Summary
التصوير في الجسم الحي هو أداة قوية لدراسة علم الأحياء في الصحة والمرض. يصف هذا البروتوكول التصوير عبر الحدقتين لشبكية الفأر باستخدام مجهر قياسي ثنائي الفوتون. كما أنه يوضح اختلافا في طرق التصوير الحي لتسمية مجموعات خلوية متعددة من شبكية العين.
Abstract
تقوم شبكية العين بتحويل الإشارات الضوئية من البيئة إلى إشارات كهربائية تنتشر إلى الدماغ. أمراض الشبكية منتشرة وتسبب ضعف البصر والعمى. إن فهم كيفية تقدم هذه الأمراض أمر بالغ الأهمية لصياغة علاجات جديدة. يعد الفحص المجهري في الجسم الحي في النماذج الحيوانية للمرض أداة قوية لفهم التنكس العصبي وقد أدى إلى تقدم مهم نحو علاج الحالات التي تتراوح من مرض الزهايمر إلى السكتة الدماغية. بالنظر إلى أن شبكية العين هي بنية الجهاز العصبي المركزي الوحيدة التي يمكن الوصول إليها بطبيعتها عن طريق الأساليب البصرية ، فإنها تفسح المجال بشكل طبيعي للتصوير في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن البصريات الأصلية للعدسة والقرنية تمثل بعض التحديات للوصول الفعال إلى التصوير.
يحدد هذا البروتوكول طرق التصوير في الجسم الحي ثنائي الفوتون للمجموعات والهياكل الخلوية في شبكية العين في شبكية الفأر بدقة خلوية ، والتي تنطبق على كل من تجارب التصوير الحادة والمزمنة. يقدم أمثلة على خلايا العقدة الشبكية (RGC) ، وخلية amacrine ، والتصوير الدبقي الصغير ، والأوعية الدموية باستخدام مجموعة من تقنيات وضع العلامات بما في ذلك ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) ، والفئران المعدلة وراثيا ، والأصباغ غير العضوية. الأهم من ذلك ، أن هذه التقنيات تمتد إلى جميع أنواع خلايا شبكية العين ، ويتم وصف الطرق المقترحة للوصول إلى المجموعات الخلوية الأخرى ذات الأهمية. كما تم تفصيل أمثلة على استراتيجيات المعالجة اللاحقة للصور اليدوية للعرض والقياس الكمي. هذه التقنيات قابلة للتطبيق مباشرة على دراسات وظيفة الشبكية في الصحة والمرض.
Introduction
يتطلب التصور في الجسم الحي للجهاز العصبي المركزي عموما إجراءات غازية مثل ترقق الجمجمة وتركيب النوافذ الزجاجية أو عدسات الترحيل البصرية. شبكية العين هي الهيكل الوحيد في الجهاز العصبي الذي يمكن ملاحظته مباشرة دون الحاجة إلى التحضير الغازي لأنه يتلقى الضوء من البيئة أصلا. سهولة الوصول البصري إلى شبكية العين تجعلها نظاما نموذجيا جذابا لدراسة الجهاز العصبي المركزي.
تم استخدام التصوير الفلوري الحي لشبكية العين في الفئران لتتبع وفاة RGC في نماذج الجلوكوما 1،2 ، وإصابة العصب البصري1،3،4 ، والسكتة الدماغية5 ، بالإضافة إلى التغيرات في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة6،7،8 والأوعية الدموية9 في الظروف التنكسية. يمكن أيضا استخدام الإشارات الجوهرية لتصور المستقبلات الضوئية 10،11،12 والخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين 13. تستخدم العديد من طرق التصوير في الجسم الحي لشبكية العين إما أجهزة عالية التخصص مصممة خصيصا لأغراض طب العيون6 أو أنظمة بصرية معدلة للغاية لتصحيح الانحرافات الأصلية للقرنية والعدسة8،9،11،12،13،14.
يوضح البروتوكول الحالي نهجا للتصوير الحي للإشارات الفلورية في شبكية العين بدقة خلوية ، باستخدام طريقة أساسية للتصحيح الجزئي للبصريات الأمامية لعين الفأر. تتطلب هذه الاستراتيجية تعديلات طفيفة جدا على إعدادات المجهر متعدد الفوتونات التي تستخدم عادة للتصوير في الجسم الحي للدماغ. نظرا لأن هذا النهج سهل الإعداد ، والفئران تحت ضغط قليل ، فإنه يساعد على إجراء تجارب الفاصل الزمني على كل من الفترات الحادة والمزمنة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإجراءات الجينية والعضوية القائمة على الصبغة التي تصنف مكونات الشبكية الفردية ، بما في ذلك RGCs وخلايا amacrine والخلايا الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية ، متوافقة مع تقنية التصوير هذه وتمكن من المراقبة في الجسم الحي لأنواع الخلايا والهياكل الحيوية لوظيفة الشبكية. يمكن تكييف هذه الأدوات لتسمية معظم أنواع الخلايا العصبية الأخرى وكذلك المكونات الدبقية والأوعية الدموية في شبكية العين.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ الإجراء التالي وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة واشنطن في سانت لويس. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف والمعدات والحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة.
1. حقن الفيروسات المرتبطة بالغدة
ملاحظة: يمكن وضع علامات على خلايا معينة في شبكية العين في خطوط الماوس المعدلة وراثيا Cre مع أنماط تعبير مقيدة. يصف هذا القسم التوصيل داخل الجسم الزجاجي لنواقل AAV التي تشفر التعبير المعتمد على Cre لبروتين الفلورسنت ، وبالتالي تسمية خلايا شبكية معينة. حقن الفئران (الذكور والإناث) ، بدءا من 4 أسابيع من العمر.
- تحضير إبرة الماصة الدقيقة
- استخدم مجتذب micropipette لإنشاء إبرة شعرية زجاجية من البورسليكات. قم بتحميل شعيرات زجاجية في مجتذب الماصة الدقيقة وقم بإجراء اختبار المنحدر ، وتسجيل القيمة الناتجة. تخلص من الشعيرات الدموية الزجاجية المستخدمة في اختبار المنحدر.
- اسحب الماصات الدقيقة بالإعدادات التالية: الحرارة: قيمة اختبار المنحدر ناقص 10 ؛ سحب: 55 ؛ السرعة: 65 ؛ الوقت: 120; ضغط الهواء: 500 ؛ وقت الهواء في بداية السحب: 20.
ملاحظة قد يلزم ضبط الإعدادات لساحبات مختلفة. - تحت مجهر التشريح ، استخدم شفرة حلاقة لقطع طرف الماصة الدقيقة المسحوبة في الموقع الذي ينحرف فيه الطرف الزجاجي قليلا تحت القوة ، ~ 10 مم من نهاية القسم المدبب. قطع بزاوية حادة بحيث ينتج عن القطع طرف مشطوف. تجاهل نصائح حادة.
- تحضير حقنة الحقن
- قم بتركيب ماصة زجاجية مقطوعة في قطعة 2 سم من الأنابيب البلاستيكية أسيتات إيثيل فينيل (EVA) (القطر الداخلي 0.05 بوصة ، القطر الخارجي 0.09 بوصة). قم بتوصيل الطرف الآخر من جزء الأنبوب هذا بطول 20 سم من أنابيب EVA (القطر الداخلي 0.02 بوصة ، القطر الخارجي 0.06 بوصة).
- قم بتوصيل الأنبوب بحقنة زجاجية سعة 50 ميكرولتر بإبرة مثبتة بوزن 22 جم. قم بإزالة المكبس من المحقنة الزجاجية وردم المحقنة والأنابيب المتصلة بالزيت المعدني باستخدام إبرة حقنة 25 جرام. اترك مساحة هوائية 4 مم عند طرف الماصة الدقيقة.
- الحقن داخل الجسم الزجاجي من AAV
- إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي بتقنية معقمة قياسية ، باستخدام قفازات جراحية معقمة ، ومعطف مختبر نظيف ، وقناع ، وحقل معقم ، وأدوات معقمة وفقا للبروتوكولات المؤسسية لجراحة البقاء على قيد الحياة.
- قم بإزالة حصص ناقل AAV من التخزين عند -80 درجة مئوية وقم بإذابة الجليد. بعد الذوبان ، جهاز طرد مركزي لمدة 10 ثوان عند 2000 × جم لإزالة أي فقاعات هواء.
- اتبع إرشادات التخدير والمواد الخاضعة للرقابة للجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية. باستخدام إبرة تحت الجلد بوزن 30 غ، يتم حقن كوكتيل الكيتامين/الزيلازين بوزن جسم الجسم 0.1 مل/10 غ (10 ملغ/مل من الكيتامين، 1 ملغ/مل من الزيلازين في محلول ملحي، جرعة فعالة للفأر: 100 ملغ/كغ من الكيتامين، 10 ملغ/كغ من الزيلازين). أعد الماوس إلى قفصه واترك 5 دقائق حتى يصبح التخدير ساري المفعول.
- باستخدام إبرة تحت الجلد 30 جم ، قم بإجراء حقن تحت الجلد 0.1 مل / 10 جم من ميلوكسيكام (0.5 مجم / مل في 0.9٪ كلوريد الصوديوم).
- اختبر عمق التخدير عن طريق التأكد من فقدان منعكس القرنية ومنعكس الانسحاب إلى قرصة الذيل وإصبع القدم. إذا استمر منعكس القرنية بعد فقدان منعكس انسحاب الذيل وإصبع القدم ، ضع قطرة من محلول بروباراكايين بنسبة 0.5٪ على كل عين وانتظر لمدة 10 ثوان.
- ضع الماوس على جانبه تحت المجهر المجسم. استخدم مشبك مرقئ البلدغ الصغير للاستيلاء على الجلد أعلى وأدنى من المدار ، وتأمين المشبك في القنب الإنسي لإزاحة الكرة الأرضية جزئيا خارج المدار.
- ثقب الصلبة الجانبية مع micropipette قطع متصلة حقنة الزجاج ، ~ 1-2 مم الخلفي إلى limbus. تجنب إزعاج الأوعية الدموية التي تمتد بشكل محيطي مباشرة إلى الخلف إلى الطرف. قم بإجراء البزل بزاوية عمودية على الصلبة ، واسحب الماصة الدقيقة قليلا فور ثقب الصلبة لتجنب إتلاف العدسة.
- استخدم مكبس المحقنة الزجاجية لسحب 1-2 ميكرولتر من الفكاهة الزجاجية ، المقابلة تقريبا لحجم السائل المخصص للحقن. سحب micropipette من العين ، وإخراج الفكاهة الزجاجية إزالتها.
- املأ طرف الماصة الدقيقة ب 1-2 ميكرولتر من AAV ، تاركا ~ 4 مم من مساحة الهواء بين الناقل الفيروسي والزيت المعدني لتجنب الاختلاط. أدخل الماصة الدقيقة في الفتحة الموجودة في الصلبة الناتجة عن البزل الأول ، واضغط ببطء على مكبس المحقنة الزجاجية لحقن الناقل الفيروسي على مدار 20-30 ثانية. تصور مستوى السائل من الناقل الفيروسي في طرف micropipette ، والحرص على التوقف عن الحقن قبل دخول أي هواء إلى العين.
- امسك الماصة الدقيقة في نفس الموضع لمدة 10 ثوان ، ثم اسحب الماصة الدقيقة. إزالة المشبك مرقئ البلدغ.
- ضع مرهم أوكسي تتراسيكلين / بوليميكسين ب للمضادات الحيوية على العين المحقونة. ضع الماوس على وسادة التدفئة ، وراقب تعافيه من التخدير (انظر 3.4.3).
- أعد الماوس إلى مسكنه ، وقم بإجراء رعاية ما بعد الجراحة وفقا للإرشادات المؤسسية. اترك 2-3 أسابيع للتعبير بوساطة فيروسية عن الفلوروفورات قبل التصوير.
2. إعداد المجهر
ملاحظة: يظهر رسم تخطيطي لمسار ضوء المجهر في الشكل 1.
- المعدات "التي تعمل دائما": يجب أن تظل هذه الأدوات قيد التشغيل دائما ما لم تخضع للتعديل أو الصيانة. اضبط درجة الحرارة العالية لنظام التبريد بالليزر على 20.0 درجة مئوية. قم بتشغيل الطاقة الرئيسية إلى ليزر Ti: Sapphire فائق السرعة ، وإتاحة الوقت لإكمال عمليات بدء تشغيل النظام ، وتحويل مفتاح "تمكين الليزر" إلى وضع "التشغيل".
- تكوين مسار ضوء الانبعاث
- قم بتكوين مسار جمع الانبعاثات الفلورية لعينة الأطوال الموجية باستخدام مجموعات مرشحات ثنائية اللون وتمرير النطاق المناسبة للفلوروفورات ذات الاهتمام.
ملاحظة: في هذه المخطوطة ، استخدم تصوير Twitch2b مكعب مرشح يتكون من 505 أزواج من أزواج مرشح تمرير ثنائي اللون للتمرير الطويل و 480/40 و 535/30. تم تصوير GFP باستخدام مكعب مرشح أحمر / أخضر يتكون من مرشح تمرير طويل 560 مع مرشحات تمرير النطاق 525/50 و 605/70. تم تصوير إيفانز بلو باستخدام مرشح تمرير قصير 560. يؤدي تغيير مرشحات الانبعاثات إلى تعريض مسار ضوء الانبعاث لضوء الغرفة الشارد الذي يمكن أن يتلف أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs). تأكد من إيقاف تشغيل PMTs ، وإطفاء أضواء الغرفة قبل تعديل مسار ضوء المجموعة لأن التعرض للضوء يمكن أن يؤثر سلبا على وظيفة PMT.
- قم بتكوين مسار جمع الانبعاثات الفلورية لعينة الأطوال الموجية باستخدام مجموعات مرشحات ثنائية اللون وتمرير النطاق المناسبة للفلوروفورات ذات الاهتمام.
- بدء الحصول على الصور
ملاحظة: التعرض المباشر لليزر ثنائي الفوتون أمر خطير ، خاصة على العين لأن الضوء الأحمر البعيد لن يحفز استجابة وميض. يجب توخي الحذر المناسب لضمان إغلاق الليزر على طول مسار الضوء ، ووجود خزائن من الفشل لحماية المستخدم من التعرض عبر قطع العين أو الانبعاثات من هدف المجهر. يجب أن يفهم المستخدمون الظروف التي ينبعث منها الليزر من الهدف ، واتخاذ الاحتياطات المناسبة لعدم تعريض أنفسهم لمثل هذه المخاطر.- قم بتشغيل جهاز الحصول على البيانات والكمبيوتر وخلية Pockels والمجهر ووحدة التحكم في المرحلة ووحدة التحكم في الغالق الميكانيكية والطاقة الرئيسية PMT. احتفظ ب PMTs في حالة "معطل" حتى تصبح جاهزة للحصول على الصورة ومحمية من الضوء الضال. افتح واجهة التحكم بالليزر على الكمبيوتر وبرنامج الحصول على الصور. قم بتشغيل الليزر من واجهة الكمبيوتر وتأكد من قفل الوضع.
- اضبط الطول الموجي لليزر المطلوب. تأكد من دخول ضوء الليزر إلى خلية Pockels عن طريق فتح مصراع الليزر ، واترك 30 دقيقة حتى تستقر طاقة الليزر.
- قياس طاقة الليزر عند الهدف وتحديد الحد الأقصى لنسبة الليزر
ملاحظة: ينبعث إشعاع الليزر من العدسة الموضوعية أثناء قياس الطاقة. أغلق ستارة حاوية المجهر ، وارتد واقيا مناسبا للعين قبل تمكين مصراع التصوير. قم بقياس طاقة الليزر في وقت التثبيت الأولي للنظام لإنشاء منحنى خرج الطاقة لكل طول موجي مهم وشهريا بعد ذلك للتحقق من استقرار قوة الإثارة.- قم بتشغيل مقياس الطاقة الضوئية ، وحدد الطول الموجي للقياس المقابل لطول موجة الليزر. ضع كاشف عداد الطاقة الضوئية على مرحلة المجهر وقم بمناورة مباشرة تحت العدسة الموضوعية في أبعاد X-Y. باستخدام محرك التركيز البؤري الميكانيكي Z-dimension ، قم بخفض العدسة الشيئية حتى يصبح كاشف عداد الطاقة ~ 1 مم أسفل العدسة الشيئية.
- قم بالتبديل من إضاءة epifluorescence إلى الليزر كمسار ضوء إثارة المجهر. قم بتمكين الغالق الميكانيكي.
- في برنامج الحصول على الصور ، ابدأ مسحا ضوئيا لفتح غالق التصوير ، وأرسل الليزر إلى مقياس الطاقة الضوئية. اضبط طاقة الليزر على 100٪ في برنامج المسح الضوئي. قم بتحسين مواضع X-Y و Z لكاشف عداد الطاقة حتى يتم تحقيق أعلى قياس لطاقة الليزر.
- قم بقياس طاقة الليزر عند الهدف من 0.1٪ إلى 100٪ على خلية Pockels ، مع أخذ القياسات على فترات 10٪. سجل النسبة المئوية لخلية Pockels المقابلة ل 45 ميجاوات من الطاقة عند الهدف. قم بتعيين هذه النسبة المئوية كأقصى طاقة ليزر في برنامج الحصول على الصور.
ملاحظة: أعلى طاقة لوحظت لتصوير شبكية العين في الجسم الحي دون تلف مرئي للأنسجة المستهدفة كانت 45 ميغاواط ، كما تم فحصها من خلال التلوين النسيجي بعد أسبوعين من التصوير. يتضح تلف الشبكية الواضح بعد التصوير بقدرة 55 ميجاوات عند الهدف. - قم بتعطيل غالق التصوير وأعد مسار ضوء الإثارة إلى التألق.
3. إعداد الماوس للحصول على الصور
- فأر التخدير للتصوير
ملاحظة: تأكد من كسح غاز النفايات المناسب للتخفيف من التعرض للأيزوفلوران. تأكد من توصيل منفذ العادم في غرفة تحريض التخدير بعلبة فلتر غاز الكسح السلبي ، وأن مخرج قطعة أنف تخدير الفأر متصل بعلبة مرشح غاز كاسح نشطة مع فراغ يوفره جهاز إخلاء الغاز. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لمراقبة وزن علبة المرشح للاستبدال.- تخدير الفأر باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3.3. بدلا من ذلك ، حث التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران إذا كنت تستخدم أيضا إيزوفلوران للحفاظ على التخدير (جلسة التصوير > 30 دقيقة). اضبط جهاز تخدير الحيوانات الصغيرة لملء غرفة الحث ب 5٪ إيزوفلوران ممزوج بهواء الغرفة بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة. ضع الماوس في غرفة الحث ، واترك 15 ثانية حتى يتم تخدير الفأر.
- قم بتبديل مبخر الأيزوفلوران إلى 0٪ ، وقم بتوجيه تدفق التخدير إلى قطعة الأنف. قم بإجراء 5 ثوان "O2 flush" لغرفة الحث. أخرج الماوس من غرفة الحث ، وقم بتثبيته في حامل الرأس (انظر القسم 3.3) ، مع إرفاق قطعة الأنف.
- استخدم مزيجا من 1٪ إيزوفلوران مع هواء الغرفة بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة للحفاظ على التخدير. مراقبة معدل التنفس على فترات 5 دقائق طوال التخدير ، وضبط نسبة إيزوفلوران للحفاظ على معدل التنفس ~ 60 نفسا / دقيقة.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذه الإعدادات (٪ إيزوفلوران ، معدل التدفق) للحفاظ على التخدير الناجم عن كوكتيل الكيتامين / الزيلازين.
- اتساع حدقة العين
- تحضير محلول 1٪ وزن / فولت الأتروبين و 2.5٪ وزن / فولت فينيليفرين هيدروكلوريد في الماء. قم بتخزين محلول الموسع في درجة حرارة الغرفة محميا من الضوء.
- باستخدام قطارة عين ماصة يمكن التخلص منها ، ضع قطرة من محلول الموسع على كل عين سيتم تصويرها. أطفئ أضواء الغرفة ، وانتظر 5 دقائق حتى يتمدد التلميذ. عندما يتم توسيع حدقة العين، امسح المحلول الموسع بأنسجة خالية من النسالة.
ملاحظة: تأكد من عدم دخول محلول الموسع إلى فتحتي الأنف. - ضع قطرة كبيرة من جل العين المزلق على كل عين سيتم تصويرها. إذا كان سيتم تصوير كلتا العينين ، ضع قطعة صغيرة من فيلم التشبث البلاستيكي على جل العين على العين غير المصورة لمنع الجفاف. في حالة تصوير عين واحدة فقط ، ضع مرهم العين المزلق على العين التي لن يتم تصويرها.
- تحديد موضع الماوس للتصوير
- لتثبيت الماوس في حامل رأس التصوير، قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يتم إمالة قضيب سماعة الأذن بزاوية 60 درجة أو أكثر تحت الوضع الأفقي. ثبت دبوس قناة الأذن السفلية في الوضع الممتد للداخل ودبوس قناة الأذن العلوي في الوضع المسحوب.
- مع مواجهة الماوس لقضيب العض ، قم بتركيب أذن واحدة على الدبوس السفلي الممتد ، وأدخل الدبوس في قناة الأذن. قم بفك المسمار اللولبي الذي يثبت دبوس قناة الأذن العلوي ، وقم بتمديد الدبوس إلى قناة الأذن الأخرى. أحكم ربط المسمار لتأمين الرأس.
- حرك شريط العض باتجاه رأس الماوس. ارفع رأس الماوس برفق ، ثم اخفض قواطع الفك العلوي للماوس في فتحة شريط اللدغة. اسحب قضيب العض بقوة لطيفة لتأمين رأس الماوس ، وقم بتأمين موضع شريط العض عن طريق شد المسمار.
- في حالة استخدام إيزوفلوران ، حرك قطعة الأنف من خلال فتحتها على شريط العضة قبل تأمين قواطع الماوس. قم بتأمين وشد موضع قضيب العض كما في الخطوة 3.3.3. شد قطعة الأنف باستخدام المسمارين الموجودين على وجهها العلوي حتى تتناسب بشكل مريح مع أنف الماوس ، ولكن لا تضيق الخطم.
- انقل الماوس ، في حامل الرأس ، إلى مرحلة المجهر أسفل الهدف. قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يتم توجيه بؤبؤ العين بشكل مستقيم لأعلى ، بما يتماشى مع مسار الضوء (الشكل 2).
- ضع غطاء #1.5 في حامل المرشح المضغوط ، وقم بتوصيل الحامل بمرحلة المجهر. اخفض الغطاء باتجاه العين ، ملامسا جل العين المزلق ، بحيث تقع زلة الغطاء أفقيا فوق القرنية مباشرة (الشكل 2). تأكد من أن الغطاء لا يلمس القرنية.
ملاحظة: على المجهر ، تأكد من ضبط مسار ضوء الإثارة على التألق وضبط مسار ضوء الانبعاث على العدسة. قم بتشغيل مصباح التألق بأقل طاقة له وافتح غالق الإضاءة. اختر الطول الموجي لمصباح التألق ومرشح التألق المقابل للفلوروفور الذي يتم تصويره. - قم بمناورة المسرح في أبعاد X-Y والهدف في الوضع Z باستخدام التحكم في المرحلة ومحرك التركيز البؤري الميكانيكي حتى يغطي ضوء الإثارة واسع المجال القرنية بالكامل. بالنظر من خلال العدسة ، استمر في ضبط موضع Z للمرحلة حتى يتم التركيز على الخلايا أو الهياكل الفلورية في شبكية العين. زيادة قوة إضاءة التألق إذا كانت إشارة العينة غير ساطعة بما يكفي لحل الخلايا الفردية أو الهياكل ذات الأهمية من خلال العدسة.
ملاحظة: إذا واجهت مشكلة في تحديد موقع الشبكية ، فإن القزحية هي معلم عالي التباين يجب تثبيته عليه ثم التركيز لأسفل نحو الشبكية. ستسمح هذه الخطوة أيضا بالتحقق من توسع التلميذ إلى أقصى حد. - احصل على منطقة تصوير على المحور باستخدام عدسة الماوس. اضبط زاوية الماوس باستخدام درجات مختلفة من الحرية على حامل الرأس حتى يحدث تمدد أو انكماش للضوء خارج نطاق التركيز البؤري فقط عند ضبط المستوى البؤري. قم بإيقاف تشغيل مصباح التألق وأغلق غالق الإضاءة.
ملاحظة: يشير اختلاف المنظر X-Y الكبير للضوء خارج نطاق التركيز أثناء التمرير عبر المستويات البؤرية ذات الاتجاه Z إلى أن شبكية العين ليست على محور فيما يتعلق بمسار ضوء التصوير.
4. الحصول على صورة ثنائية الفوتون
- معلمات إعداد الصورة والحصول عليها
ملاحظة: أطفئ أضواء الغرفة وقم بتغطية مصادر الإضاءة الشاردة في الغرفة. تأكد من إيقاف تشغيل مصباح التألق وإغلاق غالق الإضاءة.- قم بتبديل مسار ضوء الإثارة إلى مسار ضوء الليزر والانبعاث إلى PMTs.
- في برنامج الحصول على الصور ، قم بتعيين حجم إطار 512 × 512 ومتوسط إطار 3. اضبط الخطوات لكل شريحة على -8 ميكرومتر. قم بتعيين خطوة z للبدء من أعلى المكدس والتقدم لأسفل ، مما يقلل من تنشيط ليزر الفوتونين للمستقبلات الضوئية.
ملاحظة: يمكن تقليل حجم الخطوة لزيادة دقة Z بتكلفة زيادة وقت التصوير ، ولكن خطوات 8 ميكرومتر كافية لحل سوماتا الخلية في تكوين التصوير هذا. - قم بتشغيل وتمكين PMTs. اضبط جهد PMT على 680 فولت. قم بتمكين مصراع الإثارة.
ملاحظة: PMTs التي تعمل بالطاقة عرضة للتلف الخفيف. تأكد من إيقاف تشغيل مصباح epifluorescence ، وسحب ستارة حاوية المجهر ، وإطفاء أضواء الغرفة. - ابدأ معاينة حية للصورة للنسيج المستهدف ، بدءا من طاقة الليزر بنسبة 1٪. ضبط سطوع الشاشة تلقائيا لتصور الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام. ضبط مرحلة المسح تلقائيا. إذا كانت الأنسجة المستهدفة معتمة أو غير واضحة ، فقم بزيادة نسبة طاقة الليزر حتى تصبح الهياكل مرئية دون تجاوز الحد المحدد في الخطوة 2.4.4 المقابلة ل 45 ميجاوات.
ملاحظة: بالنسبة للصورة ذات 16 بت ، تشير قيمة العرض ~ 1000 عند ضبط السطوع تلقائيا في مستوى Z يحتوي على هياكل ذات أهمية إلى سطوع كاف للعينة. - قم بمناورة مرحلة المجهر في اتجاه X-Y للتركيز على منطقة التصوير المطلوبة ، ثم انتقل إلى المستوى Z مع التركيز على الهياكل ذات الاهتمام.
ملاحظة: يسمح التصوير المجاور لرأس العصب البصري بأن يكون بمثابة معلم لا لبس فيه لتجارب التصوير المزمن. - إذا كانت هذه تجربة مزمنة بفاصل زمني ، فقم بفتح صورة سابقة على كمبيوتر الاستحواذ ، واستخدمها كمرجع للعثور على نفس مجال الاهتمام. تأكد من أن زاوية التصوير مماثلة لتلك الموجودة في الصور السابقة للحصول على نفس مجموعة الخلايا مع الحد الأدنى من اختلاف المنظر.
ملاحظة: من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل لموضع رأس الماوس لتصوير نفس الخلايا كما في النقاط الزمنية السابقة (الشكل 3). - قم بتعيين حدود Z لمكدس التصوير بالانتقال إلى أعلى وأدنى مستويات Z ذات الأهمية ، والحصول على الصورة. عند الانتهاء من الحصول على الصورة ، قم بتعطيل PMTs ومصراع الانبعاثات. قم بتبديل مسار ضوء الانبعاث مرة أخرى إلى العدسة ، ومسار ضوء الإثارة إلى إضاءة epifluorescence. أخرج الماوس من مرحلة المجهر.
- إيقاف تشغيل برامج النظام والأجهزة
- اخرج من برنامج الحصول على الصور. قم بإيقاف تشغيل الليزر في واجهة الكمبيوتر. قم بإيقاف تشغيل الأجهزة بترتيب بدء التشغيل العكسي ، باستثناء المعدات "التي تعمل دائما".
- استعادة الماوس
- قم بإزالة حامل الرأس والماوس من مرحلة المجهر. إذا كان ذلك ممكنا ، اضبط مبخر الأيزوفلوران على 0٪. أخرج الماوس من حامل الرأس.
- امسح برفق جل العين المزلق بمنديل خال من النسالة ، وضع مرهم زيت تشحيم زيت البترول المعدني الأبيض على كلتا العينين. ضع الماوس على وسادة تسخين تدوير الماء الدافئ (مضبوطة على 37 درجة مئوية) ، واستمر في الاهتمام بالماوس ومراقبة معدل التنفس حتى يستيقظ الماوس ويستعيد قدرته على الإسعاف. أعد الماوس إلى غلافه.
- إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتقييم نشاط الحيوانات والمراضة في 24 ساعة بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي. عند الانتهاء من الدراسة ، يتم القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من ثلاثي برومو إيثانول (250 مجم / كجم) وإجراء التروية عبر القلب مع 4٪ بارافورمالدهيد للحفاظ على أنسجة الشبكية.
5. معالجة الصور وتحليلها
- إلغاء التشويش ودمج البيانات متعددة القنوات
- نظرا لأن بعض برامج الحصول على الصور تخزن صورا متعددة القنوات بتنسيق متداخل ، افتح ملف الصورة .tif باستخدام برنامج ، مثل Fiji (https://imagej.net/Fiji) ، لفصل القنوات.
- في قائمة الصور في فيجي، حدد مكدسات | أدوات | إزالة التداخل. أدخل عدد القنوات المكونة للصورة وانقر فوق موافق.
- لدمج القنوات المنفصلة في ملف واحد، انتقل إلى Image | اللون | دمج القنوات. ضع قنوات الصورة غير المتداخلة في قنوات لونية مستقلة، وانقر موافق لإنشاء الصورة المركبة متعددة القنوات. احفظ هذه الصورة المركبة كملف .tif جديد.
- القياس الكمي لشدة التألق في الصور متعددة القنوات
ملاحظة: يمكن قياس كثافة التألق داخل مناطق الاهتمام المحددة (ROIs) في مستويات أحادية الصورة باستخدام فيجي. يمكن تحقيق القياس الكمي لقراءات القياس النسبي عن طريق قياس شدة التألق في قنوات مختلفة لصورة مركبة ضمن نفس عائد الاستثمار. بالنسبة لتجارب التصوير المزمن ، من الأفضل استخدام أجهزة استشعار حيوية تعتمد على مخرجات الإثارة أو نسبة الانبعاثات.- في فيجي، انتقل إلى تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار. افتح الصورة المركبة في فيجي. قم بالتمرير إلى شريحة z المقابلة لبنية الاهتمام ، واستخدم أدوات التحديد (مثل تحديد المستطيل ، التحديد البيضاوي ، تحديد المضلع) لتحديد عائد الاستثمار.
- اضغط على T على لوحة المفاتيح لإضافة كل تحديد إلى مدير عائد الاستثمار. عند الانتهاء من اختيار عائد الاستثمار ، انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار لتسجيل بيانات مختلفة من عائد الاستثمار مثل قيمة المنطقة ومتوسط الكثافة.
- انسخ قياسات القناة المحددة حاليا والمسجلة في نافذة النتائج إلى جدول بيانات. قم بالتبديل إلى القناة التالية في نافذة الصورة المركبة وانقر فوق قياس للحصول على قياسات لتلك القناة ضمن نفس مجموعة عائد الاستثمار. ضمن مدير عائد الاستثمار، انتقل إلى المزيد | احفظ عائد الاستثمار واحفظه كملف .zip.
- إسقاطات الكثافة القصوى للعرض
- لإنشاء عروض لبيانات الصورة ، استخدم وظيفة Z-project في فيجي. في قائمة الصورة ، حدد مكدس | مشروع Z. اختر فقط الإطارات التي توجد فيها مناطق الاهتمام لتقليل الخلفية.
- إذا كانت إزالة ضوضاء لقطة PMT مطلوبة ، فاستخدم وظيفة مرشح المتوسط. في القائمة معالجة ، حدد معالجة | الفلاتر | الوسيط. اختر قيمة 1.0 للحفاظ على التفاصيل المكانية.
- لإنشاء إسقاطات ذات كثافة قصوى تركز على خلايا مفردة ، كرر هذه العملية باختيار إطارات الصور التي تتوافق مع الخلية محل الاهتمام فقط.
ملاحظة: هذا يمكن أن يحسن بشكل كبير القدرة على حل العرش الخلوية (الشكل 4). يجب إجراء قياسات شدة التألق في طائرات ذات صورة واحدة وليس على توقعات الكثافة القصوى.
Representative Results
يمكن استخدام العديد من الأساليب المعدلة وراثيا أو الفيروسية أو وسم الأصباغ غير العضوية لتصور العديد من أنواع وهياكل خلايا الشبكية في الجسم الحي على وجه التحديد باستخدام تكييف بسيط لمجهر أساسي متعدد الفوتونات. لتصور RGCs وخلايا amacrine ، تم إعطاء الفئران المعدلة وراثيا VGlut2-Cre و VGat-Cre ، على التوالي ، حقنة داخل الجسم الزجاجي لبناء تعبير AAV المعتمد على Cre الذي يشفر Twitch2b ، وهو مستشعر Ca 2+ القائم على نقل طاقة الرنين الفلوري السيتوبلازمي (FRET) والذي يحتوي على بروتينات فلورية سماوية وصفراء (CFP و YFP ، على التوالي) ومجال ربط Ca2+ للتروبونين15 . في فئران VGlut2-Cre ، يمكن تمييز RGC somas بوضوح ، وغالبا ما تكون حزم المحاور واضحة (الشكل 3).
تجدر الإشارة إلى أن مسار المحاور العصبية والصورة السلبية للأوعية الدموية تجعل من السهل جدا تحديد رأس العصب البصري في الفئران VGlut2-Cre ، وهو أمر مفيد كمعلم في تجارب التصوير المزمن (الشكل 3). على الرغم من أن خلايا الأمكرين تبدو أقل سطوعا من RGCs ، ربما بسبب حجمها الأصغر و / أو نقل AAV الأقل كفاءة ، إلا أن سوما لا تزال واضحة بسهولة في الطبقة النووية الداخلية. على عكس RGCs ، غالبا ما يتم ملاحظة الخلايا العصبية لخلايا amacrine في طبقات الضفيرة الداخلية (الشكل 4). يمكن تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين في خط الماوس المعدل وراثيا Cx3cr1-GFP6. ترتبط الخلايا الدبقية الصغيرة بالأوعية الدموية ، مما يجعل من الممكن العثور على نفس المنطقة في تجارب التصوير بفاصل زمني.
يمكن استخدام هذا النهج لتتبع ديناميكيات عمليات الخلايا الدبقية الصغيرة الدقيقة ، وهو إجراء له دقة مكانية أفضل في الصور أحادية المستوى ، أو إذا تم إعداد إسقاطات ذات كثافة قصوى تركز على الخلايا الفردية (الشكل 5). تمنع الدقة المحورية الضعيفة الناتجة عن الانحراف البصري من خلال عدسة الماوس فحص التفاصيل الدقيقة في البعد z. لتحديد ما إذا كانت تقنية التصوير هذه يمكنها ملاحظة التغيرات التنكسية في البنية الخلوية الفائقة ، تم حقن 1 ميكرولتر من 50 mM N-methyl-D-aspartate (NMDA) في الجسم الزجاجي للحث على الآفة السامة للإثارة. بعد يوم واحد من الحقن ، أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة عمليات قصيرة أو مورفولوجيا أميبويد (الشكل 5) وفقا للتقارير السابقة16. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا في الخط المعدل وراثيا Cx3cr1-GFP أظهرت تعبيرا أكثر اتساقا واكتمالا للبروتين الفلوري عبر الفوج الخلوي مقارنة بالتجارب مع التوصيل بوساطة AAV لأشرطة تعبير البروتين الفلوري. يجب مراعاة فوائد وضع العلامات المتنوعة والمتناثرة مقابل العلامات الكاملة والموحدة عند تصميم التجارب.
لتسمية الأوعية الدموية في شبكية العين كما هو موضح سابقا8 ، تم حقن الفئران داخل الصفاق مع 200 ميكرولتر من صبغة إيفانز الزرقاء (20 ملغ / مل في محلول ملحي معقمة) 30-60 دقيقة قبل التصوير. أدى ذلك إلى وضع علامات قوية على الأوعية الدموية المنبثقة من رأس العصب البصري (الشكل 6). والمثير للدهشة أن إشارة الفلورسنت لحقنة واحدة استمرت لمدة سبعة أيام على الأقل. تم استخدام طريقتين متميزتين لتقدير أبعاد الصور في الجسم الحي. أولا ، تم تصوير نفس مناطق الشبكية في الجسم الحي وبعد التثبيت في حوامل شبكية مسطحة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 7). تم اختيار أزواج الخلايا العشوائية من أربع عينات مختلفة في الجسم الحي ، وتم قياس المسافة الحقيقية بين أزواج الخلايا في عمليات مسح متحدة البؤر ومطابقتها مع مسافة بكسل في الجسم الحي للحصول على متوسط حجم بكسل يبلغ 0.99 ميكرومتر مع تكبير رقمي 1x. باستخدام طرق مماثلة تربط الصور في الجسم الحي مع المسح الكامل البؤري كشف أن وضع رأس واحد يسمح بالتصوير على ما يقرب من 650 مم2 رقعة من شبكية العين.
يمكن أن تسمح إعادة وضع حامل الرأس على طول محور التوائي واحد بالوصول إلى منطقة خطية من شبكية العين بطول 2.2 مم (غير معروض). علاوة على ذلك ، تم حقن كريات مجهرية فلورية بقطر 1 أو 2 ميكرومتر في عيون الفئران وتم قياس قطرها على أنه نصف عرض كامل لمسح الخط من الصور الحية مع تقريب رقمي 10x. أعطى هذا تقديرا أكبر قليلا لحجم البكسل ، ولكن مع مزيد من التباين (الشكل 7). بشكل عام ، يعد التصوير متحد البؤر للعينات الكاملة بعد الانتهاء من التجارب في الجسم الحي هو الطريقة الأكثر اتساقا لتعيين مقياس للصور الفردية ، حيث قد يؤدي التباين في خصائص القرنية والعدسة إلى تغيير مقياس الصورة من عينة إلى أخرى.
الشكل 1: مسار الضوء التخطيطي. تتكون المكونات الأساسية للمجهر ثنائي الفوتون المستخدم في هذا البروتوكول من خلية Pockels لتعديل طاقة الليزر ، وزوج عدسة لتقليل قطر شعاع الليزر لتتناسب مع الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، وزوج من مرايا مسح galvo لتوجيه الحزمة. يوجد زوج من مرايا التوجيه قبل كل مكون بصري رئيسي. يتم التحكم في التركيز بواسطة محرك يقود حامل الهدف. يمكن تخصيص مسار ضوء الانبعاث لفلوروفورات مختلفة عن طريق تغيير مرشحات ثنائية اللون والحاجز. يتم عرض إعداد عام للتصوير السماوي / الأصفر / الأحمر حيث تقوم مرآة ثنائية اللون قصيرة التمرير بتوجيه الضوء الأحمر إلى PMT الأول ، ويتم استخدام مرآة ثنائية اللون طويلة المدى مقترنة بمرشحات تمرير النطاق المناسبة لفصل الانبعاثات السماوية والصفراء. اختصار: PMT = أنبوب المضاعف الضوئي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: وضع الفئران للتصوير في الجسم الحي. لوضع الماوس مع التلميذ على المحور مع مسار الضوء ، يتم تقييد الماوس المخدر أولا في حامل الرأس ، ويتم تدوير الرأس والزاوية ، ويتم وضع قطرة كبيرة من هلام العين المزلق على العين ، ويتم وضع الماوس على المسرح. يتم تثبيت غطاء في حامل غطاء الغطاء بشكل عمودي على مسار الضوء ويتم إنزاله لأسفل باتجاه العين. يجب ألا تلامس قسيمة الغطاء القرنية أو رأس الماوس (يسار) ، وهو ما سيكون واضحا إذا انحرفت قسيمة الغطاء. ومع ذلك ، يجب أن تكون زلة الغطاء قريبة أيضا بما يكفي لتجنب خصر القطرة (يمين) ، لأن هذا سيكون له تأثير مكبرة على العينة. بعد تطبيق غمر الجل وتأمين الغطاء ، يجب تحريك المرحلة في مكانها مباشرة تحت هدف المجهر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تصوير خلايا العقدة الشبكية. لعرض الصور ، يتم إنشاء إسقاطات الكثافة القصوى مع المستويات z التي تحتوي على خلايا ذات أهمية ، ويتم تصفية الصور الناتجة بشكل متوسط لإزالة ضوضاء لقطة PMT. يتم عرض مثالين على خلايا العقدة الشبكية الموسومة عن طريق حقن AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b في الفئران المعدلة وراثيا VGlut2-Cre ، وتحديدا إشارة CFP. تم الحصول على الصور في جلسات تفصل بينها أربعة أيام ، وتم استخدام معالم الأوعية الدموية للعودة إلى نفس المنطقة بالقرب من رأس العصب البصري. يتم توجيه رأس العصب البصري نحو الجزء السفلي من الصورة. على الرغم من أن كلتا العينتين تظهران بعض التباين في الاتجاه (يشار إلى المناطق ذات الكثافة المنخفضة بالأسهم) ، إلا أن معظم الخلايا موجودة في كلتا النقطتين الزمنيتين. شريط المقياس = حوالي 50 ميكرومتر. الاختصارات: PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ AAV = الفيروس المرتبط بالغدي ؛ EF1α = عامل الاستطالة -1 ألفا ؛ فليكس = الوجه الختان. VGlut2 = ناقل الغلوتامات الحويصلي 2 ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تصوير خلايا الأمكرين. تم تصنيف خلايا Amacrine عن طريق حقن AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b في الفئران المعدلة وراثيا VGat-Cre. يتم عرض إشارة CFP الخاصة ب Twitch 2b على وجه التحديد. تشير الإسقاطات الصغيرة ذات الكثافة القصوى التي تركز على أعماق الطبقة النووية الداخلية إلى سوما خلية أماكرين ، بينما يؤدي التركيز على الضفيرة الداخلية إلى حل الخلايا العصبية لخلايا الأمكرين (السهم). يتم توجيه رأس العصب البصري نحو يمين الصورة. شريط المقياس = حوالي 50 ميكرومتر. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدي ؛ EF1α = عامل الاستطالة -1 ألفا ؛ فليكس = الوجه الختان. VGat = ناقل حمض غاما أمينوبوتيريك الحويصلي ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ IPL = طبقة الضفيرة الداخلية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة. تم استخدام خط الماوس المعدل وراثيا Cx3cr1-GFP لتسمية الخلايا الدبقية الصغيرة. يظهر الإسقاط الأقصى الكثافة لحجم المسح الكامل العديد من الخلايا الدبقية الصغيرة ، بعضها بتفاصيل عملية دقيقة يمكن حلها. لاحظ أن الخلايا باتجاه أسفل يسار الحقل لها تشوه أقل في الحد الأقصى للإسقاط من تلك الموجودة في أعلى اليمين بسبب اختلاف المنظر في هذه المنطقة. تقلل الإسقاطات ذات الكثافة القصوى التي تحتوي فقط على خلية الاهتمام بشكل كبير من اختلاف المنظر هذا (المركز ، محاصر بالألوان المقابلة). علاوة على ذلك ، يمكن لاستراتيجية التصوير هذه توثيق ديناميكيات إعادة تشكيل عملية الخلايا الدبقية الصغيرة الدقيقة (الألواح السفلية). نسبيا ، يمكن رؤية العديد من الخلايا الدبقية الصغيرة بعمليات قصيرة أو مورفولوجيا أميبويد بعد يوم واحد من آفة سامة للإثارة عن طريق الحقن داخل الجسم الزجاجي ل 50 mM NMDA (يمين). شريط المقياس = حوالي 50 ميكرومتر. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ Cx3cr1 = Cx3 مستقبلات كيموكين 1 ؛ NMDA = N-ميثيل-D-الأسبارتات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: وضع علامات على المعالم الوعائية. تم حقن الفئران ب 200 ميكرولتر من 20 مجم / مل من إيفانز الأزرق داخل الصفاق قبل 30-60 دقيقة من جلسة التصوير الأولى. تظهر الإسقاطات ذات الكثافة القصوى للسمك الكامل مضانا دائما في الأوعية الدموية في شبكية العين استمر لمدة سبعة أيام على الأقل. شريط المقياس = حوالي 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: أبعاد الصورة. تم تصوير خلايا العقدة الشبكية الموسومة عن طريق حقن AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b في الفئران المعدلة وراثيا VGlut2-Cre في الجسم الحي ، ثم تم تصوير نفس المنطقة بواسطة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر بعد التثبيت والتحضير الكامل للشبكية. تظهر قناة البروتين الفلوري الصفراء لكليهما. تشير أزواج الأسهم الملونة إلى نفس الخلية في كلا الإعدادين (الألواح العلوية). صورة أحادية المستوى لكرات مجهرية فلورية قطرها 2 ميكرومتر يتم حقنها داخل الجسم الزجاجي وتصويرها في الجسم الحي (اللوحة اليسرى السفلية). لم تستقر الكرات المجهرية وبالتالي كانت في حركة مستمرة مما يجعل قياس الدقة المحورية مستحيلا. تم حساب أحجام البكسل من قياسات نصف الحد الأقصى للعرض الكامل للكرات المجهرية الفلورية في الجسم الحي أو القياسات متحدة البؤر المترابطة المأخوذة من 2-4 شبكية لكل مجموعة (أسفل اليمين). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدي ؛ EF1α = عامل الاستطالة -1 ألفا ؛ فليكس = الوجه الختان. VGlut2 = ناقل الغلوتامات الحويصلي 2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: نشاط الكالسيوم الناجم عن المسح الضوئي بالفوتونين. خلايا العقدة الشبكية الموسومة عن طريق حقن AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b في الفئران المعدلة وراثيا VGlut2-Cre ، YFP هو أرجواني زائف اللون و CFP أخضر ، تم تصويره في مستوى واحد كسلسلة زمنية عند 4.22 هرتز. كان لجميع RGCs نسبة YFP / CFP مماثلة للبدء. استجاب معظمهم بزيادة في نسبة FRET (باستثناء الخلية البرتقالية) ، وحافظ أحدهم على نسبة YFP / CFP عالية طوال السلسلة الزمنية (الخلية الصفراء). تم تسوية نسب YFP / CFP إلى متوسط الإطار الأول ، وتتطابق الدوائر الملونة مع الآثار الملونة. تشير العلامات النجمية إلى النقاط الزمنية مع عرض الصور التمثيلية على اليسار. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدي ؛ EF1α = عامل الاستطالة -1 ألفا ؛ فليكس = الوجه الختان. VGlut2 = ناقل الغلوتامات الحويصلي 2 ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي ؛ RGCs = خلايا العقدة الشبكية ؛ الحنق = نقل طاقة الرنين الفلوري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
يتيح إجراء التصوير ثنائي الفوتون الموصوف هنا التصوير الطولي في الجسم الحي لشبكية الفأر. يمكن الحصول على صور قابلة للتكرار لنفس المنطقة من شبكية العين لفترة مستمرة تصل إلى 6 ساعات أو أكثر تحت إيزوفلوران. يمكن أيضا تصوير الماوس في أيام مختلفة باستخدام المعالم الخلوية والأوعية الدموية لتحديد موقع منطقة التصوير نفسها (الشكل 3). تم تطبيق استخدام غمر الجل الشفاف جنبا إلى جنب مع غطاء زجاجي لهذا الغرض سابقا على مجموعة من الإجراءات ، بما في ذلك تصور شبكية العين للحقن تحت الشبكية ، ونماذج إصابة الشبكية التي يسببها الليزر ، وتصوير قاع العين20،21،22.
يمثل تشريح العين تحديات فريدة للتصوير في الجسم الحي ، حيث أن القوة البصرية العالية لقرنية الفأر والعدسة تعيق التصوير المباشر على الرغم من التلميذ دون تصحيح. تعتمد العديد من طرق التصوير الأخرى في الجسم الحي على استخدام عدسة لاصقة مقعرة مستوية لتصحيح البصريات الأمامية لعين الفأر7،17،18،19. مع التصحيح البصري فقط في القرنية ، تؤدي القوة البصرية العالية لعدسة الماوس إلى كمية لا مفر منها من اختلاف المنظر ، خاصة الهياكل في مجال المسح المحيطي ، والتي تظهر على شكل تمدد وحركة متعدية في البعد X-Y في مستويات Z المختلفة. لتقليل التشوه المرتبط باختلاف منظر الصورة في أبعاد X و Y ، من الأهمية بمكان أن يتم توجيه عين الماوس بحيث يكون المستوى المماس لشبكية العين في منطقة التصوير عموديا على مسار ضوء المجهر. الإعداد الموصوف هنا يفضي إلى معالجة دقيقة لزاوية العين لتحقيق هذه المحاذاة. يسمح حامل رأس الماوس القابل للتعديل الذي يسمح بالدوران على طول محورين بإجراء تعديلات يدوية سهلة لزاوية العين حيث يقوم المجرب بالتمرير عبر البعد Z لتقليل اختلاف المنظر. يتحايل هذا الإمالة أيضا على تأثير توقف المجال للتلميذ للسماح بتصوير مناطق أكبر من شبكية العين. كما أن تقييد حامل الرأس يقلل بشكل كبير من القطع الأثرية للحركة الناتجة عن التنفس.
يجب توخي الحذر للحفاظ على وضوح عين الماوس ، حيث ستتدهور جودة الصورة مع التعتيم أثناء التصوير المستمر. تساعد إعادة الاستخدام المتكرر لجل التشحيم أثناء التصوير ، وتطبيق المرهم بعد كل جلسة تصوير على منع العين من الجفاف وتطور العتامة. بعض عتامة القرنية سوف تحل تلقائيا بعد 24-48 ساعة. يوفر استخدام الجل الشفاف وزجاج الغطاء كما هو موضح في هذا البروتوكول جودة صورة مماثلة وتصحيح انحراف مثل العدسات اللاصقة7 ، مع السماح بتعديلات أسهل لزاوية العين دون الحاجة إلى إعادة محاذاة زجاج الغطاء. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الجل ترطيبا مستمرا للعين ، مما يجعل من الممكن إجراء جلسات تصوير حادة تصل إلى عدة ساعات. أخيرا ، نظرا لأن غطاء الزجاج لا يلامس القرنية ، فإنه يسبب الحد الأدنى من تهيج العين الذي قد يقلل من الوضوح البصري لجلسات التصوير المتكررة.
أحد قيود هذا النهج هو حقيقة أن الانحرافات البصرية لا يتم تصحيحها بالكامل. في حين أن هذا يقلل بشدة من الدقة المحورية بسبب اختلاف المنظر الثقيل ، يمكن الحصول على قياسات كمية للسوما في طائرات ذات صورة واحدة. وتجدر الإشارة إلى أنه نظرا لأن شدة إشارة التألق للخلايا العصبية في شبكية العين تعتمد على محاذاة العينة بهذه الطريقة ، فإن أجهزة الاستشعار القائمة على نسبة الإثارة والانبعاث أكثر ملاءمة للتجارب التي تقارن العينات بشكل مزمن عبر جلسات التصوير المختلفة. نهج لتصحيح الانحرافات البصرية على مستوى النظام هو البصريات التكيفية ، والتي تسمح بالدقة تحت الخلوية في شبكية العين8،9،14،21. ومع ذلك ، تتطلب البصريات التكيفية معدات عالية التخصص وخبرة واسعة للتنفيذ.
الطرق البديلة لتصوير الفوتون الشبكي في الجسم الحي هي الفحص المجهري متحد البؤر أو تنظير العين6. يجب أن يكون النهج المقدم هنا قابلا للترجمة بسهولة إلى الفحص المجهري واسع المجال أو متحد البؤر. ربما يكون التصوير بالفوتون الواحد أكثر قوة ويشكل خطرا أقل لإتلاف شبكية العين بسبب الطاقة العالية لليزر ثنائي الفوتون اللازمة لتحقيق تأثير ثنائي الفوتون الفعال من خلال القرنية وعدسة العين. لتجنب تلف الليزر ثنائي الفوتون ، يجب تحديد عتبة طاقة الليزر القصوى تجريبيا عن طريق فحص شبكية العين الكاملة بعد الانتهاء من تجارب التصوير والتلوين المناعي لأنواع الخلايا في الطبقات المصورة. في النظام المعروض هنا ، تم تمييز RGCs بعلامة عموم RGC ، Rbpms ، وكانت الكثافات طبيعية تصل إلى 45 ميجاوات من طاقة التصوير ، بينما تسببت 55 ميجاوات في خسارة كبيرة في RGCs (غير معروضة).
عيب التصوير أحادي الفوتون هو حقيقة أن هذا النهج سيحفز بشدة الدوائر البصرية الأصلية لشبكية العين مقارنة بالتصوير ثنائي الفوتون23. أظهرت التجارب السابقة باستخدام حوامل الشبكية الكاملة أو مستحضرات فنجان العين أن المسح بالليزر ثنائي الفوتون يثير تنشيط الدائرة التي تكون عابرة إلى حد كبير24. هنا ، يظهر تصوير نشاط RGC باستخدام مستشعر Ca 2+ Twitch2b أن بداية المسح بالليزر تحفز ارتفاعات Ca 2+ ، والتي تعود إلى خط الأساس على مدار5-20 ثانية في معظم RGCs (الشكل 8). بالنظر إلى أن قوة الليزر في هذا البروتوكول تقع في نطاق التجارب السابقة التي أبلغت عن استجابة ضوء الشبكية في الجسم الحي8 ، فمن المحتمل أن تكون الطريقة الموصوفة حاليا قابلة لتسجيلات نشاط الدائرة في شبكية العين. هذه الاعتبارات مهمة للتجارب التي قد تتأثر بنشاط الدائرة.
يوضح هذا البروتوكول التصوير في الجسم الحي لنوعين من الخلايا العصبية في شبكية العين ، RGCs وخلايا amacrine. يمكن تحقيق علامات مماثلة لأنواع الخلايا الرئيسية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الأفقية (Cx57-Cre25) ، والخلايا ثنائية القطب (Chx10-Cre 26 ؛ mGluR6-GFP27) ، والمستقبلات الضوئية المخروطية (S- أو M-opsin-Cre 28) ، والمستقبلات الضوئية للقضيب (Nrl-Cre 29) ، و Müller glia (Foxg1-Cre 26) ، و pericytes (NG2-DsRed9). تتوفر أيضا الفئران المعدلة وراثيا لتسمية مجموعات فرعية منفصلة من RGCs (على سبيل المثال ، KCNG4-Cre ل αRGCs30 ؛ OPN4-Cre ل ipRGCs31 ؛ JAM-B-CreER ل J-RGCs 32) وخلايا amacrine (على سبيل المثال ، ChAT-Cre لخلايا amacrine النجمية26 ومحركات محفز الببتيد العصبي لمختلف الأنواع الفرعية لخلايا amacrine 3,34). يمكن استخدام النواقل الفيروسية لاستهداف مجموعات خلايا معينة بدلا من الفئران المعدلة وراثيا. الحقن داخل الجسم الزجاجي من AAV2 مع عنصر محفز CAG في كل مكان بشكل حصري تقريبا تسمية RGCs وخلايا amacrine والخلايا الأفقية25. يسمح إقران قفيصة AAV2.7m8-Y444F المعدلة ببنية مروج mGluR6 الهندسية بوضع علامات واسعة على الخلايا ثنائية القطبON 35. تؤدي الحقن تحت الشبكية من AAV إلى إثراء المستقبلات الضوئية ، مع النمط المصلي AAV2 / 5 الذي يتمتع بأعلى كفاءة نقل36. Shh10 ، بروتين قفيصة AAV6 معدل ، مقترنا بعناصر محفزة للبروتين الحمضي الليفي الدبقي تم إثباته بشكل خاص ب Müller glia37.
يمكن استخدام القدرة على مراقبة الخلايا في الجهاز العصبي المركزي بنهج غير جراحي تماما لدراسة كل من الخصائص الأساسية للدوائر العصبية8 ، وكذلك آليات التنكس العصبي3،4،5،6،38. تستهدف العديد من الأمراض المسببة للعمى المجموعات الخلوية في شبكية العين ، وقد تم استخدام أساليب التصوير في الجسم الحي في الفئران لدراسة إصابة العصب البصري1،3،4 ، والضمور البقعي13 ، والسكتة الدماغية5 ، والزرق2،6 ، والتهاب القزحية7. علاوة على ذلك ، تظهر العديد من الحالات التنكسية العصبية للجهاز العصبي المركزي في شبكية العين بما في ذلك مرض الزهايمر39 والتصلب المتعدد40 ومرض باركنسون41. لذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية التي يمكن الوصول إليها بسهولة للتصوير في الجسم الحي لشبكية العين كأداة لدراسة مجموعة واسعة من الحالات التنكسية العصبية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة البحث لمنع العمى (جائزة التطوير الوظيفي ل P.R.W. ومنحة غير مقيدة لقسم طب العيون والعلوم البصرية في كلية الطب بجامعة واشنطن في سانت لويس) ، وأبحاث الجلوكوما الوطنية (برنامج مؤسسة برايت فوكس) ، ومركز ماكدونيل لبيولوجيا الأعصاب الخلوية والجزيئية. ZW مدعوم بجائزة خدمة البحوث الوطنية المؤسسية T32 EY013360. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل مركز الأمل للناقلات الفيروسية الأساسية في كلية الطب بجامعة واشنطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
