Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מכשיר התחממות/ריסון עכשווי להזרקות יעילות של וריד זנב במודל אלח דם פטרייתי מורין

Published: November 6, 2020 doi: 10.3791/61961
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה ויעילה להזרקות ורידים בזנב מכרסם באמצעות מכשיר התחממות /הרחקה שתוכנן באופן ייחודי. על ידי ייעול ייזום תהליכי ויתור וריסון, פרוטוקול זה מאפשר זריקות מדויקות ותוך ורידי בזמן של קבוצות גדולות של בעלי חיים עם מצוקה מינימלית.

Abstract

במודלים מכרסמים, זריקות וריד זנב הן שיטות חשובות לניהול תוך ורידי של סוכנים ניסיוניים. זריקות ורידים זנב בדרך כלל כרוכות בהתחממות של החיה כדי לקדם vasodilation, אשר מסייע הן בזיהוי של כלי הדם והן מיקום המחט לתוך lumen כלי תוך ריסון מאובטח של החיה. למרות זריקות וריד זנב הם הליכים נפוצים בפרוטוקולים רבים ואינם נחשבים טכניים מאוד אם מבוצעים כראוי, זריקות מדויקות ועקביות חיוניות כדי להשיג תוצאות לשחזור ולמזער את השונות. שיטות קונבנציונליות לזירוז vasodilation לפני זריקות וריד הזנב תלויים בדרך כלל בשימוש במקור חום כגון מנורת חום, רפידות חום חשמליות / נטענות, או מים מחוממים מראש ב 37 °C (50 °F). למרות היותם נגישים בקלות במסגרת מעבדה סטנדרטית, כלים אלה סובלים ככל הנראה מקיבולת תרמו-רגולטורית ירודה/מוגבלת. באופן דומה, למרות צורות שונות של מכשירי ריסון זמינים מסחרית, יש להשתמש בהם בזהירות כדי למנוע טראומה לבעלי החיים. מגבלות אלה של השיטות הנוכחיות יוצרות משתנים מיותרים בניסויים או גורמות לתוצאות משתנות בין ניסויים ו/או מעבדות.

במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול משופר באמצעות מכשיר חדשני המשלב מכשיר התחממות עצמאי, מוסדר תרמית עם יחידת הרחקה מתכווננת למערכת אחת להזרקת ורידים בזנב יעילה. הדוגמה בה אנו משתמשים היא מודל תוך ורידי של זיהום במחזור הדם פטרייתי שגורם לאלח דם. מנגנון ההתחממות מורכב מתיבת אקריליק מחזירת חום המותקנת עם תרמוסטט אוטומטי מתכוונן כדי לשמור על הטמפרטורה הפנימית על סף שנקבע מראש. כמו כן, ניתן להתאים את הרוחב והגובה של מנגנון ההרחקה של החרוט כך שיתאימו בבטחה לגדלי מכרסמים שונים. עם התכונות המתקדמות והרב-תכליתיות של המכשיר, הטכניקה המוצגת כאן יכולה להפוך לכלי שימושי במגוון תחומי מחקר הכוללים דגמי מכרסמים המעסיקים זריקות ורידים בזנב.

Introduction

השימוש במודלים של בעלי חיים הכוללים מכרסמים היה מרכיב עיקרי במחקר הביו-רפואי. זנים מלידה וחינוך רבים, כמו גם קווים מהונדסים גנטית, זמינים ומשמשים באופן שגרתי במעבדות ברחבי העולם. הזרקת וריד זנב היא אחת השיטות החיוניות במודלים מכרסמים הדורשים ניהול תוך ורידי (i.v. ) של סוכנים ניסיוניים. בדרך כלל, i.v. זריקות יש יתרונות גדולים על פני נתיבים אחרים של הממשל כגון שיעורי ספיגה גבוהים על ידי עקיפת רקמות מקומיות ומערכת העיכול וסובלנות גבוהה לפתרונות של מגוון רחב של ריכוזים או pH לא פיזיולוגי1,2,3,4. בין נתיבי i.v. קיימא אחרים (למשל, ורידים saphenous, סינוס ורידי רטרו-מסלולית), ורידים זנב נחשבים כלי הדם הבטוח ביותר ונגיש ביותר מכרסמים2,3,5,6. לפיכך, הזרקת וריד הזנב כבר בשימוש נרחב במגוון של מודלים מכרסמים כולל מודלים למחלות זיהומיות7,8,9, השתלת חומרים ביולוגיים10,11, הערכה של טיפולים פרה-אקליניים12,13, ניתחי טוקסיקולוגיים14,15.

עקביות ודיוק של מנונים הם דרישה קריטית זריקות וריד זנב מוצלח. באופן מפתיע, הערכה כמותית ואיכותית של זריקות וריד זנב בספרות מסבכת זריקות שגויות תכופות16,17. מחקר דיווח כי 12 מתוך 30 זריקות שבוצעו על ידי מזרקים מאומנים השאירו יותר מ -10% מהמנות המוזרקות בתוך הזנב18. בנוסף, הבטיחות והנוחות של החיה המקבלת זריקות וריד זנב צריכה להיות דאגה עיקרית במהלך ההליך. איפוק לא תקין יכול להוביל לפציעות ולמגוון פתולוגיות הקשורות ללחץ (למשל, ירידה במשקל, תגובות חיסוניות לקויות) שיכולות להכניס משתנים משמעותיים באיכות המדגם19,20. שגיאות אלה עלולות לגרום לשונות מוגברת בנתונים ולשחזור לקוי, ובכך להשפיע לרעה על תוצאות המחקר.

אינדוקציה של התפשטות כלי הדם בחיה היא לעתים קרובות הכרחי בעת ביצוע זריקות וריד הזנב בשל הקוטר הקטן של הכלי, מוערך להיות 300 מיקרומטר בעכברים21. Vasodilation משפר את הנראות של ורידים זנב ומסייע בהשגת יישור מחט וריד אופטימלי בתוך לומן ורידים. מגוון שיטות דווחו על ידי מעבדות כגון טבילת הזנב במים חמים22, החלת חום על הזנב באמצעות וילון חם, מנורה, או מייבש שיער23,24, או הצבת החיה בסביבה חמה באמצעות כרית חימום, אינקובטור, או תיבה בשילוב עם אחד ממקורות חום אלה25. המכשירים יכולים להיות מתוצרת עצמית למטרות ספציפיות או זמינים מספקים מסחריים. עם זאת, רבים חסרים יכולות thermoregulatory ואם בכלל, טמפרטורת המכשיר נשמרת בצורה גרועה ולעתים קרובות כפופה לשינויים בטמפרטורת החדר. באופן דומה, השימוש במכשיר מרסן נחוץ עבור זריקות וריד הזנב כמו השימוש בהרדמה אינו מומלץ26,27. פותחו מספר סוגים של מכשירי ריסון ספציפיים למעבדה או מסחריים. בדרך כלל, החיה ממוקמת צינור חרוטי חד פעמי 50 מ"ל4, קירות פרספקס מחורצים, מנהרה, או חרוט28, כל אשר מאפשרים חשיפה בשפע של הזנב תוך הגבלת תנועות של החיה. עם זאת, לרוב המרסנים יש מגבלות גודל בשל קשיחות החומרים. יתר על כן, מכשירים מודרניים בעלי מורכבות גבוהה, למרות העיצובים המעשיים והמתוחכמים, אינם נראים אפשריים עבור זריקות המערבות קבוצות גדולות של בעלי חיים22.

מודלים עכבר של זיהום במחזור הדם ואלח דם הקשורים הם דוגמה מצוינת למצבים הדורשים שימוש בטכניקה זו. בין כל האטיולוגיה המיקרוביאלית של אלח דם קליני חמור, אלח דם פטרייתי הוא לעתים קרובות מצב קטלני עם שיעורי תמותה של >40% למרות טיפול אנטי פטרייתי29. למעשה, זיהום על ידי קנדידה albicans דווח כגורם המוביל הרביעי של זיהום במחזור הדם שנרכש בבית החולים (קנדידימיה)30,31. ב קנדידה תוך-בטן, מיקרואורגניזמים במערכת העיכול יכולים להפיץ דרך זרם הדם ולגרום לאלח דם פולימיקרוביאלי עם תמותה גדולה עוד יותר32,33,34. כמו רוב מקרי קנדידמיה nosocomial לצאת צנתרים קו מרכזי מזוהם או מכשור רפואישכינה 35,36, כלומר חיסון עם C. albicans על ידי הזרקת וריד הזנב יכול לשקף מקרוב את התפתחות אלח דם אנושי היה שיטה בסיסית במודל עכבר של קנדידה המופצת המטוגנית37,38. במודל זה, ניתן להאריך או לקצר את התמותה המתרחשת בימים על ידי התאמת C. albicans i.v. inoculum39,40,41.

לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול חדשני להזרקת וריד זנב יעילה בצורה אופטימלית באמצעות מכשיר חדשני המצויד ביחידת התחממות תרמו-רגולציה, בשילוב עם יחידת הרחקה מתכווננת, במערכת נוחה אחת. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבצע זריקות וריד זנב בצורה מדויקת ומתוזמנות, בעוד בעלי חיים יכולים להיות מותנים ומרוסנים בבטחה להליך עם מצוקה מינימלית. הטכניקות המודגמות כאן, עם השימוש במכשיר ההתחממות והריסון המתקדם, יכולות לשמש ככלי שימושי בתחומי מחקר שונים המשתמשים במודלים של מכרסמים.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים הכוללים זריקות ורידים בזנב ושימוש במכשיר ההתחממות/ההרחקה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנה

  1. התאקלמו בסביבת הדיור לפחות שבוע אחד, ואפשרו מזון ומים עד ליביטום.
    הערה: עבור רוב המשתמשים החדשים של טכניקת הזרקה זו, זנים בעלי חיים עם פרווה לבנה או בצבע בהיר עשוי להיות עדיף כמו ורידים הזנב גלויים בקלות דרך העור. זנים בצבע כהה של עכברים (למשל, C57BL/6) או חולדות (למשל, נורווגיה החומה) יש זנבות פיגמנטיים עמוקים, וכתוצאה מכך ניגוד צבעים חלש נגד הווריד. מומלץ מאוד כי משתמשים חדשים מקבלים הכשרה נאותה עד מיומנות מושגת.
  2. סוכנים להזרקת וריד זנב
    1. הכן את כל סוכני הבדיקה והפתרונות באופן טפיטי. בעת מתן אורגניזמים או חומרים תאיים, לנקוט באמצעי זהירות במהלך כל שלבי העיבוד כדי לשמור על תנאים ללא פירוגן.
    2. השתמש רק מלוחים רגילים (0.9% w /v נתרן כלורי) או פתרונות מלח מאוזנים כגון תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ככלי להזרקת וריד זנב.
      אזהרה: לעולם אל תשתמש בפתרונות מים, שמן או צמיגים בשל הסיכון הפוטנציאלי לנזק לכלי הדם. מגוון רחב של pH (4.5-8.0) נסבל בגלל השפעת האגירה של הדם וקצב זרימת הדם המהיר במכרסמים. עם זאת, פתרונות חומציים מאוד או אלקליין יכול לגרום נזק רקמות מיותר באתר ההזרקה ויש להימנע.
    3. להגביל את הנפח ואת התדירות של הזרקה למינימום. השתמש בנפחים המומלצים לעכברים וחולדות (≤200 μL ו- ≤500 μL, בהתאמה) בטמפרטורת הגוף לפני ההזרקה כדי למזער את הלחץ על החיה3.
    4. ודא כי כל הכנה של המזרק והמחט הוא ללא בועות אוויר בתמיסה; אם בועות קיימות, לטהר אותם לחלוטין כדי למנוע את הסיכון לתסחיף.
      הערה: בדרך כלל, מזרקים 1 mL עם 27 G, 1/2-in מחטים מתאימים עבור רוב זריקות וריד הזנב.
    5. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) הנדרש על ידי IACUC המקומי עם מינימום של שמלות חד פעמיות או ייעודיות וכפפות לטקס או ניטריל. מומלץ מאוד להשתמש במשקפי בטיחות בעת ביצוע הזרקת וריד הזנב.
  3. מכשיר החימום והריסון
    1. בדקו היטב את כל הרכיבים לפני השימוש כדי לוודא שהמכשיר נקי מפגמים(איור 1).
    2. אתחול התקן התחממות (איור 2A)
      1. הניחו את יחידת החימום על ספסל שטוח ונקי והפעילו את המכשיר. ודא כי מנורת מחוון כוח התרמוסטט מוארת בירוק. מניחים חומרי מצעים בתוך תא ההתחממות כדי לשמור על האזור יבש ולשמור על חום.
    3. הגדרת התקן ריסון (איור 2B)
      1. מניחים את יחידת האיפוק לצד יחידת ההתחממות, וקובעים את גודל החרוט המתאים לחיה. במידת הצורך, להתאים באופן ידני את רוחב הבסיס של חרוט אלומיניום גמיש כדי לספק ריסון הולם עבור החיה. לחלופין, החליפו את החרוט בדגמים מותאמים אישית כדי להכיל עכברים או חולדות בגדלי גוף שונים.

2. הזרקת וריד זנב

  1. התאמות מנגנון
    1. הגדרת הטמפרטורה הפנימית
      1. באמצעות חיוג הבקרה, הגדר את התרמוסטט בטמפרטורה הרצויה. ודא כי מחוון התנור מואר באדום, וכי הנורה מאירה. נטר את תצוגת הטמפרטורה הפנימית בזהירות בזמן הנורה מוארת (חימום). התרמוסטט מנטרל את הנורה באופן אוטומטי לאחר טמפרטורת היעד הגיע, בערך ב 10-15 דקות.
        הערה: הגדרת טמפרטורה גבוהה יותר מטמפרטורת הסביבה מפעילה את התנור. באופן כללי, טמפרטורת הדיור המומלצת בתנאי ויבריום סטנדרטיים משתנה, החל מ 20 עד 26 °C (70 °F), בעוד הטמפרטורה הניטרלית (כלומר, נוח) עבור עכברי מעבדה נחשבת בין 30 ל 32 °C(42 °F) 42°F . לכן, מומלץ כי הטמפרטורה הפנימית של תא ההתחממות להיות גבוה מעט יותר התרמונוטרליות, כ 32-36 °C (50 °F). לעולם אל תציב את התרמוסטט מעל טמפרטורת הגוף.
    2. מיקום פלטפורמת האיפוק
      1. באמצעות ידית כוונון הגובה, התאם את גובה החרוט לרמה האופטימלית עבור המשתמש.
  2. טיפול בחום (איור 3A)
    1. לאחר טמפרטורת היעד הגיע (32-36 °C (36 °F), בעדינות להעביר את החיות מכלוב הדיור לתוך תא ההתחממות.
      הערה: טיפול בחום במשך 5-10 דקות מספיק כדי לגרום vasodilation ולשפר את הנראות של ורידים הזנב. עם זאת, בעלי חיים יכולים להיות מוחזקים בבטחה בתא thermoregulated למשך ההליך (בדרך כלל 20-30 דקות ללא סימן של היפרתרמיה). תא ההתחממות יכול להכיל בבטחה 4-6 עכברים או חולדה אחת.
    2. לעקוב אחר החיה עבור כל סימנים של מתח חום חריף (למשל, נשימה מהירה, עייפות, קפיצה לברוח התנהגות).
      זהירות: בעלי חיים המציגים סימנים של היפרתרמיה יש להחזיר לכלוב שלהם ופיקוח עד שהם חוזרים לפעילות רגילה לפני שימוש חוזר. אם הסיבה לכך היא הטמפרטורה הפנימית העולה על הטווח האופטימלי, ודא שהתקן ההתחממות כבוי.
  3. שלבי הזרקה
    1. הרם את החיה על ידי בסיס הזנב, ולהסיר אותו מתא ההתחממות. הציגו את החיה על פתח החרוט של יחידת ההרחקה.
      זהירות: לעולם אל תרים עכברים מקצה הזנב; זה יכול לגרום לפציעות חמורות. שיטות טיפול חלופיות יש להשתמש עבור עכברים שמנים או בהריון28.
    2. כאשר החיה נאחזת בקצה הרחוק של החרוט עם רגליו המקדים, משכו בעדינות את הזנב לאחור והעבירו את הזנב דרך החריץ הפתוח. אבטחו את הקצה האחורי של החיה בבסיס החרוט עם רגל אחורית אחת בולטת החוצה מהחרוט כך שהווריד לרוחב מוצג במיקום של השעה 12. ניתן לבלט בכל רגל אחורית שכן ישנם שני ורידים לרוחב, אחד בכל צד(איור 3B).
    3. תפוס את הזנב באורך של אמצע עד שני שלישים עם היד הלא דומיננטית בין האגודל לאפרף, לשים מתח קל על הווריד לרוחב כדי לשמור על מיקום הזנב ו vasodilation.
      הערה: ראות משופרת של הוורידים המוגברים על ידי טיפול בחום מאפשרת למשתמש לקבוע במהירות אתר הזרקה לקבלת התוצאות הטובות ביותר (איור 4).
    4. לנגב את העור של אתר ההזרקה עם ספוג גזה או כרית לח עם 70% אלכוהול. יש לנקות בעדינות ובמהירות האפשרית כדי למנוע גירוי בזנב.
      הערה: ניתן להשמיט הליך זה על פי שיקול דעתו של IACUC המוסדי.
    5. החזק את המזרק עם היד הדומיננטית, ומקם את המחט במקביל לזנב. הכנס את המחט לכיוון זרימת הדם, שיפוע בזווית של 10-15° (איור 5A–B),והתקדם עוד יותר לתוך הלומן של הווריד על ידי חדירה 2-4 מ"מ (איור 5C–D). לאט לאט להזריק את הפתרון.
      הערה: אם הזריקה מוצלחת, אין התנגדות על הבוכנה צריך להיות מורגש, ואת הנוזל ניתן לראות נע דרך הווריד. במקרה של התנגדות או שלפוחיות לבנות מעל אתר ההזרקה, להסיר את המחט ולנסות זריקה שנייה באתר מעל מיקום המחט המקורי. אל תנסה להזריק מתחת לאתר ההזרקה הראשוני כמו הנוזל ישוחרר דרך האתר הראשוני. אם הזרקה של וריד צדדי אחד אינה מצליחה, מקם מחדש את החיה לצד הנגדי ובצע ניסיונות נוספים על הווריד הנגדי. המספר המרבי של ניסיונות יהיה תלוי איפה אחד מתחיל את ניסיון הזריקה לאורך הווריד ואת הנפיחות שעלולה להתרחש עם ניסיונות החמצה. יש להיוועץ בתקנות IACUC המוסדיות בנוגע לזריקות שגויות ולפציעות נלוות.
    6. הסר את המחט, ולחץ בחוזקה עם האגודל כדי למנוע את זרימת הגב של הפתרון המוזרק ו /או דם. המשיכו למרוח דחיסה עדינה עם גזה/ניגוב נקי או רקמה עד שהדימום ייפסק (איור 6).
    7. החזירו את החיה לכלוב שלה, ופקחו לפחות 5 דקות. ודא כי החיה חוזרת לפעילות רגילה ללא דימום נוסף.

3. מודל מורין של זיהום במחזור הדם פטרייתי ואלח דם

  1. זני עכבר
    1. נקבה שווייצרית וובסטר מסתגלת גברה על עכברים בגיל 6 שבועות לפי הנחיות מומלצות מוסדיות. לחלופין, השתמש בזנים מלידה/מהונדסים גנטית (לדוגמה, רקע C57BL/6) עבור פרוטוקול זה עם אינוקולה שונה (ראה הערה).
      הערה (ראה דיון לפרטים): ורידים זנב של עכברים עם פרווה כהה הם לעתים קרובות פחות גלויים מאלה עם פרווה בהירה בשל הזנב פיגמנט עמוק (איור 4). קיימת רגישות משתנה לאלח דם פטרייתי/קטלני בקרב זני עכבר שונים. שימוש בזני עכבר שאינם וובסטר שוויצרי עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול על ידי התחשבות בגורמים רלוונטיים (למשל, רקע גנטי, גיל, מין, גודל גוף) שיכולים להשפיע על מצב מערכת החיסון המארחת. לדוגמה, אתגר קטלני בעכברים C57BL/6 דורש בדרך כלל אינוקולה גבוהה יותר (עד פי 10) כדי להשיג את רמת התמותה הנראית בעכברים שוויצריים.
  2. מיקרואורגניזמים
    1. לאתגר קטלני (אלח דם), פסים קפואים מלאי של קנדידה albicans זן יום185 (או זנים של בחירה) על Sabouraud דקסטרוז אגר ודגרה ב 30 °C (50 °F) במשך 2 ימים.
    2. העבר מושבה אחת לתוך 10 מ"ל שמרים תמצית-פפטונה-דקסטרוז מרק, ותרבות לשלב נייח של צמיחה עבור 18 שעות ב 30 °C (50 °F) עם רועד.
  3. פתרונות אינקולום
    1. ביום של אתגר קטלני, לאסוף את תרבות המרק, ולשטוף את הכדור 3 פעמים על ידי צנטריפוגה (800 × גרם)ב PBS סטרילי.
    2. זהה תאי שמרים קיימא על ידי אי הכללת צבע כחול טריפן, ולספור באמצעות המוציטומטר. התאימו את ריכוז התאים ל-1 x 106 תאים/מ"ל ב-PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
      הערה: כל חיה תקבל 100 μL של פתרון inoculum. הכן נפח עודף של inoculum (>500 μL) כדי לאפשר אובדן פוטנציאלי במהלך הליך ההזרקה. ההסתעפום הסופי הוא 1 x 105 תאים לעכבר. נפח inoculum ניתן להגדיל עד 200 μL על ידי התאמת ריכוז התא בהתאם.
      אזהרה: הפתרון אינוקולום פטרייתי חייב להישמר בטמפרטורת החדר לפני ההזרקה. התחממות פתרון inoculum לטמפרטורת הגוף עלולה לגרום לשינוי מורפולוגי מתאי שמרים להייפה. לעומת זאת, ניהול בולוס i.v של פתרונות קרים יכול להוריד במהירות את טמפרטורת הגוף של החיה ויש להימנע.
  4. חיסון תוך ורידי
    1. לחמם את בעלי החיים, ולעורר vasodilation על ידי ביצוע ההליכים בסעיף 2.
    2. הזריק 100 μL של פתרון inoculum לתוך הווריד הזנב באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G, 1/2 ב.
  5. ניטור לאחר חיסון
    1. עקוב אחר בעלי החיים אחר הסימנים הבאים של תחלואה הנגרמת על ידי אלח דם: i) היבט פרווה (למשל, חלק, וולאנים), ii) פעילות (למשל, נע בחופשיות, לא מגיב), iii) יציבה (למשל, כפוף, נוקשה), iv) התנהגות (למשל, איטי, ללא רילוקיישן), v) תנועות חזה (למשל, נשימה נורמלית, קוצר נשימה), vi) עפעפיים (למשל, פתוח, סגור)43.
  6. ניקוד אלח דם
    1. ציון התחלואה הנצפית על פי ציון הערכה קלינית עכבר שונה עבור אלח דם (M-CASS) בסולם דירוג של ארבע נקודות מ 0 ל 3 בכל קטגוריה: 0, נורמלי; 1, מתון; 2, מתון; 3, חמור43.
  7. פרוטוקול אופציונלי: חיסון נגד אלח דם פטרייתי
    1. 14 ימים לפני אתגר קטלני, לחסן עכברים עם זן קנדידה dubliniensis Wü284 או זני C. albicans מוחלשים, כגון Δefg1/ Δcph1 מוטציה (1x105 תאים לעכבר), כמתואר בסעיפים 3.2-3.4 במקום C. albicans DAY185.
    2. ערוך אתגר קטלני בעכברים המחוסנים, כמתואר בסעיפים 3.2-3.4, ועקוב אחר סימני התחלואה הנגרמת מאלח דם המתוארים בסעיפים 3.5-3.6.

Representative Results

הטמפרטורה בתוך תא ההתחממות מזוהה ברציפות על ידי החיישן הפנימי ומווסתת אוטומטית על ידי התרמוסטט. ראשית, לוח הבקרה של התרמוסטט הוצב ב- 78, 85, 90 או 95 °F (26, 29, 32 או 95 °C (75 °F) כדי לבחור טמפרטורות מוגדרות. לאחר הפעלת התנור(איור 7,נקודות צהובות), פליטת חום על ידי הנורה העלתה במהירות את הטמפרטורה הפנימית במהלך 5-15 הדקות הראשונות, בהתאם לטמפרטורה שנקבעה. התנור הפעיל את הנורה אם הטמפרטורה הפנימית שזוהתה חרגה מהטמפרטורה שנקבעה (נקודות אפורות). טמפרטורות השיא הראשוניות צריכות לעלות ל 5-7 מעלות צלזיוס מעל הטמפרטורות שנקבעו בכל הקבוצות כדי לקזז את אובדן הטמפרטורה במהלך העברת בעלי חיים. לאחר מכן, המכשיר ממשיך לחזור על מחזור החום באופן אוטומטי ושומר על תא ההתחממות בטמפרטורה שנקבעה.

דוגמה לנתונים ניסיוניים שהתקבלו על ידי זריקות מוצלחות של וריד זנב באמצעות הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 8. במודל עכבר של קנדידה במחזור הדם וכתוצאה מכך אלח דם, אתגר i.v. עם קנדידה albicans (1 x 105 תאים לעכבר) בעכברים וובסטר שוויצרי גרם פתיחה מהירה של אלח דם והפצה של האורגניזמים, המוביל לתמותה גבוהה בתוך 3-4 ימים (נקודות פתוחות) (איור 8A). לעומת זאת, בעלי חיים יכולים להיות מוגנים מפני אלח דם על ידי i.v. לפני חיסון / חיסון עם זן שמרים avirulent, קנדידה dubliniensis, השגת >95% הישרדות בעקבות אתגר העירוי הקטלני עם אלביקנס C. אלביקנס ארסי (נקודות מוצקות). תוצאות אלה בתמותה מתקדמת לעומת הגנה בתיווך חיסון התקבלו באופן פורה בארבעה ניסויים עצמאיים(איור 1 משלים). הגנה דומה יכולה להיות מושגת באמצעות זני שמרים avirulent אחרים כגון מוטציות C. albicans החלשה (Δefg1/ Δcph1) (נתונים לא הראו). אלח דם יכול להיות במעקב גם בקורלציה לתמותה; בעלי החיים הלא מחוסנים עם זיהום קטלני חלה עלייה משמעותית בתחלואה הנגרמת מאלח דם, בעוד הקבוצה המחוסנת הפגינה תסמינים מינימליים בעקבות האתגר הקטלני (איור 8B).

Figure 1
איור 1: תיאור מכשיר החימום והריסון של המכרסמים. (A) מציג את הנוף החיצוני של מכשיר ההתחממות, המורכב מ:

  1. כיסוי תרמוסטט – הרם כלפי מעלה על ידי הידית כדי לחשוף את התרמוסטט
  2. מארז חשמלי – אטום לצמיתות להגנה
  3. מכסה תא – הרם כלפי מעלה במהלך העברת בעלי חיים אל /מ
  4. תא חימום – נשלף, לכסות את הרצפה עם מצעים לפני השימוש
  5. מנגנון איפוק – ניתן לאחסן עם מכשיר החימום בזמן שאינו בשימוש
  6. מתג הפעלה – מתג נדנדה מוטבע לפונקציות הפעלה/כיבוי ראשיות
  7. כבל חשמל – מתח/זרם: 120V/10A

(B) מציג את פנים מכשיר ההתחממות:

  1. נורת ליבון – תפוקת אור ב 100 וואט
  2. מגן נורות – נשלף להחלפת נורה
  3. גשושית חיישן טמפרטורה – הממוקמת בתוך התא
  4. מדחום טמפרטורה פנימי – מניחים בתוך התא לטמפרטורת ניטור

(C) מציג רכיבים של התרמוסטט של התקן החימום:

  1. מדחום טמפרטורה פנימי
  2. תרמוסטט – מווסת אוטומטית את התנור
  3. ידית בקרת נקודת קבע – מינימום/מקסימום: 78 °F / 108 ° F (25 °C /42 °C)
  4. מחוון הספק תרמוסטט – אור ירוק מציין פעולה רגילה
  5. מחוון תנור תרמוסטט – מואר באדום במהלך מחזור החימום

(D) מציג רכיבים של התקן ההרחקה:

  1. חרוט – יריעת אלומיניום גמישה המיועדת לריסון מכרסמים
  2. ערוץ זנב – מעוצב כדי לאפשר מיקום חלק של הזנב
  3. פלטפורמת הרמת חרוט – מספקת מעלית יציבה של בסיס החרוט
  4. ידית כוונון גובה – מיועדת להתאמת גובה ידנית
  5. שקע מספריים – טווח גובה בין 45-140 מ"מ (1.77-5.52 אינץ')
  6. צלחת תמיכה – מותקנת עם רגלי גומי כדי לספק יציבות אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: מכשיר החימום והריסון של המכרסמים. (א)לפני השימוש, שני חלקי ההתקן ממוקמים זה לצד זה על ספסל נקי. (B)לאחר הפעלת מכשיר החימום, התרמוסטט מפעיל את התנור. הנורה נשארת דולקת ופלטת חום עד שתא ההתחממות הגיע לטמפרטורה שנקבעה. מכשיר ההתחממות חוזר באופן אוטומטי על מחזור החום כדי לשמור על הטמפרטורה הפנימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עכברים (C57BL/6) ממוקמים במכשיר החימום והריסון. (א)עכברים המקבלים טיפול בחום עבור כלי ויתד. בעלי החיים (4-6 עכברים לטיפול) מועברים מכלוב הדיור שלהם לתא ההתחממות של המכשיר ומטופלים בחום למשך 5-10 דקות לפחות. העכבר מועבר מתא ההתחממות אל פתח החרוט של מכשיר ההרחקה כשזנבו עובר דרך החריץ הפתוח. העכבר נמשך בעדינות אחורה לקצה הרחוק של החרוט עד בסיס הזנב מגיע לקצה החרוט. כאשר החיה נמשכת לעבר בסיס החרוט עם סיבוב רוחבי עדין, רגל אחורית אחת ממוקמת כלפי מעלה כך שהיא בולטת מתוך החריץ הפתוח ומאפשרת למקם את וריד הזנב לרוחב בשעה 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי ורידי הזנב לרוחב בעכברים. (א)זנבו של עכבר וובסטר שוויצרי שלא טופל. העכבר ממוקם במכשיר ההרחקה ללא טיפול חום מוקדם להווית. וריד הזנב לרוחב יכול להיות מזוהה ככלי כהה דק כי קורסים מתחת לעור. (B)זנבו של עכבר וובסטר שוויצרי שטופלו במכשיר ההתחממות במשך 10 דקות. העכבר שטופל בחום מרוסן להזרקת וריד הזנב. וריד הזנב לרוחב נראה בקלות דרך העור בשל קוטר כלי מוגדל המושרה על ידי vasodilation. (C)הזנב של עכבר C57BL/6 שטופלו עם מכשיר ההתחממות במשך 10 דקות ומרוסן להזרקת וריד הזנב. Vasodilation משפר את הנראות של וריד הזנב דרך העור פיגמנט עמוק למרות הווריד אינו גלוי כמו בעכברים השוויצריים בצבע בהיר בשל ניגוד צבעים חלש נגד הווריד. חצים אדומים מציינים את מיקומו של וריד הזנב לרוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הזרקת וריד זנב המבוצעת בעכברים שטופלו בחום (וובסטר שוויצרי). (A-B) הכנסת מחט לווריד הזנב לרוחב באתר ההזרקה. המחט (27 G, 1/2-in) ממוקמת במקביל לווריד הזנב עם שיפוע למעלה ומצביע לכיוון זרימת הדם מוכנס. (C-D) מיקום מחט בווריד הזנב והזרקה. קצה המחט מתקדם עוד יותר 2-4 מ"מ לתוך לומן של הווריד. האגודל ממוקם על הבוכנה של המזרק, והנפח הרצוי מחולק בלחץ איטי ויציב. עיגולים אליפטיים מצביעים על אתרי הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הליך שלאחר ההזרקה. (A)אזור דימום באתר ההזרקה. דימום וזרימה אחורית של הפתרון המוזרק מתרחשים מיד לאחר הסרת מחט. זה יכול להיות ממוזער על ידי החלת דחיסה מוצקה באתר ההזרקה עם האגודל. (B)היווצרות קריש דם באתר ההזרקה. דחיסה עדינה עם גזה/ניגוב נקי מקלה על קרישת הדם על פצע ההזרקה. חצים מציינים אתרי הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: הטמפרטורה הפנימית של תא ההתחממות במהלך השימוש. מכשיר החימום הופעל לחימום בטמפרטורות שנקבעו. תא ההתחממות של המכשיר היה במעקב אחר טמפרטורת האוויר הפנימית ומחזורי החום (נורת על / נקודות צהובות, נקודות כבויות / אפורות) נרשמו במשך 45 דקות. האזור הכתום מציין את טווח הטמפרטורה האופטימלי עבור אינדוקציה של vasodilation מכרסמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמותת אלח דם לעומת הגנה בתיווך חיסון בעקבות אתגר קטלני עם קנדידה אלביקנס. עכברים (נקבות וובסטר שוויצריות בנות 8 שבועות) חוסנו תוך ורידי עם קנדידה דבלין בשידור חי של אווירוטנטינסיס Wü284(Cd),ואחריו אתגר תוך ורידי קטלני עם סוג בר C. albicans יום 185 (1 x 105 תאים לעכבר) 14 ימים לאחר מכן. (א)התמותה נבחנה במשך 10 ימים בעקבות האתגר הקטלני. (B)בעלי חיים היו במעקב אחר תחלואה אלח דם והבקיעו על פי ציון הערכה קלינית עכבר שונה עבור אלח דם (M-CASS)43. הנתונים מצטברים של 4 ניסויים עצמאיים עם 10 עכברים לכל קבוצה ונותחו באמצעות מבחן יומן הרישום של Mantel-Cox. p < 0.0001. SEM, שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: רבייה של תמותת אלח דם והישרדות בתיווך חיסון מאתגר קנדידה אלביקנס במחזור הדם. כל פאנל מייצג נתונים מארבעה ניסויים עצמאיים הכלולים בתוצאה מצטברת המוצגת באיור 8A. כל ניסוי נערך באמצעות 10 עכברים לכל קבוצה ונותח באמצעות מבחן יומן הרישום של מנטל-קוקס. קה, קנדידה אלביקנס. דיסק, קנדידה דבלין. p < 0.0001. עמ' < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Discussion

מנונים עקביים ומדויקים הם דרישות מפתח לאמינות ניסיונית במודלים של בעלי חיים. זה חשוב במיוחד במקרים של ניהול i.v. שבו הזמינות הביולוגית המערכתית של סוכנים מוזרקים היא הרבה יותר גבוהה / מהירה יותר מאשר עם נתיבי ניהול אחרים3. לכן, שגיאות הזרקת וריד הזנב יכול להיות השפעה מזיקה על תוצאות המחקר. מבחינה היסטורית, הזרקה תוך-פריתונאלית (i.p.), ולא עירוי, הייתה השיטה הנפוצה ביותר לגישה מערכתית במכרסמים בשל פשטות טכנית ונוחות. עם זאת, נתיבי ניהול הופכים קריטיים יותר בעת תרגום קריאות פרה-קליניות מבעלי חיים להגדרות קליניות. לפיכך, יש צורך בשיפור מתמשך בפרוטוקולי מכרסמים שיכול להקל על הזרקת וריד זנב מוצלחת.

ההתקדמות העיקרית בפרוטוקול הנוכחי היא מכשיר ההתחממות התרמו-רגולצי החדשני המאפשר אינדוקציה יעילה של כלי דם במכרסמים, מה שמשפר באופן דרמטי את הנראות של ורידים וזנב ויישור מחט. שיטות חימום כי הם thermoregulated גרוע (למשל, מנורות), vasodilators אקטואלי או גירויים בעור (למשל, קסילן) הם לא רק לא אמין, אבל הם גם לא בטוחים עבור החיה ויש להימנע44. בניגוד לשיטות קונבנציונליות אחרות, כגון טבילת הזנב במים חמים, יכולת autoregulation של מכשיר זה יכול להתנות בבטחה בעלי חיים מרובים בו זמנית. בנוסף, פרוטוקול זה מתחזק עוד יותר על ידי שימוש במכשיר ההרחקה שתוכנן בצורה אופטימלית ומאפשר השתקת חיה מהירה ומאובטחת במצב המציג בצורה הטובה ביותר את וריד הזנב לרוחב.

פורמטי הצינורות השקופים הנראים במרסנים עכשוויים רבים, אם כי מעוצבים היטב, דורשים זמן טיפול רב יותר עם כל בעל חיים, ובכך מאריכים את תהליך ההרחקה45. זה יכול להיות בעייתי יותר בזני מכרסמים עם תכונות אגרסיביות המציעות שיתוף פעולה מוגבל46,47. לעומת זאת, מבנה החרוט הסגור למחצה של מכשיר ההרחקה מאפשר מיקום מהיר של החיה ומסייע במזעור משך האיפוק. יחד, הפרוטוקול היעיל באמצעות מערכת ההתחממות/ריסון החדשנית והמותאמות ביותר מאיץ את הליך ההזרקה, ומאפשר מינה מהירה ויעילה של קבוצות גדולות של בעלי חיים. במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל להשלים הליך הזרקה שלם של 30 עכברים מטיפול בחום לניטור לאחר הזרקה בתוך 1 שעה באמצעות פרוטוקול זה.

למרות התכונות המתקדמות, למכשיר זה יש כמה חסרונות לכאורה: הראשון הוא עלות המכשיר והחלפת הנורה השגרתית בתא החימום. עם זאת, בנוסף ליעילות ומהירות הזריקות, המכשיר עמיד לשימוש חוזר ותואם לרוב חומרי החיטוי הנפוצים, ומאפשר ניקוי יסודי של המכשיר בין השימושים. יחד, זה מקזז את ההשקעה הראשונית. Second, במצבים עם סביבת עבודה מוגבלת, חיסרון לפרוטוקול זה עשוי להיות הדרישה לאזור ספסל ייעודי גדול מספיק כדי למקם את שתי היחידות, זו לצד זו, בעת ביצוע ההזרקה. עם זאת, מכיוון שניתן להשתמש במכשיר באופן נרחב על פני מספר פרוטוקולי מכרסמים הכוללים זריקות i.v. , ייתכן כי המכשיר יכול לשמש מכשיר ליבה דומה ציוד ויבריום משותף אחר כגון מאדי isoflurane. בכל מקרה, שתי היחידות ניידות בקלות וניתן לארוז ולאחסןן בזמן שאינן בשימוש.

מודל האתגר הקטלני של אלח דם פטרייתי מורין המתואר בפרוטוקול זה מחקה מקרוב C. albicans זיהומים במחזור הדם בבני אדם, שימש בהרחבה כדי ללמוד וירוניות פטרייתית, לבדוק יעילות של טיפולים אנטי פטרייתיים, ולאפיין תגובות חיסוניות מארח לזיהום37,39,48. כדי להשיג זיהום לשחזור, כלומר חיסון באמצעות הזרקת וריד הזנב הוא הצעד החיוני ביותר של הפרוטוקול כדי להבטיח משלוח מדויק של האורגניזמים למחזור הדם. למעשה, בעלי חיים מגיבים בצורה שונה מאוד לרמות שונות של קנדידה i.v. אתגרים; ניהול של כמויות נמוכות מדי של inoculum יגרום התאוששות ספונטנית לא רצויה, בעוד בעלי חיים המקבלים מינונים גבוהים מדי ייכנעו בטרם עת. החלון הספציפי של גדלי inoculum עבור אורגניזם נתון כדי לגרום רמה עקבית של אלח דם / תמותה תלוי במידה רבה הן זנים פטרייתיים וזני עכבר.

הפרוטוקול הנוכחי באמצעות עכברי וובסטר שוויצריים ב inoculum של 1 x 105 סוג בר C. albicans הביא להתרבות את תחילת תחלואה אלח דם בתוך יום אחד, ואחריו תמותה מתקדמת וכתוצאה מכך 100% קטלניות על ידי 5-7 ימים. לעומת זאת, האינוקולה גבוהה מ-1 x 105 מובילה בדרך כלל למוות מואץ (כלומר, 1-2 ימים ב-1 x 106, 3-4 ימים ב-5 x 105), ואלה הנמוכים מ-1 x 105 הם תת-קטלניים. בהתאם לדיווחים רבים בספרות, השימוש במינים קנדידה שאינםאלביקניים במקום C. albicans גורם לקטלניות מופחתת באופן משמעותי40,49. בנוסף, הבחירה של זני עכבר, או אפילו את המקור של מושבות, יכול להיות השפעה ניכרת על תוצאות הזיהום בשל רגישויות שונות בין זני עכבר, כפי שדווח על ידי אחרים39,40,41,50,51,52,53,54,55. לפיכך, שניהם צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסויים.

בעקבות אתגר עירוי קטלני, תאים פטרייתיים מתפשטים במהירות דרך מחזור הדם ומתחילים לפלוש לאיברים מרובים, ביניהם המושפעים ביותר הם הכליות41. איברים אחרים מושפעים הם המוח, הטחול, ומח העצם48,56. ללא קשר, אלח דם חריף הוא הגורם האולטימטיבי למוות בנקודות הזמן המוקדמות37. כפי שמוצג בתוצאות הייצוגיות, חומרת אלח דם ניתן להעריך כמותית על ידי ציון הערכה קלינית עכבר עבור אלח דם (M-CASS) בהתבסס על סימנים הראו של מצב אלח דם בבעלי חיים מאותגרים43,57. בין מספר סמנים פונדקאיים של אלח דם קטלני, היפותרמיה הוצע כמנבא קריטי למוות קרוב הן אלח דם קליני והן אלח דם ניסיוני43,58,59.

למרות שלא נערכו מחקרים רשמיים כדי להשוות ישירות בין עכברים מלידה לעומת עכברים מלידה במודל זה, נתונים המתקבלים מהפרוטוקול הנוכחי באמצעות עכברי וובסטר שוויצריים מלידה ניתנים לשחזור באופן יוצא דופן בפרמטרים שונים של אלח דם, למרות ההטרוגניות הגנטית המשוערת. בדרך כלל, דפוס של תמותה הנופל בתוך 3-5 ימים הוא מודל מוצק של אלח דם חריף, כפי שמעידים עלייה מהירה בתחלואה אלח דם ורמות של סמנים דלקתיים בתוך שעות של אתגר פוסט קטלני50,51. עבור זמני הישרדות ארוכים יותר (7-10 ימים), התמותה היא ככל הנראה תוצאה של נטל מיקרוביאלי המוביל לנזק קטלני לרקמות באיברי היעד ובמערכת העצבים המרכזית. הבחירה של אלח דם או נטל מיקרוביאלי ניתן ליישם לפי הצורך להערכת תפקודי מערכת החיסון או תגובות משטרים אנטי דלקתיים או טיפולים אנטי פטרייתיים / חיסונים, כפי שנקבע על ידי inoculum בשימוש.

בנוסף למודל האתגר הקטלני i.v. , זיהום תוך-בטן עם C. albicans בעכברים באמצעות i.p. אתגר יכול גם להוביל קנדידה מופצת אלח דם לאחר מכן, אם כי חיסון משותף עם פתוגן חיידקי, Staphylococcus aureus, בסינרגיה משפר את התמותה בהשוואה C. albicans מונו-זיהום51,60,61. במודל האתגר הקטלני של i.p, אנוקולה מיקרוביאלית גבוהה משמעותית (1.75 x 107C. albicans/8 x 107S. aureus לעכבר) נדרשים לגרום לדלקת הצפק הפומיקרוביאלית ולהפיץ את האורגניזמים מחלל הבטן למחזור הדם. באופן דומה, זיהום במערכת העיכול עם C. albicans בעכברים שטופלו בסוכנים מדכאי חיסון ו/או רירית מוביל טרנסלוקציה של התאים הפטרייתיים למחזור הדם וגורם לאלח דם פטרייתי62,63. למרות נתיבי החיסון הייחודיים, המנגנון של אלח דם פטרייתי מתפתח הוא אנלוגי במידה רבה בין שלושת מודלי המחלה, הכוללים תגובה פרו-דליקה מערכתית בלתי מבוקרת לקנדידה שמובילה לכשל איברים37,51,61. באופן דומה, אצל בני אדם, זה תהליך זה של התגובה המארחת, לא רק קנדידמיה, שגורם לתחלואה גבוהה / תמותה הקשורים קנדידה המופצת המטוגנית שנרכשה בהגדרות בריאות64,65.

באמצעות מודל אלח דם פטרייתי הנוכחי, אנו מדגימים כאן כי הגנה מפני זיהום קטלני C. albicans ניתן להשיג על ידי i.v. לפני חיסון / חיסון עם C. dubliniensis (avirulent) או מוטציות C. albicans החלשים, במקביל לירידה משמעותית בתחלואה אלח דם. ההגנה מיושרת על ידי Gr-1 מולד+ תאי מדכא שמקורם מיאלואיד שנראה כי הם מושרים במח העצם כצורה שלחסינות מולדתמאומנת 66,67. נעשים מאמצים להרחיב את ההבנה של צורה חדשנית זו של הגנה מולדת בתיווך מערכת החיסון מפני זיהומים במחזור הדם C. albicans.

לסיכום, מכשיר החימום/ריסון החדשני של המכרסמים סייע בקידום היכולת שלנו לבצע זריקות של מחקרים בבעלי חיים רב-קבוצות בקנה מידה גדול בצורה יעילה ויעילה. ככזה, טבענו את המונח, עכבר דקה, עבור המכשיר. מפרטי ההתקן זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה לרכישה של מכשיר דומה. הטכניקות המודגמות כאן יכולות לשמש ככלי שימושי במודלים מכרסמים המעסיקים זריקות ורידים בזנב במגוון רחב של תחומי מחקר.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן LSUHSC (PLF), ובחלקה על ידי U54 GM104940 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות, אשר מממן את המרכז למדעים קליניים ותרגום בלואיזיאנה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woodard, G. Methods of animal experimentation. Gay, W. J. 1, 343-359 (1965).
  2. Shimizu, S. The laboratory mouse The handbook of experimental animals. Hedrich, H. J. , Elsevier Academic Press. Ch. 32 527-541 (2004).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 614-627 (2011).
  5. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Immunology. 73 (1), Chapter 1, Unit 1 6 (2006).
  6. Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Animal. 43 (3), 95-99 (2014).
  7. Jarneborn, A., et al. Tofacitinib treatment aggravates Staphylococcus aureus septic arthritis, but attenuates sepsis and enterotoxin induced shock in mice. Scientific Reports. 10 (1), 10891 (2020).
  8. Bussey, K. A., et al. Endosomal Toll-like receptors 7 and 9 cooperate in detection of murine Gammaherpesvirus 68 infection. Journal of Virology. 93 (3), (2019).
  9. Pitts, M. G., D'Orazio, S. E. F. A Comparison of oral and intravenous mouse models of listeriosis. Pathogens. 7 (1), (2018).
  10. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  11. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  12. Srinageshwar, B., et al. Surface-modified G4 PAMAM dendrimers cross the blood-brain barrier following multiple tail-vein injections in C57BL/6J mice. ACS Chemical Neuroscience. 10 (9), 4145-4150 (2019).
  13. Channabasappa, S., et al. Efficacy of novel antistaphylococcal ectolysin P128 in a rat model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
  14. Sadeghi, B., et al. Preclinical toxicity evaluation of clinical grade placenta-derived decidua stromal cells. Frontiers in Immunology. 10, 2685 (2019).
  15. Boquet, M. P., Wonganan, P., Dekker, J. D., Croyle, M. A. Influence of method of systemic administration of adenovirus on virus-mediated toxicity: focus on mortality, virus distribution, and drug metabolism. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (3), 222-232 (2008).
  16. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. Journal of Nuclear Medicine Technology. 39 (4), 264-270 (2011).
  17. Lasnon, C., Dugue, A. E., Briand, M., Dutoit, S., Aide, N. Quantifying and correcting for tail vein extravasation in small animal PET scans in cancer research: is there an impact on therapy assessment. EJNMMI Research. 5 (1), 61 (2015).
  18. Groman, E. V., Reinhardt, C. P. Method to quantify tail vein injection technique in small animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (1), 35-38 (2004).
  19. Aller, M. A., et al. Neuro-immune-endocrine functional system and vascular pathology. Medical Hypotheses. 57 (5), 561-569 (2001).
  20. McEwen, B. S., et al. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactions. Brain Research. Brain Research Reviews. 23 (1-2), 79-133 (1997).
  21. Callewaert, B. L., et al. Absence of arterial phenotype in mice with homozygous slc2A10 missense substitutions. Genesis. 46 (8), 385-389 (2008).
  22. Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. Tumor formation assays. Methods in Enzymology. 479, 397-411 (2010).
  23. Carlson, R. P. J., Peer, B. In Vivo Models of Inflammation Progress in Inflammation Research. Morgan, D. W., Marshall, L. , Birkhäuser, Basel. 1-50 (1999).
  24. Flecknell, P. Laboratory Animals: An Introduction for New Experimenters. Tuffery, A. A. , John Wiley and Sons. 225-260 (1987).
  25. Kim, M. J., Ahituv, N. The hydrodynamic tail vein assay as a tool for the study of liver promoters and enhancers. Methods in Molecular Biology. 1015, 279-289 (2013).
  26. Bargellini, A., et al. Effects of chronic exposure to anaesthetic gases on some immune parameters. Science of The Total Environment. 270 (1-3), 149-156 (2001).
  27. Elena, G., et al. Inhalatory anesthetic (halothane) associated changes in the immune response in mice. International Journal of Immunopharmacology. 19 (11-12), 699-707 (1998).
  28. Buerge, T. The Laboratory Mouse The handbook of experimental animals. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier Academic Press. Ch. 31 517-526 (2004).
  29. Cohen, J., Cristofaro, P., Carlet, J., Opal, S. New method of classifying infections in critically ill patients. Critical Care Medicine. 32 (7), 1510-1526 (2004).
  30. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  31. Magill, S. S., et al. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1198-1208 (2014).
  32. Dupont, H., et al. Predictive factors of mortality due to polymicrobial peritonitis with Candida isolation in peritoneal fluid in critically ill patients. Archives of Surgery. 137 (12), 1341-1346 (2002).
  33. Montravers, P., et al. Candida as a risk factor for mortality in peritonitis. Critical Care Medicine. 34 (3), 646-652 (2006).
  34. Calandra, T., Bille, J., Schneider, R., Mosimann, F., Francioli, P. Clinical significance of Candida isolated from peritoneum in surgical patients. Lancet. 2 (8677), 1437-1440 (1989).
  35. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  36. Ramage, G., Martinez, J. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Research. 6 (7), 979-986 (2006).
  37. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 336-343 (2005).
  38. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105 (1), (2014).
  39. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. Journal of Innate Immunity. 3 (2), 180-199 (2011).
  40. Segal, E., Frenkel, M. Experimental in vivo models of candidiasis. Journal of Fungi. 4 (1), (2018).
  41. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
  42. Gordon, C. J. The mouse thermoregulatory system: Its impact on translating biomedical data to humans. Physiology & Behavior. 179, 55-66 (2017).
  43. Mai, S. H. C., et al. Body temperature and mouse scoring systems as surrogate markers of death in cecal ligation and puncture sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6, 20 (2018).
  44. Catty, D., Lehmann, P. F. A simple low-cost restrainer for the intravenous injection of mice. Sabouraudia. 16 (2), 89-90 (1978).
  45. Donovan, J., Brown, P. Handling and restraint. Current Protocols in Immunology. 73 (1), Chapter 1 Unit 1 (2006).
  46. Dow, H. C., et al. Genetic dissection of intermale aggressive behavior in BALB/cJ and A/J mice. Genes Brain and Behavior. 10 (1), (2010).
  47. Pugh, P. L., Ahmed, S. F., Smith, M. I., Upton, N., Hunter, A. J. A behavioural characterisation of the FVB/N mouse strain. Behavioural Brain Research. 155 (2), 283-289 (2004).
  48. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Need for early antifungal treatment confirmed in experimental disseminated Candida albicans infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (12), 4911-4914 (2004).
  49. Fakhim, H., et al. Comparative virulence of Candida auris with Candida haemulonii, Candida glabrata and Candida albicans in a murine model. Mycoses. 61 (6), 377-382 (2018).
  50. Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. R. Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis: lipopolysaccharide vs. cecal ligation and puncture. Shock. 13 (2), 110-116 (2000).
  51. Nash, E. E., Peters, B. M., Palmer, G. E., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Morphogenesis is not required for Candida albicans-Staphylococcus aureus intra-abdominal infection-mediated dissemination and lethal sepsis. Infection and Immunity. 82 (8), 3426-3435 (2014).
  52. Rogers, T., Balish, E. Experimental Candida albicans infection in conventional mice and germfree rats. Infection and Immunity. 14 (1), 33-38 (1976).
  53. Marquis, G., Montplaisir, S., Pelletier, M., Auger, P., Lapp, W. S. Genetics of resistance to infection with Candida albicans in mice. The British Journal of Experimental Pathology. 69 (5), 651-660 (1988).
  54. Ashman, R. B., Fulurija, A., Papadimitriou, J. M. Strain-dependent differences in host response to Candida albicans infection in mice are related to organ susceptibility and infectious load. Infection and Immunity. 64 (5), 1866-1869 (1996).
  55. Ashman, R. B., Bolitho, E. M., Papadimitriou, J. M. Patterns of resistance to Candida albicans in inbred mouse strains. Immunology & Cell Biology. 71 (3), 221-225 (1993).
  56. Liu, Y., Mittal, R., Solis, N. V., Prasadarao, N. V., Filler, S. G. Mechanisms of Candida albicans trafficking to the brain. PLoS Pathogens. 7 (10), 1002305 (2011).
  57. Huet, O., et al. Ensuring animal welfare while meeting scientific aims using a murine pneumonia model of septic shock. Shock. 39 (6), 488-494 (2013).
  58. Kushimoto, S., et al. The impact of body temperature abnormalities on the disease severity and outcome in patients with severe sepsis: an analysis from a multicenter, prospective survey of severe sepsis. Critical Care. 17 (6), 271 (2013).
  59. Wiewel, M. A., et al. Risk factors, host response and outcome of hypothermic sepsis. Critical Care. 20 (1), 328 (2016).
  60. Peters, B. M., Noverr, M. C. Candida albicans-Staphylococcus aureus polymicrobial peritonitis modulates host innate immunity. Infection and Immunity. 81 (6), 2178-2189 (2013).
  61. Nash, E. E., Peters, B. M., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Morphology-Independent Virulence of Candida Species during Polymicrobial Intra-abdominal Infections with Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 84 (1), 90-98 (2016).
  62. Hirayama, T., et al. Virulence assessment of six major pathogenic Candida species in the mouse model of invasive candidiasis caused by fungal translocation. Scientific Reports. 10 (1), 3814 (2020).
  63. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), 35 (2008).
  64. Vergidis, P., et al. Intra-abdominal candidiasis: The importance of early source control and antifungal treatment. PLoS One. 11 (4), 0153247 (2016).
  65. Parker, J. C., McCloskey, J. J., Knauer, K. A. Pathobiologic features of human candidiasis. A common deep mycosis of the brain, heart and kidney in the altered host. American Journal of Clinical Pathology. 65 (6), 991-1000 (1976).
  66. Esher, S. K., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Candida/Staphylococcal Polymicrobial Intra-Abdominal Infection: Pathogenesis and Perspectives for a Novel Form of Trained Innate Immunity. Journal of Fungi. 5 (2), (2019).
  67. Lilly, E. A., Ikeh, M., Nash, E. E., Fidel, P. L., Noverr, M. C. Immune protection against lethal fungal-bacterial intra-abdominal infections. mBio. 9 (1), (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 165 זריקות ורידים בזנב מכרסם זריקות תוך ורידי מכשיר לחימום מכרסמים מכשיר לריסון מכרסמים דגמים מן החי דגמי אלח דם כלי דם
מכשיר התחממות/ריסון עכשווי להזרקות יעילות של וריד זנב במודל אלח דם פטרייתי מורין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M.… More

Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter