنهايت/108 درجة فهرنهايت (25 درجة مئوية/42 درجة مئوية)
  4. مؤشر طاقة الحرارة – الضوء الأخضر يشير إلى التشغيل العادي
  5. مؤشر سخان الحرارة – مضاءة باللون الأحمر أثناء دورة التدفئة

(د) يظهر مكونات جهاز التقييد:

  1. مخروط – ورقة الألومنيوم مرنة مصممة لضبط القوارض
  2. قناة الذيل – على شكل للسماح لتحديد المواقع على نحو سلس من الذيل
  3. منصة رفع المخروط - يوفر رفع قوي من قاعدة مخروط
  4. ارتفاع مقبض التكيف - مصممة لتعديل الارتفاع اليدوي
  5. مقبس مقصي - يتراوح الارتفاع من 45 إلى 140 مم (1.77-5.52 بوصة)
  6. لوحة الدعم – مثبتة بأقدام مطاطية لتوفير الاستقرار يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: جهاز تدفئة القوارض وتقييدها. (أ) قبل الاستخدام، يتم وضع جزأين من الجهاز جنبا إلى جنب على أعلى مقاعد البدلاء نظيفة. (ب) بمجرد تشغيل جهاز الاحترار، ينشط منظم الحرارة المدفأة. المصباح الكهربائي لا يزال مضاءة وتنبعث الحرارة حتى غرفة الاحترار قد وصلت إلى درجة الحرارة المحددة. جهاز الاحترار يكرر تلقائيا دورة الحرارة للحفاظ على درجة الحرارة الداخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفئران (C57BL/6) وضعت في جهاز الاحترار وتقييد. (أ)الفئران تلقي العلاج الحراري لال توسع الأوعية. يتم نقل الحيوانات (4-6 فئران لكل علاج) من قفصها السكني إلى غرفة الاحترار للجهاز والمعالجة بالحرارة لمدة لا تقل عن 5-10 دقائق (B)فأر مقيد لحقن الوريد الذيل. يتم نقل الماوس من غرفة الاحترار إلى فتح مخروط الجهاز تقييد مع ذيله يمر عبر فتحة مفتوحة. يتم سحب الماوس بلطف إلى الخلف إلى الحافة البعيدة للمخروط حتى تصل قاعدة الذيل إلى طرف المخروط. كما يتم رسمها الحيوان نحو قاعدة المخروط مع دوران الجانبي لطيف، يتم وضع ساق واحدة الخلفية صعودا بحيث يبرز من شق مفتوح مما يسمح للوريد الذيل الجانبي ليتم وضعها في الساعة 12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد الأوردة الذيل الجانبي في الفئران. (أ)ذيل فأر ويبستر السويسري غير المعالج. يتم وضع الماوس في جهاز تقييد دون المعالجة الحرارية المسبقة لvasodilation. يمكن تحديد الوريد الذيل الجانبي على أنه وعاء داكن رقيق ي كورسات تحت الجلد. (ب) ذيل فأر ويبستر السويسري المعالج بجهاز الاحترار لمدة 10 دقائق. يتم تقييد الماوس المعالج بالحرارة لحقن الوريد الذيل. وريد الذيل الجانبي مرئي بسهولة من خلال الجلد بسبب قطر الأوعية المتضخم الناجم عن توسع الأوعية. (ج) ذيل الماوس C57BL/6 تعامل مع جهاز الاحترار لمدة 10 دقيقة وضبط النفس لحقن الوريد الذيل. يعزز توسع الأوعية رؤية الوريد الذيل من خلال الجلد المصطبغ بعمق على الرغم من أن الوريد ليس مرئيا بسهولة كما هو الحال في فئران ويبستر السويسرية ذات الألوان الفاتحة بسبب تباين اللون الضعيف ضد الوريد. تشير الأسهم الحمراء إلى موقع الوريد الجانبي الذيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: حقن الوريد الذيل يؤديها في الفئران المعالجة بالحرارة (السويسري ويبستر). (أ- ب) إدخال إبرة في الوريد الذيل الجانبي في موقع الحقن. الإبرة (27 G, 1/2-in) يتم وضعها بالتوازي مع الوريد الذيل مع شطبة وأشار نحو تدفق الدم وإدراجها. (C-D) وضع إبرة في الوريد الذيل والحقن. غيض من الإبرة هو مزيد من التقدم 2-4 ملم في تجويف الوريد. يتم وضع الإبهام على المكبس من الحقنة ، ويتم الاستغناء عن الحجم المطلوب مع الضغط البطيء والمطرد. تشير الدوائر البيضاوية إلى مواقع الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: إجراء ما بعد الحقن. أ)منطقة نزيف في موقع الحقن. يحدث النزيف والتدفق الخلفي للمحلول المحقون مباشرة بعد إزالة الإبرة. ويمكن التقليل من ذلك عن طريق تطبيق ضغط شركة على موقع الحقن مع الإبهام. (ب) تشكيل جلطة دموية في موقع الحقن. ضغط لطيف مع شاش نظيفة / مسح يسهل تخثر الدم على الجرح الحقن. الأسهم تدل على مواقع الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: درجة الحرارة الداخلية للغرفة الاحترار أثناء الاستخدام. تم تنشيط جهاز الاحترار للاحترار في درجات الحرارة المحددة. تم رصد غرفة الاحترار للجهاز لدرجة حرارة الهواء الداخلية وسجلت دورات الحرارة (مصباح كهربائي على / النقاط الصفراء، قبالة / النقاط الرمادية) أكثر من 45 دقيقة. تشير المنطقة البرتقالية إلى النطاق الأمثل لدرجة الحرارة لتحريض توسع الأوعية في القوارض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: وفيات الإنتان مقابل الحماية بوساطة اللقاح بعد تحد قاتل مع المبيضات albicans. تم تطعيم الفئران (8 أسابيع السويسري ويبستر الإناث) عن طريق الوريد مع avirulent يعيش المبيضات دبلنينسيس Wü284 (Cd)، تليها تحديا في الوريد قاتلة مع البرية من نوع C. albicans اليوم 185 (1 × 105 خلايا لكل فأر) 14 يوما في وقت لاحق. (أ)تم تقييم معدل الوفيات على مدى 10 أيام بعد التحدي القاتل. (ب)تم رصد الحيوانات لمراضة الإنتان وسجل وفقا لتعديل الماوس التقييم السريري النتيجة لتعفن الدم (M-CASS)43. البيانات تراكمية من 4 تجارب مستقلة مع 10 فئران لكل مجموعة وتحليلها باستخدام اختبار رتبة سجل Mantel-Cox. ص < 0.0001. SEM، خطأ قياسي من المتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: استنساخ وفيات الإنتان والبقاء على قيد الحياة بوساطة اللقاح من تحدي المبيضات المبيضات مجرى الدم. تمثل كل لوحة بيانات من أربع تجارب مستقلة مضمنة في نتيجة تراكمية موضحة في الشكل 8A. وأجريت كل تجربة باستخدام 10 فئران لكل مجموعة وتحليلها باستخدام اختبار رتبة سجل مانتل كوكس. كا، كانديدا ألبيكانز. Cd, كانديدا دبلنينسيس. ص < 0.0001. ص < 0.01. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Discussion

الدواسة متسقة ودقيقة هي المتطلبات الرئيسية للموثوقية التجريبية في النماذج الحيوانية. وهذا مهم بشكل خاص في حالات أي إدارة حيث التوافر البيولوجي النظامي للعوامل المحقونة أعلى بكثير / أسرع مما كانت عليه مع طرق الإدارة الأخرى3. وهكذا، يمكن أن يكون للأخطاء في حقن الوريد الذيل تأثير ضار على نتائج الدراسة. تاريخيا، الحقن داخل الصفاق (أي p.) ، بدلا من أي، كان الأسلوب الأكثر شيوعا للوصول النظامي في القوارض بسبب البساطة التقنية والراحة. ومع ذلك ، تصبح طرق الإدارة أكثر أهمية عند ترجمة قراءات ما قبل السريرية من الحيوانات إلى بيئات سريرية. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تحسين مستمر في بروتوكولات القوارض التي يمكن أن تسهل حقن الوريد الذيل الناجح.

التقدم الرئيسي في هذا البروتوكول هو جهاز الاحترار الحراري المبتكر الذي يمكن من التعريفي الفعال لل توسع الأوعية في القوارض ، مما يحسن بشكل كبير من رؤية عروق الذيل ومحاذاة الإبر. طرق التدفئة التي هي غير منظم حراريا سيئة (مثل المصابيح) ، وvasodilators الموضعية أو مهيجات الجلد (على سبيل المثال ، xylenes) ليست فقط غير موثوق بها ، ولكنها أيضا غير آمنة للحيوان وينبغي تجنبها44. خلافا لغيرها من الأساليب التقليدية، مثل غمر الذيل في الماء الدافئ، يمكن للقدرة على التنظيم الذاتي لهذا الجهاز شرط بأمان متعددة في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعزيز هذا البروتوكول بشكل أكبر باستخدام جهاز التقييد المصمم على النحو الأمثل والسماح بشل الحركة السريع والآمن للحيوان في وضع يعرض أفضل وريد الذيل الجانبي.

تنسيقات البوق شفافة ينظر في العديد من القيود الحالية، على الرغم من تصميمها بشكل جيد عمليا، تتطلب المزيد من الوقت التعامل مع كل حيوان، وبالتالي إطالة أمد عملية تقييد45. هذا يمكن أن يكون أكثر إشكالية في سلالات القوارض مع الصفات العدوانية التي تقدم التعاون المحدود46،47. وعلى النقيض من ذلك، يسمح الهيكل شبه المغلق للجهاز التقييدي بتحديد المواقع السريع للحيوان ويساعد على تقليل مدة ضبط النفس إلى أدنى حد. معا، بروتوكول مبسطة باستخدام مبتكرة، ونظام الاحترار الأمثل للغاية / كبح يسرع إجراء الحقن، مما يسمح للتعاطي سريعة وفعالة من مجموعات كبيرة من الحيوانات. في مختبرنا، نقوم عادة بإكمال إجراء حقن كامل ل 30 فأرا بدءا من المعالجة الحرارية إلى مراقبة ما بعد الحقن في غضون ساعة واحدة باستخدام هذا البروتوكول.

على الرغم من الميزات المتقدمة، وهذا الجهاز لديه بعض العيوب واضحة: الأول هو تكلفة الجهاز واستبدال المصباح الكهربائي الروتينية في غرفة الاحترار. ومع ذلك ، بالإضافة إلى كفاءة وسرعة الحقن ، فإن الجهاز دائم للاستخدام المتكرر ومتوافق مع المطهرات الأكثر شيوعا ، مما يسمح بالتنظيف الشامل للجهاز بين الاستخدامات. معا، وهذا يعوض الاستثمار الأولي. Second، في الحالات ذات مساحة عمل محدودة، قد يكون عيب لهذا البروتوكول شرط لمنطقة مقاعد البدلاء مخصصة كبيرة بما يكفي لوضع وحدتين، جنبا إلى جنب، أثناء تنفيذ الحقن. ومع ذلك ، لأنه يمكن استخدام الجهاز على نطاق واسع عبر العديد من بروتوكولات القوارض التي تنطوي على حقن أي v. ، فمن الممكن أن يكون الجهاز بمثابة أداة أساسية مماثلة لمعدات vivarium المجتمعية الأخرى مثل مبخرات isoflurane. بغض النظر عن ذلك، فإن الوحدتين محمولتان بسهولة ويمكن تجميعهما وتخزينهما أثناء عدم استخدامهما.

نموذج التحدي القاتل لتعفن الدم الفطري المورين الموصوف في هذا البروتوكول يحاكي عن كثب التهابات مجرى الدم C. albicans في البشر وقد تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة الفوعة الفطرية ، واختبار فعالية العلاجات المضادة للفطريات ، وتوصيف الاستجابات المناعية المضيفة للعدوى37،39،48. لتحقيق عدوى قابلة للاستنساخ ، أي التطعيم عن طريق حقن الوريد الذيل هو الخطوة الأكثر حيوية في البروتوكول لضمان التسليم الدقيق للكائنات الحية في مجرى الدم. في الواقع ، تستجيب الحيوانات بشكل مختلف جدا لمستويات مختلفة من تحديات المبيضات ؛ إدارة كميات منخفضة جدا من inoculum سيؤدي إلى استرداد عفوية غير المرغوب فيها، في حين أن الحيوانات التي تتلقى جرعات عالية جدا سوف تستسلم قبل الأوان. تعتمد النافذة المحددة لأحجام الإنكولوم للكائن الحي المعين للحث على مستوى ثابت من الإنتان / الوفيات إلى حد كبير على كل من السلالات الفطرية وسلالات الماوس.

البروتوكول الحالي باستخدام الفئران ويبستر السويسرية في inoculum من 1 ×10 5 البرية من نوع C. albicans تسبب بشكل مستنسخ بداية مراضة الإنتان في غضون يوم واحد، تليها وفيات تدريجية مما أدى إلى 100٪ الفتك من قبل 5-7 أيام. في المقابل، يؤدي العقاط أعلى من 1 ×10 5 عادة إلى تسارع الوفيات (أي 1-2 أيام في 1 × 106، 3-4 أيام في 5 × 105)،وتلك التي تقل عن 1 × 105 هي دون قاتلة. تمشيا مع العديد من التقارير في الأدب، واستخدام الأنواع المبيضات غيرalbicans بدلا من C. albicans النتائج في انخفاض كبير في الفتك40،49. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون لاختيار سلالات الماوس ، أو حتى أصل المستعمرات ، تأثير كبير على نتائج العدوى بسبب الحساسية المختلفة بين سلالات الماوس ، كما ذكر آخرون39،40،41،50،51،52،53،54،55. ومن ثم، ينبغي أن يؤخذ كلاهما في الاعتبار عند تصميم التجارب.

بعد تحدي قاتل في أي، تنتشر الخلايا الفطرية بسرعة عبر مجرى الدم وتبدأ في غزو أعضاء متعددة، من بينها الأكثر تضررا هي الكلى41. الأعضاء الأخرى المتضررة هي الدماغ والطحال ونخاع العظم48،56. بغض النظر عن ذلك ، الإنتان الحاد هو السبب النهائي للوفاة في وقت مبكر من النقاط37. كما هو مبين في النتائج التمثيلية ، يمكن تقييم شدة الإنتان كميا من خلال نقاط التقييم السريري الماوس لتعفن الدم (M-CASS) استنادا إلى العلامات المعروضة على حالة الإنتان في الحيوانات المطعون فيها43،57. من بين العديد من العلامات البديلة لتعفن الدم القاتل ، تم اقتراح انخفاض حرارة الجسم كمنبئ حرج للوفاة الوشيكة في كل من الإنتان السريري والتجريبي43،58،59.

على الرغم من عدم إجراء دراسات رسمية لمقارنة الفئران الأصيلة مقابل الأصيلة مباشرة في هذا النموذج ، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من البروتوكول الحالي باستخدام فئران ويبستر السويسرية الأصيلة قابلة للاستنساخ بشكل استثنائي في معلمات الإنتان المختلفة ، على الرغم من التغايرية الوراثية المفترضة. عموما، نمط من الوفيات التي تقع في غضون 3-5 أيام هو نموذج ثابت من الإنتان الحاد، كما يتضح من الارتفاع السريع في مراضة الإنتان ومستويات علامات الالتهاب في غضون ساعات من التحدي بعدالقاتلة 50،51. بالنسبة لأوقات البقاء على قيد الحياة الأطول (7-10 أيام)، من المرجح أن يكون الوفيات نتيجة للعبء الميكروبي الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة القاتلة في الأعضاء المستهدفة والجهاز العصبي المركزي. يمكن تطبيق اختيار الإنتان أو العبء الميكروبي حسب الضرورة لتقييم وظائف المناعة أو الاستجابات للأنظمة المضادة للالتهابات أو العلاجات المضادة للفطريات / اللقاحات ، كما يحددها الإنكولوم المستخدم.

بالإضافة إلى نموذج التحدي القاتل i.v. ، يمكن أن تؤدي العدوى داخل البطن مع C. albicans في الفئران عن طريق تحدي i.p. أيضا إلى انتشار المبيضات والإنتان اللاحق ، على الرغم من أن التطعيم المشترك مع الممرض البكتيري ، المكورات العنقودية والكورس المسالك التنفسية ، يعزز الوفيات بشكل تآزري مقارنة ب C. albicans أحادي العدوى51،60،61. في نموذج التحدي القاتل i.p. ، مطلوب من العقور الميكروبي الأعلى بكثير (1.75 ×10 7C. albicans/ 8 ×10 7S. aureus لكل فأر) التسبب في التهاب الصفاق متعدد الميكروبات ونشر الكائنات الحية من تجويف البطن في مجرى الدم. وبالمثل ، فإن العدوى المعدية المعوية مع C. albicans في الفئران المعالجة بعوامل مثبطة للمناعة و / أو ضارة بالغشاء المخاطي تؤدي إلى نقل الخلايا الفطرية إلى مجرى الدم وتؤدي إلى الإنتان الفطري62،63. على الرغم من طرق التطعيم المميزة ، فإن آلية الإنتان الفطري الذي يترتب على ذلك مماثلة إلى حد كبير بين نماذج المرض الثلاثة ، والتي تنطوي على استجابة proinflammatory الجهازية غير المنضبطة ل المبيضات التي تؤدي إلى فشل الجهاز37،51،61. وبالمثل ، في البشر ، فإن هذه العملية من الاستجابة المضيفة ، وليس فقط candidemia ، هي التي تسبب ارتفاع المراضة / الوفيات المرتبطة بداء المبيضات المنشورة بشكل دموي المكتسبة في بيئات الرعاية الصحية64،65.

باستخدام نموذج الإنتان الفطري الحالي ، نثبت هنا أن الحماية من عدوى C. albicans القاتلة يمكن تحقيقها عن طريق أي ما قبل التحصين / التطعيم مع C. dubliniensis (avirulent) أو المسوخ الموهنة C. albicans ، مع ما يصاحب ذلك من انخفاض كبير في مراضة الإنتان. يتم التوسط في الحماية من قبل الفطرية Gr-1+ الخلايا القامع المايلويد المشتقة التي يبدو أن المستحثة في نخاع العظام كشكل من أشكال المناعة الفطرية المدربة66،67. وتبذل الجهود لتوسيع نطاق فهم هذا الشكل الجديد من الحماية الفطرية بوساطة المناعة ضد التهابات مجرى الدم C. albicans.

في الختام ، كان جهاز احترار / تقييد القوارض المبتكر مفيدا في تعزيز قدرتنا على إجراء حقن أي دراسات حيوانية متعددة المجموعات على نطاق واسع بطريقة فعالة وفعالة. على هذا النحو ، لقد صاغنا مصطلح ، ماوس دقيقة ، للجهاز. مواصفات الجهاز متاحة من المؤلف المقابلة بناء على طلب لشراء جهاز مماثل. يمكن أن تكون التقنيات التي تم إثباتها هنا بمثابة أداة مفيدة في نماذج القوارض التي تستخدم حقن الوريد الذيل عبر مجموعة واسعة من مجالات البحث.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مؤسسة LSUHSC (PLF)، وجزؤا من قبل U54 GM104940 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة، والذي يمول مركز لويزيانا للعلوم السريرية والترجمة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woodard, G. Methods of animal experimentation. Gay, W. J. 1, 343-359 (1965).
  2. Shimizu, S. The laboratory mouse The handbook of experimental animals. Hedrich, H. J. , Elsevier Academic Press. Ch. 32 527-541 (2004).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 614-627 (2011).
  5. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Immunology. 73 (1), Chapter 1, Unit 1 6 (2006).
  6. Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Animal. 43 (3), 95-99 (2014).
  7. Jarneborn, A., et al. Tofacitinib treatment aggravates Staphylococcus aureus septic arthritis, but attenuates sepsis and enterotoxin induced shock in mice. Scientific Reports. 10 (1), 10891 (2020).
  8. Bussey, K. A., et al. Endosomal Toll-like receptors 7 and 9 cooperate in detection of murine Gammaherpesvirus 68 infection. Journal of Virology. 93 (3), (2019).
  9. Pitts, M. G., D'Orazio, S. E. F. A Comparison of oral and intravenous mouse models of listeriosis. Pathogens. 7 (1), (2018).
  10. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  11. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  12. Srinageshwar, B., et al. Surface-modified G4 PAMAM dendrimers cross the blood-brain barrier following multiple tail-vein injections in C57BL/6J mice. ACS Chemical Neuroscience. 10 (9), 4145-4150 (2019).
  13. Channabasappa, S., et al. Efficacy of novel antistaphylococcal ectolysin P128 in a rat model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
  14. Sadeghi, B., et al. Preclinical toxicity evaluation of clinical grade placenta-derived decidua stromal cells. Frontiers in Immunology. 10, 2685 (2019).
  15. Boquet, M. P., Wonganan, P., Dekker, J. D., Croyle, M. A. Influence of method of systemic administration of adenovirus on virus-mediated toxicity: focus on mortality, virus distribution, and drug metabolism. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (3), 222-232 (2008).
  16. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. Journal of Nuclear Medicine Technology. 39 (4), 264-270 (2011).
  17. Lasnon, C., Dugue, A. E., Briand, M., Dutoit, S., Aide, N. Quantifying and correcting for tail vein extravasation in small animal PET scans in cancer research: is there an impact on therapy assessment. EJNMMI Research. 5 (1), 61 (2015).
  18. Groman, E. V., Reinhardt, C. P. Method to quantify tail vein injection technique in small animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (1), 35-38 (2004).
  19. Aller, M. A., et al. Neuro-immune-endocrine functional system and vascular pathology. Medical Hypotheses. 57 (5), 561-569 (2001).
  20. McEwen, B. S., et al. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactions. Brain Research. Brain Research Reviews. 23 (1-2), 79-133 (1997).
  21. Callewaert, B. L., et al. Absence of arterial phenotype in mice with homozygous slc2A10 missense substitutions. Genesis. 46 (8), 385-389 (2008).
  22. Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. Tumor formation assays. Methods in Enzymology. 479, 397-411 (2010).
  23. Carlson, R. P. J., Peer, B. In Vivo Models of Inflammation Progress in Inflammation Research. Morgan, D. W., Marshall, L. , Birkhäuser, Basel. 1-50 (1999).
  24. Flecknell, P. Laboratory Animals: An Introduction for New Experimenters. Tuffery, A. A. , John Wiley and Sons. 225-260 (1987).
  25. Kim, M. J., Ahituv, N. The hydrodynamic tail vein assay as a tool for the study of liver promoters and enhancers. Methods in Molecular Biology. 1015, 279-289 (2013).
  26. Bargellini, A., et al. Effects of chronic exposure to anaesthetic gases on some immune parameters. Science of The Total Environment. 270 (1-3), 149-156 (2001).
  27. Elena, G., et al. Inhalatory anesthetic (halothane) associated changes in the immune response in mice. International Journal of Immunopharmacology. 19 (11-12), 699-707 (1998).
  28. Buerge, T. The Laboratory Mouse The handbook of experimental animals. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier Academic Press. Ch. 31 517-526 (2004).
  29. Cohen, J., Cristofaro, P., Carlet, J., Opal, S. New method of classifying infections in critically ill patients. Critical Care Medicine. 32 (7), 1510-1526 (2004).
  30. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  31. Magill, S. S., et al. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1198-1208 (2014).
  32. Dupont, H., et al. Predictive factors of mortality due to polymicrobial peritonitis with Candida isolation in peritoneal fluid in critically ill patients. Archives of Surgery. 137 (12), 1341-1346 (2002).
  33. Montravers, P., et al. Candida as a risk factor for mortality in peritonitis. Critical Care Medicine. 34 (3), 646-652 (2006).
  34. Calandra, T., Bille, J., Schneider, R., Mosimann, F., Francioli, P. Clinical significance of Candida isolated from peritoneum in surgical patients. Lancet. 2 (8677), 1437-1440 (1989).
  35. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  36. Ramage, G., Martinez, J. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Research. 6 (7), 979-986 (2006).
  37. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 336-343 (2005).
  38. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105 (1), (2014).
  39. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. Journal of Innate Immunity. 3 (2), 180-199 (2011).
  40. Segal, E., Frenkel, M. Experimental in vivo models of candidiasis. Journal of Fungi. 4 (1), (2018).
  41. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
  42. Gordon, C. J. The mouse thermoregulatory system: Its impact on translating biomedical data to humans. Physiology & Behavior. 179, 55-66 (2017).
  43. Mai, S. H. C., et al. Body temperature and mouse scoring systems as surrogate markers of death in cecal ligation and puncture sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6, 20 (2018).
  44. Catty, D., Lehmann, P. F. A simple low-cost restrainer for the intravenous injection of mice. Sabouraudia. 16 (2), 89-90 (1978).
  45. Donovan, J., Brown, P. Handling and restraint. Current Protocols in Immunology. 73 (1), Chapter 1 Unit 1 (2006).
  46. Dow, H. C., et al. Genetic dissection of intermale aggressive behavior in BALB/cJ and A/J mice. Genes Brain and Behavior. 10 (1), (2010).
  47. Pugh, P. L., Ahmed, S. F., Smith, M. I., Upton, N., Hunter, A. J. A behavioural characterisation of the FVB/N mouse strain. Behavioural Brain Research. 155 (2), 283-289 (2004).
  48. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Need for early antifungal treatment confirmed in experimental disseminated Candida albicans infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (12), 4911-4914 (2004).
  49. Fakhim, H., et al. Comparative virulence of Candida auris with Candida haemulonii, Candida glabrata and Candida albicans in a murine model. Mycoses. 61 (6), 377-382 (2018).
  50. Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. R. Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis: lipopolysaccharide vs. cecal ligation and puncture. Shock. 13 (2), 110-116 (2000).
  51. Nash, E. E., Peters, B. M., Palmer, G. E., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Morphogenesis is not required for Candida albicans-Staphylococcus aureus intra-abdominal infection-mediated dissemination and lethal sepsis. Infection and Immunity. 82 (8), 3426-3435 (2014).
  52. Rogers, T., Balish, E. Experimental Candida albicans infection in conventional mice and germfree rats. Infection and Immunity. 14 (1), 33-38 (1976).
  53. Marquis, G., Montplaisir, S., Pelletier, M., Auger, P., Lapp, W. S. Genetics of resistance to infection with Candida albicans in mice. The British Journal of Experimental Pathology. 69 (5), 651-660 (1988).
  54. Ashman, R. B., Fulurija, A., Papadimitriou, J. M. Strain-dependent differences in host response to Candida albicans infection in mice are related to organ susceptibility and infectious load. Infection and Immunity. 64 (5), 1866-1869 (1996).
  55. Ashman, R. B., Bolitho, E. M., Papadimitriou, J. M. Patterns of resistance to Candida albicans in inbred mouse strains. Immunology & Cell Biology. 71 (3), 221-225 (1993).
  56. Liu, Y., Mittal, R., Solis, N. V., Prasadarao, N. V., Filler, S. G. Mechanisms of Candida albicans trafficking to the brain. PLoS Pathogens. 7 (10), 1002305 (2011).
  57. Huet, O., et al. Ensuring animal welfare while meeting scientific aims using a murine pneumonia model of septic shock. Shock. 39 (6), 488-494 (2013).
  58. Kushimoto, S., et al. The impact of body temperature abnormalities on the disease severity and outcome in patients with severe sepsis: an analysis from a multicenter, prospective survey of severe sepsis. Critical Care. 17 (6), 271 (2013).
  59. Wiewel, M. A., et al. Risk factors, host response and outcome of hypothermic sepsis. Critical Care. 20 (1), 328 (2016).
  60. Peters, B. M., Noverr, M. C. Candida albicans-Staphylococcus aureus polymicrobial peritonitis modulates host innate immunity. Infection and Immunity. 81 (6), 2178-2189 (2013).
  61. Nash, E. E., Peters, B. M., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Morphology-Independent Virulence of Candida Species during Polymicrobial Intra-abdominal Infections with Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 84 (1), 90-98 (2016).
  62. Hirayama, T., et al. Virulence assessment of six major pathogenic Candida species in the mouse model of invasive candidiasis caused by fungal translocation. Scientific Reports. 10 (1), 3814 (2020).
  63. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), 35 (2008).
  64. Vergidis, P., et al. Intra-abdominal candidiasis: The importance of early source control and antifungal treatment. PLoS One. 11 (4), 0153247 (2016).
  65. Parker, J. C., McCloskey, J. J., Knauer, K. A. Pathobiologic features of human candidiasis. A common deep mycosis of the brain, heart and kidney in the altered host. American Journal of Clinical Pathology. 65 (6), 991-1000 (1976).
  66. Esher, S. K., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Candida/Staphylococcal Polymicrobial Intra-Abdominal Infection: Pathogenesis and Perspectives for a Novel Form of Trained Innate Immunity. Journal of Fungi. 5 (2), (2019).
  67. Lilly, E. A., Ikeh, M., Nash, E. E., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Immune protection against lethal fungal-bacterial intra-abdominal infections. mBio. 9 (1), (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 165، حقن الوريد ذيل القوارض، الحقن الوريدية، جهاز احترار القوارض، جهاز تقييد القوارض، نماذج حيوانية، نماذج الإنتان، توسع الأوعية
جهاز الاحترار / تقييد المعاصرة لحقن الوريد الذيل كفاءة في نموذج الإنتان الفطرية مورين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M.… More

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter