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Immunology and Infection

뮤린 곰팡이 패혈증 모델에서 효율적인 꼬리 정맥 주사를위한 현대 온난화 / 억제 장치

Published: November 6, 2020 doi: 10.3791/61961
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

Summary

여기에서, 우리는 독특하게 디자인된 온난화/억제 장치를 사용하여 설치류 꼬리 정맥 주사를 위한 효과적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 혈관 확장 및 억제 과정의 개시를 간소화함으로써,이 프로토콜은 최소한의 고통을 가진 동물의 큰 그룹의 정확하고 적시에 정맥 주사를 허용합니다.

Abstract

설치류 모델에서, 꼬리 정맥 주사는 실험 에이전트의 정맥 투여를위한 중요한 방법입니다. 꼬리 정맥 주사는 일반적으로 혈관 확장을 촉진하기 위해 동물의 온난화를 포함, 이는 혈관의 식별과 안전하게 동물을 억제하면서 혈관 루멘에 바늘의 위치 모두에서 도움이. 꼬리 정맥 주사는 많은 프로토콜에서 일반적인 절차이며 올바르게 수행하면 매우 기술적으로 간주되지 않지만 정확하고 일관된 주사는 재현 가능한 결과를 얻고 가변성을 최소화하는 데 중요합니다. 꼬리 정맥 주사 전에 혈관 확장을 유도하는 종래의 방법은 일반적으로 열램프, 전기 /충전식 열패드 또는 37 °C에서 예열 된 물과 같은 열원의 사용에 의존한다. 표준 실험실 환경에서 쉽게 액세스할 수 있음에도 불구하고 이러한 도구는 열 조절 능력이 좋지 않습니다. 마찬가지로, 다양한 형태의 제지 장치가 시판되고 있지만 동물에 대한 외상을 피하기 위해 신중하게 사용해야 합니다. 현재 방법의 이러한 제한은 실험에서 불필요한 변수를 생성하거나 실험 및/또는 실험실 간에 다양한 결과를 초래합니다.

이 문서에서는 독립적이고 열조절된 온난화 장치를 하나의 시스템으로 조정 가능한 제지 장치와 결합하여 효율적인 유선형 테일 정맥 주입을 제공하는 혁신적인 장치를 사용하여 향상된 프로토콜을 시연합니다. 우리가 사용하는 예는 패혈증을 초래하는 곰팡이 혈류 감염의 정맥 내 모델입니다. 온난화 장치는 사전 설정된 임계값에서 내부 온도를 유지하기 위해 조절 가능한 자동 온도 조절장치가 설치된 열 반사 아크릴 박스로 구성됩니다. 마찬가지로, 원뿔 억제 장치의 폭과 높이는 다양한 설치류 크기를 안전하게 수용하기 위해 조정할 수 있습니다. 장치의 고급 및 다재다능한 기능을 통해 여기에 표시된 기술은 꼬리 정맥 주사를 사용하는 설치류 모델과 관련된 다양한 연구 영역에서 유용한 도구가 될 수 있습니다.

Introduction

설치류와 관련 된 동물 모델의 사용은 생물 의학 연구의 주식 되었습니다. 수많은 근친근이 많고 근친근이 많은 균주와 유전자 변형 라인이 전 세계 실험실에서 일상적으로 사용되고 있습니다. 꼬리 정맥 주사는 실험 에이전트의 정맥 (즉) 투여를 요구하는 설치류 모델의 필수적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, i.v. 주사는 국소 조직 및 소화관을 우회하여 높은 흡광도 와 높은 내성 및 광범위한 농도 또는 비생리적 pH1,2,3,4의용액에 대한 높은 내성 과 같은 다른 투여 경로에 비해 큰 이점이있다. 다른 실행 가능한 i.v. 경로 중 (예를 들어, 사페누스 정맥, 복고풍 궤도 정맥 부비동), 꼬리 정맥은 설치류2,3,5,6에서가장 안전하고 가장 쉽게 접근 할 수있는 혈관으로 간주됩니다. 따라서, 꼬리 정맥 주사는 감염성 질환 모델7,8,9,생물학적 물질의이식(10, 11,전임상 치료제12,13,및 독성 분석14,15)을포함하는 설치류 모델의배열에널리 사용되고 있다.

투약의 일관성과 정확성은 성공적인 꼬리 정맥 주사에 중요한 요구 사항입니다. 놀랍게도, 문헌에서 꼬리 정맥 주사의 정량적 및 질적 평가는 빈번한주사를 연루16,17. 한 연구에 따르면 훈련받은 인젝터에 의해 수행된 30개의 주사 중 12개는 꼬리 내에서 주입된 복용량의 10% 이상을남겼다고 18. 또한, 꼬리 정맥 주사를 받는 동물의 안전과 편안함은 시술 중에 주요 관심사여야 합니다. 부적절한 구속은 샘플 품질19,20에서실질적인 변수를 도입할 수 있는 부상 및 다양한 스트레스 관련 병리학(예를 들어, 체중 감소, 면역 반응 장애)으로 이어질 수 있다. 이러한 오류는 데이터의 가변성을 높이고 재현성이 떨어지므로 연구 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.

마우스(21)에서300μm로 추정되는 선박의 작은 직경으로 인해 꼬리 정맥 주사를 수행할 때 동물내 혈관 팽창유도가 종종 필요하다. 혈관 확장은 정맥 정맥의 가시성을 향상시키고 정맥 루멘 내에서 최적의 바늘 정맥 정렬을 달성하는 데 도움이됩니다. 따뜻한물(22)에꼬리를 담그거나, 따뜻한 드레이프, 램프 또는 헤어드라이어(23,24)를사용하여 꼬리에 열을 가하거나, 가열패드, 인큐베이터 또는 상자를 이용하여 따뜻한 환경에 동물을 배치하는 등의 다양한 방법이보고되었다(25). 이 장치는 특정 목적으로 자체 제작되거나 상용 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 많은 열 조절 기능이 부족하고 있는 경우, 장치 온도가 제대로 유지되지 않으며 종종 실온의 변화에 따라 달라질 수 있습니다. 유사하게, 마취의 사용은 권장되지 않기 때문에 꼬리 정맥 주사에 대한 억제 장치의 사용이 필요합니다26,27. 여러 유형의 실험실 별 또는 상용 제지 장치가 개발되었습니다. 전형적으로, 동물은 일회용 50ml 원뿔관4,슬롯플렉시유리 벽, 터널 또는콘(28)에배치되며, 모두 동물의 움직임을 제한하면서 꼬리를 충분히 노출할 수 있다. 그러나 대부분의 구속자는 재료의 강성으로 인해 크기 제한이 있습니다. 또한, 현대의 고복잡성 장치는 실용적이고 정교한 디자인에도 불구하고, 동물의 큰 그룹을 포함하는 주사에 대한 가능한 것으로 보이지 않는22.

혈류 감염 및 관련 패혈증의 마우스 모델은이 기술의 사용을 필요로하는 상황의 대표적인 예입니다. 가혹한 임상 패혈증의 모든 미생물 병인학 중, 곰팡이 패혈증은 항진균 요법(29)에도불구하고 >40 %의 사망률을 가진 치명적인 상태입니다. 실제로 칸디다 알비칸에 의한 감염은 병원 취득혈류 감염(칸디데미아)30,31의네 번째 주요 원인으로 보고되었다. 복부 내 칸디다증에서 위장관내미생물은 혈류를 통해 보급되어 더 큰 사망률32,33,34로폴리균 패혈증을 유발할 수 있다. 대부분의 nosocomial 칸디데미아 케이스는 오염된 중앙 선 카테터 또는 주거 의료 기기35,36,즉 테일 정맥 주사에 의한 C. 알비칸과 접종을 통해 인간 패혈증 발달을 밀접하게 반영할 수 있으며, 혈액투원적으로 전파된 캔디디스37, 38의마우스 모델에서 주식적인 방법으로 사용되어 왔다. 본 모델에서, 일에서 발생하는 사망률은 C. albicans i.v. inoculum39,40,41을조정하여 연장또는 단축될 수 있다.

최근, 우리의 실험실은 하나의 편리한 시스템에서 조정 가능한 제지 장치와 결합 된 열 조절 된 온난화 장치를 갖춘 혁신적인 장치를 사용하여 최적으로 간소화 된 꼬리 정맥 주입을위한 혁신적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 연구원이 정확하고 적시에 꼬리 정맥 주사를 수행 할 수 있게해 주며, 동물은 최소한의 고민으로 절차를 위해 안전하게 조절되고 억제 될 수 있습니다. 여기에 입증 된 기술은 고급 온난화 및 억제 장치를 사용하여 설치류 모델을 사용하는 다양한 연구 분야에서 유용한 도구가 될 수 있습니다.

Protocol

꼬리 정맥 주사 및 온난화 /억제 장치의 사용과 관련된 모든 동물 프로토콜은 현지 기관 동물 관리위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 준비

  1. 적어도 1 주 동안 주거 환경에서 동물을 적응하고 음식과 물 광고 리비툼을 허용합니다.
    참고: 이 주입 기술의 대부분의 새로운 사용자에 대 한, 흰색 또는 밝은 색깔의 모피동물 긴장 꼬리 정맥 피부를 통해 쉽게 볼 수 있는 바람직할 수 있습니다. 쥐의 어두운 색변종 (예를 들어, C57BL/6) 또는 쥐 (예를 들어, 브라운 노르웨이)는 정맥에 대한 약한 색상 대조의 결과로 깊은 색소 꼬리를 가지고있다. 숙련도가 취득할 때까지 새로운 사용자가 적절한 교육을 받는 것이 좋습니다.
  2. 꼬리 정맥 주입을위한 에이전트
    1. 모든 테스트 에이전트와 솔루션을 무균적으로 준비합니다. 유기체 또는 세포 물질을 투여할 때, 파이로겐이 없는 조건을 유지하기 위해 모든 처리 단계에서 예방 조치를 취하십시오.
    2. 일반 식염수(염화나트륨 0.9% w/v)를 사용하거나 인산염 완충식식염수(PBS)와 같은 균형 잡힌 염액을 테일 정맥 주입용 차량으로만 사용하십시오.
      주의: 혈관 손상의 잠재적 위험으로 인해 물, 오일 또는 점성 솔루션을 사용하지 마십시오. 광범위한 pH(4.5-8.0)는 설치류의 혈액 완충 효과와 빠른 혈류율 때문에 견딜 수 있습니다. 그러나, 고산성 또는 알칼리성 솔루션 은 주사 부위에 불필요한 조직 손상을 초래할 수 있으며 피해야한다.
    3. 주입의 부피와 빈도를 최소한으로 제한합니다. 주사 전 체온에서 쥐와 쥐(≤200 μL 및 ≤500 μL)에 권장되는 부피를 사용하여동물3에대한 스트레스를 최소화한다.
    4. 주사기와 바늘의 각 준비는 용액의 기포가 없는지 확인하십시오. 거품이 존재하는 경우, 색전증에 대한 위험을 방지하기 위해 완전히 제거.
      참고: 일반적으로, 1 mL 주사기 와 27 G, 1/2-에 바늘은 대부분의 꼬리 정맥 주사에 대 한 적절 한.
    5. 일회용 또는 전용 가운과 라텍스 또는 니트릴 장갑을 최소화할 수 있는 현지 IACUC에서 요구하는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 꼬리 정맥 주입을 수행 할 때 안전 안경의 사용은 매우 권장됩니다.
  3. 온난화 및 구속 장치
    1. 기기가 결함이 없는지 확인하기 위해 사용하기 전에 모든 구성 요소를 주의 깊게 검사합니다(그림1).
    2. 온난화 장치 초기화(그림 2A)
      1. 온난화 장치를 깨끗한 평평한 벤치탑에 놓고 장치에 전원을 공급합니다. 온도 조절기 전원 표시등램프가 녹색으로 켜지는지 확인합니다. 침구 재료를 온난화 챔버 내부에 배치하여 이 지역을 건조하게 유지하고 열을 유지합니다.
    3. 구속 장치 설정(그림 2B)
      1. 데징 유닛을 온난화 장치와 함께 배치하고 동물에 적합한 원뿔 크기를 결정합니다. 필요한 경우 유연한 알루미늄 콘의 기본 폭을 수동으로 조정하여 동물에 적합한 구속을 제공합니다. 또는 콘을 다양한 신체 크기의 마우스 또는 쥐를 수용할 수 있도록 맞춤 장착 모델로 교체하십시오.

2. 꼬리 정맥 주입

  1. 장치 조정
    1. 내부 온도 설정
      1. 컨트롤 다이얼을 사용하여 온도 조절기를 원하는 온도로 설정합니다. 히터 표시등이 빨간색으로 켜지고 전구가 켜지는지 확인합니다. 전구가 켜지는 동안 내부 온도 디스플레이를 주의 깊게 모니터링합니다(가열). 온도 조절기는 목표 온도가 약 10-15분 후에 전구를 자동으로 비활성화합니다.
        참고: 주변 온도보다 높은 온도를 설정하면 히터가 활성화됩니다. 일반적으로, 표준 vivarium 조건에서 권장되는 하우징 온도는 20~26°C에 이르기까지 다양하며, 실험실 마우스의 중성(즉, 쾌적한) 온도는 30과 32°C42사이로 간주됩니다. 따라서, 온난화 챔버의 내부 온도는 약 32-36 °C에서 열중성보다 약간 높은 것이 좋습니다. 체온 위에 온도 조절기를 설정하지 마십시오.
    2. 구속 플랫폼 위치 지정
      1. 높이 조정 노브를 사용하여 원뿔 높이를 사용자의 최적의 수준으로 조정합니다.
  2. 열처리(그림 3A)
    1. 목표 온도(32-36°C)에 도달하면 하우징 케이지에서 동물을 따뜻하게 하는 챔버로 부드럽게 이송합니다.
      참고: 5-10 분 동안의 열 처리는 혈관 확장을 유도하고 꼬리 정맥의 가시성을 향상시키기에 충분합니다. 그러나, 동물은 절차의 기간 동안 열 조절 챔버에서 안전하게 개최 될 수있다 (일반적으로 20-30 고열증의 흔적없이 분). 온난화 챔버는 안전하게 4-6 마우스 또는 하나의 쥐를 포함 할 수 있습니다.
    2. 급성 열 응력의 징후 (예 : 빠른 호흡, 혼수, 점프 탈출 동작)에 대한 동물을 모니터링합니다.
      주의: 고열증의 징후를 보이는 동물은 케이지로 돌아와 재사용 전에 정상적인 활동을 재개할 때까지 모니터링해야 합니다. 최적의 범위를 초과하는 내부 온도 때문인 경우 온난화 장치가 꺼져 있는지 확인합니다.
  3. 사출 단계
    1. 꼬리의 기지에 의해 동물을 들어 올려, 온난화 챔버에서 제거합니다. 억제 장치의 원뿔 개구부에 동물을 소개합니다.
      주의: 꼬리 끝에서 마우스를 들어 올리지 마십시오. 이로 인해 심각한 부상을 초래할 수 있습니다. 취급의 대체 방법은 비만 또는 임신한 마우스(28)를위해 이용되어야 합니다.
    2. 동물이 앞다리로 원뿔의 먼 가장자리를 잡으면서 꼬리를 부드럽게 뒤로 당기고 꼬리를 열린 슬릿을 통과합니다. 원뿔의 밑면에 있는 동물의 뒷쪽 끝을 고정하고 원뿔에서 한쪽 뒷다리가 튀어나와 측면 정맥이 12시 의 위치에 표시되도록 합니다. 양쪽 뒷다리는 양쪽에 두 개의 측면 정맥이 있기 때문에 돌출될 수있습니다(그림 3B).
    3. 엄지와 집게 손가락 사이의 비 지배적 인 손으로 중간에서 2/3 길이의 꼬리를 잡고 측면 정맥에 약간의 장력을 넣어 꼬리 위치 지정 및 혈관 확장을 유지합니다.
      참고: 열처리에 의한 팽창된 정맥의 가시성향상을 통해 사용자는 최상의 결과를 위해 주사 부위를 신속하게 결정할 수있습니다(그림 4).
    4. 70%의 알코올로 촉촉한 거즈 스폰지 나 패드로 주사 부위의 피부를 닦으부습니다. 꼬리에 자극을 피하기 위해 가능한 한 부드럽고 빠르게 청소하십시오.
      참고: 이 절차는 기관 IACUC의 재량에 따라 생략할 수 있습니다.
    5. 주사기를 우세한 손으로 잡고 바늘을 꼬리에 평행하게 배치합니다. 바늘을 혈류 방향으로 삽입하고, 10-15°각도(도 5A-B)로돌이키고, 2-4mm(그림5C-D)를관통하여 정맥의 루멘으로 더 나아가게 한다. 용액을 천천히 주입하십시오.
      참고: 주사가 성공하면 플런저에 대한 저항을 느껴야 하며, 액체가 정맥을 통과하는 것을 볼 수 있습니다. 주사 부위 위에 저항또는 백색 물집이 있는 경우, 바늘을 제거하고 원래 바늘 배치 위의 부위에서 두 번째 주사를 시도한다. 유체가 초기 사이트를 통해 방출될 때 초기 주사 부위 아래에 주입을 시도하지 마십시오. 한 측면 정맥의 주입이 실패하는 경우, 반대편에 동물을 재배치하고 반대 정맥에 더 많은 시도를합니다. 시도의 최대 수는 정맥을 따라 시도 된 주입을 시작하는 곳과 놓친 시도로 발생할 수있는 붓기에 따라 달라집니다. 잘못된 주사 및 관련 부상에 대한 기관 IACUC 규정을 참조하십시오.
    6. 바늘을 제거하고 엄지 손가락으로 단단히 눌러 주입 된 용액 및 / 또는 혈액의 역류를 방지하십시오. 출혈이 멈출 때까지 깨끗한 거즈/닦아 또는 조직으로 부드러운 압축을 계속 적용합니다(그림6).
    7. 동물을 케이지로 돌려보내 최소 5분 동안 모니터링합니다. 동물이 추가 출혈없이 정상적인 활동을 재개하도록하십시오.

3. 곰팡이 혈류 감염 및 패혈증의 뮤린 모델

  1. 마우스 균주
    1. 기관적으로 추천된 지침당 6주에 달하는 여성 스위스 웹스터 의 쥐를 어기고 있습니다. 또는 변형된 이 프로토콜에 대해 근친/유전자 변형 균주(예: C57BL/6 배경)를 사용하여 수정된 이노쿨라(참고 참조)를 사용합니다.
      참고 (세부 사항에 대한 토론 참조): 어두운 털을 가진 마우스의 꼬리 정맥은 종종 깊은 색소 꼬리(그림 4)로인해 밝은 모피를 가진 것보다 덜 볼 수 있습니다. 다른 마우스 긴장 중 곰팡이 패혈증 / 치사에 대한 다양한 감수성이 있습니다. 스위스 웹스터 이외의 마우스 균주를 사용하면 호스트 면역 상태에 영향을 줄 수 있는 관련 요인(예: 유전적 배경, 나이, 성별, 신체 크기)을 고려하여 추가 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들면, C57BL/6 마우스에 있는 치명적인 도전은 전형적으로 스위스 웹스터 마우스에서 보인 사망의 수준을 달성하기 위하여 더 높은 이노쿨라 (최대 10x)를 요구합니다.
  2. 미생물
    1. 치명적인 도전 (패혈증)의 경우, 칸디다 알비칸스 변형 DAY185 (또는 선택의 변종)의 줄무늬 냉동 주식은 사부라우드 덱스트로스 agar에 2 일 동안 30 °C에서 배양한다.
    2. 단일 콜로니를 10mL 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 국물로 옮기고, 배양물을 30°C에서 18h의 성장단계로 옮기고 흔들림을 갖는다.
  3. 이노큐럼 솔루션
    1. 치명적인 도전의 날에, 국물 문화를 수집하고, 멸균 PBS에서 원심 분리 (800 × g)에의해 펠릿을 3 번 세척.
    2. 트라이판 블루 염료 배제에 의해 실행 가능한 효모 세포를 식별하고 혈류계를 사용하여 확대합니다. 실온에서 멸균 PBS에서 세포 농도를 1 x 106 셀/mL로 조정합니다.
      참고: 각 동물은 접종 용액의 100 μL을 받게 됩니다. 주입 시술 중에 잠재적인 손실을 허용하도록 접종(>500 μL)의 초과 부피를 준비합니다. 최종 접종은 마우스 당 1 x 105 세포입니다. 접종 부피는 그에 따라 세포 농도를 조정하여 최대 200 μL까지 증가될 수 있다.
      주의: 곰팡이 접종 용액은 주입 전에 실온에서 보관해야합니다. 체온에 대한 접종용액을 온난화하는 것은 효모 세포에서 최해로의 형태학적 변화를 유도할 수 있다. 반대로, 감기 솔루션의 bolus i.v 투여는 동물의 체온을 급속히 낮출 수 있으며 피해야 합니다.
  4. 정맥 예방 접종
    1. 동물을 따뜻하게 하고, 2절의 절차를 따라 혈관 확장을 유도한다.
    2. 27 G, 1/2인치 바늘을 사용하여 1mL 주사기를 사용하여 비통용액의 100 μL을 꼬리 정맥에 주입합니다.
  5. 접종 후 모니터링
    1. 패혈증으로 인한 이환율의 다음 징후: i) 모피 양태(예:, 매끄럽고, 주름진), ii) 활동 (예를 들어, 자유롭게 이동, 응답하지 않음), iii) 자세 (예를 들어, 구직, 뻣뻣함), iv) 행동 (예를 들어, 느리고, 재배치 없음), v) 가슴 움직임 (예를 들어, 정상적인 호흡, dyspnea), vi) 눈꺼풀 (예를 들어, 개방, 폐쇄)43.
  6. 패혈증 득점
    1. 각 범주에서 0에서 3까지 4점 채점 척도에서 패혈증(M-CASS)에 대한 수정된 마우스 임상 평가 점수에 따라 관찰된 이환율을 점수: 0, 보통; 1, 온화한; 2, 중간; 3, 심한43.
  7. 선택적 프로토콜: 곰팡이 패혈증 예방 접종
    1. 치명적인 도전 14 일 전에, 칸디다 더블린시스 균주 Wü284 또는 감쇠 C. 알비칸균균을 가진 접종 마우스, Δefg1/Δcph1 돌연변이체 (마우스 당 1x105 세포), 섹션에 설명 된 바와 같이 3.2-3.4 C. albicans DAY15.
    2. 3.2-3.4항에 설명된 바와 같이 예방 접종된 마우스에서 치명적인 도전을 수행하고, 3.5-3.6항에 기재된 패혈증 유발 이환율의 징후를 모니터링한다.

Representative Results

온난화 챔버 내부의 온도는 내부 센서에 의해 지속적으로 감지되고 온도 조절에 의해 자동 조절됩니다. 먼저, 온도조절기의 제어 다이얼은 설정 온도를 선택하기 위해 78, 85, 90 또는 95°F(26, 29, 32 또는 95°C)로 배치되었다. 히터가 활성화되면(그림 7,노란색 점), 전구에 의한 열 방출은 설정 온도에 따라 처음 5-15 분 동안 내부 온도를 빠르게 상승시다. 감지된 내부 온도가 설정된 온도(회색 점)를 초과하는 경우 히터가 전구를 비활성화합니다. 초기 피크 온도는 동물 이송 중 온도 손실을 상쇄하기 위해 모든 그룹의 설정 온도보다 5~7°C 상승해야 합니다. 이어서, 장치는 열 주기를 자동으로 반복하고 설정된 온도에서 온난화 챔버를 유지합니다.

현재 프로토콜을 이용한 성공적인 꼬리 정맥 주사에 의해 얻어진 실험 데이터의 예가 도 8에도시된다. 혈류 칸디다증의 마우스 모델에서 패혈증의 결과, 스위스 웹스터 마우스에서 칸디다 알비칸스 (마우스 당 1 x 105 세포)와 i.v. 도전은 패혈증과 유기체의 보급의 급속한 발병을 일으켰으며, 3-4 일 이내에 높은 사망률 (도8A)으로이어졌습니다. 대조적으로, 동물은 아비룰런트 효모 균주를 가진 사전 예방 접종/예방 접종을 통해 패혈증으로부터 보호될 수 있으며,악성 C. albicans(고체 점)를 가진 치명적인 i.v. 챌린지에 따라 >95% 생존을 달성했습니다. 이러한 결과는 4개의 독립적인실험(보충도 1)에서점진적사망률 대 백신 중재 보호로부터 재현적으로 얻어졌다. 감쇠된 C. 알비칸 돌연변이체(Δefg1/Δcph1)와 같은 다른 avirulent 효모 균주를 사용하여 유사한 보호를 달성할 수 있다(데이터가 표시되지 않음). 패혈증뿐만 아니라 모니터링 및 사망과 상관 관계가 될 수있다; 치명적인 감염을 가진 예방 접종되지 않은 동물은 패혈증 유도 이환율의 상당한 증가를 보였지만, 예방 접종 그룹은 치명적인 도전(그림 8B)에따라 최소한의 증상을 나타냈다.

Figure 1
그림 1: 설치류 온난화 및 억제 장치에 대한 설명입니다. (A) 다음과 같은 온난화 장치의 외부 보기를 보여 주며 다음과 같은 장치로 구성됩니다.

  1. 온도 조절장치 커버 – 핸들로 위쪽으로 들어 올려 온도 조절기를 노출합니다.
  2. 전기 인클로저 – 보호를 위해 영구적으로 밀봉
  3. 챔버 뚜껑 – 동물 이송 중 위쪽으로 들어 올리세요.
  4. 온난화 챔버 - 탈착식, 사용하기 전에 침구로 바닥을 덮습니다.
  5. 구속 장치 – 사용하지 않는 동안 가열 장치로 견딜 수 있습니다.
  6. 전원 스위치 – 메인 온/오프 기능을 위한 인라인 로커 스위치
  7. 전원 코드 – 전압/전류: 120V/10A

(B) 온난화 장치의 내부를 나타낸다:

  1. 백열 전구 – 100와트의 광 출력
  2. 전구 보호막 - 전구 교체용 탈착식
  3. 온도 센서 프로브 – 챔버 내부에 위치
  4. 내부 온도계 – 온도를 모니터링하기 위해 챔버 내부에 배치

(C) 온난화 장치 온도 조절기의 구성 요소를 나타낸다:

  1. 내부 온도계
  2. 온도 조절기 – 히터를 자동 조절
  3. 설정점 제어 레버 – 최소/최대: 78°F/108°F (25°C/42°C)
  4. 온도 조절기 전원 표시기 - 녹색 표시등이 정상 작동을 나타냅니다.
  5. 온도 조절기 히터 표시기 – 가열 주기 동안 빨간색 으로 켜집니다.

(D) 절제 장치의 구성 요소를 표시합니다.

  1. 콘 - 설치류 구속을 위해 설계된 유연한 알루미늄 시트
  2. 꼬리 채널 – 꼬리의 매끄러운 위치를 허용하는 모양
  3. 콘 리프트 플랫폼 - 콘 베이스의 견고한 리프트를 제공합니다.
  4. 높이 조절 노브 – 수동 높이 조정을 위해 설계
  5. 가위 잭 – 높이 45-140 mm (1.77-5.52")
  6. 지원 플레이트 – 안정성을 제공하기 위해 고무 발로 설치이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 설치류 온난화 및 억제 장치입니다. (A)사용하기 전에 장치의 두 부분이 깨끗한 벤치 탑에 나란히 배치됩니다. (B)온난화 장치가 전원을 켜면 온도 조절장치가 히터를 활성화합니다. 전구는 켜진 상태로 유지되며 온난화 챔버가 설정된 온도에 도달할 때까지 열을 방출합니다. 온난화 장치는 자동으로 열 주기를 반복하여 내부 온도를 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 온난화 및 억제 장치에 배치된 마우스(C57BL/6). (A)혈관 확장을 위한 열처리를 받는 마우스. 동물(치료당 4-6마리 마우스)은 하우징 케이지에서 장치의 온난화 챔버로 옮겨져 최소 5-10분 동안 열처리됩니다.(B)꼬리 정맥 주사를 위해 절제된 마우스. 마우스는 열개의 슬릿을 통과하는 꼬리가 있는 절제 장치의 원뿔 개구부로 온난화 챔버에서 전송됩니다. 마우스는 꼬리의 기근이 원뿔 끝에 도달할 때까지 원뿔의 먼 가장자리로 부드럽게 뒤로 당겨져 있습니다. 동물이 부드러운 측면 회전으로 원뿔의 밑쪽으로 그려지므로 한쪽 뒷다리는 위쪽으로 배치되어 열린 슬릿에서 튀어나와 측면 꼬리 정맥을 12시에 배치할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 마우스의 측면 꼬리 정맥 식별. (A)처리되지 않은 스위스 웹스터 마우스의 꼬리. 마우스는 혈관 확장을 위한 사전 열처리 없이 제지 장치에 배치됩니다. 측면 꼬리 정맥은 피부 아래 를 코스 얇은 어두운 혈관으로 식별 할 수 있습니다. (B)스위스 웹스터 마우스의 꼬리는 10 분 동안 온난화 장치로 처리. 열 처리 된 마우스는 꼬리 정맥 주입을 위해 억제됩니다. 측면 꼬리 정맥은 혈관 확장에 의해 유도된 확대된 혈관 직경으로 인해 피부를 통해 쉽게 볼 수 있습니다. (C)C57BL/6 마우스의 꼬리는 10분 동안 온난화 장치로 처리되고 꼬리 정맥 주사를 위해 제지하였다. 혈관 확장은 정맥이 정맥에 대한 약한 색상 대비로 인해 밝은 색상의 스위스 웹스터 마우스에서와 같이 쉽게 볼 수 없지만 깊은 색소 침착 피부를 통해 꼬리 정맥의 가시성을 향상시킵니다. 빨간색 화살표는 측면 꼬리 정맥의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 열 처리 마우스에서 수행 된 꼬리 정맥 주입 (스위스 웹스터). (A-B) 주사 부위의 측면 꼬리 정맥에 바늘 삽입. 바늘(27G, 1/2-in)은 베벨이 올라와 꼬리 정맥과 평행하게 위치하여 혈류를 가리키고 삽입된다. (C-D) 꼬리 정맥과 주입에 바늘 배치. 바늘의 끝은 정맥의 루멘으로 2-4 mm 더 진보되어 있습니다. 엄지 손가락은 주사기의 플런저에 위치하며 원하는 볼륨은 느리고 안정적인 압력으로 분배됩니다. 타원형 원은 사출 사이트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 사출 후 절차. (A)주사 부위의 출혈 부위. 주입된 용액의 출혈과 역류는 바늘 제거 직후에 발생합니다. 이것은 엄지 손가락으로 주사 부위에 회사 압축을 적용하여 최소화 할 수 있습니다. (B)주사 부위에서 혈전 형성. 깨끗한 거즈/닦아로 부드러운 압축을 통해 주사 상처에 혈액 응고가 용이합니다. 화살표는 주입 사이트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 사용 중 온난화 챔버의 내부 온도입니다. 온난화 장치는 지정된 설정 온도에서 온난화를 위해 활성화되었습니다. 장치의 온난화 챔버는 내부 공기 온도 및 열 주기(전구 온/옐로우 도트, 오프/그레이 점)를 위해 모니터링하였다. 주황색 영역은 설치류의 혈관 확장을 유도하기위한 최적의 온도 범위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 칸디다 알비칸스와치명적인 도전에 따라 패혈증 사망률 대 백신 중재 보호 . 마우스(8주된 스위스 웹스터 암컷)는 14일 후 야생형 C. 알비칸스 DAY 185(마우스당 1x 105세포)로 치명적인 정맥 내 도전을 받은 후 조류예방라이브 칸디다 더블린시스 Wü284(Cd)로 정맥 예방접종을 받았다. (A)사망률은 치명적인 도전 후에 10 일 이상 평가되었습니다. (B)동물은 패혈증 이환율을 모니터링하고 패혈증 (M-CASS)43에대한 수정 된 마우스 임상 평가 점수에 따라 득점하였다. 데이터는 그룹당 10마우스를 가진 4개의 독립적인 실험의 누적이고 Mantel-Cox 로그 랭크 시험을 사용하여 분석됩니다. p < 0.0001. SEM, 평균의 표준 오류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: 혈류 칸디다 알비칸스 도전에서 패혈증 사망률및 백신 매개 생존의 재현성. 각 패널은 그림 8A에표시된 누적 결과에 포함된 4개의 독립적인 실험의 데이터를 나타냅니다. 각 실험은 그룹당 10마우스를 사용하여 수행되었으며 Mantel-Cox 로그 랭크 테스트를 사용하여 분석하였다. Ca, 칸디다 알비칸스. CD, 칸디다 더블린시스. p < 0.0001. p < 0.01. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

일관되고 정확한 도징은 동물 모델의 실험적 신뢰성에 대한 주요 요구 사항입니다. 이는 주사된 제제의 전신 생체 이용률이 다른 관리 경로3보다상당히 높으며 빠르는 i.v. 투여의 경우에 특히 중요합니다. 따라서, 꼬리 정맥 주입에 오류 연구 결과에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 역사적으로, i.v.가 아닌 인트라보네탈(i.p.) 주사는 기술적 단순성과 편의성으로 인해 설치류에서 전신 액세스하는 가장 일반적인 방법이었습니다. 그러나, 관리 경로 임상 설정으로 동물에서 전임상 판독을 번역 할 때 더 중요 해진다. 따라서 성공적인 꼬리 정맥 주입을 용이하게 할 수있는 설치류 프로토콜의 지속적인 개선이 필요합니다.

본 프로토콜의 주요 발전은 설치류의 혈관 확장에 효과적인 유도를 가능하게 하는 혁신적인 열조절 온난화 장치로, 꼬리 정맥과 바늘 정렬의 가시성을 획기적으로 향상시킵니다. 열조절(예를 들어, 램프), 국소 혈관 확장제 또는 피부 자극제(예: xylenes)가 불안정할 뿐만 아니라 동물에게도 안전하지 않을 뿐만 아니라44를피해야 하는 가열 방법이 있습니다. 따뜻한 물에 꼬리를 침지하는 것과 같은 다른 종래의 방법과는 달리,이 장치의 자동 조절 능력은 여러 동물을 동시에 안전하게 조절 할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 최적으로 설계된 억제 장치를 사용하고 측면 꼬리 정맥을 가장 잘 표시하는 위치에서 동물의 빠르고 안전한 고정을 허용함으로써 더욱 강화된다.

많은 현재 억제제에서 볼 수있는 투명 관 형식은 실질적으로 잘 설계되었지만 각 동물과 더 많은 처리 시간이 필요하므로 억제 과정(45)을연장합니다. 이것은 제한된 협력을 제공하는 공격적인 특성을 가진 설치류 균주에서 더 문제가 될 수 있습니다46,47. 대조적으로, 억제 장치의 반밀된 원뿔 구조는 동물의 빠른 포지셔닝을 허용하고 구속 기간을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 혁신적이고 최적화된 온난화/절제 시스템을 사용하는 간소화된 프로토콜은 주입 절차를 가속화하여 대규모 동물 그룹을 빠르고 효과적으로 투약할 수 있도록 합니다. 우리의 실험실에서, 우리는 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 1 시간 안에 열 처리에서 사후 주입 감시에 30 마우스의 전체 주입 절차를 완료합니다.

고급 기능에도 불구하고,이 장치는 몇 가지 명백한 단점이 있습니다 : 첫 번째는 온난화 챔버에서 장치 및 일상적인 전구 교체의 비용입니다. 그러나 주사의 효율성과 속도 외에도 이 장치는 반복적인 사용을 위해 내구성이 뛰어나며 가장 일반적인 소독제와 호환되어 사용 사이에 장치를 철저히 세척할 수 있습니다. 이 와 함께 초기 투자를상쇄합니다. Second, 제한된 작업 공간이있는 상황에서,이 프로토콜에 대한 단점은 주사를 수행하는 동안, 나란히 두 단위를 배치 할 수있을만큼 큰 전용 벤치 영역에 대한 요구 사항 일 수있다. 그러나, 이 장치는 i.v. 주사와 관련된 여러 설치류 프로토콜에 광범위하게 활용될 수 있기 때문에, 이소플루란 기화기와 같은 다른 공동 생체 혈관 장비와 유사한 핵심 기기역할을 할 수 있다. 그럼에도 불구하고 두 유닛은 쉽게 휴대 할 수 있으며 사용하지 않는 동안 번들로 묶고 보관 할 수 있습니다.

이 프로토콜에 기재된 뮤린 곰팡이 패혈증의 i.v. 치명적인 도전 모델은 인간에서 C. albicans 혈류 감염을 밀접하게 모방하고 곰팡이 독성, 항진균 요법의 시험 효능을 연구하고 감염37,39,48에대한 숙주 면역 반응을 특성화하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 재현 가능한 감염을 달성하기 위해, 즉 꼬리 정맥 주사를 통한 접종은 혈류로 유기체를 정확하게 전달하는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 사실, 동물은 칸디다 i.v. 도전의 다양한 수준에 매우 다르게 반응; 너무 적은 양의 접종을 투여하면 원치 않는 자발적인 회복이 발생할 수 있지만 너무 높은 복용량을받는 동물은 조기에 굴복할 것입니다. 패혈증 /사망률의 일관된 수준을 유도하기 위해 주어진 유기체에 대한 접종 크기의 특정 창은 주로 곰팡이 균주와 마우스 균주 모두에 달려 있습니다.

1 x 105 야생형 C. 알비칸의 접종에서 스위스 웹스터 마우스를 사용하는 현재 프로토콜은 1일 이내에 패혈증 이환율의 발병을 재현적으로 유도한 후, 점진적 사망률이 5-7일까지 100% 치사율로 이어졌다. 대조적으로, 1 x 105보다 높은 이노쿨라는 일반적으로 가속된 죽음(즉, 1-2일 1 x 106,5 x 105에서3-4일) 및 1 x 105보다 낮은 사람들은 하위 치명적입니다. 문학에 있는 수많은 보고에 따라, C. albicans 대신에비-알비칸칸스 칸디다 종의 사용은 크게 감소 치사40,49. 또한, 마우스 균주의 선택, 또는 식민지의 기원은, 다른 사람에 의해보고된 마우스 균주 사이의 다양한 감수성으로 인해 감염 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다39,40,41,51,51, 52,53,54,55. 따라서 실험을 설계할 때 둘 다 고려해야 합니다.

치명적인 i.v. 도전에 따라, 곰팡이 세포는 혈류를 통해 급속하게 퍼지고 다중 기관을 침략하기 시작하며, 그 중 가장 영향을받는 신장은 신장41입니다. 영향을 받는 다른 장기는 뇌, 비장, 골수48,56입니다. 어쨌든 급성 패혈증은 초기 시점에서 사망의 궁극적 인원인입니다 37. 대표적인 결과에 나타난 바와 같이, 패혈증 심각도는도전동물(43,57)에서패혈증 상태의 징후가 나타난 것을 기반으로 패혈증(M-CASS)에 대한 마우스 임상 평가 점수에 의해 정량적으로 평가될 수 있다. 치명적인 패혈증의 몇몇 대리 마커 중, 저체온증은 임상 및 실험 패혈증43,58,59둘 다에 있는 임박한 죽음에 대한 중요한 예측자로 건의되었습니다.

이 모형에 있는 근친교개 대 근친 마우스를 직접 비교하기 위하여 공식적인 연구 결과가 실시되지 않더라도, 추정된 유전 이질성에도 불구하고, 다양한 패혈증 매개 변수에서 예외적으로 재현가능한 스위스 Webster 마우스를 사용하여 현재 프로토콜에서 얻은 데이터는 예외적으로 재현됩니다. 일반적으로, 3-5일 이내에 떨어지는 사망률의 패턴은 치명적인 도전 후 시간 내에 패혈증 이환율 및 염증성 마커의 수준에 급속한 고도에 의해 입증된 바와 같이 급성 패혈증의 확고한 모델이다50,51. 더 긴 생존 시간 (7-10 일)의 경우, 사망률은 표적 장기와 중추 신경계에서 치명적인 조직 손상으로 이어지는 미생물 부담의 결과일 가능성이 높습니다. 패혈증 또는 미생물 부담의 선택은 사용되는 접종에 의해 결정된 바와 같이 항 염증 요법 또는 항진균 요법/백신에 대한 면역 기능 또는 반응을 평가하기 위해 필요에 따라 적용될 수 있습니다.

i.v. 치명적인 도전 모델 외에도 i.p. 챌린지를 통해 마우스에서 C. albicans를 통한 복부 내 감염은 또한 세균 병원균, 황색 포도상 구균, 시너지 효과 및 Cbicans에 비해 사망률을 향상시키지만 전파된 칸디다증및 후속 패혈증으로 이어질 수 있다. i.p. 치명적인 도전 모델에서는, 실질적으로 더 높은 미생물 이노쿨라 (1.75 x 107C. albicans/8 x 107S. 마우스 당aureus) 폴리균 복막염및 혈류로 복강에서 유기체의 보급을 일으키는 원인이 되기 위하여 요구됩니다. 유사하게, 면역억제및/또는 점막 손상제로 치료된 마우스에서 C. albicans를 가진 위장 감염은 혈류로 곰팡이 세포의 전좌로 이어져 곰팡이 패혈증62,63의결과를 낳는다. 특유의 접종 경로에도 불구하고, 계속되는 곰팡이 패혈증의 메커니즘은 기관 부전37,51,61로이어지는 칸디다에 대한 통제되지 않는 전신 염증 반응을 포함하는 세 가지 질병 모델 간에 크게 유사합니다. 유사하게, 인간에서는, 단순히 칸디데미아가 아니라, 건강 관리 설정64,65에서취득한 혈종으로 전파된 칸디다증과 관련된 높은 이환율/사망률을 유발하는 호스트 반응의 이 과정이다.

현재 곰팡이 패혈증 모델을 사용하여, 우리는 치명적인 C. 알비칸 감염에 대한 보호가 C. dubliniensis (avirulent) 또는 감쇠 된 C. 알비칸 돌연변이를 가진 i.v. 사전 예방 접종 / 예방 접종에 의해 달성 될 수 있음을 여기에서 입증, 패혈증 병치의 상당한 감소와 수반되는. 보호는 훈련된 선천성 면역66,67의한 형태로 골수에서 유도되는 것처럼 보이는 선천적인 Gr-1+ 골수성 서프레서 세포에 의해 중재된다. C. 알비칸혈감염에 대한 이 새로운 형태의 선천적 면역 중재 보호에 대한 이해를 확대하기 위한 노력이 진행되고 있습니다.

결론적으로, 혁신적인 설치류 온난화/억제 장치는 효율적이고 효과적인 방식으로 대규모 다그룹 동물 연구의 주사를 수행하는 우리의 능력을 발전시키는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 이와 같이, 우리는 용어, 마우스 분, 장치에 대한 만들어졌습니다. 장치 사양은 유사한 장치의 조달 요청에 따라 해당 작성자로부터 사용할 수 있습니다. 여기에서 입증된 기술은 광범위한 연구 영역에 걸쳐 꼬리 정맥 주사를 사용하는 설치류 모델에서 유용한 도구가 될 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 LSUHSC 재단 (PLF)에 의해 지원되었다, 그리고 부분적으로 루이지애나 임상 및 번역 과학 센터에 자금을 국립 보건 원의 국립 일반 의학 연구소에서 U54 GM104940에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors

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면역학 및 감염 문제 165 설치류 꼬리 정맥 주사 정맥 주사 설치류 온난화 장치 설치류 억제 장치 동물 모델 패혈증 모델 혈관 확장
뮤린 곰팡이 패혈증 모델에서 효율적인 꼬리 정맥 주사를위한 현대 온난화 / 억제 장치
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Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M.… More

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).

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