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Immunology and Infection

Ein modernes Erwärmungs-/Rückhaltegerät für effiziente Injektionen von Schwanzvenen in einem murinen Pilz-Sepsis-Modell

Published: November 6, 2020 doi: 10.3791/61961
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

Summary

Hier stellen wir eine effektive und effiziente Methode für Nagetier-Schwanzvenen-Injektionen mit einem einzigartig entwickelten Erwärmungs- / Rückhaltegerät vor. Durch die Rationalisierung der Einleitung von Vasodilatations- und Zurückhaltungsprozessen ermöglicht dieses Protokoll genaue und rechtzeitige intravenöse Injektionen großer Gruppen von Tieren mit minimaler Belastung.

Abstract

In Nagetiermodellen sind Schwanzveneninjektionen wichtige Methoden zur intravenösen Verabreichung von experimentellen Wirkstoffen. Schwanzveneninjektionen beinhalten typischerweise die Erwärmung des Tieres, um die Vasodilatation zu fördern, was sowohl bei der Identifizierung der Blutgefäße als auch bei der Positionierung der Nadel in das Gefäßlumen hilft und das Tier sicher zurückhält. Obwohl Injektionen von Schwanzvenen in vielen Protokollen üblich sind und bei korrekter Durchführung nicht als hochtechnische Verfahren gelten, sind genaue und konsistente Injektionen entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und die Variabilität zu minimieren. Herkömmliche Methoden zur Induktion der Vasodilatation vor Injektionen der Schwanzvene hängen im Allgemeinen von der Verwendung einer Wärmequelle wie einer Wärmelampe, elektrischer / wiederaufladbarer Wärmekissen oder vorgewärmtem Wasser bei 37 ° C ab. Obwohl diese Werkzeuge in einem Standardlabor leicht zugänglich sind, leiden sie offensichtlich unter einer schlechten/begrenzten thermoregulatorischen Kapazität. Obwohl verschiedene Formen von Rückhaltevorrichtungen im Handel erhältlich sind, müssen sie sorgfältig verwendet werden, um ein Trauma der Tiere zu vermeiden. Diese Einschränkungen der aktuellen Methoden erzeugen unnötige Variablen in Experimenten oder führen zu unterschiedlichen Ergebnissen zwischen Experimenten und / oder Laboren.

In diesem Artikel demonstrieren wir ein verbessertes Protokoll mit einem innovativen Gerät, das ein unabhängiges, thermisch reguliertes Erwärmungsgerät mit einer einstellbaren Rückhalteeinheit in einem System für eine effiziente, stromlinienförmige Injektion der Schwanzvene kombiniert. Das Beispiel, das wir verwenden, ist ein intravenöses Modell einer Pilzinfektion des Blutkreislaufs, die zu sepsis führt. Die Erwärmungsvorrichtung besteht aus einer wärmereflektierenden Acrylbox, die mit einem einstellbaren automatischen Thermostat installiert ist, um die Innentemperatur auf einem voreingestellten Schwellenwert zu halten. Ebenso können breite und höhe der Kegelrückhaltevorrichtung eingestellt werden, um verschiedene Nagetiergrößen sicher aufzunehmen. Mit den fortschrittlichen und vielseitigen Funktionen des Geräts könnte die hier gezeigte Technik zu einem nützlichen Werkzeug in einer Reihe von Forschungsbereichen werden, die Nagetiermodelle umfassen, die Schwanzveneninjektionen verwenden.

Introduction

Die Verwendung von Tiermodellen mit Nagetieren war ein Grundnahrungsmittel der biomedizinischen Forschung. Zahlreiche Inzucht- und Outzuchtstämme sowie gentechnisch veränderte Linien sind weltweit verfügbar und werden routinemäßig in Laboren eingesetzt. Die Injektion von Schwanzvenen ist eine der wesentlichen Methoden in Nagetiermodellen, die die intravenöse (i.v.) Verabreichung von experimentellen Wirkstoffen erfordern. Im Allgemeinen haben i.v. Injektionen große Vorteile gegenüber anderen Verabreichungswegen wie hohe Absorptionsraten durch Umgehung lokaler Gewebe und des Verdauungstraktes und hohe Toleranz gegenüber Lösungen eines breiten Konzentrationsbereichs oder nicht-physiologischem pH1,2,3,4. Neben anderen lebensfähigen i.v. Routen (z. B. Saphenvenen, retroorbitale Venenhöhlen) gelten Schwanzvenen als das sicherste und am leichtesten zugängliche Blutgefäß bei Nagetieren2,3,5,6. Daher wurde die Injektion von Schwanzvenen in einer Reihe von Nagetiermodellen weit verbreitet, darunter die Modelle für Infektionskrankheiten7,8,9, Transplantation biologischer Materialien10,11, Bewertung präklinischer Therapeutika12,13und toxikologische Analysen14,15.

Konsistenz und Genauigkeit der Dosierung sind eine entscheidende Voraussetzung für erfolgreiche Injektionen von Schwanzvenen. Überraschenderweise impliziert die quantitative und qualitative Bewertung von Schwanzveneninjektionen in der Literatur häufige Fehlinjektionen16,17. Eine Studie berichtete, dass zwölf von dreißig Injektionen, die von geschulten Injektoren durchgeführt wurden, mehr als 10% der injizierten Dosen im Schwanz18 hinterließen. Darüber hinaus sollte die Sicherheit und der Komfort des Tieres, das Schwanzveneninjektionen erhält, während des Eingriffs ein Hauptanliegen sein. Unsachgemäße Zurückhaltung kann zu Verletzungen und einer Reihe von stressbedingten Pathologien (z. B. Gewichtsverlust, beeinträchtigte Immunantworten) führen, die erhebliche Variablen in der Probenqualität mit sich bringen können19,20. Diese Fehler können zu einer erhöhten Variabilität der Daten und einer schlechten Reproduzierbarkeit führen, was sich negativ auf die Studienergebnisse auswirkt.

Die Induktion der Gefäßerweiterung beim Tier ist oft notwendig, wenn Schwanzveneninjektionen aufgrund des kleinen Durchmessers des Gefäßes durchgeführt werden, der bei Mäusen auf 300 μm geschätzt wird21. Vasodilatation verbessert die Sichtbarkeit von Schwanzvenen und hilft dabei, eine optimale Nadel-Venen-Ausrichtung innerhalb des venösen Lumens zu erreichen. Eine Vielzahl von Methoden wurde von Laboratorien berichtet, wie z.B. das Eintauchen des Schwanzes in warmes Wasser22,das Anwenden von Wärme auf den Schwanz mit einem warmen Vorhang, einer Lampe oder einem Haartrockner23,24oder das Platzieren des Tieres in einer warmen Umgebung mit einem Heizkissen, Inkubator oder einer Box in Kombination mit einer dieser Wärmequellen25. Die Geräte können entweder selbst für bestimmte Zwecke hergestellt oder bei kommerziellen Anbietern erhältlich sein. Vielen fehlt es jedoch an thermoregulatorischen Fähigkeiten, und wenn überhaupt, ist die Gerätetemperatur schlecht gewartet und unterliegt oft Schwankungen der Raumtemperatur. Ebenso ist die Verwendung einer Rückhaltevorrichtung für Injektionen in die Schwanzvene notwendig, da die Verwendung von Anästhesie nicht empfohlen wird26,27. Es wurden verschiedene Arten von laborspezifischen oder kommerziellen Rückhaltevorrichtungen entwickelt. Typischerweise wird das Tier in ein konisches Einwegrohr40ml, geschlitzte Plexiglaswände, einen Tunnel oder Kegel28gelegt, die alle eine ausreichende Exposition des Schwanzes ermöglichen und gleichzeitig die Bewegungen des Tieres einschränken. Die meisten Rückhaltemittel haben jedoch größenbeschränkungen aufgrund der Steifigkeit der Materialien. Darüber hinaus scheinen moderne hochkomplexe Geräte trotz der praktischen und ausgeklügelten Konstruktionen für Injektionen mit großen Tiergruppen nicht durchführbar zu sein22.

Mausmodelle für Blutbahninfektionen und damit verbundene Sepsis sind ein Paradebeispiel für Situationen, die den Einsatz dieser Technik erfordern. Unter allen mikrobiellen Ätiologien der schweren klinischen Sepsis ist die Pilzsepsis oft eine tödliche Erkrankung mit Mortalitätsraten von >40% trotz antimykotischer Therapie29. Tatsächlich wurde eine Infektion mit Candida albicans als vierthäufigste Ursache für eine im Krankenhaus erworbene Blutbahninfektion (Candidämie) berichtet30,31. Bei der intraabdominalen Candidiasis können sich Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt über den Blutkreislauf verbreiten und eine polymikrobielle Sepsis mit einer noch höheren Mortalität verursachen32,33,34. Da die meisten nosokomialen Candidämiefälle aus kontaminierten Zentrallinienkathetern oder innewohnenden Medizinprodukten hervorgehen35,36, i.v. die Impfung mit C. albicans durch Schwanzveneninjektion kann die menschliche Sepsisentwicklung genau widerspiegeln und war eine Hauptmethode in einem Mausmodell der hämatogen disseminierten Candidiasis37,38. In diesem Modell kann die Mortalität, die in Tagen auftritt, durchAnpassung der C. albicans i.v. inoculum39, 40,41verlängert oder verkürzt werden.

Vor kurzem hat unser Labor ein innovatives Protokoll für eine optimal optimierte Injektion der Schwanzvene mit einem innovativen Gerät entwickelt, das mit einer thermoregulierten Erwärmungseinheit, gepaart mit einer einstellbaren Rückhalteeinheit, in einem praktischen System ausgestattet ist. Dieses Protokoll ermöglicht es forschern, Schwanzveneninjektionen genau und rechtzeitig durchzuführen, während Tiere sicher konditioniert und für das Verfahren mit minimaler Belastung zurückgehalten werden können. Die hier demonstrierten Techniken könnten unter Verwendung der fortschrittlichen Erwärmungs- und Rückhaltevorrichtung als nützliches Werkzeug in verschiedenen Forschungsbereichen mit Nagetiermodellen dienen.

Protocol

Alle Tierprotokolle, die Injektionen von Schwanzvenen und die Verwendung des Erwärmungs- / Rückhaltegeräts beinhalten, wurden vom lokalen Institutional Animal Care Committee (IACUC) überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung

  1. Akklimatisieren Sie Tiere mindestens 1 Woche lang in der Haltungsumgebung und lassen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zu.
    HINWEIS: Für die meisten neuen Benutzer dieser Injektionstechnik können Tierstämme mit weißem oder hellem Fell vorzuziehen sein, da die Schwanzvenen durch die Haut leicht sichtbar sind. Dunkel gefärbte Stämme von Mäusen (z. B. C57BL/ 6) oder Ratten (z. B. Braunes Norwegen) haben tief pigmentierte Schwänze, was zu einem schwachen Farbkontrast gegen die Vene führt. Es wird dringend empfohlen, dass neue Benutzer eine angemessene Schulung erhalten, bis die Kenntnisse erreicht sind.
  2. Mittel zur Injektion von Schwanzvenen
    1. Bereiten Sie alle Testmittel und Lösungen aseptisch vor. Wenn Sie Organismen oder Zellmaterialien verabreichen, treffen Sie während aller Verarbeitungsschritte Vorsichtsmaßnahmen, um pyrogenfreie Bedingungen aufrechtzuerhalten.
    2. Verwenden Sie nur normale Kochsalzlösung (0,9% w/v Natriumchlorid) oder ausgewogene Salzlösungen wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Vehikel für die Injektion von Schwanzvenen.
      ACHTUNG: Verwenden Sie niemals Wasser, Öl oder viskose Lösungen, da das Risiko von Gefäßschäden besteht. Ein breiter pH-Bereich (4,5-8,0) ist aufgrund der puffernden Wirkung von Blut und der schnellen Blutflussraten bei Nagetieren tolerierbar. Stark saure oder alkalische Lösungen können jedoch zu unnötigen Gewebeschäden an der Injektionsstelle führen und sollten vermieden werden.
    3. Begrenzen Sie das Volumen und die Häufigkeit der Injektion auf ein Minimum. Verwenden Sie die empfohlenen Volumina für Mäuse und Ratten (≤200 μL bzw. ≤500 μL) bei Körpertemperatur vor der Injektion, um den Stress für das Tier zu minimieren3.
    4. Stellen Sie sicher, dass jede Zubereitung der Spritze und nadel frei von Luftblasen in der Lösung ist. Wenn Blasen vorhanden sind, reinigen Sie sie vollständig, um das Risiko einer Embolie zu vermeiden.
      HINWEIS: Typischerweise sind 1 ml Spritzen mit 27 G, 1/2-Zoll-Nadeln für die meisten Injektionen in die Schwanzvene ausreichend.
    5. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), die von der örtlichen IACUC mit einem Minimum an Einweg- oder speziellen Kleidern und Latex- oder Nitrilhandschuhen verlangt wird. Die Verwendung einer Schutzbrille wird bei der Injektion von Schwanzvenen dringend empfohlen.
  3. Die Wärme- und Rückhaltevorrichtung
    1. Überprüfen Sie alle Komponenten vor gebrauchen sorgfältig, um sicherzustellen, dass das Gerät frei von Defekten ist (Abbildung 1).
    2. Initialisierung des Aufwärmgeräts (Abbildung 2A)
      1. Stellen Sie die Wärmeeinheit auf eine saubere, flache Tischplatte und schalten Sie das Gerät ein. Stellen Sie sicher, dass die Thermostat-Betriebsanzeige grün leuchtet. Legen Sie Bettungsmaterialien in die Wärmekammer, um den Bereich trocken zu halten und Wärme zu speichern.
    3. Einrichtung der Rückhaltevorrichtung (Abbildung 2B)
      1. Platzieren Sie die Rückhalteeinheit neben der Wärmeeinheit und bestimmen Sie die geeigneten Kegelgrößen für das Tier. Passen Sie bei Bedarf die Grundbreiten des biegsamen Aluminiumkegels manuell an, um dem Tier eine ausreichende Zurückhaltung zu bieten. Alternativ können Sie den Kegel durch speziell angepasste Modelle ersetzen, um Mäuse oder Ratten unterschiedlicher Körpergröße aufzunehmen.

2. Injektion der Schwanzvene

  1. Geräteanpassungen
    1. Einstellen der Innentemperatur
      1. Stellen Sie den Thermostat über das Einstellrad auf die gewünschte Temperatur ein. Stellen Sie sicher, dass die Heizungsanzeige rot leuchtet und dass die Glühbirne leuchtet. Überwachen Sie die interne Temperaturanzeige sorgfältig, während die Glühbirne beleuchtet ist (Heizung). Der Thermostat inaktiviert die Glühbirne automatisch, sobald eine Zieltemperatur erreicht ist, ungefähr in 10-15 minuten.
        HINWEIS: Wenn Sie eine Temperatur einstellen, die höher als die Umgebungstemperatur ist, wird die Heizung aktiviert. Im Allgemeinen variiert die empfohlene Gehäusetemperatur unter Standard-Vivariumsbedingungen im Bereich von 20 bis 26 °C, während die neutrale (d.h. angenehme) Temperatur für Labormäuse zwischen 30 und 32 °C42liegt. Daher wird empfohlen, die Innentemperatur der Wärmekammer etwas höher als die Thermoneutralität zu erhöhen, etwa bei 32–36 °C. Stellen Sie den Thermostat niemals über die Körpertemperatur.
    2. Positionierung der Rückhalteplattform
      1. Stellen Sie mit dem Höhenverstellknopf die Kegelhöhe auf das für den Benutzer optimale Niveau ein.
  2. Wärmebehandlung (Abbildung 3A)
    1. Sobald die Zieltemperatur (32–36 °C) erreicht ist, werden die Tiere vorsichtig aus dem Haltungskäfig in die Wärmekammer überführen.
      HINWEIS: Eine Wärmebehandlung von 5-10 minuten ist ausreichend, um eine Vasodilatation zu induzieren und die Sichtbarkeit der Schwanzvenen zu verbessern. Tiere können jedoch für die Dauer des Eingriffs (typischerweise 20-30 Minuten ohne Anzeichen einer Hyperthermie) sicher in der thermoregulierten Kammer gehalten werden. Die Wärmekammer kann sicher 4-6 Mäuse oder eine Ratte enthalten.
    2. Überwachen Sie das Tier auf Anzeichen von akutem Hitzestress (z. B. schnelle Atmung, Lethargie, springendes Fluchtverhalten).
      VORSICHT: Tiere, die Anzeichen einer Hyperthermie aufweisen, sollten in ihren Käfig zurückgebracht und überwacht werden, bis sie vor der Wiederverwendung wieder normal aktiv sind. Wenn dies darauf zurückliegt, dass die Innentemperatur den optimalen Bereich überschreitet, stellen Sie sicher, dass das Erwärmungsgerät ausgeschaltet ist.
  3. Injektionsschritte
    1. Heben Sie das Tier an der Schwanzbasis an und entfernen Sie es aus der Wärmekammer. Führen Sie das Tier auf die Kegelöffnung der Rückhalteeinheit ein.
      ACHTUNG: Heben Sie niemals Mäuse vom Schwanzende ab; dies kann zu schweren Verletzungen führen. Alternative Behandlungsmethoden sollten für fettleibige oder trächtige Mäuse verwendet werden28.
    2. Während das Tier mit seinen Vorderbeinen am äußersten Rand des Kegels greift, ziehen Sie den Schwanz vorsichtig nach hinten und führen Sie den Schwanz durch den offenen Schlitz. Sichern Sie das Hinterende des Tieres an der Basis des Kegels mit einem Hinterbein, das aus dem Kegel herausragt, so dass die seitliche Vene in einer Position von 12 Uhr angezeigt wird. Beide Hinterbeine können hervorstehen, da es zwei seitliche Venen gibt, eine auf jeder Seite (Abbildung 3B).
    3. Greifen Sie den Schwanz auf der mittleren bis zwei Drittellänge mit der nicht dominanten Hand zwischen Daumen und Zeigefinger und verspannen Sie die laterale Vene leicht, um die Schwanzpositionierung und Vasodilatation aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Verbesserte Sichtbarkeit der erweiterten Venen durch Wärmebehandlung ermöglicht es dem Benutzer, schnell eine Injektionsstelle für die besten Ergebnisse zu bestimmen (Abbildung 4).
    4. Wischen Sie die Haut der Injektionsstelle mit einem Mullschwamm oder einem mit 70% Alkohol angefeuchteten Pad ab. Reinigen Sie so sanft und schnell wie möglich, um Reizungen des Schwanzes zu vermeiden.
      HINWEIS: Dieses Verfahren kann nach Ermessen der institutionellen IACUC entfallen.
    5. Halten Sie die Spritze mit der dominanten Hand und positionieren Sie die Nadel parallel zum Schwanz. Führen Sie die Nadel in Richtung des Blutflusses ein, fasen Sie sie in einem Winkel von 10–15° ab (Abbildung 5A–B), und dringen Sie weiter in das Lumen der Vene vor, indem Sie 2–4 mm eindringen(Abbildung 5C–D). Injizieren Sie die Lösung langsam.
      HINWEIS: Wenn die Injektion erfolgreich ist, sollte kein Widerstand am Kolben zu spüren sein, und die Flüssigkeit kann gesehen werden, wie sie sich durch die Vene bewegt. Im Falle eines Widerstands oder weißer Blasen über der Injektionsstelle entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie eine zweite Injektion an einer Stelle oberhalb der ursprünglichen Nadelplatzierung. Versuchen Sie nicht, unterhalb der ursprünglichen Injektionsstelle zu injizieren, da die Flüssigkeit durch die Ausgangsstelle frei wird. Wenn die Injektion einer lateralen Vene nicht erfolgreich ist, positionieren Sie das Tier auf der gegenüberliegenden Seite und unternehmen Sie weitere Versuche auf der kontralateralen Vene. Die maximale Anzahl der Versuche hängt davon ab, wo man die versuchte Injektion entlang der Vene beginnt und welche Schwellung bei verpassten Versuchen auftreten kann. Konsultieren Sie die institutionellen IACUC-Vorschriften für Fehlinjektionen und damit verbundene Verletzungen.
    6. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie fest mit dem Daumen, um einen Rückfluss der injizierten Lösung und / oder des Blutes zu verhindern. Setzen Sie die sanfte Kompression mit einer sauberen Gaze/Tuch oder einem sauberen Gewebe fort, bis die Blutung aufgehört hat (Abbildung 6).
    7. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überwachen Sie es mindestens 5 Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass das Tier die normale Aktivität ohne weitere Blutungen wieder aufnimmt.

3. Ein murines Modell der Pilzinfektion des Blutkreislaufs und der Sepsis

  1. Mausstämme
    1. Akklimatisieren weibchen Swiss Webster züchtete Mäuse im Alter von 6 Wochen gemäß den institutionell empfohlenen Richtlinien. Alternativ können Sie für dieses Protokoll Inzucht-/gentechnisch veränderte Stämme (z. B. C57BL/6-Hintergrund) mit modifizierter Impfung verwenden (siehe HINWEIS).
      HINWEIS (siehe Diskussion für Details): Schwanzadern von Mäusen mit dunklem Fell sind aufgrund des tief pigmentierten Schwanzes oft weniger sichtbar als solche mit hellerem Fell (Abbildung 4). Es gibt eine unterschiedliche Anfälligkeit für Pilzse sepsis/letalität bei verschiedenen Mausstämmen. Die Verwendung von mausigen anderen Stämmen als Swiss Webster kann eine zusätzliche Protokolloptimierung erfordern, indem relevante Faktoren (z. B. genetischer Hintergrund, Alter, Geschlecht, Körpergröße) berücksichtigt werden, die den Immunstatus des Wirts beeinflussen könnten. Zum Beispiel erfordert eine tödliche Herausforderung bei C57BL / 6-Mäusen typischerweise eine höhere Inokula (bis zu 10x), um das Mortalitätsniveau zu erreichen, das bei Schweizer Webster-Mäusen beobachtet wird.
  2. Mikroorganismen
    1. Für eine tödliche Herausforderung (Sepsis) streifen Sie gefrorene Bestände von Candida albicans Stamm DAY185 (oder Sorten Ihrer Wahl) auf Sabouraud Dextrose-Agar und inkubieren Sie bei 30 ° C für 2 Tage.
    2. Eine einzelne Kolonie in 10 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Brühe überführen und in die stationäre Wachstumsphase für 18 h bei 30 °C mit Schütteln kulturieren.
  3. Inoculum Lösungen
    1. Sammeln Sie am Tag einer tödlichen Herausforderung die Brühekultur und waschen Sie das Pellet 3 Mal durch Zentrifugation (800 × g)in sterilem PBS.
    2. Identifizieren Sie lebensfähige Hefezellen durch Ausschluss von Trypanblaufarbstoffen und enumerieren Sie mit einem Hämozytometer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 106 Zellen/ml in sterilem PBS bei Raumtemperatur ein.
      HINWEIS: Jedes Tier erhält 100 μL der Inokumlösung. Bereiten Sie ein überschüssiges Volumen des Inokums (>500 μL) vor, um einen möglichen Verlust während des Injektionsverfahrens zu ermöglichen. Das endgültige Inokum beträgt 1 x 105 Zellen pro Maus. Das Inokumvolumen kann durch entsprechende Anpassung der Zellkonzentration auf bis zu 200 μL erhöht werden.
      ACHTUNG: Die Pilzinokumlösung muss vor der Injektion bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Das Erwärmen der Inokularlösung auf Körpertemperatur kann einen morphologischen Wechsel von Hefezellen zu Hyphen induzieren. Im Gegensatz dazu kann die Bolus-i.v-Verabreichung von Kältelösungen die Körpertemperatur des Tieres schnell senken und sollte vermieden werden.
  4. Intravenöse Impfung
    1. Erwärmen Sie die Tiere und induzieren Sie eine Vasodilatation, indem Sie die Verfahren in Abschnitt 2 befolgen.
    2. 100 μL der Inokularlösung mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G, 1/2-Zoll-Nadel in die Schwanzvene injizieren.
  5. Überwachung nach der Impfung
    1. Überwachen Sie die Tiere auf folgende Anzeichen einer sepsisinduzierten Morbidität: i) Fellaspekt (z. B. glatt, zerzaust), ii) Aktivität (z. B. freie Bewegung, nicht ansprechbar), iii) Haltung (z. B. gebeugt, steif), iv) Verhalten (z. B. langsam, keine Umsiedlung), v) Brustbewegungen (z. B. normale Atmung, Dyspnoe), vi) Augenlider (z. B. offen, geschlossen)43.
  6. Sepsis-Scoring
    1. Bewerten Sie die beobachtete Morbidität gemäß einem modifizierten Mouse Clinical Assessment Score für Sepsis (M-CASS) in einer vierstufigen Bewertungsskala von 0 bis 3 in jeder Kategorie: 0, normal; 1, mild; 2, moderat; 3, schwer43.
  7. Fakultativprotokoll: Impfung gegen Pilzse sepsis
    1. Vierzehn Tage vor einer tödlichen Herausforderung impfen Mäuse mit Candida dubliniensis-Stamm Wü284 oder abgeschwächten C. albicans-Stämmen wie Δefg1/ Δcph1-Mutanten (1x105 Zellen pro Maus), wie in den Abschnitten 3.2–3.4 anstelle von C. albicans DAY185 beschrieben.
    2. Führen Sie eine tödliche Herausforderung an den geimpften Mäusen durch, wie in den Abschnitten 3.2–3.4 beschrieben, und überwachen Sie die in den Abschnitten 3.5–3.6 beschriebenen Anzeichen einer Sepsis-induzierten Morbidität.

Representative Results

Die Temperatur in der Wärmekammer wird kontinuierlich vom internen Sensor erfasst und vom Thermostat automatisch reguliert. Zuerst wurde das Einstellrad des Thermostats bei 78, 85, 90 oder 95 °F (26, 29, 32 oder 95 °C) positioniert, um die eingestellten Temperaturen auszuwählen. Sobald die Heizung aktiviert wurde(Abbildung 7,gelbe Punkte), erhöhte die Wärmeabgabe der Glühbirne die Innentemperatur während der ersten 5-15 Minuten schnell, abhängig von der eingestellten Temperatur. Die Heizung deaktivierte die Glühbirne, wenn die erkannte Innentemperatur die eingestellte Temperatur (graue Punkte) überschritten hat. Die anfänglichen Spitzentemperaturen sollten in allen Gruppen auf 5–7 °C über den eingestellten Temperaturen ansteigen, um den Temperaturverlust während des Tiertransfers auszugleichen. Anschließend wiederholt das Gerät den Wärmezyklus automatisch und hält die Wärmekammer auf der eingestellten Temperatur.

Ein Beispiel für experimentelle Daten, die durch erfolgreiche Injektionen von Schwanzvenen unter Verwendung des aktuellen Protokolls erhalten wurden, ist in Abbildung 8 dargestellt. In einem Mausmodell der Blutbahn-Candidiasis, die zu sepsis führte, verursachte eine i.v. Herausforderung mit Candida albicans (1 x10 5 Zellen pro Maus) bei Schweizer Webster-Mäusen einen schnellen Beginn der Sepsis und Ausbreitung der Organismen, was zu einer hohen Mortalität innerhalb von 3-4 Tagen führte (offene Punkte) (Abbildung 8A). Im Gegensatz dazu könnten Tiere durch vorherige i.v. Vorimmunisierung / Impfung mit einem avirulenten Hefestamm, Candida dubliniensis,vor Sepsis geschützt werden und nach der tödlichen i.v.-Herausforderung mit virulenten C. albicans (festen Punkten) ein Überleben von >95% erreichen. Diese Ergebnisse in progressiver Mortalität vs. impfstoffvermittelter Schutz wurden in vier unabhängigen Experimenten reproduzierbar erhalten (Ergänzende Abbildung 1). Ein ähnlicher Schutz könnte mit anderen avirulenten Hefestämmen wie abgeschwächten C. albicans-Mutanten (Δefg1/Δcph1) erreicht werden (Daten nicht gezeigt). Sepsis konnte ebenso überwacht werden und korrelierte mit der Mortalität; die ungeimpften Tiere mit tödlicher Infektion wiesen einen signifikanten Anstieg der Sepsis-induzierten Morbidität auf, während die geimpfte Gruppe nach der tödlichen Herausforderung minimale Symptome zeigte (Abbildung 8B).

Figure 1
Abbildung 1: Beschreibung der Nagetiererwärmungs- und Rückhaltevorrichtung. (A) zeigt die Außenansicht der Erwärmungsvorrichtung, die aus Folgendem besteht:

  1. Thermostatabdeckung – am Griff nach oben heben, um den Thermostat freizulegen
  2. Schaltschrank – zum Schutz dauerhaft abgedichtet
  3. Kammerdeckel – beim Tiertransfer nach/von nach oben heben
  4. Wärmekammer – abnehmbar, bedecken Sie den Boden vor Gebrauch mit Bettwäsche
  5. Rückhaltevorrichtung – bei Nichtgebrauch mit der Heizvorrichtung verstaubar
  6. Netzschalter – Inline-Wippschalter für Haupt-Ein-/Aus-Funktionen
  7. Netzkabel – Spannung/Strom: 120V/10A

B) zeigt das Innere der Wärmeeinrichtung:

  1. Glühlampe – Lichtleistung bei 100 Watt
  2. Glühbirnenschutzschild – abnehmbar für Lampenwechsel
  3. Temperaturfühler – befindet sich in der Kammer
  4. Internes Temperaturthermometer – zur Temperaturüberwachung in die Kammer stellen

(C) zeigt Komponenten des Thermostats der Erwärmungsvorrichtung:

  1. Internes Temperaturthermometer
  2. Thermostat – reguliert die Heizung automatisch
  3. Sollwert-Steuerhebel – Minimum/Maximum: 25 °C/42 °C (78 °F/108 °F)
  4. Thermostat-Leistungsanzeige – grünes Licht zeigt normalen Betrieb an
  5. Thermostatheizungsanzeige – leuchtet während des Heizzyklus rot

(D) zeigt die Komponenten der Rückhalteeinrichtung:

  1. Kegel – biegsames Aluminiumblech für nagetierrückhaltendes
  2. Tail Channel – geformt, um eine reibungslose Positionierung des Hecks zu ermöglichen
  3. Kegelhubbühne – sorgt für einen stabilen Antrieb der Kegelbasis
  4. Höhenverstellknopf – konzipiert für manuelle Höhenverstellung
  5. Scherenheber – Höhenbereich von 45–140 mm (1,77–5,52")
  6. Stützplatte – mit Gummifüßen installiert, um Stabilität zu gewährleisten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Ermärm- und Rückhaltevorrichtung für Nagetiere. (A) Vor dem Gebrauch werden die beiden Teile des Geräts nebeneinander auf einer sauberen Tischplatte platziert. (B) Sobald die Wärmeeinrichtung eingeschaltet ist, aktiviert der Thermostat die Heizung. Die Glühbirne bleibt beleuchtet und gibt Wärme ab, bis die Wärmekammer die eingestellte Temperatur erreicht hat. Das Wärmegerät wiederholt automatisch den Wärmezyklus, um die Innentemperatur aufrechtzuerhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Mäuse (C57BL/6), die in die Erwärmungs- und Rückhaltevorrichtung eingelegt sind. (A) Mäuse, die eine Wärmebehandlung zur Vasodilatation erhalten. Die Tiere (4–6 Mäuse pro Behandlung) werden aus ihrem Haltungskäfig in die Wärmekammer des Gerätes überführt und für mindestens 5–10 min wärmebehandelt. (B)Eine Maus wird für die Injektion von Schwanzvenen zurückgehalten. Die Maus wird von der Wärmekammer in die Kegelöffnung der Rückhaltevorrichtung überführt, wobei ihr Schwanz durch den offenen Schlitz führt. Die Maus wird vorsichtig nach hinten zum äußersten Rand des Kegels gezogen, bis die Schwanzbasis die Spitze des Kegels erreicht. Da das Tier mit einer sanften seitlichen Drehung zur Basis des Kegels gezogen wird, wird ein Hinterbein nach oben positioniert, so dass es aus dem offenen Schlitz herausragt, so dass die seitliche Schwanzvene bei 12 Uhr positioniert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Identifizierung der seitlichen Schwanzvenen bei Mäusen. (A) Der Schwanz einer unbehandelten Schweizer Webster-Maus. Die Maus wird ohne vorherige Wärmebehandlung zur Vasodilatation in die Rückhaltevorrichtung eingesetzt. Die seitliche Schwanzvene kann als dünnes dunkles Gefäß identifiziert werden, das unter der Haut verläuft. (B) Der Schwanz einer Schweizer Webster-Maus, die mit der Wärmevorrichtung für 10 min behandelt wurde. Die wärmebehandelte Maus wird für die Injektion der Schwanzvene zurückgehalten. Die seitliche Schwanzvene ist aufgrund des vergrößerten Gefäßdurchmessers, der durch Vasodilatation induziert wird, durch die Haut gut sichtbar. (C) Der Schwanz einer C57BL/6-Maus, die 10 Minuten lang mit der Erwärmungsvorrichtung behandelt und für die Injektion der Schwanzvene zurückgehalten wurde. Die Vasodilatation verbessert die Sichtbarkeit der Schwanzvene durch die tief pigmentierte Haut, obwohl die Vene aufgrund eines schwachen Farbkontrasts zur Vene nicht so gut sichtbar ist wie bei den hellen Schweizer Webster-Mäusen. Rote Pfeile kennzeichnen die Lage der seitlichen Schwanzvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Injektion der Schwanzvene bei wärmebehandelten Mäusen (Swiss Webster). (A–B) Nadeleinführung in die laterale Schwanzvene an der Injektionsstelle. Die Nadel (27 G, 1/2-in) wird parallel zur Schwanzvene mit der Fasen nach oben positioniert und auf den Blutfluss gerichtet und eingeführt. (C–D) Nadelplatzierung in der Schwanzvene und Injektion. Die Nadelspitze wird weiter 2–4 mm in das Lumen der Vene vorgeschoben. Der Daumen wird auf dem Kolben der Spritze positioniert, und das gewünschte Volumen wird mit langsamem und gleichmäßigem Druck entfallen. Ovale Kreise zeigen Injektionsstellen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Verfahren nach der Injektion. (A) Ein Blutungsbereich an der Injektionsstelle. Blutungen und Rückfluss der injizierten Lösung treten unmittelbar nach der Nadelentfernung auf. Dies kann minimiert werden, indem mit dem Daumen eine feste Kompression auf die Injektionsstelle angewendet wird. (B) Blutgerinnselbildung an der Injektionsstelle. Sanfte Kompression mit einer sauberen Gaze / Wipe erleichtert die Blutgerinnung auf der Injektionswunde. Pfeile kennzeichnen Injektionsstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Die Innentemperatur der Wärmekammer während des Gebrauchs. Die Erwärmungsvorrichtung wurde für die Erwärmung bei den angegebenen eingestellten Temperaturen aktiviert. Die Wärmekammer des Gerätes wurde auf die interne Lufttemperatur überwacht und Wärmezyklen (Glühbirne an/gelbe Punkte, aus/graue Punkte) wurden über 45 min aufgezeichnet. Der orangefarbene Bereich zeigt den optimalen Temperaturbereich für die Induktion der Vasodilatation bei Nagetieren an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Sepsis-Mortalität vs. impfstoffvermittelter Schutz nach einer tödlichen Herausforderung mit Candida albicans. Mäuse (8 Wochen alte Schweizer Webster-Weibchen) wurden intravenös mit avirulenter lebender Candida dubliniensis Wü284 (Cd) geimpft, gefolgt von einer tödlichen intravenösen Herausforderung mit Wildtyp C. albicans DAY 185 (1 x 105 Zellen pro Maus) 14 Tage später. (A) Die Mortalität wurde über 10 Tage nach der tödlichen Herausforderung beurteilt. (B) Die Tiere wurden auf Sepsis-Morbidität überwacht und nach einem modifizierten Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis (M-CASS)43bewertet. Die Daten sind kumulativ aus 4 unabhängigen Experimenten mit 10 Mäusen pro Gruppe und wurden mit dem Mantel-Cox-Log-Rank-Test analysiert. s < 0,0001. SEM, Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Reproduzierbarkeit der Sepsis-Mortalität und impfstoffvermitteltes Überleben aus einer Candida albicans-Herausforderung im Blutkreislauf. Jedes Panel stellt Daten aus vier unabhängigen Experimenten dar, die in einem kumulativen Ergebnis in Abbildung 8Aenthalten sind. Jedes Experiment wurde mit 10 Mäusen pro Gruppe durchgeführt und mit dem Mantel-Cox-Log-Rank-Test analysiert. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. s < 0,0001. s < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Discussion

Eine konsistente und genaue Dosierung sind wesentliche Voraussetzungen für die Experimentelle zuverlässigkeit in Tiermodellen. Dies ist besonders wichtig in Fällen der i.v. Verabreichung, in denen die systemische Bioverfügbarkeit der injizierten Wirkstoffe erheblich höher/schneller ist als bei anderen Verabreichungswegen3. Daher könnten sich Fehler bei der Injektion von Schwanzvenen nachteilig auf die Studienergebnisse auswirken. In der Vergangenheit war die intraperitoneale (i.p.) Injektion anstelle von i.v. aufgrund der technischen Einfachheit und Bequemlichkeit die häufigste Methode für den systemischen Zugang bei Nagetieren. Verabreichungswege werden jedoch bei der Übersetzung präklinischer Auslesungen von Tieren in klinische Umgebungen immer wichtiger. Daher besteht ein Bedarf an kontinuierlicher Verbesserung der Nagetierprotokolle, die eine erfolgreiche Injektion von Schwanzvenen erleichtern könnten.

Der wichtigste Fortschritt im vorliegenden Protokoll ist das innovative thermoregulierte Erwärmungsgerät, das eine effektive Induktion der Vasodilatation bei Nagetieren ermöglicht, was die Sichtbarkeit von Schwanzvenen und Nadelausrichtung dramatisch verbessert. Schlecht thermoregulierte Heizmethoden (z.B. Lampen), topische Vasodilatatoren oder Hautreizstoffe (z.B. Xylol) sind nicht nur unzuverlässig, sondern auch unsicher für das Tier und sollten vermieden werden44. Im Gegensatz zu anderen herkömmlichen Methoden, wie dem Eintauchen des Schwanzes in warmes Wasser, kann die Autoregulationsfähigkeit dieses Geräts mehrere Tiere gleichzeitig sicher konditionieren. Darüber hinaus wird dieses Protokoll durch den Einsatz der optimal ausgelegten Rückhaltevorrichtung weiter gestärkt und ermöglicht eine schnelle und sichere Immobilisierung des Tieres in einer Position, die die seitliche Schwanzvene am besten anzeigt.

Die transparenten Tubenformate, die in vielen aktuellen Rückhaltemitteln zu sehen sind, obwohl praktisch gut gestaltet, erfordern mehr Handhabungszeit mit jedem Tier, wodurch der Rückhalteprozess verlängertwird 45. Dies kann bei Nagetierstämmen mit aggressiven Merkmalen, die eine begrenzte Zusammenarbeit bieten, problematischer sein46,47. Im Gegensatz dazu ermöglicht die halbgeschlossene Kegelstruktur der Rückhaltevorrichtung eine schnelle Positionierung des Tieres und hilft, die Dauer der Zurückhaltung zu minimieren. Zusammen beschleunigt das schlanke Protokoll mit dem innovativen, hochoptimierten Erwärmungs-/Rückhaltesystem den Injektionsvorgang und ermöglicht eine schnelle und effektive Dosierung großer Tiergruppen. In unserem Labor führen wir in der Regel einen gesamten Injektionsvorgang von 30 Mäusen von der Wärmebehandlung bis zur Überwachung nach der Injektion innerhalb von 1 h mit diesem Protokoll durch.

Trotz der erweiterten Funktionen hat dieses Gerät einige offensichtliche Nachteile: Der erste sind die Kosten für das Gerät und den routinemäßigen Austausch von Glühbirnen in der Wärmekammer. Zusätzlich zur Effizienz und Geschwindigkeit der Injektionen ist das Gerät jedoch langlebig für den wiederholten Gebrauch und mit den meisten gängigen Desinfektionsmitteln kompatibel, was eine gründliche Reinigung des Geräts zwischen den Anwendungen ermöglicht. Zusammen gleicht dies die Anfangsinvestitionaus. InSituationen mit begrenztem Arbeitsbereich kann ein Nachteil dieses Protokolls die Anforderung eines dedizierten Bankbereichs sein, der groß genug ist, um die beiden Einheiten während der Injektion nebeneinander zu platzieren. Da das Gerät jedoch breit über mehrere Nagetierprotokolle mit i.v.-Injektionen eingesetzt werden kann, ist es möglich, dass das Gerät als Kerninstrument ähnlich wie andere kommunale Vivariumgeräte wie Isofluran-Vaporizer dienen könnte. Unabhängig davon sind die beiden Geräte leicht tragbar und können gebündelt und verstaut werden, während sie nicht verwendet werden.

Das in diesem Protokoll beschriebene i.v. lethal challenge-Modell der murinen Pilzsepilzsezisis ahmt C. albicans-Blutbahninfektionen beim Menschen genau nach und wurde ausgiebig verwendet, um pilzvirulenz zu untersuchen, die Wirksamkeit antimykotischer Therapien zu testen und die Immunantworten des Wirts auf Infektionen zu charakterisieren37,39,48. Um eine reproduzierbare Infektion zu erreichen, ist die Impfung durch Schwanzveneninjektion der wichtigste Schritt des Protokolls, um eine genaue Abgabe der Organismen in den Blutkreislauf zu gewährleisten. Tatsächlich reagieren Tiere sehr unterschiedlich auf unterschiedliche Ebenen von Candida i.v. Herausforderungen; Die Verabreichung zu geringer Mengen an Inokum führt zu unerwünschten spontanen Genesungen, während Tiere, die zu hohe Dosen erhalten, vorzeitig erliegen. Das spezifische Fenster der Inokumgrößen für einen bestimmten Organismus, um ein konsistentes Niveau der Sepsis / Mortalität zu induzieren, hängt weitgehend sowohl von Pilzstämmen als auch von Mausstämmen ab.

Das aktuelle Protokoll mit Schweizer Webster-Mäusen im Inokum von 1 x 105 Wildtyp C. albicans induzierte reproduzierbar den Beginn der Sepsis-Morbidität innerhalb von 1 Tag, gefolgt von einer fortschreitenden Mortalität, die zu einer 100% Letalität von 5-7 Tagen führte. Im Gegensatz dazu führen Inokula höher als 1 x 105 typischerweise zu beschleunigten Todesfällen (dh 1-2 Tage bei 1 x 106,3-4 Tage bei 5 x 105), und diejenigen unter 1 x 105 sind subletal. Im Einklang mit zahlreichen Berichten in der Literatur führt die Verwendung vonnicht-albicans Candida-Arten anstelle von C. albicans zu einer signifikant verminderten Letalität40,49. Darüber hinaus kann die Wahl der Mausstämme oder sogar der Ursprung der Kolonien aufgrund unterschiedlicher Anfälligkeiten zwischen Mausstämmen einen erheblichen Einfluss auf die Infektionsergebnisse haben, wie von anderenberichtet 39,40,41,50,51,52,53,54,55. Daher sollte beides bei der Gestaltung von Experimenten berücksichtigt werden.

Nach einer tödlichen i.v.-Herausforderung breiten sich Pilzzellen schnell durch den Blutkreislauf aus und beginnen, in mehrere Organe einzudringen, von denen die Nieren am stärksten betroffen sind41. Andere betroffene Organe sind Gehirn, Milz und Knochenmark48,56. Unabhängig davon ist akute Sepsis die ultimative Todesursache zu den frühen Zeitpunkten37. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, kann der Schweregrad der Sepsis quantitativ durch den Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis (M-CASS) basierend auf den gezeigten Anzeichen einer Sepsiserkrankung bei herausgeforderten Tieren beurteilt werden43,57. Unter den verschiedenen Surrogatmarkern der tödlichen Sepsis wurde Hypothermie als kritischer Prädiktor für den bevorstehenden Tod sowohl bei klinischer als auch bei experimenteller Sepsisvorgeschlagen 43,58,59.

Obwohl in diesem Modell keine formalen Studien durchgeführt wurden, um Inzucht- und Outzuchtmäuse direkt zu vergleichen, sind die Daten aus dem aktuellen Protokoll mit ausgezüchteten Schweizer Webster-Mäusen trotz der vermuteten genetischen Heterogenität in verschiedenen Sepsisparametern ausserordentlich reproduzierbar. Im Allgemeinen ist ein Mortalitätsmuster, das innerhalb von 3-5 Tagen fällt, ein festes Modell der akuten Sepsis, wie durch eine schnelle Erhöhung der Sepsis-Morbidität und der Entzündungsmarker innerhalb von Stunden nach der postletalen Herausforderungbelegt wird 50,51. Bei längeren Überlebenszeiten (7-10 Tage) ist die Mortalität wahrscheinlich das Ergebnis einer mikrobiellen Belastung, die zu tödlichen Gewebeschäden in den Zielorganen und im zentralen Nervensystem führt. Die Wahl der Sepsis oder mikrobiellen Belastung kann je nach Bedarf zur Bewertung von Immunfunktionen oder Reaktionen auf entzündungshemmende Therapien oder antimykotische Therapien/ Impfstoffe angewendet werden, wie durch das verwendete Inokum bestimmt.

Zusätzlich zum i.v. lethal challenge-Modell kann eine intraabdominale Infektion mit C. albicans bei Mäusen über eine i.p. Challenge auch zu disseminiertem Candidiasis und anschließender Sepsis führen, obwohl die Koimpfung mit dem bakteriellen Erreger Staphylococcus aureus die Mortalität im Vergleich zur Monoinfektion von C. albicans synergistisch erhöht51,60,61. Im i.p. lethal challenge-Modell sind wesentlich höhere mikrobielle Inokula (1,75 x 107C. albicans/8 x 107S. aureus pro Maus) erforderlich, um eine polymikrobielle Peritonitis und Ausbreitung der Organismen aus der Bauchhöhle in den Blutkreislauf zu verursachen. In ähnlicher Weise führt eine gastrointestinale Infektion mit C. albicans bei Mäusen, die mit immunsuppressiven und/oder schleimhautschädigenden Mitteln behandelt werden, zur Translokation der Pilzzellen in den Blutkreislauf und führt zu einer Pilzselixsis62,63. Trotz der ausgeprägten Impfwege ist der Mechanismus der anschließenden Pilzsezinsis weitgehend analog zwischen den drei Krankheitsmodellen, die eine unkontrollierte systemische entzündungsfördernde Reaktion auf Candida beinhalten, die zu Organversagen führt37,51,61. In ähnlicher Weise ist es beim Menschen dieser Prozess der Wirtsreaktion, nicht einfach Candidämie, der die hohe Morbidität / Mortalität verursacht, die mit hämatogen disseminierter Candidiasis verbundenist,die in Gesundheitseinrichtungen erworben wurde64,65.

Anhand des aktuellen Pilzsepsemodells zeigen wir hier, dass der Schutz vor einer tödlichen C. albicans-Infektion durch i.v. Vorimmunisierung/Impfung mit C. dubliniensis (avirulent) oder abgeschwächten C. albicans-Mutanten erreicht werden kann, die mit einer signifikanten Verringerung der Sepsis-Morbidität einhergehen. Der Schutz wird durch angeborene Gr-1+ myeloische Suppressorzellen vermittelt, die im Knochenmark als eine Form der trainierten angeborenen Immunität induziert zu werden scheinen66,67. Es gibt Bestrebungen, das Verständnis dieser neuartigen Form des angeborenen immunvermittelten Schutzes gegen C. albicans-Blutbahninfektionen zu erweitern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das innovative Nagetiererwärmungs- / Rückhaltegerät entscheidend dazu beigetragen hat, unsere Fähigkeit zu verbessern, i.v. Injektionen von groß angelegten Mehrgruppen-Tierversuchen effizient und effektiv durchzuführen. Daher haben wir den Begriff Mouse a Minute für das Gerät geprägt. Die Gerätespezifikationen sind beim entsprechenden Autor auf Anfrage für die Beschaffung eines ähnlichen Geräts erhältlich. Die hier demonstrierten Techniken könnten als nützliches Werkzeug in Nagetiermodellen dienen, die Schwanzveneninjektionen in einem breiten Spektrum von Forschungsbereichen verwenden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der LSUHSC Foundation (PLF) und teilweise von U54 GM104940 vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unterstützt, das das Louisiana Clinical and Translational Science Center finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors

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Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).

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