Summary
In vivo imaging er et kraftig verktøy for studiet av biologi i helse og sykdom. Denne protokollen beskriver transpupillary avbildning av musens netthinne med et standard to-foton mikroskop. Det demonstrerer også forskjellige vivoimaging metoder for å fluorescerende merke flere cellulære kohorter av netthinnen.
Abstract
Netthinnen forvandler lyssignaler fra miljøet til elektriske signaler som forplantes til hjernen. Sykdommer i netthinnen er utbredt og forårsaker synshemming og blindhet. Å forstå hvordan slike sykdommer utvikler seg er avgjørende for å formulere nye behandlinger. In vivo mikroskopi i dyremodeller av sykdom er et kraftig verktøy for å forstå nevrodegenerasjon og har ført til viktige fremskritt mot behandling av tilstander som spenner fra Alzheimers sykdom til hjerneslag. Gitt at netthinnen er den eneste strukturen i sentralnervesystemet som iboende er tilgjengelig ved optiske tilnærminger, egner den seg naturlig til in vivo-avbildning. Imidlertid gir den opprinnelige optikken til linsen og hornhinnen noen utfordringer for effektiv bildetilgang.
Denne protokollen skisserer metoder for in vivo to-fotonavbildning av cellulære kohorter og strukturer i musens netthinne ved cellulær oppløsning, som gjelder for både akutte og kroniske varighetsmodelleringseksperimenter. Den presenterer eksempler på retinal ganglioncelle (RGC), amakrine celler, mikroglial og vaskulær avbildning ved hjelp av en rekke merkingsteknikker, inkludert adeno-assosierte virus (AAV) vektorer, transgene mus og uorganiske fargestoffer. Det er viktig at disse teknikkene strekker seg til alle celletyper i netthinnen, og foreslåtte metoder for tilgang til andre cellulære populasjoner av interesse er beskrevet. Også detaljert er eksempler på strategier for manuell bildebehandling for visning og kvantifisering. Disse teknikkene er direkte anvendelige for studier av retinal funksjon i helse og sykdom.
Introduction
In vivo visualisering av sentralnervesystemet krever vanligvis invasive prosedyrer som skallefortynning og installasjon av glassvinduer eller optiske relélinser. Netthinnen er den eneste strukturen i nervesystemet som kan observeres direkte uten behov for invasiv forberedelse, da den naturlig mottar lys fra miljøet. Den enkle optiske tilgangen til netthinnen gjør det til et attraktivt modellsystem for å studere sentralnervesystemet.
Levende fluorescerende avbildning av netthinnen hos mus har blitt brukt til å spore RGC-død i modeller av DrDeramus 1,2, optisk nerveskade 1,3,4 og slag5, samt endringer i mikrogliaaktivering 6,7,8 og vaskulatur 9 i degenerative forhold. Indre signaler kan også brukes til å visualisere fotoreceptorer 10,11,12 og retinale pigmentepitelceller 13. Mange tilnærminger til in vivo avbildning av netthinnen bruker enten høyt spesialiserte enheter spesielt utviklet for oftalmologiske formål6 eller svært modifiserte optiske systemer for å korrigere for de innfødte avvikene i hornhinnen og linsen 8,9,11,12,13,14.
Den nåværende protokollen demonstrerer en tilnærming til in vivo avbildning av fluorescerende signaler i netthinnen ved cellulær oppløsning, ved hjelp av en grunnleggende metode for delvis korrigering for museøyets fremre optikk. Denne strategien krever svært små tilpasninger til multifotonmikroskopoppsett som ofte brukes til in vivo-avbildning av hjernen. Siden denne tilnærmingen er enkel å sette opp, og musene er under lite stress, bidrar det til å utføre time-lapse-eksperimenter over både akutt og kronisk varighet. I tillegg er genetiske og organiske fargestoffbaserte prosedyrer som merker individuelle retinale komponenter, inkludert RGC, amakrine celler, mikroglia og vaskulatur, kompatible med denne avbildningsteknikken og muliggjør in vivo observasjon av celletyper og strukturer som er kritiske for retinal funksjon. Disse verktøyene kan tilpasses for å merke de fleste andre nevroncelletyper, samt glial og vaskulære komponenter i netthinnen.
Protocol
MERK: Følgende prosedyre ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Washington University i St. Louis. Se materialtabellen for detaljer om reagenser, utstyr og dyr som ble brukt i denne studien.
1. Adeno-assosiert virusinjeksjon
MERK: Merking av spesifikke celler i netthinnen kan oppnås i Cre transgene muselinjer med begrensede uttrykksmønstre. Denne delen beskriver intravitreal levering av AAV-vektorer som koder for Cre-avhengig ekspresjon av et fluorescerende protein, og dermed merker spesifikke retinale celler. Injiser mus (mann og kvinne), fra 4 ukers alder.
- Klargjøre mikropipettenålen
- Bruk en mikropipette puller for å lage en borosilikatglass kapillærnål. Legg i en glasskapillær i mikropipettetrekkeren og utfør rampetesten, og registrer den resulterende verdien. Kast glasskapillæren som ble brukt til rampetesten.
- Trekk mikropipetter med følgende innstillinger: varme: Rampetestverdi minus 10; trekk: 55; hastighet: 65; tid: 120; lufttrykk: 500; Sendetid ved starten av trekk: 20.
MERK-innstillinger må kanskje justeres for forskjellige avtrekkere. - Under et dissekeringsmikroskop, bruk et barberblad for å kutte spissen av den trukket mikropipetten på stedet der glassspissen avbøyes litt under kraft, ~ 10 mm fra enden av den koniske delen. Klipp i skarp vinkel slik at kuttet gir en skrå spiss. Kast stumpe tips.
- Klargjøre injeksjonssprøyten
- Monter en kuttet glassmikropipette i et 2 cm segment av etylvinylacetat (EVA) plastrør (0,05" indre diameter, 0,09" ytre diameter). Koble den andre enden av dette rørsegmentet til en 20 cm lengde på EVA-slangen (0,02" indre diameter, 0,06" ytre diameter).
- Koble slangen til en 50 μL glasssprøyte med en 22 G sementert nål. Fjern stempelet fra glasssprøyten og fyll på igjen sprøyten og den tilkoblede slangen med mineralolje ved hjelp av en 25 G sprøytekanyle. La 4 mm luftrom stå på tuppen av mikropipetten.
- Intravitreal injeksjon av AAV
- Utfør intravitreal injeksjon med standard aseptisk teknikk, ved hjelp av sterile kirurgiske hansker, ren laboratoriefrakk, maske, sterilt felt og autoklaverte instrumenter i henhold til institusjonelle protokoller for overlevelseskirurgi.
- Fjern en aliquot av AAV-vektor fra lagring ved -80 °C og tine på is. Etter tining, sentrifuger i 10 s ved 2000 × g for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Følg retningslinjene for anestesi og kontrollerte stoffer fra institusjonens dyreforsøkskomité. Bruk en 30 g hypodermisk nål, utfør en 0,1 ml / 10 g kroppsvekt intraperitoneal (IP) injeksjon av en ketamin / xylazincocktail (10 mg / ml ketamin, 1 mg / ml xylazin i saltvann, effektiv dose til mus: 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin). Sett musen tilbake til buret og la 5 minutter for anestesi tre i kraft.
- Bruk en 30 g hypodermisk nål, utfør en 0,1 ml / 10 g kroppsvekt subkutan injeksjon av meloksikam (0,5 mg / ml i 0,9% natriumklorid).
- Test dybden av anestesi ved å bekrefte tap av hornhinnerefleks og tilbaketrekningsrefleks til hale og tåklemme. Hvis hornhinnerefleksen vedvarer etter tap av hale- og tåuttaksrefleks, bruk en dråpe 0,5% proparakainløsning på hvert øye og vent på 10 s.
- Plasser musen på siden under stereomikroskopet. Bruk en mini bulldog hemostatisk klemme for å ta tak i huden overlegen og dårligere enn bane, og fest klemmen ved medial canthus for delvis å forskyve kloden opp av banen.
- Punkter lateral sclera med kuttet mikropipette koblet til glasssprøyten, ~ 1-2 mm bakre til limbus. Unngå å forstyrre vaskulaturen som går rundt umiddelbart bakre til limbus. Utfør punkteringen i en vinkel vinkelrett på scleraen, og trekk mikropipetten litt tilbake umiddelbart etter piercing av sclera for å unngå å skade linsen.
- Bruk stempelet på glasssprøyten til å trekke ut 1-2 μL glasslegeme, tilsvarende omtrent væskevolumet beregnet til injeksjon. Trekk mikropipetten ut av øyet, og ta ut den fjernede glasslegemet.
- Fyll tuppen av mikropipetten med 1-2 μL AAV, og la ~ 4 mm luftrom mellom virusvektoren og mineraloljen unngås blanding. Sett mikropipetten i hullet i scleraen som ble opprettet ved den første punkteringen, og trykk sakte på stempelet på glasssprøyten for å injisere virusvektoren i løpet av 20-30 s. Visualiser væskenivået til virusvektoren i spissen av mikropipetten, og vær forsiktig med å slutte å injisere før luft kommer inn i øyet.
- Hold mikropipetten i samme posisjon i 10 s, og trekk deretter mikropipetten tilbake. Fjern bulldog hemostatisk klemme.
- Påfør oksytetracyklin / polymyxin B antibiotika oftalmisk salve til det injiserte øyet. Plasser musen på en varmepute, og overvåk dens utvinning fra anestesi (se 3.4.3).
- Returner musen til huset, og utfør postoperativ omsorg i henhold til institusjonelle retningslinjer. Tillat 2-3 uker for viral-mediert ekspresjon av fluoroforer før bildebehandling.
2. Oppsett av mikroskop
MERK: Et skjema for mikroskopets lysbane er vist i figur 1.
- "Alltid på"-utstyr: Disse instrumentene skal alltid være på med mindre de gjennomgår justering eller vedlikehold. Still den høye temperaturen på laserkjølesystemet til 20,0 °C. Slå på hovedstrømmen til den ultraraske Ti: Sapphire-laseren, gi tid til fullføring av systemoppstartsprosesser, og vri "Laser Enable" -tasten til "På" -posisjonen.
- Konfigurasjon av utslippslysbane
- Konfigurer fluorescensutslippsinnsamlingsbanen til prøvebølgelengder ved hjelp av passende dikroiske og båndpassfiltersett for fluoroforer av interesse.
MERK: I dette manuskriptet brukte Twitch2b-avbildning en filterkube bestående av en 505 langpass dikroic og 480/40 og 535/30 båndpassfilterpar. GFP ble avbildet ved hjelp av en rød / grønn filterkube bestående av et 560 langpassfilter med 525/50 og 605/70 båndpassfiltre. Evans Blue ble avbildet ved hjelp av et 560 kortpassfilter. Endring av utslippsfiltre utsetter utslippslysbanen for bortkommen romlys som kan skade fotomultiplikatorrør (PMT). Forsikre deg om at PMT-er er slått av, og slå av romlysene før du endrer oppsamlingslysbanen, da lyseksponering kan påvirke PMT-funksjonen negativt.
- Konfigurer fluorescensutslippsinnsamlingsbanen til prøvebølgelengder ved hjelp av passende dikroiske og båndpassfiltersett for fluoroforer av interesse.
- Starte opp bildeopptak
MERK: Direkte eksponering for to-fotonlaseren er farlig, spesielt for øyet, da langt rødt lys ikke vil indusere en blinkrespons. Riktig forsiktighet bør tas for å sikre at laseren er lukket langs lysbanen, og feilsikringer er på plass for å beskytte brukeren mot eksponering via øyestykkene eller utslipp fra mikroskopmålet. Brukere bør forstå under hvilke forhold laseren vil avgi fra målet, og ta riktige forholdsregler for ikke å utsette seg for slike farer.- Slå på datainnsamlingsenheten, datamaskinen, Pockels-cellen, mikroskopet og scenekontrolleren, mekanisk lukkerkontroller og PMT-hovedstrøm. Hold PMT-er i "Deaktivert" -tilstand til de er klare for bildeopptak og skjermet fra bortkommen lys. Åpne laserkontrollgrensesnittet på datamaskinen og bildeoppkjøpsprogramvaren. Slå på laseren fra datamaskingrensesnittet og sørg for moduslåsing.
- Still inn ønsket laserbølgelengde. Forsikre deg om at laserlyset kommer inn i Pockels Cell ved å åpne laserlukkeren, og la 30 minutter for laserkraft å stabilisere seg.
- Måling av lasereffekt ved målet og innstilling av maksimal laserprosent
MERK: Laserstråling avgir fra objektivlinsen under effektmåling. Lukk mikroskopkapslingsgardinen, og bruk passende øyevern før du aktiverer bildelukkeren. Mål lasereffekt på tidspunktet for den første systeminstallasjonen for å etablere effektutgangskurven for hver bølgelengde av interesse og deretter månedlig for å verifisere stabiliteten til eksitasjonskraften.- Slå på den optiske effektmåleren, og velg målebølgelengden som tilsvarer laserbølgelengden. Plasser den optiske strømmålerdetektoren på mikroskoptrinnet og manøvrer den direkte under objektivlinsen i X-Y-dimensjonene. Bruk Z-dimensjon motorisert fokusdrev, senk objektivlinsen til effektmålerdetektoren er ~ 1 mm under objektivlinsen.
- Bytt fra epifluorescensbelysning til laseren som mikroskopets eksitasjonslysbane. Aktiver den mekaniske lukkeren.
- I bildeinnsamlingsprogramvaren starter du en punktskanning for å åpne bildelukkeren, og sender laseren til den optiske effektmåleren. Sett lasereffekten til 100% i skanneprogramvaren. Optimaliser X-Y- og Z-posisjonene til strømmålerdetektoren til den høyeste lasereffektmålingen er oppnådd.
- Mål lasereffekt på målet fra 0,1% til 100% på Pockels-cellen, og ta målinger med 10% intervaller. Registrer Pockels Cell-prosentandelen som tilsvarer 45 mW strøm på målet. Angi denne prosentandelen som maksimal lasereffekt i programvaren for bildeinnhenting.
MERK: Den høyeste effekten observert for in vivo mus retinal imaging uten synlig skade på målvevet var 45 mW, som analysert ved histologisk farging to uker etter avbildning. Åpenbar retinal skade er tydelig etter avbildning med 55 mW på målet. - Deaktiver bildelukkeren og returner eksitasjonslysbanen til epifluorescens.
3. Forberedelse av mus for bildeoppkjøp
- Bedøvende mus for avbildning
MERK: Sørg for riktig avgassrensing for å redusere eksponeringen for isofluran. Forsikre deg om at eksosporten til anestesiinduksjonskammeret er koblet til en passiv scavenging gassfilterbeholder, og utløpet til musebedøvelsen nesestykket er koblet til en aktiv scavenging gassfilterbeholder med vakuum levert av et gassevakueringsapparat. Følg produsentens retningslinjer for overvåking av filterbeholderens vekt for utskifting.- Bedøv musen ved hjelp av ketamin/xylazincocktailen som beskrevet ovenfor i trinn 1.3.3. Alternativt kan du indusere anestesi via isofluraninhalasjon hvis du også bruker isofluran til vedlikehold av anestesi (bildebehandling > 30 min). Still inn anestesianordningen til å fylle induksjonskammeret med 5 % isofluran blandet med romluft med en strømningshastighet på 0,5 l/min. Plasser musen i induksjonskammeret, og la 15 s for musen bli bedøvet.
- Bytt isofluranfordamperen til 0%, og rett anestesistrømmen til nesestykket. Utfør en 5-sekunders "O2 flush" av induksjonskammeret. Ta musen ut av induksjonskammeret, og fest den i hodeholderen (se pkt. 3.3), og fest nesestykket.
- Bruk en blanding av 1 % isofluran med romluft med en strømningshastighet på 0,5 l/min for vedlikehold av anestesi. Overvåk respirasjonsfrekvensen med 5-minutters intervaller gjennom anestesi, og juster isofluranprosenten for å opprettholde en respirasjonsfrekvens på ~60 pust/min.
MERK: Disse innstillingene (% isofluran, strømningshastighet) kan også brukes til vedlikehold av anestesi indusert av ketamin/xylazincocktailen.
- Utvidelse av pupillen
- Klargjør en oppløsning av 1% w / v atropin og 2,5% w / v fenylefrinhydroklorid i vann. Oppbevar dilatoroppløsningen ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Bruk en engangspipette øyedråper, bruk en dråpe av dilatorløsningen til hvert øye som skal avbildes. Slå av romlysene, og vent 5 min til eleven utvides. Når pupillen er utvidet, må du fjerne dilatorløsningen med lofritt vev.
MERK: Forsikre deg om at dilatoroppløsningen ikke kommer inn i neseborene. - Påfør en stor dråpe smøremiddel øye gel til hvert øye som vil bli avbildet. Hvis begge øynene skal avbildes, bruk et lite stykke plast klamfilm over øyegelen på det ikke-avbildende øyet for å forhindre dehydrering. Hvis du bare avbilder ett øye, bruk smøremiddel øyesalve på øyet som ikke vil bli avbildet.
- Plassere musen for avbildning
- For å feste musen i bildehodeholderen, roter hovedarmen på hodeholderen til ørepluggstangen er vippet i en vinkel på 60 ° eller mer under horisontal. Fest den nedre øregangspinnen i innover utvidet stilling og øvre øregangspinne i trukket stilling.
- Med musen vendt mot bitestangen, monter det ene øret på den utvidede nedre pinnen, og sett pinnen inn i øregangen. Løsne skruen som fester øvre øregangspinne, og strekk tappen inn i den andre øregangen. Stram skruen for å feste hodet.
- Skyv bitestangen mot musens hode. Løft musens hode forsiktig, og senk deretter musens maksillære snitt inn i hullet på bitestangen. Trekk inn bitestangen med forsiktig kraft for å feste musens hode, og fest bitestangposisjonen ved å stramme skruen.
- Hvis du bruker isofluran, skyv nesestykket gjennom sporet på bitestangen før du fester musenes fortenner. Fest og stram bitestangposisjonen som i trinn 3.3.3. Stram nesestykket med de to skruene på oversiden til det sitter godt på musens nese, men innsnevrer ikke snuten.
- Overfør musen, i hodeholderen, til mikroskopstadiet under målet. Roter hovedarmen på hodeholderen til pupillen i øyet er orientert rett opp, på linje med lysbanen (figur 2).
- Plasser en #1.5 dekselslipp i kompaktfilterholderen, og fest holderen til mikroskoptrinnet. Senk dekselet mot øyet, kom i kontakt med smøremiddelets øyegel, slik at dekselet ligger horisontalt rett over hornhinnen (figur 2). Forsikre deg om at dekselet ikke berører hornhinnen.
MERK: På mikroskopet, sørg for at eksitasjonslysbanen er satt til epifluorescens og utslippslysbane er satt til okular. Slå på epifluorescensbelysningen med lavest effekt og åpne belysningslukkeren. Velg epifluorescensbelysningsbølgelengden og fluorescensfilteret som tilsvarer fluoroforen som avbildes. - Manøvrer scenen i X-Y-dimensjonene og målet i Z-posisjon ved hjelp av scenekontrollen og motorisert fokusdrift til vidvinkeleksitasjonslyset dekker hornhinnen helt. Ser gjennom okularet, fortsett å justere Z-posisjonen til scenen til fluorescerende celler eller strukturer i netthinnen kommer i fokus. Øk epifluorescensbelysningseffekten hvis prøvesignalet ikke er tilstrekkelig lyst til å løse individuelle celler eller strukturer av interesse gjennom okularet.
MERK: Hvis du har problemer med å finne netthinnen, er iris et landemerke med høy kontrast å forankre på og deretter fokusere ned mot netthinnen. Dette trinnet vil også tillate verifisering av at eleven er maksimalt utvidet. - Få et bildeområde på akse med muselinsen. Juster vinkelen på musen ved hjelp av de forskjellige frihetsgradene på hodeholderen til bare utvidelse eller sammentrekning av ufokusert lys oppstår når du justerer fokalplanet. Slå av epifluorescensbelysningen og lukk belysningslukkeren.
MERK: Signifikant X-Y-parallakse av ufokusert lys mens du blar gjennom Z-retningsfokalplanene, indikerer at netthinnen ikke er på aksen med hensyn til bildelysbanen.
4. To-foton bilde oppkjøp
- Parametere for bildeoppsett og anskaffelse
MERK: Slå av romlys, og dekk til lyskilder i rommet. Forsikre deg om at epifluorescensbelysningen er av, og belysningslukkeren er lukket.- Bytt eksitasjonslysbanen til laseren og emisjonslysbanen til PMT-ene.
- I bildeoppkjøpsprogramvaren angir du en rammestørrelse på 512 x 512 og rammegjennomsnitt på 3. Sett trinnene per skive til -8 μm. Angi z-stepping for å starte på toppen av stabelen og gå nedover, minimere to-foton laseraktivering av fotoreceptorer.
MERK: Trinnstørrelsen kan reduseres for å øke Z-oppløsningen til en kostnad med økt bildetid, men 8 μm trinn er tilstrekkelig til å løse celle somata i denne bildekonfigurasjonen. - Slå på og aktiver PMT-ene. Juster PMT-spenningen til 680 V. Aktiver eksitasjonslukkeren.
MERK: Drevne PMT-er er utsatt for lett skade. Sørg for at epifluorescensbelysningen er av, mikroskopkapslingsgardinen er trukket og romlysene er av. - Begynn en live forhåndsvisning av målvevet, og start med 1% laserkraft. Juster skjermens lysstyrke automatisk for å visualisere cellene eller strukturene av interesse. Juster skannefasen automatisk. Hvis målvevet er svakt eller uklart, øker du lasereffektprosenten til strukturer blir synlige uten å overskride grensen som er angitt i trinn 2.4.4 som tilsvarer 45 mW.
MERK: For et 16-biters bilde indikerer en visningsverdi på ~ 1000 når automatisk justering av lysstyrken i et Z-plan som inneholder strukturer av interesse, tilstrekkelig lysstyrke på prøven. - Manøvrer mikroskoptrinnet i X-Y-retningen for å sentrere på et ønsket bildebehandlingsområde, og naviger deretter til Z-planet med strukturer av interesse i fokus.
MERK: Imaging ved siden av optisk nerve hodet gjør det mulig å tjene som et entydig landemerke for kroniske bildeeksperimenter. - Hvis dette er et kronisk time-lapse-eksperiment, har du et tidligere bilde åpent på anskaffelsesdatamaskinen, og bruker det som referanse for å finne det samme interesseområdet. Kontroller at bildevinkelen ligner på tidligere bilder for å få det samme settet med celler med minimal parallakse.
MERK: Ytterligere justering av musens hodeposisjon er sannsynligvis nødvendig for å avbilde de samme cellene som i tidligere tidspunkter (figur 3). - Angi Z-grensene for bildestakken ved å navigere til de øverste og nederste Z-planene av interesse, og skaff deg bildet. Når bildeopptaket er fullført, deaktiverer du PMT-ene og utslippslukkeren. Bytt utslippslysbanen tilbake til okularet, og eksitasjonslysbanen til epifluorescensbelysning. Fjern musen fra mikroskopstadiet.
- Avslutning av systemprogramvare og maskinvare
- Avslutt programvaren for bildeinnhenting. Slå av laseren i datamaskingrensesnittet. Slå av maskinvaren i omvendt oppstartsrekkefølge, med unntak av "Always-On" -utstyret.
- Gjenoppretting av mus
- Fjern hodeholderen og musen fra mikroskopstadiet. Sett eventuelt isofluranfordamperen til 0 %. Fjern musen fra hodeholderen.
- Tørk forsiktig av smøremiddelets øyegel med et lofritt vev, og påfør hvit petrolatum-mineralolje smøremiddel øyesalve på begge øynene. Plasser musen på varmtvannssirkulerende varmepute (satt til 37 °C), fortsett å ta vare på musen og overvåke respirasjonsfrekvensen til musen våkner og gjenvinner ambulatorisk kapasitet. Sett musen tilbake til huset.
- Hvis det er aktuelt, vurder dyrs aktivitet og sykelighet ved 24 timer etter intravitreal injeksjon. Når studien er fullført, avlive musen med en overdose tribromoetanol (250 mg / kg) og utfør transkardial perfusjon med 4% paraformaldehyd for å bevare retinalvev.
5. Bildebehandling og analyse
- Fjerne og slå sammen flerkanalsdata
- Siden enkelte programmer for bildeanskaffelse lagrer flerkanalsbilder i et sammenflettet format, åpner du .tif-bildefilen ved hjelp av programvare, for eksempel Fiji (https://imagej.net/Fiji), for å skille kanalene.
- I Bilde-menyen på Fiji velger du Stabler | Verktøy | Deinterleave. Skriv inn antall kanaler som komponerer bildet, og klikk OK.
- Hvis du vil slå sammen de separerte kanalene til én enkelt fil, går du til Bilde | Farge | slå sammen kanaler. Plasser de sammenflettede bildekanalene i separate fargekanaler, og klikk OK for å opprette det sammensatte flerkanalsbildet. Lagre dette sammensatte bildet som en ny .tif-fil.
- Kvantifisering av fluorescensintensitet i flerkanalsbilder
MERK: Fluorescensintensitet innenfor utpekte interesseområder (ROI) kan kvantifiseres i enkeltbildeplan ved hjelp av Fiji. Kvantifisering av ratiometriske avlesninger kan oppnås ved å måle fluorescensintensiteten i forskjellige kanaler i et sammensatt bilde innenfor samme avkastning. For kroniske bildeeksperimenter er det best å bruke biosensorer basert på eksitasjons- eller utslippsratiometriske utganger.- I Fiji, gå til Analyser | Verktøy | Avkastning Manager. Åpne det sammensatte bildet på Fiji. Bla til z-stykket som tilsvarer strukturen av interesse, og bruk markeringsverktøyene (for eksempel Rektangelmarkering, Oval markering, Polygon-markering) til å skissere avkastningen.
- Trykk på T på tastaturet for å legge til hvert valg i ROI Manager. Når avkastningsvalget er fullført, klikker du på Mål i ROI Manager for å registrere forskjellige data fra avkastningene, for eksempel areal - og middelintensitetsverdi.
- Kopier målene for den valgte kanalen som er registrert i resultatvinduet , til et regneark. Bytt til neste kanal i det sammensatte bildevinduet og klikk på Mål for å få målinger for den kanalen innenfor samme sett med avkastninger. I ROI Manager går du til Mer | Lagre, og lagre avkastningen som en .zip fil.
- Maksimale intensitetsprojeksjoner for visning
- For å lage visninger av bildedataene, bruk Z-prosjektfunksjonen i Fiji. I Bilde-menyen velger du Stable | Z-prosjektet. Velg bare rammene der interesseområder er til stede for å redusere bakgrunnen.
- Hvis du ønsker å fjerne PMT-skuddstøy, bruker du Median-filterfunksjonen. I Prosess-menyen velger du Prosess | Filtre | Median. Velg verdien 1,0 for å opprettholde romlige detaljer.
- For å lage projeksjoner med maksimal intensitet fokusert på enkeltceller, gjenta denne prosessen ved å velge bare bilderammene som tilsvarer cellen av interesse.
MERK: Dette kan i stor grad forbedre evnen til å løse cellulære arbors (figur 4). Målinger av fluorescensintensitet bør utføres i enkeltbildeplan og ikke på maksimale intensitetsprojeksjoner.
Representative Results
Ulike transgene, virale vektorer eller uorganiske fargestoffmerkingsmetoder kan brukes til å spesifikt visualisere flere retinale celletyper og strukturer in vivo ved hjelp av en enkel tilpasning av et grunnleggende multifotonmikroskop. For å visualisere RGCs og amakrine celler ble henholdsvis VGlut2-Cre og VGat-Cre transgene mus gitt en intravitreal injeksjon av en Cre-avhengig AAV-uttrykkskonstruksjon som koder for Twitch2b, en cytoplasmatisk fluorescensresonansenergioverføring (FRET) -basert Ca 2+ sensor som inneholder cyan og gule fluorescerende proteiner (henholdsvis CFP og YFP) og Ca2+ bindingsdomenet til troponin15 . Hos VGlut2-Cre-mus er RGC somas tydelig merkbare, og fascikler av aksoner er ofte tydelige (figur 3).
Det skal bemerkes at banen til axoner og det negative bildet av vaskulaturen gjør det veldig enkelt å identifisere optisk nervehode i VGlut2-Cre-mus, noe som er nyttig som et landemerke i kroniske bildeeksperimenter (figur 3). Selv om amakrine celler ser mindre lyse ut enn RGCer, muligens på grunn av deres mindre soma-størrelse og / eller mindre effektive AAV-transduksjon, er deres somas fortsatt lett synlige i det indre kjernefysiske laget. I motsetning til RGC observeres amakrine celleneuritter oftere i de indre pleksiforme lagene (figur 4). Retinal microglia kan avbildes i Cx3cr1-GFP transgen muselinje6. Microglia assosieres med vaskulaturen, noe som gjør det mulig å finne den samme regionen i time-lapse imaging eksperimenter.
Denne tilnærmingen kan brukes til å spore dynamikken i fine microglia-prosesser, en prosedyre som har bedre romlig oppløsning i enkeltplanbilder, eller hvis maksimale intensitetsprojeksjoner utarbeides med fokus på individuelle celler (figur 5). Den dårlige aksialoppløsningen forårsaket av optisk aberrasjon gjennom muselinsen utelukker undersøkelse av fine detaljer i z-dimensjonen. For å avgjøre om denne avbildningsteknikken kan observere degenerative endringer i cellulær ultrastruktur, ble 1 μL 50 mM N-metyl-D-aspartat (NMDA) injisert i glasslegemet for å indusere excitotoksisk lesjon. En dag etter injeksjon viste mikroglia korte prosesser eller amoeboid morfologi (figur 5) i henhold til tidligere rapporter16. Det skal bemerkes at celler i Cx3cr1-GFP-transgen linje viste mer jevn og fullstendig fluorescerende proteinuttrykk over den cellulære kohorten enn i eksperimenter med AAV-mediert levering av fluorescerende proteinuttrykkskassetter. Fordelene med variert og sparsom versus fullstendig og jevn merking bør vurderes ved utforming av eksperimenter.
For å merke retinal vaskulatur som tidligere beskrevet8, ble mus injisert intraperitonealt med 200 μL Evans blå fargestoff (20 mg / ml i steril saltvann) 30-60 minutter før avbildning. Dette førte til sterk merking av blodkar som kom fra synsnervehodet (figur 6). Overraskende nok vedvarte det fluorescerende signalet om en enkelt injeksjon i minst syv dager. To forskjellige metoder ble brukt til å estimere dimensjonene til in vivo-bildene. Først ble de samme retinale områdene avbildet in vivo og etter fiksering i flate retinale wholemounts ved hjelp av konfokalmikroskopi (figur 7). Tilfeldige cellepar ble valgt fra fire forskjellige in vivo-prøver, og den sanne avstanden mellom cellepar ble målt i konfokale skanninger og matchet med in vivo pikselavstand for å oppnå en gjennomsnittlig pikselstørrelse på 0,99 μm med 1x digital forstørrelse. Bruk av lignende metoder som korrelerer in vivo-bilder med konfokale wholemount-skanninger, har avslørt at en enkelt hodeposisjon tillater avbildning over en omtrent 650 mm2 av netthinnen.
Omplassering av hodeholderen langs en torsjonsakse kan gi tilgang til et lineært område av netthinnen 2,2 mm i lengde (ikke vist). Videre ble fluorescerende mikrosfærer med diameter på 1 eller 2 μm injisert i musens øyne, og diameteren ble målt som halvmaksimum linjeskanninger i full bredde fra in vivo-bilder med 10x digital zoom. Dette ga et litt større pikselstørrelsesestimat, men med mer varians (figur 7). Samlet sett er konfokal avbildning av wholemount-prøver etter fullføring av in vivo-eksperimenter den mest konsistente metoden for å tildele skala til individuelle bilder, da varians i hornhinnen og linseegenskapene kan endre bildeskalaen fra prøve til prøve.
Figur 1: Lysbane skjematisk. De grunnleggende komponentene i to-fotonmikroskopet som brukes i denne protokollen, består av en Pockels-celle for å modulere laserkraft, et linsepar for å redusere laserstrålediameteren for å matche mikroskopets bakåpning, og et par galvo-skannespeil for strålestyring. Et par styrespeil er til stede før hver større optisk komponent. Fokuset styres av en motor som driver målfestet. Utslippslysbanen kan tilpasses for forskjellige fluoroforer ved å bytte ut dikroiske og barrierefiltre. Et generelt oppsett for cyan / gul / rød bildebehandling vises der et kortpass dikroisk speil leder rødt lys til den første PMT, og et langpass dikroisk speil parret med passende båndpassfiltre brukes til å skille cyan og gule utslipp. Forkortelse: PMT = fotomultiplikator rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Posisjonering av mus for in vivo-avbildning. For å plassere musen med eleven på aksen med lysbanen, blir den bedøvede musen først festet i en hodeholder, hodet roteres og vinkles, en stor dråpe smøremiddeløyegel plasseres på øyet, og musen plasseres på scenen. Et deksel er montert i dekselholderen vinkelrett på lysbanen og senket ned mot øyet. Dekselet skal ikke komme i kontakt med hornhinnen eller musehodet (til venstre), noe som vil være tydelig hvis dekselet avbøyes. Imidlertid bør dekselet også være nær nok til å unngå midje på dråpen (høyre), fordi dette vil ha en demagnifiserende effekt på prøven. Etter påføring av gelnedsenking og sikring av dekselet, bør scenen flyttes på plass direkte under mikroskopmålet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Avbildning av retinale ganglionceller. For bildevisning opprettes projeksjoner med maksimal intensitet med z-planene som inneholder celler av interesse, og resulterende bilder blir medianfiltrert for å fjerne PMT-skuddstøy. To eksempler på retinale ganglionceller merket ved å injisere AAV-EF1a-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus er vist, spesielt CFP-signalet. Bilder ble tatt med fire dagers mellomrom, og vaskulære landemerker ble brukt til å returnere til samme region nær synsnervehodet. Synsnervehodet er orientert mot bunnen av bildet. Selv om begge prøvene viser en viss varians i orientering (regioner med redusert intensitet er indikert med piler), er de fleste celler til stede på begge tidspunkter. Skala bar = ca 50 μm. Forkortelser: PMT = fotomultiplikator rør; AAV = adeno-assosiert virus; EF1α = forlengelse faktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2; CFP = cyan fluorescerende protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Avbildning av amakrine celler. Amacrine-celler ble merket ved å injisere AAV-EF1a-FLEX-Twitch2b i VGat-Cre transgene mus. CFP-signalet til Twitch 2b er spesielt vist. Små projeksjoner med maksimal intensitet fokusert på dypet av det indre kjernelaget indikerer amakrine celle somas, mens fokus på den indre plexiformen løser amakrine celleneuritter (pil). Synsnervehodet er orientert mot høyre i bildet. Skala bar = ca 50 μm. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; EF1α = forlengelse faktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGat = vesikulær gamma aminosmørsyretransportør; CFP = cyan fluorescerende protein; INL = indre kjernelag; IPL = indre plexiformlag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bildemikroglia. Den transgene muselinjen Cx3cr1-GFP ble brukt til å merke microglia. En maksimal intensitetsprojeksjon av hele skannevolumet viser mange mikroglia, noen med fine prosessdetaljer som kan løses. Legg merke til at celler nederst til venstre i feltet har mindre forvrengning i maksimal projeksjon enn de mot øvre høyre på grunn av parallakse i denne regionen. Maksimal intensitetsprojeksjoner som bare inneholder cellen av interesse, reduserer denne parallaksen betydelig (senter, bokset i tilsvarende farger). Videre kan denne bildestrategien dokumentere dynamikken i finmikrogliaprosessombygging (lavere paneler). Til sammenligning kan man se mange mikroglia med korte prosesser eller amoeboid morfologi én dag etter en eksitotoksisk lesjon ved intravitreal injeksjon av 50 mM NMDA (høyre). Skala bar = ca 50 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; Cx3cr1 = Cx3 kjemokinreseptor 1; NMDA = N-metyl-D-aspartat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Merking av vaskulære landemerker. Mus ble injisert med 200 μL av 20 mg / ml Evans blå intraperitonealt 30-60 min før første bildebehandling. Full tykkelse maksimal intensitetsprojeksjoner viser varig fluorescens i retinal vaskulatur som vedvarte i minst syv dager. Skala bar = ca 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bildedimensjoner. Retinale ganglionceller merket ved å injisere AAV-EF1a-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus ble avbildet in vivo, og det samme området ble deretter avbildet ved konfokal laserskanningsmikroskopi etter fiksering og helmontert forberedelse av netthinnen. Gul fluorescerende proteinkanal vises for begge. Fargede pilpar indikerer samme celle i begge preparatene (øvre paneler). Enkeltplansbilde med fluorescerende mikrosfærer med diameter på 2 μm injisert intravitrealt og avbildet in vivo (nedre venstre panel). Mikrosfærene slo seg ikke til ro og var dermed i konstant bevegelse, noe som gjorde måling av aksial oppløsning umulig. Pikselstørrelser beregnet ut fra halvmaksimale målinger i full bredde av in vivo fluorescerende mikrosfærer eller korrelative konfokale målinger tatt fra 2-4 netthinner per gruppe (nederst til høyre). Skala bar = 50 μm. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; EF1α = forlengelse faktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Kalsiumaktivitet indusert av to-foton skanning. Retinale ganglionceller merket ved å injisere AAV-EF1a-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus, YFP er pseudofarget magenta og CFP grønn, avbildet i et enkelt plan som en tidsserie ved 4,22 Hz. Alle RGCs hadde et lignende start YFP / CFP-forhold. De fleste svarte med en økning i FRET-ratio (ekskludert oransje celle), og man opprettholdt et høyt YFP/CFP-forhold gjennom hele tidsserien (gul celle). YFP / CFP-forhold ble normalisert til det første rammegjennomsnittet, og fargede sirkler samsvarer med fargede spor. Stjerner indikerer tidspunkter med representative bilder vist til venstre. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; EF1α = forlengelse faktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2; YFP = gult fluorescerende protein; CFP = cyan fluorescerende protein; RGCs = retinale ganglionceller; FRET = fluorescensresonans energioverføring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
To-fotonavbildningsprosedyren beskrevet her muliggjør langsgående in vivo-avbildning av musens netthinne. Repeterbare bilder av samme netthinneområde kan tas i en sammenhengende periode på opptil 6 timer eller mer under isofluran. Musen kan også avbildes på forskjellige dager ved hjelp av cellulære og vaskulære landemerker for å finne det samme bildeområdet (figur 3). Bruken av en klar gel nedsenking kombinert med dekselglass til dette formålet har tidligere blitt brukt på en rekke prosedyrer, inkludert visualisering av retina for subretinal injeksjon, laserinduserte retinalskademodeller og fundus imaging20,21,22.
Øyets anatomi gir unike utfordringer for in vivo-avbildning, da den høye optiske kraften til musens hornhinne og linse hindrer direkte avbildning gjennom eleven uten korreksjon. Flere andre in vivo avbildningsmetoder er avhengige av bruk av en plano-konkav kontaktlinse for korreksjon av den fremre optikken i museøyet 7,17,18,19. Med bare optisk korreksjon ved hornhinnen, resulterer den høye optiske kraften til muselinsen i en uunngåelig mengde parallakse, spesielt av strukturer i det perifere skannefeltet, som manifesterer seg som strekk og translasjonsbevegelse i X-Y-dimensjonen ved forskjellige Z-plan. For å minimere bildeparallakserelatert forvrengning i X- og Y-dimensjoner, er det avgjørende at museøyet er orientert slik at tangentplanet til netthinnen ved bildeområdet er vinkelrett på mikroskopets lysbane. Oppsettet som er beskrevet her, bidrar til presis manipulering av øyets vinkel for å oppnå denne justeringen. En justerbar musehodeholder som tillater rotasjon langs to akser, muliggjør enkle manuelle justeringer av øyets vinkel når eksperimentøren ruller gjennom Z-dimensjonen for å minimere parallakse. Denne vippingen omgår også elevens feltstoppeffekt for å tillate avbildning av større områder av netthinnen. Fastholdelsen av hodeholderen reduserer også bevegelsesartefakter forårsaket av respirasjon.
Det må utvises forsiktighet for å opprettholde klarhet i museøyet, da bildekvaliteten vil forverres med opacifisering under kontinuerlig avbildning. Hyppig påføring av smøremiddelgel under bildebehandling og salvepåføring etter hver bildebehandling bidrar til å forhindre at øyet tørker og utvikler fortetninger. Noen hornhinde fortetninger vil spontant løse etter 24-48 timer. Bruken av klar gel og dekselglass som beskrevet i denne protokollen gir lignende bildekvalitet og aberrasjonskorreksjon som en kontaktlinse7, samtidig som det muliggjør enklere justeringer av øyevinkelen uten å måtte justere dekselglasset. I tillegg gir gelen kontinuerlig hydrering til øyet, noe som gjør det mulig å utføre akutte bildebehandlingsøkter på opptil flere timer. Til slutt, siden dekselglasset ikke kommer i kontakt med hornhinnen, forårsaker det minimal irritasjon i øyet som kan redusere optisk klarhet for gjentatte bildebehandlinger.
En begrensning av denne tilnærmingen er det faktum at optiske avvik ikke er helt korrigert. Selv om dette sterkt reduserer aksial oppløsning på grunn av den tunge parallaksen, kan kvantitative målinger av soma oppnås i enkeltbildeplan. Det skal bemerkes at ettersom fluorescenssignalintensiteten til retinale nevroner er avhengig av prøvejustering med denne metoden, er eksitasjons- og utslippsforholdmetriske baserte sensorer mer hensiktsmessige for eksperimenter som sammenligner prøver kronisk på tvers av forskjellige bildebehandlingsøkter. En tilnærming til å korrigere optiske avvik på systemnivå er adaptiv optikk, noe som muliggjør subcellulær oppløsning i netthinnen 8,9,14,21. Adaptiv optikk krever imidlertid høyt spesialisert utstyr og omfattende kompetanse for å implementere.
Alternative tilnærminger til to-foton in vivo retinal imaging er konfokalmikroskopi eller oftalmoskopi6. Tilnærmingen som presenteres her, bør lett kunne oversettes til vidvinkel- eller konfokalmikroskopi. Enkeltfotonavbildning er kanskje mer robust og utgjør mindre risiko for å skade netthinnen på grunn av høy energi fra to-fotonlaseren som er nødvendig for å oppnå effektiv to-fotoneffekt gjennom hornhinnen og øyets linse. For å unngå to-foton laserskade, bør terskelen for maksimal lasereffekt empirisk bestemmes ved å undersøke helmonterte netthinner etter ferdigstillelse av bildeeksperimenter og immunostaining for celletyper i lagene som er avbildet. I systemet som presenteres her, ble RGC merket med pan-RGC-markøren, Rbpms, og tettheter var normale opp til 45 mW bildeeffekt, mens 55 mW forårsaket et signifikant tap av RGC (ikke vist).
En ulempe med enkeltfotonavbildning er det faktum at denne tilnærmingen i stor grad vil stimulere de innfødte visuelle kretsene i netthinnen sammenlignet med to-fotonbilder23. Tidligere eksperimenter ved bruk av retinal wholemounts eller eyecup preparater har vist at to-foton laserskanning fremkaller kretsaktivering som i stor grad er forbigående24. Her viser avbildning av RGC-aktivitet med Ca 2+-sensoren Twitch2b at starten på laserskanning induserer Ca 2+-stigninger, som går tilbake til baseline i løpet av5-20 s i de fleste RGCer (figur 8). Gitt at laserkraften i denne protokollen er innenfor rekkevidden av tidligere eksperimenter som rapporterer in vivo retinal lysrespons8, er den for tiden beskrevne metoden sannsynligvis egnet til opptak av kretsaktivitet i netthinnen. Slike hensyn er viktige for forsøk som kan påvirkes av kretsaktivitet.
Denne protokollen demonstrerer in vivo avbildning av to typer retinale nevroner, RGCs og amacrine celler. Lignende merking av andre store celletyper kan oppnås, inkludert horisontale celler (Cx57-Cre 25), bipolare celler (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), kjeglefotoreceptorer (S- eller M-opsin-Cre 28), stavfotoreceptorer (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) og pericytter (NG2-DsRed9). Transgene mus er også tilgjengelige for å merke diskrete delmengder av RGC (f.eks. KCNG4-Cre for αRGCs30; OPN4-Cre for ipRGCs31; JAM-B-CreER for J-RGCs 32) og amakrine celler (f.eks. ChAT-Cre for starburst amacrine celler26 og neuropeptidpromotor drivere for ulike amakrine celle subtyper 3,34). Virale vektorer kan brukes til å målrette mot spesifikke cellepopulasjoner i stedet for transgene mus. Intravitreale injeksjoner av AAV2 med et allestedsnærværende CAG-promotorelement merker nesten utelukkende RGCer, amakrine celler og horisontale celler25. Paring av det modifiserte AAV2.7m8-Y444F-kapsidet med en konstruert mGluR6-promotorkonstruksjon muliggjør bred merking av ON bipolare celler35. Subretinale injeksjoner av AAV fører til en anrikning av fotoreseptorer, med serotype AAV2/5 som har den høyeste transduksjonseffektiviteten36. Shh10, et modifisert AAV6 kapsidprotein, parret med gliafibrillære sure proteinpromotorelementer, er vist spesifikt for Müller glia37.
Evnen til å observere celler i sentralnervesystemet med en helt ikke-invasiv tilnærming kan brukes til å studere både grunnleggende egenskaper av nevrale kretser8, samt mekanismer for nevrodegenerasjon 3,4,5,6,38. Mange blindende sykdommer retter seg mot cellulære populasjoner i netthinnen, og in vivo imaging tilnærminger hos mus har blitt brukt til å studere optisk nerveskade 1,3,4, makuladegenerasjon13, slag5, DrDeramus 2,6 og uveitt7. Videre manifesterer mange nevrodegenerative tilstander i sentralnervesystemet i netthinnen, inkludert Alzheimers sykdom39, multippel sklerose40 og Parkinsons sykdom41. Derfor kan denne lett tilgjengelige teknikken for in vivo avbildning av netthinnen brukes som et verktøy for å studere et bredt sett av nevrodegenerative forhold.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award til PRW og et ubegrenset tilskudd til Institutt for oftalmologi og visuell vitenskap ved Washington University School of Medicine i St. Louis), National DrDeramus Research (et program for BrightFocus Foundation) og McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. støttes av en Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Dette arbeidet ble også støttet av Hope Center Viral Vectors Core ved Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
