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Neuroscience

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/61970
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3,4
1John F. Hardesty, MD Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Neuroscience, Washington University School of Medicine, 3Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine, 4Hope Center for Neurological Disorders, Washington University School of Medicine

Summary

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Abstract

La rétine transforme les signaux lumineux de l’environnement en signaux électriques qui se propagent au cerveau. Les maladies de la rétine sont répandues et provoquent une déficience visuelle et la cécité. Comprendre comment ces maladies progressent est essentiel pour formuler de nouveaux traitements. La microscopie in vivo dans des modèles animaux de la maladie est un outil puissant pour comprendre la neurodégénérescence et a conduit à des progrès importants vers le traitement de maladies allant de la maladie d’Alzheimer à l’accident vasculaire cérébral. Étant donné que la rétine est la seule structure du système nerveux central intrinsèquement accessible par des approches optiques, elle se prête naturellement à l’imagerie in vivo. Cependant, l’optique native du cristallin et de la cornée présente certains défis pour un accès efficace à l’imagerie.

Ce protocole décrit des méthodes d’imagerie in vivo à deux photons de cohortes cellulaires et de structures dans la rétine de la souris à résolution cellulaire, applicables aux expériences d’imagerie de durée aiguë et chronique. Il présente des exemples d’imagerie des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), des cellules amacrines, microgliales et vasculaires à l’aide d’une série de techniques de marquage, notamment des vecteurs de virus adéno-associés (AAV), des souris transgéniques et des colorants inorganiques. Il est important de noter que ces techniques s’étendent à tous les types de cellules de la rétine et que des méthodes suggérées pour accéder à d’autres populations cellulaires d’intérêt sont décrites. Vous trouverez également des exemples de stratégies de post-traitement manuel d’images pour l’affichage et la quantification. Ces techniques sont directement applicables aux études de la fonction rétinienne dans la santé et la maladie.

Introduction

La visualisation in vivo du système nerveux central nécessite généralement des procédures invasives telles que l’amincissement du crâne et l’installation de fenêtres en verre ou de lentilles relais optiques. La rétine est la seule structure du système nerveux qui peut être directement observée sans avoir besoin d’une préparation invasive car elle reçoit nativement la lumière de l’environnement. La facilité d’accès optique à la rétine en fait un système modèle attrayant pour l’étude du système nerveux central.

L’imagerie fluorescente vivante de la rétine chez la souris a été utilisée pour suivre la mort du CGR dans des modèles de glaucome 1,2, de lésion du nerf optique 1,3,4 et d’accident vasculaire cérébral5, ainsi que les changements dans l’activation microgliale 6,7,8 et le système vasculaire 9 dans des conditions dégénératives. Les signaux intrinsèques peuvent également être utilisés pour visualiser les photorécepteurs 10,11,12 et les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes 13. De nombreuses approches de l’imagerie in vivo de la rétine utilisent soit des dispositifs hautement spécialisés spécifiquement conçus à des fins ophtalmologiques6, soit des systèmes optiques hautement modifiés pour corriger les aberrations natives de la cornée et du cristallin 8,9,11,12,13,14.

Le présent protocole démontre une approche de l’imagerie in vivo des signaux fluorescents dans la rétine à la résolution cellulaire, en utilisant une méthode de base de correction partielle de l’optique antérieure de l’œil de souris. Cette stratégie nécessite des adaptations très mineures aux configurations de microscope multiphotonique qui sont couramment utilisées pour l’imagerie in vivo du cerveau. Comme cette approche est simple à mettre en place et que les souris sont peu stressées, elle est propice à la réalisation d’expériences en accéléré sur des durées aiguës et chroniques. De plus, les procédures génétiques et à base de colorants organiques qui marquent les composants rétiniens individuels, y compris les CGR, les cellules amacrines, la microglie et le système vasculaire, sont compatibles avec cette technique d’imagerie et permettent l’observation in vivo des types de cellules et des structures critiques pour la fonction rétinienne. Ces outils peuvent être adaptés pour marquer la plupart des autres types de cellules neuronales ainsi que les composants gliaux et vasculaires de la rétine.

Protocol

REMARQUE : La procédure suivante a été effectuée conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Washington à St. Louis. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, l’équipement et les animaux utilisés dans cette étude.

1. Injection de virus adéno-associé

REMARQUE: Le marquage de cellules spécifiques dans la rétine peut être accompli dans des lignées de souris transgéniques Cre avec des modèles d’expression restreints. Cette section décrit l’administration intravitréenne de vecteurs AAV qui codent pour l’expression Cre-dépendante d’une protéine fluorescente, marquant ainsi des cellules rétiniennes spécifiques. Injectez des souris (mâles et femelles), à partir de l’âge de 4 semaines.

  1. Préparation de l’aiguille de micropipette
    1. Utilisez un extracteur de micropipette pour créer une aiguille capillaire en verre borosilicate. Chargez un capillaire en verre dans l’extracteur de micropipette et effectuez le test de rampe, en enregistrant la valeur résultante. Jetez le capillaire en verre utilisé pour l’essai de rampe.
    2. Tirez les micropipettes avec les réglages suivants : chaleur : valeur de l’essai de rampe moins 10 ; tirer: 55; vélocité : 65; temps: 120; pression atmosphérique: 500; Temps d’antenne au début de la traction: 20.
      NOTE Il peut être nécessaire de régler les paramètres pour différents extracteurs.
    3. Sous un microscope à dissection, utilisez une lame de rasoir pour couper l’extrémité de la micropipette tirée à l’endroit où la pointe du verre dévie légèrement sous force, ~10 mm de l’extrémité de la section conique. Couper à un angle vif tel que la coupe produise une pointe biseautée. Jetez les pointes émoussées.
  2. Préparation de la seringue d’injection
    1. Installez une micropipette en verre coupé dans un segment de 2 cm de tube en plastique d’acétate d’éthyle vinylique (EVA) (0,05 po de diamètre intérieur, 0,09 po de diamètre extérieur). Connectez l’autre extrémité de ce segment de tube à un tube EVA d’une longueur de 20 cm (0,02 » de diamètre intérieur, 0,06 » de diamètre extérieur).
    2. Connectez le tube à une seringue en verre de 50 μL à l’aide d’une aiguille cimentée de 22 G. Retirez le piston de la seringue en verre et remplissez la seringue et le tube connecté avec de l’huile minérale à l’aide d’une aiguille de seringue de 25 G. Laissez un espace d’air de 4 mm à l’extrémité de la micropipette.
  3. Injection intravitréenne d’AAV
    1. Effectuer une injection intravitréenne avec une technique aseptique standard, en utilisant des gants chirurgicaux stériles, une blouse de laboratoire propre, un masque, un champ stérile et des instruments autoclavés conformément aux protocoles institutionnels pour la chirurgie de survie.
    2. Retirer une partie aliquote du vecteur AAV de l’entreposage à -80 °C et décongeler sur la glace. Après décongélation, centrifuger pendant 10 s à 2 000 × g pour éliminer les bulles d’air.
    3. Suivez les lignes directrices sur l’anesthésie et les substances contrôlées du Comité d’études animales de l’établissement. À l’aide d’une aiguille hypodermique de 30 g, effectuer une injection intrapéritonéale (IP) de 0,1 mL/10 g de poids corporel d’un cocktail kétamine/xylazine (10 mg/mL de kétamine, 1 mg/mL de xylazine dans une solution saline, dose efficace à la souris : 100 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine). Remettez la souris dans sa cage et attendez 5 minutes pour que l’anesthésie fasse effet.
    4. À l’aide d’une aiguille hypodermique de 30 g, effectuer une injection sous-cutanée de méloxicam de 0,1 mL/10 g de poids corporel (0,5 mg/mL dans du chlorure de sodium à 0,9 %).
    5. Testez la profondeur de l’anesthésie en confirmant la perte du réflexe cornéen et du réflexe de retrait à la queue et au pincement des orteils. Si le réflexe cornéen persiste après la perte du réflexe de retrait de la queue et des orteils, appliquez une goutte de solution de proparacaïne à 0,5% sur chaque œil et attendez 10 s.
    6. Placez la souris sur le côté sous le stéréomicroscope. Utilisez une mini pince hémostatique bulldog pour saisir la peau supérieure et inférieure à l’orbite, et fixez la pince à la canette médiale pour déplacer partiellement le globe hors de l’orbite.
    7. Percer la sclérotique latérale avec la micropipette coupée reliée à la seringue en verre, ~1-2 mm postérieure au limbe. Évitez de perturber le système vasculaire qui court circonférentiellement immédiatement postérieurement au limbe. Effectuez la ponction à un angle perpendiculaire à la sclérotique et rétractez légèrement la micropipette immédiatement après avoir percé la sclérotique pour éviter d’endommager la lentille.
    8. Utilisez le piston de la seringue en verre pour prélever 1 à 2 μL d’humeur vitrée, correspondant approximativement au volume de liquide destiné à l’injection. Retirez la micropipette de l’œil et éjectez l’humeur vitrée enlevée.
    9. Remplissez l’extrémité de la micropipette avec 1-2 μL d’AAV, en laissant ~4 mm d’espace d’air entre le vecteur viral et l’huile minérale pour éviter le mélange. Insérez la micropipette dans le trou de la sclérotique créé par la première ponction et appuyez lentement sur le piston de la seringue en verre pour injecter le vecteur viral pendant 20 à 30 s. Visualisez le niveau de liquide du vecteur viral dans l’extrémité de la micropipette et veillez à arrêter l’injection avant que l’air ne pénètre dans l’œil.
    10. Maintenez la micropipette dans la même position pendant 10 s, puis rétractez la micropipette. Retirez la pince hémostatique bulldog.
    11. Appliquez une pommade ophtalmique antibiotique oxytétracycline/polymyxine B sur l’œil injecté. Placez la souris sur un coussin chauffant et surveillez sa récupération après l’anesthésie (voir 3.4.3).
    12. Remettez la souris dans son logement et effectuez des soins postopératoires conformément aux directives de l’établissement. Prévoir 2 à 3 semaines pour l’expression virale des fluorophores avant l’imagerie.

2. Configuration du microscope

REMARQUE : Un schéma du trajet de la lumière du microscope est illustré à la figure 1.

  1. Équipement « toujours allumé » : Ces instruments doivent toujours rester allumés à moins qu’ils ne soient en cours d’ajustement ou d’entretien. Réglez la température élevée du système de refroidissement laser à 20,0 °C. Allumez l’alimentation principale du laser Ti:Saphir ultrarapide, laissez le temps d’achever les processus de démarrage du système et tournez la touche « Laser Enable » sur la position « On ».
  2. Configuration du trajet de la lumière d’émission
    1. Configurez le chemin de collecte des émissions de fluorescence pour échantillonner les longueurs d’onde à l’aide des ensembles de filtres dichroïques et passe-bande appropriés pour les fluorophores d’intérêt.
      REMARQUE: Dans ce manuscrit, l’imagerie Twitch2b a utilisé un cube filtrant composé d’une paire de filtres passe-longues 505 et de paires de filtres passe-bande 480/40 et 535/30. GFP a été imagé à l’aide d’un cube de filtre rouge/vert composé d’un filtre passe-long 560 avec des filtres passe-bande 525/50 et 605/70. Evans Blue a été imagé à l’aide d’un filtre de passe courte 560. La modification des filtres d’émission expose le trajet de la lumière d’émission à la lumière ambiante parasite qui pourrait endommager les tubes photomultiplicateurs (PMT). Assurez-vous que les PMT sont éteints et éteignez les lumières de la pièce avant de modifier le trajet de la lumière de collecte, car l’exposition à la lumière peut nuire à la fonction PMT.
  3. Démarrage de l’acquisition d’images
    REMARQUE: L’exposition directe au laser à deux photons est dangereuse, en particulier pour l’œil car la lumière rouge lointain n’induira pas de réponse de clignement. Des précautions appropriées doivent être prises pour s’assurer que le laser est fermé le long du trajet de la lumière et que des dispositifs de sécurité sont en place pour protéger l’utilisateur contre l’exposition via les oculaires ou les émissions de l’objectif du microscope. Les utilisateurs doivent comprendre dans quelles conditions le laser émettra à partir de l’objectif et prendre les précautions appropriées pour ne pas s’exposer à de tels dangers.
    1. Allumez le dispositif d’acquisition de données, l’ordinateur, la cellule Pockels, le microscope et le contrôleur de scène, le contrôleur d’obturateur mécanique et l’alimentation principale PMT. Gardez les PMT dans l’état « Désactivé » jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’acquisition d’image et protégés de la lumière parasite. Ouvrez l’interface de contrôle laser sur l’ordinateur et le logiciel d’acquisition d’images. Allumez le laser à partir de l’interface de l’ordinateur et assurez-vous du verrouillage du mode.
    2. Réglez la longueur d’onde laser souhaitée. Assurez-vous que la lumière laser pénètre dans la cellule Pockels en ouvrant l’obturateur laser et attendez 30 minutes pour que la puissance laser se stabilise.
  4. Mesure de la puissance laser à l’objectif et réglage du pourcentage laser maximal
    REMARQUE: Le rayonnement laser émet à partir de la lentille de l’objectif pendant la mesure de puissance. Fermez le rideau du boîtier du microscope et portez une protection oculaire appropriée avant d’activer l’obturateur d’imagerie. Mesurer la puissance laser au moment de l’installation initiale du système pour établir la courbe de puissance de sortie pour chaque longueur d’onde d’intérêt et mensuellement par la suite pour vérifier la stabilité de la puissance d’excitation.
    1. Allumez le wattmètre optique et sélectionnez la longueur d’onde de mesure correspondant à la longueur d’onde laser. Placez le détecteur de capteur de puissance optique sur la platine du microscope et manœuvrez-le directement sous la lentille de l’objectif dans les dimensions X-Y. À l’aide de l’entraînement de mise au point motorisé de dimension Z, abaissez la lentille de l’objectif jusqu’à ce que le détecteur de capteur de puissance soit ~1 mm sous la lentille de l’objectif.
    2. Passez de l’éclairage par épifluorescence au laser comme chemin de lumière d’excitation au microscope. Activez l’obturateur mécanique.
    3. Dans le logiciel d’acquisition d’images, lancez un balayage ponctuel pour ouvrir l’obturateur d’imagerie et envoyez le laser au capteur de puissance optique. Réglez la puissance laser à 100% dans le logiciel de numérisation. Optimisez les positions X-Y et Z du détecteur de capteur de puissance jusqu’à ce que la mesure de puissance laser la plus élevée soit atteinte.
    4. Mesurez la puissance laser à l’objectif de 0,1% à 100% sur la cellule Pockels, en prenant des mesures à intervalles de 10%. Enregistrer le pourcentage de Pockels Cell correspondant à 45 mW de puissance à l’objectif. Définissez ce pourcentage comme puissance laser maximale dans le logiciel d’acquisition d’images.
      REMARQUE : La puissance la plus élevée observée pour l’imagerie rétinienne in vivo de souris sans dommages visibles au tissu cible était de 45 mW, telle que mesurée par coloration histologique deux semaines après l’imagerie. Des dommages rétiniens évidents sont évidents après l’imagerie avec 55 mW à l’objectif.
    5. Désactivez l’obturateur d’imagerie et renvoyez le chemin de la lumière d’excitation à l’épifluorescence.

3. Préparation de la souris pour l’acquisition d’images

  1. Souris anesthésiante pour l’imagerie
    REMARQUE : Assurer un nettoyage adéquat des gaz résiduaires pour atténuer l’exposition à l’isoflurane. Assurez-vous que l’orifice d’échappement de la chambre d’induction de l’anesthésie est connecté à un réservoir de filtre à gaz de récupération passif et que la sortie du nez d’anesthésie de souris est connectée à un cannister de filtre à gaz de récupération actif avec vide fourni par un appareil d’évacuation de gaz. Suivez les directives du fabricant pour surveiller le poids de la cartouche filtrante pour le remplacement.
    1. Anesthésier la souris à l’aide du cocktail kétamine/xylazine tel que décrit ci-dessus à l’étape 1.3.3. Alternativement, induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane si vous utilisez également de l’isoflurane pour le maintien de l’anesthésie (séance d’imagerie > 30 min). Régler l’appareil d’anesthésie des petits animaux pour remplir la chambre d’induction avec de l’isoflurane à 5 % mélangé à de l’air ambiant à un débit de 0,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez 15 s pour que la souris soit anesthésiée.
    2. Réglez le vaporisateur d’isoflurane sur 0% et dirigez le flux d’anesthésie vers l’embout nasal. Effectuez un rinçage « O2 » de 5 secondes de la chambre d’induction. Sortez la souris de la chambre à induction et fixez-la dans le support de tête (voir rubrique 3.3), en fixant le nez.
    3. Utiliser un mélange d’isoflurane à 1 % avec de l’air ambiant à un débit de 0,5 L/min pour le maintien de l’anesthésie. Surveiller la fréquence respiratoire à intervalles de 5 minutes tout au long de l’anesthésie, en ajustant le pourcentage d’isoflurane pour maintenir une fréquence respiratoire de ~60 respirations / min.
      NOTE: Ces réglages (% isoflurane, débit) peuvent également être utilisés pour le maintien de l’anesthésie induite par le cocktail kétamine/xylazine.
  2. Dilatation de la pupille
    1. Préparer une solution de 1% p/v d’atropine et de 2,5% p/v de chlorhydrate de phényléphrine dans l’eau. Conserver la solution dilatatrice à température ambiante à l’abri de la lumière.
    2. À l’aide d’un compte-gouttes jetable pour les yeux, appliquez une goutte de la solution dilatatrice sur chaque œil qui sera photographié. Éteignez les lumières de la pièce et attendez 5 minutes que la pupille se dilate. Lorsque la pupille est dilatée, épongez la solution dilatatrice avec du tissu non pelucheux.
      REMARQUE: Assurez-vous que la solution dilatatrice ne pénètre pas dans les narines.
    3. Appliquez une grosse goutte de gel lubrifiant pour les yeux sur chaque œil qui sera imagée. Si les deux yeux doivent être imagés, appliquez un petit morceau de film plastique sur le gel oculaire sur l’œil non imageur pour prévenir la déshydratation. Si vous n’imagez qu’un œil, appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur l’œil qui ne sera pas imagée.
  3. Positionnement de la souris pour l’imagerie
    1. Pour fixer la souris dans le support de tête d’imagerie, faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la barre de l’écouteur soit inclinée à un angle de 60° ou plus au-dessous de l’horizontale. Fixez la broche du conduit auditif inférieur en position étendue vers l’intérieur et la broche du conduit auditif supérieur en position retirée.
    2. Avec la souris face à la barre de morsure, montez une oreille sur la broche inférieure étendue, en insérant la broche dans le conduit auditif. Desserrez la vis fixant la goupille du conduit auditif supérieur et étendez la broche dans l’autre conduit auditif. Serrez la vis pour fixer la tête.
    3. Faites glisser la barre de morsure vers la tête de la souris. Élevez doucement la tête de la souris, puis abaissez les incisives maxillaires de la souris dans le trou de la barre de morsure. Rétractez la barre de morsure avec une force douce pour fixer la tête de la souris et fixez la position de la barre de morsure en serrant la vis.
    4. Si vous utilisez de l’isoflurane, faites glisser le nez à travers sa fente sur la barre de morsure avant de fixer les incisives de la souris. Fixez et serrez la position de la barre de morsure comme à l’étape 3.3.3. Serrez le nez à l’aide des deux vis sur sa face supérieure jusqu’à ce qu’il s’adapte parfaitement au nez de la souris, mais ne resserre pas le museau.
    5. Transférez la souris, dans le support de tête, à l’étage du microscope sous l’objectif. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la pupille de l’œil soit orientée droit vers le haut, en fonction du trajet de la lumière (Figure 2).
    6. Placez un capset #1.5 dans le porte-filtre compact et fixez le support à la platine du microscope. Abaissez le capot vers l’œil, en entrant en contact avec le gel lubrifiant pour les yeux, de sorte que le couvercle se trouve horizontalement immédiatement au-dessus de la cornée (Figure 2). Assurez-vous que le couvercle ne touche pas la cornée.
      REMARQUE: Sur le microscope, assurez-vous que le chemin de la lumière d’excitation est réglé sur l’épifluorescence et que le chemin de la lumière d’émission est réglé sur l’oculaire. Allumez l’illuminateur d’épifluorescence à sa puissance la plus basse et ouvrez l’obturateur de l’illuminateur. Choisissez la longueur d’onde de l’illuminateur d’épifluorescence et le filtre de fluorescence correspondant au fluorophore à imager.
    7. Manœuvrez la scène dans les dimensions X-Y et l’objectif en position Z à l’aide de la commande de scène et de l’entraînement de mise au point motorisé jusqu’à ce que le voyant d’excitation à grand champ recouvre complètement la cornée. En regardant à travers l’oculaire, continuez à ajuster la position Z de la scène jusqu’à ce que les cellules fluorescentes ou les structures de la rétine soient mises au point. Augmenter la puissance de l’illuminateur d’épifluorescence si le signal de l’échantillon n’est pas suffisamment lumineux pour résoudre les cellules individuelles ou les structures d’intérêt à travers l’oculaire.
      REMARQUE: Si vous avez du mal à localiser la rétine, l’iris est un point de repère à contraste élevé sur lequel s’ancrer, puis se concentrer vers la rétine. Cette étape permettra également de vérifier que la pupille est dilatée au maximum.
    8. Obtenez une zone d’imagerie sur l’axe avec l’objectif de la souris. Ajustez l’angle de la souris à l’aide des différents degrés de liberté sur le support de tête jusqu’à ce que seule l’expansion ou la contraction de la lumière floue se produise lors du réglage du plan focal. Éteignez l’illuminateur d’épifluorescence et fermez l’obturateur de l’illuminateur.
      REMARQUE: Une parallaxe X-Y significative de lumière floue lors du défilement dans les plans focaux de la direction Z indique que la rétine n’est pas sur l’axe par rapport au trajet de la lumière d’imagerie.

4. Acquisition d’images à deux photons

  1. Paramètres de configuration et d’acquisition des images
    REMARQUE: Éteignez les lumières de la pièce et couvrez les sources lumineuses parasites dans la pièce. Assurez-vous que l’illuminateur d’épifluorescence est éteint et que l’obturateur de l’illuminateur est fermé.
    1. Basculez le chemin de la lumière d’excitation vers le laser et le chemin de la lumière d’émission vers les PMT.
    2. Dans le logiciel d’acquisition d’images, définissez une taille d’image de 512 x 512 et une moyenne d’images de 3. Réglez les pas par tranche sur -8 μm. Désignez le z-step pour commencer au sommet de la pile et progresser vers le bas, minimisant ainsi l’activation laser à deux photons des photorécepteurs.
      REMARQUE: La taille du pas peut être réduite pour augmenter la résolution Z au prix d’un temps d’imagerie accru, mais des pas de 8 μm sont suffisants pour résoudre le somata cellulaire dans cette configuration d’imagerie.
    3. Allumez et activez les PMT. Ajustez la tension PMT à 680 V. Activez l’obturateur d’excitation.
      REMARQUE: Les PMT alimentés sont sensibles aux dommages légers. Assurez-vous que l’illuminateur d’épifluorescence est éteint, que le rideau du boîtier du microscope est tiré et que les lumières de la pièce sont éteintes.
    4. Commencez un aperçu de l’image en direct du tissu cible, en commençant par une puissance laser de 1%. Ajustez automatiquement la luminosité de l’écran pour visualiser les cellules ou les structures d’intérêt. Ajustez automatiquement la phase de numérisation. Si le tissu cible est sombre ou peu clair, augmenter le pourcentage de puissance laser jusqu’à ce que les structures deviennent visibles sans dépasser la limite fixée à l’étape 2.4.4 correspondant à 45 mW.
      Remarque : Pour une image 16 bits, une valeur d’affichage de ~1000 lors du réglage automatique de la luminosité dans un plan Z contenant des structures d’intérêt indique une luminosité suffisante de l’échantillon.
    5. Manœuvrez l’étage du microscope dans la direction X-Y pour vous centrer sur une zone d’imagerie souhaitée, puis naviguez vers le plan Z avec les structures d’intérêt dans la mise au point.
      REMARQUE: L’imagerie adjacente à la tête du nerf optique lui permet de servir de point de repère sans ambiguïté pour les expériences d’imagerie chronique.
    6. S’il s’agit d’une expérience de time-lapse chronique, ouvrez une image précédente sur l’ordinateur d’acquisition et utilisez-la comme référence pour trouver la même zone d’intérêt. Assurez-vous que l’angle d’imagerie est similaire à celui des images précédentes pour acquérir le même ensemble de cellules avec une parallaxe minimale.
      REMARQUE : un réglage supplémentaire de la position de la tête de la souris est probablement nécessaire pour imager les mêmes cellules que dans les points temporels précédents (Figure 3).
    7. Définissez les limites Z de la pile d’images en accédant aux plans Z les plus élevés et les plus bas d’intérêt, et acquérez l’image. Une fois l’acquisition d’image terminée, désactivez les PMT et l’obturateur d’émission. Retournez le chemin de la lumière d’émission vers l’oculaire et le chemin de la lumière d’excitation vers l’éclairage par épifluorescence. Retirez la souris de l’étage du microscope.
  2. Arrêt du logiciel et du matériel système
    1. Quittez le logiciel d’acquisition d’images. Éteignez le laser dans l’interface de l’ordinateur. Arrêtez le matériel dans l’ordre de démarrage inversé, à l’exception de l’équipement « toujours actif ».
  3. Récupération de souris
    1. Retirez le support de tête et la souris de l’étage du microscope. Le cas échéant, réglez le vaporisateur d’isoflurane sur 0 %. Retirez la souris du support principal.
    2. Essuyez délicatement le gel lubrifiant pour les yeux avec un mouchoir non pelucheux et appliquez une pommade pour les yeux lubrifiante à base de vaseline blanche et d’huile minérale sur les deux yeux. Placez la souris sur le coussin chauffant de circulation d’eau chaude (réglé à 37 °C), continuez à vous occuper de la souris et à surveiller sa fréquence respiratoire jusqu’à ce que la souris se réveille et retrouve sa capacité ambulatoire. Remettez la souris dans son boîtier.
    3. S’il y a lieu, évaluer l’activité et la morbidité de l’animal 24 heures après l’injection intravitréenne. À la fin de l’étude, euthanasier la souris avec une surdose de tribromoéthanol (250 mg / kg) et effectuer une perfusion transcardique avec 4% de paraformaldéhyde pour préserver le tissu rétinien.

5. Traitement et analyse d’images

  1. Désentrelacement et fusion de données multicanaux
    1. Comme certains logiciels d’acquisition d’images stockent des images multicanaux dans un format entrelacé, ouvrez le fichier image .tif à l’aide d’un logiciel, tel que Fiji (https://imagej.net/Fiji), pour séparer les canaux.
    2. Dans le menu Image des Fidji, sélectionnez Piles | Outils | Désentrelacer. Entrez le nombre de canaux composant l’image et cliquez sur OK.
    3. Pour fusionner les canaux séparés en un seul fichier, accédez à Image | Couleur | Fusionner les canaux. Placez les couches d’image désentrelacées dans des couches de couleur distinctes, puis cliquez sur OK pour créer l’image composite multicouche. Enregistrez cette image composite en tant que nouveau fichier .tif.
  2. Quantification de l’intensité de fluorescence dans les images multicanaux
    NOTE: L’intensité de fluorescence dans les régions d’intérêt désignées (ROI) peut être quantifiée dans des plans d’image unique en utilisant Fidji. La quantification des lectures ratiométriques peut être obtenue en mesurant l’intensité de fluorescence dans différents canaux d’une image composite dans le même retour sur investissement. Pour les expériences d’imagerie chronique, il est préférable d’utiliser des biocapteurs basés sur des sorties métriques d’excitation ou de rapport d’émission.
    1. Aux Fidji, allez à Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Ouvrez l’image composite aux Fidji. Faites défiler jusqu’à la tranche z correspondant à la structure qui vous intéresse et utilisez les outils de sélection (tels que la sélection de rectangle, la sélection ovale, la sélection de polygones) pour définir le retour sur investissement.
    2. Appuyez sur T sur le clavier pour ajouter chaque sélection au ROI Manager. Une fois la sélection du retour sur investissement terminée, cliquez sur Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer diverses données à partir des ROI, telles que la valeur de surface et d’intensité moyenne.
    3. Copiez les mesures du canal actuellement sélectionné enregistrées dans la fenêtre Résultats dans une feuille de calcul. Passez au canal suivant dans la fenêtre Image composite et cliquez sur Mesure pour obtenir des mesures pour ce canal dans le même ensemble de ROI. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, accédez à Plus | Enregistrez et enregistrez les retours sur investissement en tant que fichier .zip.
  3. Projections d’intensité maximale pour l’affichage
    1. Pour créer des affichages des données d’image, utilisez la fonction Z-project aux Fidji. Dans le menu Image , sélectionnez Pile | Projet Z. Choisissez uniquement les cadres dans lesquels les zones d’intérêt sont présentes pour réduire l’arrière-plan.
    2. Si vous souhaitez supprimer le bruit de tir PMT, utilisez la fonction de filtre médiane. Dans le menu Processus, sélectionnez Processus | Filtres | Médiane. Choisissez une valeur de 1,0 pour conserver les détails spatiaux.
    3. Pour créer des projections d’intensité maximale axées sur des cellules individuelles, répétez ce processus en choisissant uniquement les images qui correspondent à la cellule d’intérêt.
      REMARQUE : Cela peut grandement améliorer la capacité à résoudre les tonnelles cellulaires (Figure 4). Les mesures de l’intensité de fluorescence doivent être effectuées dans des plans d’image unique et non sur des projections d’intensité maximale.

Representative Results

Diverses approches de marquage de colorants transgéniques, viraux ou inorganiques peuvent être utilisées pour visualiser spécifiquement plusieurs types et structures de cellules rétiniennes in vivo à l’aide d’une simple adaptation d’un microscope multiphotonique de base. Pour visualiser les CGR et les cellules amacrines, les souris transgéniques VGlut2-Cre et VGat-Cre, respectivement, ont reçu une injection intravitréenne d’une construction d’expression AAV dépendante de Cre codant pour Twitch2b, un capteur Ca 2+ basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence cytoplasmique (FRET) qui contient des protéines fluorescentes cyan et jaune (CFP et YFP, respectivement) et le domaine de liaison Ca2+ de la troponine15 . Chez les souris VGlut2-Cre, les somas RGC sont clairement discernables et les fascicules des axones sont souvent apparents (Figure 3).

Il convient de noter que la trajectoire des axones et l’image négative du système vasculaire rendent très simple l’identification de la tête du nerf optique chez les souris VGlut2-Cre, ce qui est utile comme point de repère dans les expériences d’imagerie chronique (Figure 3). Bien que les cellules amacrines semblent moins brillantes que les CGR, peut-être en raison de leur taille de soma plus petite et / ou de leur transduction AAV moins efficace, leurs somas sont toujours facilement apparents dans la couche nucléaire interne. Contrairement aux CGR, les neurites des cellules amacrines sont plus souvent observées dans les couches plexiformes internes (Figure 4). La microglie rétinienne peut être imagée dans la lignée de souris transgéniques Cx3cr1-GFP6. Les microglies s’associent au système vasculaire, ce qui permet de retrouver la même région dans des expériences d’imagerie time-lapse.

Cette approche peut être utilisée pour suivre la dynamique des processus microgliaux fins, une procédure qui a une meilleure résolution spatiale dans les images à plan unique, ou si des projections d’intensité maximale sont préparées en se concentrant sur des cellules individuelles (Figure 5). La faible résolution axiale causée par l’aberration optique à travers la lentille de la souris empêche l’examen des détails fins dans la dimension z. Pour déterminer si cette technique d’imagerie permet d’observer des changements dégénératifs dans l’ultrastructure cellulaire, 1 μL de 50 mM de N-méthyl-D-aspartate (NMDA) a été injecté dans le vitré pour induire une lésion excitotoxique. Un jour après l’injection, la microglie a montré des processus courts ou une morphologie amiboïde (Figure 5) conformément aux rapports précédents16. Il convient de noter que les cellules de la lignée transgénique Cx3cr1-GFP présentaient une expression de protéines fluorescentes plus uniforme et complète dans la cohorte cellulaire que dans les expériences de livraison médiée par AAV de cassettes d’expression de protéines fluorescentes. Les avantages d’un étiquetage varié et clairsemé par rapport à un étiquetage complet et uniforme doivent être pris en compte lors de la conception des expériences.

Pour marquer le système vasculaire rétinien comme décrit précédemment8, des souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 200 μL de colorant bleu Evans (20 mg / mL dans une solution saline stérile) 30 à 60 minutes avant l’imagerie. Cela a conduit à un fort marquage des vaisseaux sanguins émanant de la tête du nerf optique (Figure 6). Étonnamment, le signal fluorescent d’une seule injection a persisté pendant au moins sept jours. Deux méthodes distinctes ont été utilisées pour estimer les dimensions des images in vivo. Tout d’abord, les mêmes régions rétiniennes ont été imagées in vivo et après fixation dans des montures rétiniennes entières aplaties à l’aide de la microscopie confocale (Figure 7). Des paires de cellules aléatoires ont été sélectionnées à partir de quatre échantillons in vivo différents, et la distance réelle entre les paires de cellules a été mesurée dans des balayages confocaux et appariée à la distance de pixels in vivo pour obtenir une taille moyenne de pixels de 0,99 μm avec un grossissement numérique 1x. L’utilisation de méthodes similaires corrélant des images in vivo avec des balayages confocaux complets a révélé qu’une seule position de la tête permet d’imager sur une plaque de rétine d’environ 650 mm2 .

Le repositionnement du support de tête le long d’un axe de torsion peut permettre d’accéder à une région linéaire de la rétine de 2,2 mm de longueur (non représentée). De plus, des microsphères fluorescentes de 1 ou 2 μm de diamètre ont été injectées dans les yeux de souris et leur diamètre a été mesuré en largeur pleine largeur demi-maximum de balayages linéaires à partir d’images in vivo avec zoom numérique 10x. Cela a donné une estimation de la taille des pixels légèrement plus grande, mais avec plus de variance (Figure 7). Dans l’ensemble, l’imagerie confocale d’échantillons entiers après la fin des expériences in vivo est la méthode la plus cohérente pour attribuer une échelle à des images individuelles, car la variance des propriétés de la cornée et de la lentille peut modifier l’échelle de l’image d’un échantillon à l’autre.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du chemin de lumière. Les composants de base du microscope à deux photons utilisés dans ce protocole consistent en une cellule Pockels pour moduler la puissance laser, une paire de lentilles pour réduire le diamètre du faisceau laser afin de correspondre à l’ouverture arrière de l’objectif du microscope et une paire de miroirs à balayage galvo pour la direction du faisceau. Une paire de rétroviseurs est présente avant chaque composant optique majeur. La mise au point est contrôlée par un moteur qui entraîne le montage de l’objectif. Le trajet de la lumière d’émission peut être personnalisé pour différents fluorophores en remplaçant les filtres dichroïques et barrières. Une configuration générale pour l’imagerie cyan/jaune/rouge est affichée dans laquelle un miroir dichroïque passe-court dirige la lumière rouge vers le premier PMT, et un miroir dichroïque passe-long associé à des filtres passe-bande appropriés est utilisé pour séparer les émissions cyan et jaune. Abréviation : PMT = tube photomultiplicateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Positionnement des souris pour l’imagerie in vivo. Pour positionner la souris avec la pupille sur l’axe avec le trajet de la lumière, la souris anesthésiée est d’abord retenue dans un support de tête, la tête est tournée et inclinée, une grosse goutte de gel lubrifiant pour les yeux est placée sur l’œil et la souris est placée sur la scène. Un capset est monté dans le porte-couvercle perpendiculaire au trajet de la lumière et abaissé vers l’œil. Le bordereau de couverture ne doit pas entrer en contact avec la cornée ou la tête de souris (à gauche), ce qui sera évident si le capot est dévié. Cependant, la lamelle de couverture doit également être suffisamment proche pour éviter la déformation de la gouttelette (à droite), car cela aura un effet démagnifiant sur l’échantillon. Après avoir appliqué l’immersion de gel et fixé la lamelle de couverture, la platine doit être déplacée directement sous l’objectif du microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie des cellules ganglionnaires de la rétine. Pour l’affichage de l’image, des projections d’intensité maximale avec les plans z contenant des cellules d’intérêt sont créées, et les images résultantes sont filtrées médianes pour éliminer le bruit de prise de vue PMT. Deux exemples de cellules ganglionnaires de la rétine marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre sont présentés, en particulier le signal CFP. Les images ont été acquises lors de séances à quatre jours d’intervalle, et des repères vasculaires ont été utilisés pour revenir dans la même région près de la tête du nerf optique. La tête du nerf optique est orientée vers le bas de l’image. Bien que les deux échantillons montrent une certaine variance dans l’orientation (les régions avec une intensité réduite sont indiquées par des flèches), la plupart des cellules sont présentes aux deux points temporels. Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : PMT = tube photomultiplicateur; AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2; CFP = protéine cyan fluorescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie des cellules amacrines. Les cellules amacrines ont été marquées en injectant AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGat-Cre. Le signal CFP de Twitch 2b est spécifiquement affiché. De petites projections d’intensité maximale axées sur les profondeurs de la couche nucléaire interne indiquent des somas de cellules amacrines, tandis que se concentrer sur le plexiforme interne résout les neurites des cellules amacrines (flèche). La tête du nerf optique est orientée vers la droite de l’image. Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGat = transporteur vésiculeux d’acide gamma aminobutyrique; CFP = protéine cyanfluorescente; INL = couche nucléaire interne; IPL = couche plexiforme interne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Microglie d’imagerie. La lignée de souris transgéniques Cx3cr1-GFP a été utilisée pour marquer la microglie. Une projection d’intensité maximale du volume de balayage complet montre de nombreuses microglies, certaines avec des détails de processus fins qui peuvent être résolus. Notez que les cellules vers le bas à gauche du champ ont moins de distorsion dans la projection maximale que celles vers le haut à droite en raison de la parallaxe dans cette région. Les projections d’intensité maximale ne contenant que la cellule d’intérêt réduisent considérablement cette parallaxe (centre, encadrée dans les couleurs correspondantes). De plus, cette stratégie d’imagerie peut documenter la dynamique du remodelage du processus de microglie fine (panneaux inférieurs). Comparativement, de nombreuses microglies peuvent être observées avec des processus courts ou une morphologie amiboïde un jour après une lésion excitotoxique par injection intravitréenne de 50 mM NMDA (à droite). Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; Cx3cr1 = récepteur 1 de chimiokine Cx3; NMDA = N-méthyl-D-aspartate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Étiquetage des repères vasculaires. Des souris ont reçu 200 μL de bleu Evans à 20 mg/mL par voie intrapéritonéale 30 à 60 minutes avant la première séance d’imagerie. Les projections d’intensité maximale de pleine épaisseur démontrent une fluorescence durable dans le système vasculaire rétinien qui a persisté pendant au moins sept jours. Barre d’échelle = environ 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Dimensions de l’image. Les cellules ganglionnaires de la rétine marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre ont été imagées in vivo, et la même région a ensuite été imagée par microscopie confocale à balayage laser après fixation et préparation complète de la rétine. Le canal protéique fluorescent jaune est indiqué pour les deux. Les paires de flèches colorées indiquent la même cellule dans les deux préparations (panneaux supérieurs). Image monoplan de microsphères fluorescentes de 2 μm de diamètre injectées par voie intravitréenne et imagée in vivo (panneau inférieur gauche). Les microsphères ne se sont pas déposées et étaient donc en mouvement constant, ce qui rendait impossible la mesure de la résolution axiale. Tailles de pixels calculées à partir de mesures demi-maximales pleine largeur de microsphères fluorescentes in vivo ou de mesures confocales corrélatives prises à partir de 2 à 4 rétines par groupe (en bas à droite). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Activité calcique induite par le balayage à deux photons. Cellules ganglionnaires rétiniennes marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre, YFP est pseudocoloré magenta et CFP vert, imagé dans un seul plan comme une série chronologique à 4,22 Hz. Tous les RGC avaient un ratio YFP/CFP de départ similaire. La plupart ont répondu par une augmentation du rapport FRET (à l’exclusion de la cellule orange), et un a maintenu un rapport YFP/CFP élevé tout au long de la série chronologique (cellule jaune). Les rapports YFP/CFP ont été normalisés à la moyenne de la première image, et les cercles colorés correspondent aux traces colorées. Les astérisques indiquent des points temporels avec des images représentatives affichées à gauche. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2; YFP = protéine fluorescente jaune; CFP = protéine cyanfluorescente; RGC = cellules ganglionnaires de la rétine; FRET = transfert d’énergie par résonance de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La procédure d’imagerie à deux photons décrite ici permet une imagerie longitudinale in vivo de la rétine de la souris. Des images reproductibles de la même région de la rétine peuvent être obtenues pendant une période continue allant jusqu’à 6 h ou plus sous isoflurane. La souris peut également être imagée à différents jours à l’aide de repères cellulaires et vasculaires pour localiser la même zone d’imagerie (Figure 3). L’utilisation d’une immersion en gel transparent combinée à un verre de couverture à cette fin a déjà été appliquée à une gamme de procédures, y compris la visualisation de la rétine pour l’injection sous-rétinienne, les modèles de lésions rétiniennes induites par laser et l’imagerie du fond d’œil20,21,22.

L’anatomie de l’œil présente des défis uniques pour l’imagerie in vivo, car la puissance optique élevée de la cornée et du cristallin de la souris empêche l’imagerie directe à travers la pupille sans correction. Plusieurs autres méthodes d’imagerie in vivo reposent sur l’utilisation d’une lentille de contact plano-concave pour la correction de l’optique antérieure de l’œil de souris 7,17,18,19. Avec seulement une correction optique au niveau de la cornée, la puissance optique élevée de la lentille de la souris entraîne une quantité inévitable de parallaxe, en particulier de structures dans le champ de balayage périphérique, se manifestant par un étirement et un mouvement de translation dans la dimension X-Y à différents plans Z. Pour minimiser la distorsion liée à la parallaxe de l’image en dimensions X et Y, il est essentiel que l’œil de souris soit orienté de telle sorte que le plan tangent à la rétine au niveau de la zone d’imagerie soit perpendiculaire au trajet de la lumière du microscope. La configuration décrite ici est propice à une manipulation précise de l’angle de l’œil pour obtenir cet alignement. Un porte-tête de souris réglable qui permet une rotation le long de deux axes permet des ajustements manuels faciles de l’angle de l’œil lorsque l’expérimentateur fait défiler la dimension Z pour minimiser la parallaxe. Cette inclinaison contourne également l’effet d’arrêt de champ de la pupille pour permettre l’imagerie de plus grandes zones de la rétine. La retenue du support de tête réduit également considérablement les artefacts de mouvement causés par la respiration.

Il faut veiller à maintenir la clarté de l’œil de la souris, car la qualité de l’image se détériorera avec l’opacification pendant l’imagerie continue. La réapplication fréquente de gel lubrifiant pendant l’imagerie et l’application de pommade après chaque séance d’imagerie aident à empêcher l’œil de sécher et de développer des opacités. Certaines opacités cornéennes disparaîtront spontanément après 24-48 h. L’utilisation de gel transparent et de verre de couverture telle que décrite dans ce protocole permet une qualité d’image et une correction d’aberration similaires à celles d’une lentille de contact7, tout en permettant des ajustements plus faciles de l’angle oculaire sans qu’il soit nécessaire de réaligner le verre de couverture. De plus, le gel fournit une hydratation continue à l’œil, ce qui permet d’effectuer des séances d’imagerie aiguë allant jusqu’à plusieurs heures. Enfin, comme le verre de couverture n’entre pas en contact avec la cornée, il provoque une irritation minimale de l’œil qui peut réduire la clarté optique pour des séances d’imagerie répétées.

Une limite de cette approche est le fait que les aberrations optiques ne sont pas entièrement corrigées. Bien que cela diminue considérablement la résolution axiale en raison de la parallaxe lourde, des mesures quantitatives du soma peuvent être obtenues dans des plans à image unique. Il convient de noter que comme l’intensité du signal de fluorescence des neurones rétiniens dépend de l’alignement des échantillons avec cette méthode, les capteurs basés sur le rapport d’excitation et d’émission sont plus appropriés pour les expériences comparant des échantillons de manière chronique à travers différentes sessions d’imagerie. Une approche pour corriger les aberrations optiques au niveau du système est l’optique adaptative, qui permet une résolution subcellulaire dans la rétine 8,9,14,21. Cependant, l’optique adaptative nécessite un équipement hautement spécialisé et une vaste expertise à mettre en œuvre.

Les approches alternatives à l’imagerie rétinienne in vivo à deux photons sont la microscopie confocale ou l’ophtalmoscopie6. L’approche présentée ici devrait être facilement transposable à la microscopie à grand champ ou confocale. L’imagerie monophotonique est peut-être plus robuste et présente moins de risques d’endommager la rétine en raison de la haute énergie du laser à deux photons nécessaire pour obtenir un effet efficace à deux photons à travers la cornée et le cristallin. Pour éviter les dommages causés par le laser à deux photons, le seuil de puissance laser maximale doit être déterminé empiriquement en examinant les rétines entières après l’achèvement des expériences d’imagerie et d’immunomarquage pour les types de cellules dans les couches imagées. Dans le système présenté ici, les CGR étaient étiquetés avec le marqueur pan-RGC, Rbpms, et les densités étaient normales jusqu’à une puissance d’imagerie de 45 mW, tandis que 55 mW causaient une perte importante de CGR (non illustré).

Un inconvénient de l’imagerie monophotonique est le fait que cette approche stimulera très fortement les circuits visuels natifs de la rétine par rapport à l’imagerie biphotonique23. Des expériences antérieures utilisant des montures entières rétiniennes ou des préparations d’œillets ont montré que le balayage laser à deux photons provoque une activation du circuit qui est en grande partie transitoire24. Ici, l’imagerie de l’activité du RGC avec le capteur Ca 2+ Twitch2b montre que le début du balayage laser induit des élévations Ca 2+, qui reviennent à la ligne de base au cours de5-20 s dans la plupart des RGC (Figure 8). Étant donné que la puissance laser dans ce protocole se situe dans la gamme des expériences précédentes rapportant une réponse lumineuse rétinienne in vivo8, la méthode actuellement décrite se prête probablement à des enregistrements de l’activité des circuits dans la rétine. De telles considérations sont importantes pour les expériences qui peuvent être influencées par l’activité du circuit.

Ce protocole démontre l’imagerie in vivo de deux types de neurones rétiniens, les RGC et les cellules amacrines. Un marquage similaire d’autres types de cellules majeures peut être réalisé, y compris les cellules horizontales (Cx57-Cre 25), les cellules bipolaires (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP27), les photorécepteurs coniques (S- ou M-opsin-Cre 28), les photorécepteurs en bâtonnets (Nrl-Cre29), la glie de Müller (Foxg1-Cre 26) et les péricytes (NG2-DsRed9). Des souris transgéniques sont également disponibles pour marquer des sous-ensembles discrets de CGR (p. ex., KCNG4-Cre pour αRGCs30; OPN4-Cre pour ipRGCs31; JAM-B-CreER pour les J-RGCs 32) et les cellules amacrines (par exemple, ChAT-Cre pour les cellules amacrinesstarburst 26 et les pilotes promoteurs de neuropeptides pour divers sous-types de cellules amacrines 3,34). Les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour cibler des populations cellulaires spécifiques au lieu de souris transgéniques. Injections intravitréennes d’AAV2 avec un élément promoteur CAG omniprésent marquent presque exclusivement les CGR, les cellules amacrines et les cellules horizontales25. L’association de la capside AAV2.7m8-Y444F modifiée avec une construction promotrice mGluR6 modifiée permet un large marquage des cellules bipolaires ON35. Les injections sous-rétiniennes d’AAV conduisent à un enrichissement des photorécepteurs, le sérotype AAV2/5 ayant l’efficacité de transduction la plus élevée36. Shh10, une protéine de capside AAV6 modifiée, associée à des éléments promoteurs de protéines acides fibrillaires gliales, a été démontrée spécifique pour la glie de Müller37.

La capacité d’observer les cellules du système nerveux central avec une approche complètement non invasive peut être utilisée pour étudier à la fois les propriétés de base des circuits neuronaux8, ainsi que les mécanismes de la neurodégénérescence 3,4,5,6,38. De nombreuses maladies cécitantes ciblent les populations cellulaires de la rétine, et des approches d’imagerie in vivo chez la souris ont été utilisées pour étudier les lésions du nerf optique 1,3,4, la dégénérescence maculaire13, l’accident vasculaire cérébral5, le glaucome 2,6 et l’uvéite 7. En outre, de nombreuses affections neurodégénératives du système nerveux central se manifestent dans la rétine, notamment la maladie d’Alzheimer39, la sclérose en plaques40 et la maladie de Parkinson41. Par conséquent, cette technique facilement accessible pour l’imagerie in vivo de la rétine peut être appliquée comme un outil pour étudier un large éventail de maladies neurodégénératives.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award à P.R.W. et une subvention sans restriction au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de la Washington University School of Medicine à St. Louis), National Glaucoma Research (un programme de la Fondation BrightFocus) et le McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. est soutenu par un prix de service national de recherche institutionnel T32 EY013360. Ce travail a également été soutenu par le Hope Center Viral Vectors Core de la faculté de médecine de l’Université de Washington.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 coverslip ThermoFisher 152440 Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL glass syringe Hamilton 80950 22G cemented needle
Adeno-associated virus (AAV2) Hope Center Viral Core NA
Anesthesia Air Pump RWD Life Science R510-30
Atropine Sigma A0132 For pupil dilator solution
Basic Small Animal Anesthesia Device RWD Life Science R500IE
Borosilicate glass capillary Sutter B150-86-10 Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm
CFP/YFP filter cube Chroma custom 480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Two channel PMT detection unit Scientifica S-MPLG-1002
Circulating heating pump Braintree Scientific tp-700 Set to 37 °C
Cling film VWR 10713-916
Compact Filter Holder ThorLabs DH1 Holds coverslip over mouse eye
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) The Jackson Laboratory 005582
DAQ controller chassis National Instruments PXIe-1073
Data acquisition device National Instruments BNC-2090A
Evans Blue dye Fisher Scientific AAA1677409
FPGA module with digitizer National Instruments NI-5734
Gas Evacuation Apparatus RWD Life Science R546W
GenTeal Severe lubricant eye gel   Alcon (from local pharmacy) For use during imaging
GFP/Red filter cube Chroma custom 535/30, 560 long pass, 605/70
Heating pad McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell Scientifica S-MP-101080
HyperScope Main module Scientifica S-MP-100466
HyperScope Scan Path Scientifica S-MP-100406
HyperScope X galvo Module Scientifica MP-100443
ImageJ Fiji software Freeware
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) RWD Life Science R510-31
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) RWD Life Science R510-31S
ketamine HCl (100 mg/mL) Vedco NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter ThorLabs M32M26S
MaiTai GUI software Spectra-Physics NA
MATLAB software MathWorks NA R2015b
meloxicam (5 mg/mL) Boehringer Ingelheim NDC 0010-6013-01 Analgesic
Micorscope Objective Edmund Optics 46-404 Mitutoyo WE715042319
micropipette puller Sutter Flaming/Brown Model P-97
Mineral oil Fisher BP2629-1
Mini bulldog hemostatic clamp Fine Science Tools 18053-28
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD McMaster Carr 1883T1
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD McMaster Carr 1883T4
Mouse head holder Narishige SGM-4
No. 5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
Optic Posts 1/2" ThorLabs TR3-P5
Optical power meter kit ThorLabs PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery Scientifica COO-LED3ULLGs
Phenylephrine hydrochloride Sigma P6126 For pupil dilator solution
Pockels cell Conoptics 350-80-02
Pockels cell amplifier Conoptics Model 302RM
Proparacaine hydrochloride Sigma 1571001 For eye immobilization
Red & Far Red short pass filter Cube Chroma custom 560 short pass
Rotating 1/2" post clamp ThorLabs SWC
ScanImage package Vidrio Technologies Freeware Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB
sodium chloride solution, sterile (0.9%) Fresenius Kabi NDC 63323-186-01
Stereomicroscope Leica S9 E
Tabletop centrifuge Oxford Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment Zoetisus NA For use after intravitreal injection
ThermoRack cooling system Solid State Cooling Systems ThermoRack 401 Set to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016962
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016963
VivoScope for In Vivo Imaging Scientifica S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment Stye NA For use after imaging
xylazine HCl (20 mg/mL) Akorn NDC 59399-110-20

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References

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Neurosciences numéro 168 rétine imagerie in vivo microscopie à deux photons cellules ganglionnaires de la rétine cellules amacrines microglie
Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris
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Wang, Z., McCracken, S., Williams,… More

Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (168), e61970, doi:10.3791/61970 (2021).

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