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Neuroscience

माउस रेटिना के विवो इमेजिंग में ट्रांसप्युपिलरी टू-फोटॉन

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/61970
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3,4
1John F. Hardesty, MD Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Neuroscience, Washington University School of Medicine, 3Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine, 4Hope Center for Neurological Disorders, Washington University School of Medicine

Summary

विवो इमेजिंग में स्वास्थ्य और बीमारी में जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल एक मानक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ माउस रेटिना की ट्रांसप्युपिलरी इमेजिंग का वर्णन करता है। यह रेटिना के कई सेलुलर समूहों को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए विवोइमेजिंग विधियों में भी अलग-अलग प्रदर्शित करता है।

Abstract

रेटिना पर्यावरण से प्रकाश संकेतों को विद्युत संकेतों में बदल देता है जो मस्तिष्क में प्रसारित होते हैं। रेटिना के रोग प्रचलित हैं और दृश्य हानि और अंधापन का कारण बनते हैं। यह समझना कि ऐसी बीमारियां कैसे प्रगति करती हैं, नए उपचार तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। रोग के पशु मॉडल में विवो माइक्रोस्कोपी न्यूरोडीजेनेरेशन को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और अल्जाइमर रोग से स्ट्रोक तक की स्थितियों के उपचार की दिशा में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। यह देखते हुए कि रेटिना एकमात्र केंद्रीय तंत्रिका तंत्र संरचना है जो ऑप्टिकल दृष्टिकोण द्वारा स्वाभाविक रूप से सुलभ है, यह स्वाभाविक रूप से विवो इमेजिंग में खुद को उधार देता है। हालांकि, लेंस और कॉर्निया के देशी प्रकाशिकी प्रभावी इमेजिंग पहुंच के लिए कुछ चुनौतियां पेश करते हैं।

यह प्रोटोकॉल सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर माउस रेटिना में सेलुलर समूहों और संरचनाओं के विवो टू-फोटॉन इमेजिंग के लिए तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है, जो तीव्र और पुरानी अवधि इमेजिंग प्रयोगों दोनों के लिए लागू होता है। यह एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) वैक्टर, ट्रांसजेनिक चूहों और अकार्बनिक रंगों सहित लेबलिंग तकनीकों के एक सूट का उपयोग करके रेटिना गैंग्लियन सेल (आरजीसी), एमोक्राइन सेल, माइक्रोग्लियल और संवहनी इमेजिंग के उदाहरण प्रस्तुत करता है। महत्वपूर्ण रूप से, ये तकनीकें रेटिना के सभी सेल प्रकारों तक फैली हुई हैं, और रुचि की अन्य सेलुलर आबादी तक पहुंचने के लिए सुझाए गए तरीकों का वर्णन किया गया है। प्रदर्शन और परिमाणीकरण के लिए मैन्युअल छवि पोस्टप्रोसेसिंग के लिए उदाहरण रणनीतियाँ भी विस्तृत हैं। ये तकनीकें स्वास्थ्य और बीमारी में रेटिना फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए सीधे लागू होती हैं।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विवो विज़ुअलाइज़ेशन में आम तौर पर खोपड़ी को पतला करने और ग्लास खिड़कियों या ऑप्टिकल रिले लेंस की स्थापना जैसी आक्रामक प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। रेटिना तंत्रिका तंत्र में एकमात्र संरचना है जिसे आक्रामक तैयारी की आवश्यकता के बिना सीधे देखा जा सकता है क्योंकि यह मूल रूप से पर्यावरण से प्रकाश प्राप्त करता है। रेटिना तक ऑप्टिकल पहुंच की आसानी इसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाती है।

चूहों में रेटिना के लाइव फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग ग्लूकोमा 1,2, ऑप्टिकतंत्रिका चोट 1,3,4 और स्ट्रोक5 के मॉडल में आरजीसी मृत्यु को ट्रैक करने के लिए किया गया है, साथ ही अपक्षयी स्थितियों में माइक्रोग्लियल सक्रियण 6,7,8 और वाहिका9 में परिवर्तन। आंतरिक संकेतों का उपयोग फोटोरिसेप्टर10,11,12 और रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं 13 की कल्पना करनेके लिए भी किया जा सकता है। रेटिना के विवो इमेजिंग में कई दृष्टिकोण या तो विशेष रूप से नेत्र विज्ञान उद्देश्यों के लिए डिज़ाइन किए गए अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों का उपयोग करते हैं6 या अत्यधिक संशोधित ऑप्टिकल सिस्टम कॉर्निया और लेंस 8,9,11,12,13,14 के मूल विचलन को ठीक करने के लिए।

वर्तमान प्रोटोकॉल सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर रेटिना में फ्लोरोसेंट सिग्नल के विवो इमेजिंग में एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है, माउस आंख के पूर्ववर्ती प्रकाशिकी के लिए आंशिक रूप से सही करने की एक बुनियादी विधि का उपयोग करता है। इस रणनीति के लिए मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए बहुत मामूली अनुकूलन की आवश्यकता होती है जो आमतौर पर मस्तिष्क के विवो इमेजिंग में उपयोग किए जाते हैं। चूंकि यह दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए सीधा है, और चूहे थोड़े तनाव में हैं, इसलिए तीव्र और पुरानी अवधि दोनों पर समय-चूक प्रयोग करने के लिए अनुकूल है। इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक और कार्बनिक डाई-आधारित प्रक्रियाएं जो आरजीसी, एमोक्रिन कोशिकाओं, माइक्रोग्लिया और वास्कुलचर सहित व्यक्तिगत रेटिना घटकों को लेबल करती हैं, इस इमेजिंग तकनीक के साथ संगत हैं और रेटिना फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण सेल प्रकारों और संरचनाओं के विवो अवलोकन में सक्षम हैं। इन उपकरणों को रेटिना के अधिकांश अन्य न्यूरोनल सेल प्रकारों के साथ-साथ ग्लियल और संवहनी घटकों को लेबल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

नोट: सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुपालन में निम्नलिखित प्रक्रिया की गई थी। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों, उपकरणों और जानवरों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. एडेनो से जुड़े वायरस इंजेक्शन

नोट: रेटिना में विशिष्ट कोशिकाओं की लेबलिंग अभिव्यक्ति के प्रतिबंधित पैटर्न के साथ क्रे ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में पूरी की जा सकती है। यह खंड एएवी-वैक्टर के इंट्राविट्रल डिलीवरी का वर्णन करता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सीआरई-निर्भर अभिव्यक्ति को एन्कोड करता है, इस प्रकार विशिष्ट रेटिना कोशिकाओं को लेबल करता है। इंजेक्शन चूहों (नर और मादा), 4 सप्ताह की उम्र से शुरू होता है।

  1. माइक्रोपिपेट सुई तैयार करना
    1. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका सुई बनाने के लिए एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। माइक्रोपिपेट पुलर में एक ग्लास केशिका लोड करें और परिणामी मूल्य रिकॉर्ड करते हुए रैंप टेस्ट करें। रैंप टेस्ट के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास केशिका को छोड़ दें।
    2. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ माइक्रोपिपेट्स खींचें: गर्मी: रैंप टेस्ट मान माइनस 10; पुल: 55; वेग: 65; समय: 120; हवा का दबाव: 500; खींचने की शुरुआत में हवा का समय: 20.
      नोट विभिन्न पुलर्स के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, उस स्थान पर खींचे गए माइक्रोपिपेट की नोक को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें जहां कांच की नोक बल के तहत थोड़ा सा विक्षेपित होती है, पतला खंड के अंत से ~ 10 मिमी। एक तेज कोण पर इस तरह से काटें कि कट एक घुमावदार नोक पैदा करे। कुंद युक्तियों को छोड़ दें।
  2. इंजेक्शन सिरिंज तैयार करना
    1. एथिल विनाइल एसीटेट (ईवीए) प्लास्टिक ट्यूबिंग (0.05 "आंतरिक व्यास, 0.09" बाहरी व्यास) के 2 सेमी खंड में एक कट ग्लास माइक्रोपिपेट फिट करें। इस ट्यूबिंग सेगमेंट के दूसरे छोर को ईवीए ट्यूबिंग की 20 सेमी लंबाई (0.02 "आंतरिक व्यास, 0.06" बाहरी व्यास) से कनेक्ट करें।
    2. ट्यूबिंग को 22 ग्राम सीमेंटेड सुई के साथ 50 μL ग्लास सिरिंज से कनेक्ट करें। ग्लास सिरिंज से प्लंजर को निकालें और सिरिंज को बैकफिल करें और 25 ग्राम सिरिंज सुई का उपयोग करके खनिज तेल के साथ ट्यूबिंग को जोड़ा। माइक्रोपिपेट के सिरे पर 4 मिमी हवा की जगह छोड़ दें।
  3. एएवी का इंट्राविट्रल इंजेक्शन
    1. जीवित रहने की सर्जरी के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार बाँझ सर्जिकल दस्ताने, साफ लैब कोट, मास्क, बाँझ क्षेत्र और आटोक्लेव उपकरणों का उपयोग करके मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक के साथ इंट्राविट्रल इंजेक्शन करें।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से एएवी वेक्टर के एक एलिकोट को हटा दें और बर्फ पर पिघल जाएं। पिघलने के बाद, किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 2,000 × ग्राम पर 10 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    3. संस्थागत पशु अध्ययन समिति के संज्ञाहरण और नियंत्रित पदार्थ दिशानिर्देशों का पालन करें। 30 ग्राम हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करके, केटामाइन / ज़ाइलाज़िन कॉकटेल (10 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन, खारा में 1 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलाज़िन, माउस को प्रभावी खुराक: 100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन, 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन) का 0.1 एमएल / 10 ग्राम शरीर के वजन इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन करें। माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और संज्ञाहरण को प्रभावी करने के लिए 5 मिनट की अनुमति दें।
    4. 30 ग्राम हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करके, मेलोक्सिकैम (0.9% सोडियम क्लोराइड में 0.5 मिलीग्राम / एमएल) के शरीर के वजन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन का 0.1 एमएल / 10 ग्राम प्रदर्शन करें।
    5. पूंछ और पैर की अंगुली की चुटकी में कॉर्नियल रिफ्लेक्स और वापसी रिफ्लेक्स के नुकसान की पुष्टि करके संज्ञाहरण की गहराई का परीक्षण करें। यदि पूंछ और पैर की अंगुली की वापसी रिफ्लेक्स के नुकसान के बाद कॉर्नियल रिफ्लेक्स बना रहता है, तो प्रत्येक आंख पर 0.5% प्रोपैराकेन समाधान की एक बूंद लागू करें और 10 सेकंड तक प्रतीक्षा करें।
    6. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे माउस को अपनी तरफ रखें। कक्षा से बेहतर और अवर त्वचा को पकड़ने के लिए एक मिनी बुलडॉग हेमोस्टैटिक क्लैंप का उपयोग करें, और ग्लोब को कक्षा से बाहर आंशिक रूप से विस्थापित करने के लिए मध्यवर्ती कैंथस पर क्लैंप को सुरक्षित करें।
    7. कांच की सिरिंज से जुड़े कटे हुए माइक्रोपिपेट के साथ पार्श्व श्वेतपटल को पंचर करें, ~ 1-2 मिमी लिम्बस के पीछे। वाहिका को परेशान करने से बचें जो लिम्बस के तुरंत पीछे परिधीय रूप से चलता है। पंचर को श्वेतपटल के लंबवत कोण पर करें, और लेंस को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए श्वेतपटल को छेदने के तुरंत बाद माइक्रोपिपेट को थोड़ा वापस ले लें।
    8. ग्लास सिरिंज के प्लंजर का उपयोग 1-2 μL विट्रियस हास्य को वापस लेने के लिए करें, जो इंजेक्शन के लिए लक्षित द्रव की मात्रा के अनुरूप है। आंख से माइक्रोपिपेट को वापस लें, और हटाए गए विट्रियस हास्य को बाहर निकाल दें।
    9. मिश्रण से बचने के लिए वायरल वेक्टर और खनिज तेल के बीच ~ 4 मिमी वायु स्थान छोड़ते हुए, एएवी के 1-2 μL के साथ माइक्रोपिपेट की नोक भरें। पहले पंचर द्वारा बनाए गए श्वेतपटल में छेद में माइक्रोपिपेट डालें, और 20-30 सेकंड के दौरान वायरल वेक्टर को इंजेक्ट करने के लिए धीरे-धीरे ग्लास सिरिंज के प्लंजर को दबाएं। माइक्रोपिपेट के सिरे में वायरल वेक्टर के द्रव स्तर की कल्पना करें, और किसी भी हवा को आंख में प्रवेश करने से पहले इंजेक्शन को रोकने के लिए सावधान रहें।
    10. माइक्रोपिपेट को 10 सेकंड के लिए एक ही स्थिति में रखें, फिर माइक्रोपिपेट को वापस लें। बुलडॉग हेमोस्टैटिक क्लैंप को हटा दें।
    11. ऑक्सीटेट्रासाइक्लिन/पॉलीमाइक्सिन बी एंटीबायोटिक ऑप्थेल्मिक मलहम इंजेक्ट की गई आंखों पर लगाएं। माउस को हीटिंग पैड पर रखें, और संज्ञाहरण से इसकी वसूली की निगरानी करें (3.4.3 देखें)।
    12. माउस को उसके आवास पर वापस करें, और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार पोस्टऑपरेटिव देखभाल करें। इमेजिंग से पहले फ्लोरोफोरे की वायरल-मध्यस्थता अभिव्यक्ति के लिए 2-3 सप्ताह की अनुमति दें।

2. माइक्रोस्कोप सेटअप

नोट: माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

  1. "ऑलवेज-ऑन" उपकरण: इन उपकरणों को हमेशा तब तक चालू रहना चाहिए जब तक कि समायोजन या रखरखाव से न गुजरें। लेजर शीतलन प्रणाली के उच्च तापमान को 20.0 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। अल्ट्राफास्ट टीआई: सफायर लेजर के लिए मुख्य शक्ति चालू करें, सिस्टम स्टार्टअप प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए समय दें, और "लेजर सक्षम" कुंजी को "ऑन" स्थिति में बदल दें।
  2. उत्सर्जन प्रकाश पथ विन्यास
    1. फ्लोरोफोरेस के लिए उपयुक्त डाइक्रोइक और बैंड पास फिल्टर सेट का उपयोग करके नमूना तरंग दैर्ध्य के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संग्रह पथ को कॉन्फ़िगर करें।
      नोट: इस पांडुलिपि में, ट्विच 2 बी इमेजिंग ने एक फिल्टर क्यूब का उपयोग किया जिसमें 505 लंबा पास डाइक्रोइक और 480/40 और 535/30 बैंड पास फिल्टर जोड़े शामिल थे। जीएफपी को लाल /हरे रंग के फ़िल्टर क्यूब का उपयोग करके चित्रित किया गया था जिसमें 525/50 और 605/70 बैंड पास फ़िल्टर के साथ 560 लंबा पास फ़िल्टर शामिल था। इवांस ब्लू को 560 शॉर्ट पास फिल्टर का उपयोग करके चित्रित किया गया था। उत्सर्जन फिल्टर बदलने से उत्सर्जन प्रकाश पथ को आवारा कमरे के प्रकाश में उजागर किया जाता है जो फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों (पीएमटी) को नुकसान पहुंचा सकता है। सुनिश्चित करें कि पीएमटी बंद हैं, और संग्रह प्रकाश पथ को संशोधित करने से पहले कमरे की रोशनी बंद कर दें क्योंकि प्रकाश जोखिम पीएमटी फ़ंक्शन पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है।
  3. छवि अधिग्रहण शुरू करना
    नोट: दो-फोटॉन लेजर के लिए प्रत्यक्ष संपर्क खतरनाक है, खासकर आंखों के लिए क्योंकि दूर-लाल प्रकाश पलक प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करेगा। यह सुनिश्चित करने के लिए उचित देखभाल की जानी चाहिए कि लेजर प्रकाश पथ के साथ बंद है, और माइक्रोस्कोप उद्देश्य से आंखों के टुकड़ों या उत्सर्जन के माध्यम से उपयोगकर्ता को जोखिम से बचाने के लिए असफल-तिजोरियां हैं। उपयोगकर्ताओं को समझना चाहिए कि किन परिस्थितियों में लेजर उद्देश्य से उत्सर्जित होगा, और इस तरह के खतरों के लिए खुद को उजागर न करने के लिए उचित सावधानी बरतें।
    1. डेटा अधिग्रहण डिवाइस, कंप्यूटर, पोकेल्स सेल, माइक्रोस्कोप और स्टेज कंट्रोलर, मैकेनिकल शटर कंट्रोलर और पीएमटी मुख्य शक्ति चालू करें। पीएमटी को "अक्षम" स्थिति में रखें जब तक कि छवि अधिग्रहण के लिए तैयार न हो और आवारा प्रकाश से परिरक्षित न हो। कंप्यूटर और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर लेजर नियंत्रण इंटरफ़ेस खोलें। कंप्यूटर इंटरफ़ेस से लेजर चालू करें और मोड-लॉकिंग सुनिश्चित करें।
    2. वांछित लेजर तरंग दैर्ध्य सेट करें। सुनिश्चित करें कि लेजर शटर खोलकर लेजर प्रकाश पोकेल्स सेल में प्रवेश कर रहा है, और लेजर शक्ति को स्थिर करने के लिए 30 मिनट की अनुमति दें।
  4. उद्देश्य पर लेजर शक्ति को मापना और अधिकतम लेजर प्रतिशत सेट करना
    नोट: लेजर विकिरण बिजली माप के दौरान उद्देश्य लेंस से उत्सर्जित होता है। माइक्रोस्कोप बाड़े के पर्दे को बंद करें, और इमेजिंग शटर को सक्षम करने से पहले उचित आंखों की सुरक्षा पहनें। प्रारंभिक प्रणाली स्थापना के समय लेजर शक्ति को मापें ताकि रुचि के प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए पावर आउटपुट वक्र स्थापित किया जा सके और उसके बाद उत्तेजना शक्ति की स्थिरता को सत्यापित करने के लिए मासिक रूप से।
    1. ऑप्टिकल पावर मीटर चालू करें, और लेजर तरंग दैर्ध्य के अनुरूप माप तरंग दैर्ध्य का चयन करें। माइक्रोस्कोप चरण पर ऑप्टिकल पावर मीटर डिटेक्टर रखें और इसे एक्स-वाई आयामों में उद्देश्य लेंस के नीचे सीधे पैंतरेबाज़ी करें। जेड-आयाम मोटराइज्ड फोकस ड्राइव का उपयोग करके, उद्देश्य लेंस को तब तक कम करें जब तक कि पावर मीटर डिटेक्टर उद्देश्य लेंस से ~ 1 मिमी नीचे न हो।
    2. माइक्रोस्कोप उत्तेजना प्रकाश पथ के रूप में एपिफ्लोरेसेंस रोशनी से लेजर में स्विच करें। यांत्रिक शटर सक्षम करें।
    3. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, इमेजिंग शटर खोलने के लिए एक बिंदु स्कैन शुरू करें, और लेजर को ऑप्टिकल पावर मीटर पर भेजें। स्कैनिंग सॉफ्टवेयर में लेजर पावर को 100% सेट करें। उच्चतम लेजर पावर माप प्राप्त होने तक पावर मीटर डिटेक्टर के एक्स-वाई और जेड पदों को अनुकूलित करें।
    4. पोकेल्स सेल पर 0.1% से 100% तक उद्देश्य पर लेजर शक्ति को मापें, 10% अंतराल पर माप लें। उद्देश्य पर 45 mW शक्ति के अनुरूप पोकेल्स सेल प्रतिशत रिकॉर्ड करें। छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में अधिकतम लेजर शक्ति के रूप में इस प्रतिशत को सेट करें।
      नोट: लक्ष्य ऊतक को दिखाई देने वाले नुकसान के बिना विवो माउस रेटिना इमेजिंग में देखी गई उच्चतम शक्ति 45 एमडब्ल्यू थी, जैसा कि इमेजिंग के दो सप्ताह बाद हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग द्वारा जांच की गई थी। उद्देश्य पर 55 mW के साथ इमेजिंग के बाद स्पष्ट रेटिना क्षति स्पष्ट है।
    5. इमेजिंग शटर को अक्षम करें और उत्तेजना प्रकाश पथ को एपिफ्लोरेसेंस में वापस करें।

3. छवि अधिग्रहण के लिए माउस की तैयारी

  1. इमेजिंग के लिए एनेस्थेटाइजिंग माउस
    नोट: आइसोफ्लुरेन के संपर्क को कम करने के लिए उचित अपशिष्ट गैस स्कैवेंजिंग सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष का निकास पोर्ट एक निष्क्रिय स्कैवेंजिंग गैस फिल्टर कैनिस्टर से जुड़ा हुआ है, और माउस एनेस्थीसिया नोजपीस का आउटलेट गैस निकासी तंत्र द्वारा प्रदान किए गए वैक्यूम के साथ एक सक्रिय स्कैवेंजिंग गैस फिल्टर कैनिस्टर से जुड़ा हुआ है। प्रतिस्थापन के लिए फ़िल्टर कनस्तर वजन की निगरानी के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें।
    1. केटामाइन / ज़ाइलज़िन कॉकटेल का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें जैसा कि चरण 1.3.3 में ऊपर वर्णित है। वैकल्पिक रूप से, संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन के माध्यम से संज्ञाहरण को प्रेरित करें (इमेजिंग सत्र > 30 मिनट)। 0.5 एल / मिनट की प्रवाह दर पर कमरे की हवा के साथ मिश्रित 5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्रेरण कक्ष को भरने के लिए छोटे पशु संज्ञाहरण उपकरण सेट करें। माउस को प्रेरण कक्ष में रखें, और माउस को एनेस्थेटाइज्ड होने के लिए 15 सेकंड की अनुमति दें।
    2. आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 0% पर स्विच करें, और संज्ञाहरण प्रवाह को नाक के टुकड़े में निर्देशित करें। प्रेरण कक्ष के 5 सेकंड "ओ2 फ्लश" का प्रदर्शन करें। माउस को प्रेरण कक्ष से बाहर निकालें, और इसे हेड होल्डर में सुरक्षित करें (अनुभाग 3.3 देखें), नाक के टुकड़े को संलग्न करें।
    3. संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए 0.5 एल / मिनट की प्रवाह दर पर कमरे की हवा के साथ 1% आइसोफ्लुरेन के मिश्रण का उपयोग करें। संज्ञाहरण के दौरान 5 मिनट के अंतराल पर श्वसन दर की निगरानी करें, ~ 60 सांस / मिनट की श्वसन दर बनाए रखने के लिए आइसोफ्लुरेन प्रतिशत को समायोजित करें।
      नोट: इन सेटिंग्स (% आइसोफ्लुरेन, प्रवाह दर) का उपयोग केटामाइन / ज़ाइलज़िन कॉकटेल द्वारा प्रेरित संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए भी किया जा सकता है।
  2. छात्र फैलाव
    1. पानी में 1% w/v एट्रोपिन और 2.5% w/v फेनिलफ्राइन हाइड्रोक्लोराइड का घोल तैयार करें। डिलेटर समाधान को प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. डिस्पोजेबल पिपेट आई ड्रॉपर का उपयोग करके, प्रत्येक आंख पर डायलेटर समाधान की एक बूंद लागू करें जिसे चित्रित किया जाएगा। कमरे की रोशनी बंद करें, और छात्र के फैलने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें। जब पुतली फैल जाती है, तो लिंट-मुक्त ऊतक के साथ डायलेटर समाधान को दूर करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि डायलेटर समाधान नाक के छिद्रों में प्रवेश नहीं करता है।
    3. प्रत्येक आंख पर स्नेहक आंख जेल की एक बड़ी बूंद लागू करें जिसे चित्रित किया जाएगा। यदि दोनों आंखों को चित्रित किया जाना है, तो निर्जलीकरण को रोकने के लिए गैर-इमेजिंग आंख पर आंख जेल पर प्लास्टिक क्लिंग फिल्म का एक छोटा टुकड़ा लागू करें। यदि केवल एक आंख की इमेजिंग होती है, तो आंख पर स्नेहक आंख मलहम लागू करें जिसे चित्रित नहीं किया जाएगा।
  3. इमेजिंग के लिए माउस की स्थिति
    1. इमेजिंग हेड होल्डर में माउस को सुरक्षित करने के लिए, हेड होल्डर के मुख्य हाथ को तब तक घुमाएं जब तक कि ईयरपीस बार क्षैतिज से 60 डिग्री या उससे अधिक के कोण पर झुक न जाए। निचले कान नहर पिन को अंदर की ओर विस्तारित स्थिति में और ऊपरी कान नहर पिन को वापस ली गई स्थिति में सुरक्षित करें।
    2. माउस के काटने की पट्टी का सामना करने के साथ, विस्तारित निचले पिन पर एक कान माउंट करें, पिन को कान नहर में डालें। ऊपरी कान नहर पिन को सुरक्षित करने वाले पेंच को ढीला करें, और पिन को अन्य कान नहर में विस्तारित करें। सिर को सुरक्षित करने के लिए शिकंजा कसें।
    3. काटने की पट्टी को माउस के सिर की ओर स्लाइड करें। धीरे से माउस के सिर को ऊपर उठाएं, फिर माउस के मैक्सिलरी छेदक को काटने की पट्टी के छेद में कम करें। माउस के सिर को सुरक्षित करने के लिए कोमल बल के साथ काटने की पट्टी को वापस लें, और स्क्रू को कसकर काटने की बार की स्थिति को सुरक्षित करें।
    4. यदि आइसोफ्लुरेन का उपयोग कर रहे हैं, तो माउस के छेदक को सुरक्षित करने से पहले अपने स्लॉट के माध्यम से नाक के टुकड़े को काटने की पट्टी पर स्लाइड करें। चरण 3.3.3 में बाइट बार की स्थिति को सुरक्षित और कस लें। अपने ऊपरी चेहरे पर दो स्क्रू का उपयोग करके नाक के टुकड़े को कसें जब तक कि यह माउस की नाक पर अच्छी तरह से फिट न हो जाए, लेकिन स्नाउट को संकुचित न करे।
    5. माउस को, हेड होल्डर में, उद्देश्य के नीचे माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें। सिर धारक के मुख्य हाथ को तब तक घुमाएं जब तक कि आंख की पुतली सीधे प्रकाश पथ के अनुरूप न हो जाए (चित्र 2)।
    6. कॉम्पैक्ट फिल्टर धारक में # 1.5 कवरस्लिप रखें, और धारक को माइक्रोस्कोप चरण से संलग्न करें। आंख की ओर कवरस्लिप को कम करें, स्नेहक आंख जेल से संपर्क करें, जैसे कि कवरस्लिप कॉर्निया के ठीक ऊपर क्षैतिज रूप से स्थित है (चित्रा 2)। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप कॉर्निया को नहीं छूता है।
      नोट: माइक्रोस्कोप पर, सुनिश्चित करें कि उत्तेजना प्रकाश पथ एपिफ्लोरेसेंस पर सेट है और उत्सर्जन प्रकाश पथ को आंखों के टुकड़े पर सेट किया गया है। एपिफ्लोरेसेंस इल्युमिनेटर को उसकी सबसे कम शक्ति पर चालू करें और इलुमिनेटर शटर खोलें। चित्रित किए जा रहे फ्लोरोफोरे के अनुरूप एपिफ्लोरेसेंस इलुमिनेटर तरंग दैर्ध्य और फ्लोरेसेंस फ़िल्टर चुनें।
    7. स्टेज कंट्रोल और मोटराइज्ड फोकस ड्राइव का उपयोग करके जेड-पोजिशन में एक्स-वाई आयामों और उद्देश्य में चरण को पैंतरेबाज़ी करें जब तक कि वाइडफील्ड उत्तेजना प्रकाश कॉर्निया को पूरी तरह से कवर नहीं करता है। आईपीस के माध्यम से देखते हुए, चरण की जेड-स्थिति को समायोजित करना जारी रखें जब तक कि रेटिना में फ्लोरोसेंट कोशिकाएं या संरचनाएं फोकस में न आ जाएं। यदि नमूना संकेत आंखों के टुकड़े के माध्यम से व्यक्तिगत कोशिकाओं या रुचि की संरचनाओं को हल करने के लिए अपर्याप्त रूप से उज्ज्वल है तो एपिफ्लोरेसेंस इल्युमिनेटर शक्ति बढ़ाएं।
      नोट: यदि रेटिना का पता लगाने में परेशानी हो रही है, तो आईरिस रेटिना की ओर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उच्च कंट्रास्ट लैंडमार्क है। यह कदम यह भी सत्यापन की अनुमति देगा कि छात्र अधिकतम रूप से पतला है।
    8. माउस लेंस के साथ अक्ष पर एक इमेजिंग क्षेत्र प्राप्त करें। हेड होल्डर पर स्वतंत्रता की विभिन्न डिग्री का उपयोग करके माउस के कोण को समायोजित करें जब तक कि फोकल प्लेन को समायोजित करते समय केवल आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश का विस्तार या संकुचन न हो। एपिफ्लोरेसेंस इलुमिनेटर को बंद करें और इलुमिनेटर शटर को बंद करें।
      नोट: जेड-दिशा फोकल प्लेन के माध्यम से स्क्रॉल करते समय आउट-ऑफ-फोकस लाइट का महत्वपूर्ण एक्स-वाई पैरालेक्स इंगित करता है कि रेटिना इमेजिंग प्रकाश पथ के संबंध में अक्ष पर नहीं है।

4. दो-फोटॉन छवि अधिग्रहण

  1. छवि सेटअप और अधिग्रहण पैरामीटर
    नोट: कमरे की रोशनी बंद करें, और कमरे में आवारा प्रकाश स्रोतों को कवर करें। सुनिश्चित करें कि एपिफ्लोरेसेंस इलुमिनेटर बंद है, और इलुमिनेटर शटर बंद है।
    1. उत्तेजना प्रकाश पथ को लेजर और उत्सर्जन प्रकाश पथ को पीएमटी में स्विच करें।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, 512 x 512 का फ्रेम आकार और 3 का फ्रेम औसत सेट करें। चरणों को प्रति टुकड़ा -8 μm पर सेट करें। स्टैक के शीर्ष पर शुरू करने और नीचे की ओर प्रगति करने के लिए जेड-स्टेपिंग को नामित करें, फोटोरिसेप्टर के दो-फोटॉन लेजर सक्रियण को कम करें।
      नोट: बढ़े हुए इमेजिंग समय की लागत पर जेड-रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए चरण आकार को कम किया जा सकता है, लेकिन इस इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन में सेल सोमाटा को हल करने के लिए 8 μm चरण पर्याप्त हैं।
    3. PMT को चालू और सक्षम करें। PMT वोल्टेज को 680 V में समायोजित करें। उत्तेजना शटर सक्षम करें।
      नोट: संचालित पीएमटी प्रकाश क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। सुनिश्चित करें कि एपिफ्लोरेसेंस इलुमिनेटर बंद है, माइक्रोस्कोप बाड़े का पर्दा खींचा गया है, और कमरे की रोशनी बंद है।
    4. 1% लेजर शक्ति से शुरू करते हुए लक्ष्य ऊतक का एक लाइव छवि पूर्वावलोकन शुरू करें। रुचि की कोशिकाओं या संरचनाओं की कल्पना करने के लिए प्रदर्शन चमक को स्वचालित रूप से समायोजित करें। स्कैन चरण को स्वतः समायोजित करें। यदि लक्ष्य ऊतक मंद या अस्पष्ट है, तो लेजर शक्ति प्रतिशत बढ़ाएं जब तक कि संरचनाएं 45 एमडब्ल्यू के अनुरूप चरण 2.4.4 में निर्धारित सीमा को पार किए बिना दिखाई न दें।
      नोट: 16-बिट छवि के लिए, जेड-प्लेन में चमक को स्वचालित रूप से समायोजित करते समय ~ 1000 का प्रदर्शन मूल्य जिसमें रुचि की संरचनाएं होती हैं, नमूने की पर्याप्त चमक को इंगित करती है।
    5. एक्स-वाई दिशा में माइक्रोस्कोप चरण को वांछित इमेजिंग क्षेत्र पर केंद्रित करने के लिए पैंतरेबाज़ी करें, फिर फोकस में रुचि की संरचनाओं के साथ जेड-प्लेन पर नेविगेट करें।
      नोट: ऑप्टिक तंत्रिका सिर से सटे इमेजिंग इसे पुरानी इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक स्पष्ट मील का पत्थर के रूप में सेवा करने की अनुमति देता है।
    6. यदि यह एक पुरानी टाइम-लैप्स प्रयोग है, तो अधिग्रहण कंप्यूटर पर एक पिछली छवि खुली रखें, और रुचि के एक ही क्षेत्र को खोजने के लिए संदर्भ के रूप में इसका उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि इमेजिंग का कोण पिछली छवियों के समान है ताकि न्यूनतम पैरालेक्स के साथ कोशिकाओं का एक ही सेट प्राप्त किया जा सके।
      नोट: माउस हेड की स्थिति के आगे समायोजन की संभावना पिछले समय बिंदुओं (चित्रा 3) के समान कोशिकाओं को चित्रित करने के लिए आवश्यक है।
    7. रुचि के सबसे ऊपरी और सबसे निचले जेड-विमानों पर नेविगेट करके इमेजिंग स्टैक की जेड-सीमाएं सेट करें, और छवि प्राप्त करें। छवि अधिग्रहण के पूरा होने पर, पीएमटी और उत्सर्जन शटर को अक्षम करें। उत्सर्जन प्रकाश पथ को वापस आंखों के टुकड़े पर स्विच करें, और उत्तेजना प्रकाश पथ को एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के लिए। माइक्रोस्कोप चरण से माउस को हटा दें।
  2. सिस्टम सॉफ़्टवेयर और हार्डवेयर शटडाउन
    1. छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर से बाहर निकलें। कंप्यूटर इंटरफ़ेस में लेजर बंद करें। "ऑलवेज-ऑन" उपकरण के अपवाद के साथ, रिवर्स स्टार्टअप ऑर्डर में हार्डवेयर बंद करें।
  3. माउस पुनर्प्राप्ति
    1. माइक्रोस्कोप चरण से हेड होल्डर और माउस को हटा दें। यदि लागू हो, तो आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 0% पर सेट करें। माउस को हेड होल्डर से हटा दें।
    2. धीरे से एक लिंट-मुक्त ऊतक के साथ स्नेहक आंख जेल को पोंछें, और दोनों आंखों पर सफेद पेट्रोलाटम-खनिज तेल स्नेहक आंख मलहम लागू करें। माउस को गर्म पानी के परिसंचारी हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस पर सेट) पर रखें, माउस में भाग लेना जारी रखें और इसकी श्वसन दर की निगरानी करें जब तक कि माउस जाग न जाए और एम्बुलेटरी क्षमता हासिल न कर ले। माउस को उसके आवास पर वापस करें।
    3. यदि लागू हो, तो इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में पशु गतिविधि और रुग्णता का आकलन करें। अध्ययन के पूरा होने पर, ट्राइब्रोमोएथेनॉल (250 मिलीग्राम / किग्रा) के ओवरडोज के साथ माउस को इच्छामृत्यु करें और रेटिना ऊतक को संरक्षित करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव करें।

5. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. Deinterleave and merge multichannel data
    1. चूंकि कुछ छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम मल्टीचैनल छवियों को एक इंटरलेव्ड प्रारूप में संग्रहीत करते हैं, चैनलों को अलग करने के लिए सॉफ़्टवेयर, जैसे फिजी (https://imagej.net/Fiji) का उपयोग करके .tif छवि फ़ाइल खोलें।
    2. फिजी के छवि मेनू में, स्टैक्स का चयन करें | उपकरण | डीइंटरलेव। छवि की रचना करने वाले चैनलों की संख्या इनपुट करें और ठीक पर क्लिक करें।
    3. अलग किए गए चैनलों को एकल फ़ाइल में विलय करने के लिए, छवि पर जाएं | रंग | मर्ज चैनल. डिइंटरलेव्ड छवि चैनलों को अलग-अलग रंग चैनलों में रखें, और मल्टीचैनल समग्र छवि बनाने के लिए ओके पर क्लिक करें। इस समग्र छवि को एक नई .tif फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  2. मल्टीचैनल छवियों में प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण
    नोट: रुचि के निर्दिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता को फिजी का उपयोग करके एकल-छवि विमानों में निर्धारित किया जा सकता है। अनुपातमेट्रिक रीडआउट का परिमाणीकरण एक ही आरओआई के भीतर एक समग्र छवि के विभिन्न चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापकर प्राप्त किया जा सकता है। पुरानी इमेजिंग प्रयोगों के लिए, उत्तेजना या उत्सर्जन अनुपातमेट्रिक आउटपुट के आधार पर बायोसेंसर का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
    1. फिजी में, विश्लेषण करने के लिए जाएं | उपकरण | ROI प्रबंधक. फिजी में समग्र छवि खोलें। रुचि की संरचना के अनुरूप जेड-स्लाइस पर स्क्रॉल करें, और आरओआई को रेखांकित करने के लिए चयन उपकरण (जैसे आयत चयन, ओवल चयन, बहुभुज चयन) का उपयोग करें।
    2. ROI प्रबंधक में प्रत्येक चयन जोड़ने के लिए कुंजीपटल पर T दबाएँ। आरओआई चयन के पूरा होने पर, आरओआई से विभिन्न डेटा जैसे क्षेत्र और माध्य तीव्रता मूल्य रिकॉर्ड करने के लिए आरओआई प्रबंधक में माप पर क्लिक करें।
    3. परिणाम विंडो में रिकॉर्ड किए गए वर्तमान में चयनित चैनल के लिए माप की स्प्रैडशीट में प्रतिलिपि बनाएँ. कम्पोजिट इमेज विंडो में अगले चैनल पर स्विच करें और आरओआई के एक ही सेट के भीतर उस चैनल के लिए माप प्राप्त करने के लिए माप पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक के भीतर, अधिक पर जाएं | ROIs को .zip फ़ाइल के रूप में सहेजें, और सहेजें।
  3. प्रदर्शन के लिए अधिकतम तीव्रता अनुमान
    1. छवि डेटा के प्रदर्शन बनाने के लिए, Fiji में Z-प्रोजेक्ट फ़ंक्शन का उपयोग करें। छवि मेनू में, स्टैक का चयन करें | जेड परियोजना। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए केवल उन फ्रेम का चयन करें जिनके भीतर रुचि के क्षेत्र मौजूद हैं।
    2. यदि पीएमटी शॉट शोर को हटाना वांछित है, तो मेडियन फिल्टर फ़ंक्शन का उपयोग करें। प्रक्रिया मेनू में, प्रक्रिया का चयन करें | फिल्टर | औसत। स्थानिक विवरण बनाए रखने के लिए 1.0 का मान चुनें।
    3. एकल कोशिकाओं पर केंद्रित अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान बनाने के लिए, इस प्रक्रिया को केवल छवि फ्रेम चुनते हुए दोहराएं जो रुचि के सेल के अनुरूप हैं।
      नोट: यह सेलुलर आर्बर्स को हल करने की क्षमता में काफी सुधार कर सकता है (चित्रा 4)। प्रतिदीप्ति तीव्रता का माप एकल-छवि विमानों में किया जाना चाहिए न कि अधिकतम तीव्रता अनुमानों पर।

Representative Results

विभिन्न ट्रांसजेनिक, वायरल वेक्टर, या अकार्बनिक डाई-लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग विशेष रूप से एक बुनियादी मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के सरल अनुकूलन का उपयोग करके विवो में कई रेटिना कोशिकाओं के प्रकारों और संरचनाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। आरजीसी और एमोक्राइन कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, VGlut2-Cre और VGat-Cre ट्रांसजेनिक चूहों को क्रमशः Cre-निर्भर AAV अभिव्यक्ति निर्माण एन्कोडिंग Twitch2b, एक साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) -आधारित Ca2+ सेंसर का इंट्राविट्रल इंजेक्शन दिया गया था जिसमें सियान और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP और YFP, क्रमशः) और ट्रोपोनिन15 के Ca2+ बाइंडिंग डोमेन शामिल थे। . VGlut2-Cre चूहों में, RGC सोमा स्पष्ट रूप से समझदार होते हैं, और अक्षतंतु के फसिकल्स अक्सर स्पष्ट होते हैं (चित्रा 3)।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अक्षतंतु का प्रक्षेपवक्र और वाहिका की नकारात्मक छवि VGlut2-Cre चूहों में ऑप्टिक तंत्रिका सिर की पहचान करना बहुत सरल बनाती है, जो पुरानी इमेजिंग प्रयोगों (चित्रा 3) में एक मील का पत्थर के रूप में उपयोगी है। यद्यपि एमोक्राइन कोशिकाएं आरजीसी की तुलना में कम उज्ज्वल दिखाई देती हैं, संभवतः उनके छोटे सोमा आकार और / या कम कुशल एएवी पारगमन के कारण, उनके सोमा अभी भी आंतरिक परमाणु परत में आसानी से स्पष्ट हैं। आरजीसी के विपरीत, एमोक्राइन सेल न्यूरॉइट्स को अक्सर आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परतों (चित्रा 4) में देखा जाता है। रेटिना माइक्रोग्लिया को सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी ट्रांसजेनिक माउस लाइन6 में चित्रित किया जा सकता है। माइक्रोग्लिया वाहिका के साथ जुड़ता है, जिससे टाइम-लैप्स इमेजिंग प्रयोगों में एक ही क्षेत्र को ढूंढना संभव हो जाता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग ठीक माइक्रोग्लिया प्रक्रियाओं की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है, एक प्रक्रिया जिसमें एकल-विमान छवियों में बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है, या यदि अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान व्यक्तिगत कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हुए तैयार किए जाते हैं (चित्रा 5)। माउस लेंस के माध्यम से ऑप्टिकल विपथन के कारण खराब अक्षीय रिज़ॉल्यूशन जेड-आयाम में ठीक विवरणों की परीक्षा को रोकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यह इमेजिंग तकनीक सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर में अपक्षयी परिवर्तनों का निरीक्षण कर सकती है, एक्साइटोटॉक्सिक घाव को प्रेरित करने के लिए 50 एमएम एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए) के 1 μL को विट्रस में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के एक दिन बाद, माइक्रोग्लिया ने पिछली रिपोर्ट16 के अनुसार छोटी प्रक्रियाओं या अमीबॉइड आकृति विज्ञान (चित्रा 5) का प्रदर्शन किया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइन में कोशिकाओं ने फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट्स के एएवी-मध्यस्थता वितरण के साथ प्रयोगों की तुलना में सेलुलर कॉहोर्ट में अधिक समान और पूर्ण फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। प्रयोगों को डिजाइन करते समय विविध और विरल बनाम पूर्ण और समान लेबलिंग के लाभों पर विचार किया जाना चाहिए।

रेटिना वास्कुलचर को लेबल करने के लिए जैसा कि पहले वर्णित8 था, चूहों को इमेजिंग से 30-60 मिनट पहले इवांस ब्लू डाई (बाँझ खारा में 20 मिलीग्राम / एमएल) के 200 μL के साथ इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दिया गया था। इससे ऑप्टिक तंत्रिका सिर से निकलने वाली रक्त वाहिकाओं की मजबूत लेबलिंग हुई (चित्रा 6)। आश्चर्यजनक रूप से, एक इंजेक्शन का फ्लोरोसेंट सिग्नल कम से कम सात दिनों तक बना रहा। विवो छवियों के आयामों का अनुमान लगाने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, विवो में एक ही रेटिना क्षेत्रों को चित्रित किया गया था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7) का उपयोग करके चपटे रेटिना होलमाउंट में निर्धारण के बाद। विवो नमूनों में चार अलग-अलग से यादृच्छिक सेल जोड़े का चयन किया गया था, और सेल जोड़े के बीच की सही दूरी को कॉन्फोकल स्कैन में मापा गया था और 1x डिजिटल आवर्धन के साथ 0.99 μm का औसत पिक्सेल आकार प्राप्त करने के लिए विवो पिक्सेल दूरी के साथ मिलान किया गया था। कॉन्फोकल होलमाउंट स्कैन के साथ विवो छवियों में सहसंबंधित समान तरीकों का उपयोग करने से पता चला है कि एक एकल सिर की स्थिति रेटिना के लगभग 650 मिमी2 पैच पर इमेजिंग की अनुमति देती है।

एक टोर्सनल अक्ष के साथ सिर धारक की पुनर्स्थापना रेटिना के रैखिक क्षेत्र तक पहुंच की अनुमति दे सकती है 2.2 मिमी लंबाई (नहीं दिखाया गया)। इसके अलावा, चूहों की आंखों में 1 या 2 μm व्यास फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स इंजेक्ट किए गए थे और उनके व्यास को 10x डिजिटल ज़ूम के साथ विवो छवियों से लाइन स्कैन की पूर्ण चौड़ाई आधा-अधिकतम के रूप में मापा गया था। इसने थोड़ा बड़ा पिक्सेल आकार अनुमान दिया, लेकिन अधिक भिन्नता के साथ (चित्रा 7)। कुल मिलाकर, विवो प्रयोगों में पूरा होने के बाद होलमाउंट नमूनों की कॉन्फोकल इमेजिंग व्यक्तिगत छवियों को स्केल असाइन करने का सबसे सुसंगत तरीका है, क्योंकि कॉर्नियल और लेंस गुणों में भिन्नता नमूना से नमूने में छवि पैमाने को बदल सकती है।

Figure 1
चित्र 1: प्रकाश पथ योजनाबद्ध। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के मूल घटकों में लेजर पावर को संशोधित करने के लिए एक पोकेल्स सेल, माइक्रोस्कोप उद्देश्य के पिछले एपर्चर से मेल खाने के लिए लेजर बीम व्यास को कम करने के लिए एक लेंस जोड़ी और बीम स्टीयरिंग के लिए गैल्वो स्कैन मिरर की एक जोड़ी शामिल है। प्रत्येक प्रमुख ऑप्टिकल घटक से पहले स्टीयरिंग दर्पण की एक जोड़ी मौजूद है। फोकस को एक मोटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो ऑब्जेक्टिव माउंट चलाता है। उत्सर्जन प्रकाश पथ को डाइक्रोइक और बैरियर फिल्टर को बदलकर विभिन्न फ्लोरोफोरे के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। लाल इमेजिंग के लिए एक सामान्य सेटअप प्रदर्शित किया जाता है जिसमें एक छोटा पास डाइक्रोइक दर्पण लाल प्रकाश को पहले पीएमटी तक निर्देशित करता है, और उचित बैंड पास फिल्टर के साथ युग्मित एक लंबे पास डाइक्रोइक दर्पण का उपयोग सियान और पीले उत्सर्जन को अलग करने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विवो इमेजिंग में चूहों की स्थिति। प्रकाश पथ के साथ अक्ष पर पुतली के साथ माउस को रखने के लिए, एनेस्थेटाइज्ड माउस को पहले एक सिर धारक में नियंत्रित किया जाता है, सिर को घुमाया जाता है और कोण किया जाता है, स्नेहक आंख जेल की एक बड़ी बूंद आंख पर रखी जाती है, और माउस को मंच पर रखा जाता है। एक कवरस्लिप को प्रकाश पथ के लंबवत कवरस्लिप धारक में लगाया जाता है और आंख की ओर नीचे उतारा जाता है। कवरस्लिप को कॉर्निया या माउस हेड (बाएं) से संपर्क नहीं करना चाहिए, जो स्पष्ट होगा यदि कवरस्लिप विक्षेपित है। हालांकि, ड्रॉपलेट (दाएं) की कमर से बचने के लिए कवरस्लिप भी काफी करीब होना चाहिए, क्योंकि इससे नमूने पर डिमैग्नेफाइंग प्रभाव पड़ेगा। जेल विसर्जन को लागू करने और कवरस्लिप को सुरक्षित करने के बाद, मंच को माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत सीधे जगह पर ले जाया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं की इमेजिंग। छवि प्रदर्शन के लिए, जेड-प्लेन के साथ अधिकतम तीव्रता के अनुमान बनाए जाते हैं, जिसमें रुचि की कोशिकाएं होती हैं, और परिणामी छवियों को पीएमटी शॉट शोर को हटाने के लिए औसत-फ़िल्टर किया जाता है। VGlut2-Cre ट्रांसजेनिक चूहों में AAV-EF1-FLEX-Twitch2b को इंजेक्ट करके लेबल किए गए रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के दो उदाहरण दिखाए गए हैं, विशेष रूप से सीएफपी सिग्नल। छवियों को चार दिनों के अंतराल पर सत्रों में प्राप्त किया गया था, और ऑप्टिक तंत्रिका सिर के पास एक ही क्षेत्र में लौटने के लिए संवहनी स्थलों का उपयोग किया गया था। ऑप्टिक तंत्रिका सिर छवि के निचले भाग की ओर उन्मुख है। यद्यपि दोनों नमूने अभिविन्यास में कुछ भिन्नता दिखाते हैं (कम तीव्रता वाले क्षेत्रों को तीर के साथ इंगित किया जाता है), अधिकांश कोशिकाएं दोनों समय बिंदुओं पर मौजूद होती हैं। स्केल बार = लगभग 50 μm। संक्षिप्तीकरण: पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; EF1 = बढ़ाव कारक -1अल्फा; फ्लेक्स = फ्लिप-एक्सिशन; VGlut2 = वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: इमेजिंग अमाक्रिन कोशिकाएं। एमोक्राइन कोशिकाओं को VGat-Cre ट्रांसजेनिक चूहों में AAV-EF1-FLEX-Twitch2b इंजेक्ट करके लेबल किया गया था। ट्विच 2 बी का सीएफपी सिग्नल विशेष रूप से दिखाया गया है। आंतरिक परमाणु परत की गहराई पर केंद्रित छोटे अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान एमाक्राइन सेल सोमा को इंगित करते हैं, जबकि आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म पर ध्यान केंद्रित करने से एमाक्राइन सेल न्यूराइट्स (तीर) हल होता है। ऑप्टिक तंत्रिका सिर छवि के दाईं ओर उन्मुख है। स्केल बार = लगभग 50 μm। संक्षेप: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; EF1 = बढ़ाव कारक -1अल्फा; फ्लेक्स = फ्लिप-एक्सिशन; वीजीएटी = वेसिकुलर गामा एमिनोब्यूट्रिक एसिड ट्रांसपोर्टर; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; आईपीएल = आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इमेजिंग माइक्रोग्लिया। ट्रांसजेनिक माउस लाइन Cx3cr1-GFP का उपयोग माइक्रोग्लिया को लेबल करने के लिए किया गया था। पूर्ण स्कैन वॉल्यूम का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण कई माइक्रोग्लिया दिखाता है, कुछ ठीक प्रक्रिया विवरण के साथ जिन्हें हल किया जा सकता है। ध्यान दें कि क्षेत्र के निचले बाईं ओर की कोशिकाओं में इस क्षेत्र में पैरालेक्स के कारण ऊपरी दाईं ओर की तुलना में अधिकतम प्रक्षेपण में कम विकृति होती है। अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान जिसमें केवल रुचि की कोशिका होती है, इस परालेक्स (केंद्र, संबंधित रंगों में बॉक्स) को काफी कम कर देती है। इसके अलावा, यह इमेजिंग रणनीति ठीक माइक्रोग्लिया प्रक्रिया रीमॉडेलिंग (निचले पैनल) की गतिशीलता का दस्तावेजीकरण कर सकती है। तुलनात्मक रूप से, कई माइक्रोग्लिया को 50 एमएम एनएमडीए (दाएं) के इंट्राविट्रल इंजेक्शन द्वारा एक्साइटोटॉक्सिक घाव के एक दिन बाद छोटी प्रक्रियाओं या अमीबॉइड आकृति विज्ञान के साथ देखा जा सकता है। स्केल बार = लगभग 50 μm। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएक्स 3 सीआर 1 = सीएक्स 3 केमोकाइन रिसेप्टर 1; एनएमडीए = एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: संवहनी स्थलों को लेबल करना। चूहों को पहले इमेजिंग सत्र से 30-60 मिनट पहले 20 मिलीग्राम / एमएल इवांस ब्लू इंट्रापरिटोनियल रूप से 200 μL के साथ इंजेक्ट किया गया था। पूर्ण मोटाई अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान रेटिना वाहिका में स्थायी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं जो कम से कम सात दिनों तक जारी रहता है। स्केल पट्टी = लगभग 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: छवि आयाम। VGlut2-Cre ट्रांसजेनिक चूहों में AAV-EF1-FLEX-Twitch2b इंजेक्ट करके लेबल की गई रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं को विवो में चित्रित किया गया था, और उसी क्षेत्र को रेटिना के निर्धारण और संपूर्ण तैयारी के बाद कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल दोनों के लिए दिखाया गया है। रंगीन तीर जोड़े दोनों तैयारी (ऊपरी पैनलों) में एक ही सेल का संकेत देते हैं। 2 μm व्यास फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स की एकल-विमान छवि इंट्राविट्रल रूप से इंजेक्ट की गई और विवो (निचले बाएं पैनल) में छवि बनाई गई। माइक्रोसेफर्स व्यवस्थित नहीं हुए और इस प्रकार निरंतर गति में थे जिससे अक्षीय संकल्प का माप असंभव हो गया। पिक्सेल आकार की गणना विवो फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स में पूर्ण-चौड़ाई आधे-अधिकतम माप से की जाती है या प्रति समूह 2-4 रेटिना (निचले दाएं) से लिए गए कोररिलेटिव कॉन्फोकल माप। स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; EF1 = बढ़ाव कारक -1अल्फा; फ्लेक्स = फ्लिप-एक्सिशन; VGlut2 = वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: दो-फोटॉन स्कैनिंग द्वारा प्रेरित कैल्शियम गतिविधि। रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं को VGlut2-Cre ट्रांसजेनिक चूहों में AAV-EF1-FLEX-Twitch2b इंजेक्ट करके लेबल किया गया है, YFP स्यूडोकलर्ड मैजेंटा और CFP हरा है, जिसे 4.22 Hz पर समय श्रृंखला के रूप में एक विमान में चित्रित किया गया है। सभी आरजीसी में एक समान प्रारंभिक वाईएफपी / सीएफपी अनुपात था। अधिकांश ने फ्रेट अनुपात (नारंगी सेल को छोड़कर) में वृद्धि के साथ जवाब दिया, और एक ने पूरे समय श्रृंखला (पीले सेल) में उच्च वाईएफपी / सीएफपी अनुपात बनाए रखा। वाईएफपी / सीएफपी अनुपात को पहले फ्रेम औसत पर सामान्यीकृत किया गया था, और रंगीन सर्कल रंगीन निशान के साथ मेल खाते थे। तारांकन बाईं ओर प्रदर्शित प्रतिनिधि छवियों के साथ समय बिंदुओं को इंगित करते हैं। स्केल बार = 20 μm। संक्षेप: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; EF1 = बढ़ाव कारक -1अल्फा; फ्लेक्स = फ्लिप-एक्सिशन; VGlut2 = वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरजीसी = रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं; फ्रेट = प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित दो-फोटॉन इमेजिंग प्रक्रिया माउस रेटिना के विवो इमेजिंग में अनुदैर्ध्य को सक्षम बनाती है। रेटिना के एक ही क्षेत्र की दोहराने योग्य छवियों को आइसोफ्लुरेन के तहत 6 या अधिक घंटे तक की निरंतर अवधि के लिए प्राप्त किया जा सकता है। माउस को एक ही इमेजिंग क्षेत्र (चित्रा 3) का पता लगाने के लिए सेलुलर और संवहनी स्थलों का उपयोग करके अलग-अलग दिनों में भी चित्रित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए कवर ग्लास के साथ संयुक्त एक स्पष्ट जेल विसर्जन का उपयोग पहले प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला पर लागू किया गया है, जिसमें सबरेटिनल इंजेक्शन के लिए रेटिना का विज़ुअलाइज़ेशन, लेजर-प्रेरित रेटिना चोट मॉडल और फंडस इमेजिंग 20,21,22 शामिल हैं।

आंख की शारीरिक रचना विवो इमेजिंग में अद्वितीय चुनौतियां प्रस्तुत करती है, क्योंकि माउस कॉर्निया और लेंस की उच्च ऑप्टिकल शक्ति सुधार के बिना पुतली के माध्यम से प्रत्यक्ष इमेजिंग को बाधित करती है। विवो इमेजिंग विधियों में कई अन्य माउस आंख 7,17,18,19 के पूर्ववर्ती प्रकाशिकी के सुधार के लिए एक प्लानो-अवतल संपर्क लेंस के उपयोग पर भरोसा करते हैं। कॉर्निया में केवल ऑप्टिकल सुधार के साथ, माउस लेंस की उच्च ऑप्टिकल शक्ति के परिणामस्वरूप पैरालेक्स की एक अनिवार्य मात्रा होती है, विशेष रूप से परिधीय स्कैन क्षेत्र में संरचनाओं की, जो विभिन्न जेड-प्लेन पर एक्स-वाई आयाम में स्ट्रेचिंग और ट्रांसलेशनल मूवमेंट के रूप में प्रकट होती है। एक्स और वाई आयामों में छवि पैरालेक्स से संबंधित विकृति को कम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि माउस आंख इस तरह उन्मुख हो कि इमेजिंग क्षेत्र में रेटिना के लिए स्पर्शरेखा विमान माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ के लंबवत हो। यहां वर्णित सेटअप इस संरेखण को प्राप्त करने के लिए आंख के कोण के सटीक हेरफेर के लिए अनुकूल है। एक समायोज्य माउस हेड होल्डर जो दो अक्षों के साथ रोटेशन की अनुमति देता है, आंख के कोण के आसान मैनुअल समायोजन की अनुमति देता है क्योंकि प्रयोगकर्ता पैरालेक्स को कम करने के लिए जेड-आयाम के माध्यम से स्क्रॉल करता है। यह झुकाव रेटिना के अधिक क्षेत्रों की इमेजिंग की अनुमति देने के लिए पुतली के फील्ड स्टॉप प्रभाव को भी दरकिनार करता है। हेड होल्डर का संयम श्वसन के कारण होने वाली गति कलाकृतियों को भी बहुत कम कर देता है।

माउस आंख की स्पष्टता बनाए रखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि निरंतर इमेजिंग के दौरान ओपसिफिकेशन के साथ छवि की गुणवत्ता बिगड़ जाएगी। इमेजिंग के दौरान स्नेहक जेल का लगातार पुन: उपयोग, और प्रत्येक इमेजिंग सत्र के बाद मलहम आवेदन आंख को सूखने और ओपेसिटी विकसित करने से रोकने में मदद करता है। कुछ कॉर्नियल ओपेसिटी 24-48 घंटे के बाद अनायास हल हो जाएंगे। इस प्रोटोकॉल में वर्णित स्पष्ट जेल और कवर ग्लास का उपयोग संपर्क लेंस7 के समान छवि गुणवत्ता और विपथन सुधार प्रदान करता है, जबकि कवर ग्लास को फिर से संरेखित करने की आवश्यकता के बिना आंख के कोण के आसान समायोजन की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, जेल आंखों को लगातार हाइड्रेशन प्रदान करता है, जिससे कई घंटों तक तीव्र इमेजिंग सत्र करना संभव हो जाता है। अंत में, चूंकि कवर ग्लास कॉर्निया से संपर्क नहीं करता है, इसलिए यह आंखों में न्यूनतम जलन का कारण बनता है जो दोहराए जाने वाले इमेजिंग सत्रों के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता को कम कर सकता है।

इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह तथ्य है कि ऑप्टिकल विपथन पूरी तरह से ठीक नहीं हैं। जबकि यह भारी पैरलेक्स के कारण अक्षीय संकल्प को गंभीर रूप से कम करता है, सोमा के मात्रात्मक माप एकल-छवि विमानों में प्राप्त किए जा सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूंकि रेटिना न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता इस विधि के साथ नमूना संरेखण पर निर्भर है, उत्तेजना और उत्सर्जन अनुपातमेट्रिक आधारित सेंसर विभिन्न इमेजिंग सत्रों में नमूनों की तुलना करने वाले प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हैं। सिस्टम स्तर पर ऑप्टिकल विपथन को सही करने के लिए एक दृष्टिकोण अनुकूली प्रकाशिकी है, जो रेटिना 8,9,14,21 में उपकोशिकीय संकल्प की अनुमति देता है। हालांकि, अनुकूली प्रकाशिकी को लागू करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरण और व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।

विवो रेटिना इमेजिंग में दो-फोटॉन के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या नेत्र विज्ञान6 हैं। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण को वाइडफील्ड या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आसानी से ट्रांसलेटेबल होना चाहिए। एकल फोटॉन इमेजिंग शायद अधिक मजबूत है और आंख के कॉर्निया और लेंस के माध्यम से कुशल दो-फोटॉन प्रभाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक दो-फोटॉन लेजर की उच्च ऊर्जा के कारण रेटिना को नुकसान पहुंचाने का कम जोखिम पैदा करता है। दो-फोटॉन लेजर क्षति से बचने के लिए, अधिकतम लेजर शक्ति के लिए सीमा को इमेजिंग प्रयोगों के पूरा होने के बाद होलमाउंट रेटिना की जांच करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए और छवि की गई परतों में सेल प्रकारों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत प्रणाली में, आरजीसी को पैन-आरजीसी मार्कर, आरबीपीएमएस के साथ लेबल किया गया था, और घनत्व 45 मेगावाट इमेजिंग शक्ति तक सामान्य थे, जबकि 55 मेगावाट ने आरजीसी का महत्वपूर्ण नुकसान किया (नहीं दिखाया गया)।

एकल-फोटॉन इमेजिंग का एक दोष यह तथ्य है कि यह दृष्टिकोण दो-फोटॉन इमेजिंग23 की तुलना में रेटिना के मूल दृश्य सर्किट को बहुत भारी उत्तेजित करेगा। रेटिना होलमाउंट या आईकप तैयारी का उपयोग करके पिछले प्रयोगों से पता चला है कि दो-फोटॉन लेजर स्कैनिंग सर्किट सक्रियण को प्राप्त करती है जो काफी हद तक क्षणिकहै। यहां, सीए2 + सेंसर ट्विच 2 बी के साथ आरजीसी गतिविधि की इमेजिंग से पता चलता है कि लेजर स्कैनिंग की शुरुआत सीए2 + ऊंचाई को प्रेरित करती है, जो अधिकांश आरजीसी में 5-20 एस के दौरान बेसलाइन पर वापस आ जाती है (चित्रा 8)। यह देखते हुए कि इस प्रोटोकॉल में लेजर शक्ति विवो रेटिना लाइट रिस्पांस8 में रिपोर्टिंग पिछले प्रयोगों की सीमा में है, वर्तमान में वर्णित विधि रेटिना में सर्किट गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए उत्तरदायी है। इस तरह के विचार उन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं जो सर्किट गतिविधि से प्रभावित हो सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल दो प्रकार के रेटिना न्यूरॉन्स, आरजीसी और एमोक्राइन कोशिकाओं के विवो इमेजिंग में प्रदर्शित करता है। अन्य प्रमुख सेल प्रकारों के समान लेबलिंग हासिल की जा सकती है, जिसमें क्षैतिज कोशिकाएं (सीएक्स 57-सीआरई25), द्विध्रुवी कोशिकाएं (Chx10-Cre26; mGluR6-GFP27), शंकु फोटोरिसेप्टर (S- या M-opsin-Cre28), रॉड फोटोरिसेप्टर (Nrl-Cre29), मुलर ग्लिया (Foxg1-Cre26), और पेरिसाइट (NG2-DSRed9) शामिल हैं। ट्रांसजेनिक चूहे आरजीसी के असतत उपसमुच्चय को लेबल करने के लिए भी उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, केसीएनजी 4-सीआरई के लिएआर.जी.जी.सी.30; IPRGCs31 के लिए OPN4-Cre; जे-आरजीसी32 के लिए जैम-बी-सीआरईआर) और एमोक्रिन कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, स्टारबर्स्ट एमाक्रिन कोशिकाओं के लिए सीएचएटी-सीआरई26 और विभिन्न एमोक्राइन सेल उपप्रकारों के लिए न्यूरोपैप्टाइड प्रमोटर ड्राइवर 3,34)। ट्रांसजेनिक चूहों के बदले विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करने के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग किया जा सकता है। एक सर्वव्यापी सीएजी प्रमोटर तत्व के साथ एएवी 2 के इंट्राविट्रल इंजेक्शन लगभग विशेष रूप से आरजीसी, एमोक्रिन कोशिकाओं और क्षैतिज कोशिकाओंको लेबल करते हैं। संशोधित AAV2.7m8-Y444F कैप्सिड को एक इंजीनियर mGluR6 प्रमोटर निर्माण के साथ जोड़ने से द्विध्रुवी कोशिकाओं35 के व्यापक लेबलिंग की अनुमति मिलती है। एएवी के सबरेटिनल इंजेक्शन से फोटोरिसेप्टर का संवर्धन होता है, जिसमें सीरोटाइप एएवी 2/5 में उच्चतम पारगमन दक्षता36 होती है। एसएचएच 10, एक संशोधित एएवी 6 कैप्सिड प्रोटीन, ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन प्रमोटर तत्वों के साथ जोड़ा गया है, जिसे मुलर ग्लिया37 के लिए विशिष्ट प्रदर्शित किया गया है।

पूरी तरह से गैर-इनवेसिव दृष्टिकोण के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कोशिकाओं का निरीक्षण करने की क्षमता का उपयोग तंत्रिका सर्किट8 के बुनियादी गुणों के साथ-साथ न्यूरोडीजेनेरेशन 3,4,5,6,38 के तंत्र दोनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। कई अंधा रोग रेटिना में सेलुलर आबादी को लक्षित करते हैं, और चूहों में विवो इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका चोट 1,3,4, मैकुलर अपघटन13, स्ट्रोक5, ग्लूकोमा 2,6 और यूवाइटिस 7 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां रेटिना में प्रकट होती हैं जिनमें अल्जाइमर रोग39, मल्टीपल स्केलेरोसिस40 और पार्किंसंस रोग41 शामिल हैं। इसलिए, रेटिना के विवो इमेजिंग के लिए इस आसानी से सुलभ तकनीक को न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के एक व्यापक सेट का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस फाउंडेशन (पीआरडब्ल्यू को कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और सेंट लुइस में वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में ओप्थाल्मोलॉजी और विजुअल साइंसेज विभाग को एक अप्रतिबंधित अनुदान), नेशनल ग्लूकोमा रिसर्च (ब्राइटफोकस फाउंडेशन का एक कार्यक्रम), और मैकडॉनेल सेंटर फॉर सेलुलर एंड मॉलिक्यूलर न्यूरोबायोलॉजी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। जेडडब्ल्यू एक संस्थागत राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार टी 32 ईवाई013360 द्वारा समर्थित है। इस काम को वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में होप सेंटर वायरल वैक्टर कोर द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 coverslip ThermoFisher 152440 Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL glass syringe Hamilton 80950 22G cemented needle
Adeno-associated virus (AAV2) Hope Center Viral Core NA
Anesthesia Air Pump RWD Life Science R510-30
Atropine Sigma A0132 For pupil dilator solution
Basic Small Animal Anesthesia Device RWD Life Science R500IE
Borosilicate glass capillary Sutter B150-86-10 Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm
CFP/YFP filter cube Chroma custom 480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Two channel PMT detection unit Scientifica S-MPLG-1002
Circulating heating pump Braintree Scientific tp-700 Set to 37 °C
Cling film VWR 10713-916
Compact Filter Holder ThorLabs DH1 Holds coverslip over mouse eye
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) The Jackson Laboratory 005582
DAQ controller chassis National Instruments PXIe-1073
Data acquisition device National Instruments BNC-2090A
Evans Blue dye Fisher Scientific AAA1677409
FPGA module with digitizer National Instruments NI-5734
Gas Evacuation Apparatus RWD Life Science R546W
GenTeal Severe lubricant eye gel   Alcon (from local pharmacy) For use during imaging
GFP/Red filter cube Chroma custom 535/30, 560 long pass, 605/70
Heating pad McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell Scientifica S-MP-101080
HyperScope Main module Scientifica S-MP-100466
HyperScope Scan Path Scientifica S-MP-100406
HyperScope X galvo Module Scientifica MP-100443
ImageJ Fiji software Freeware
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) RWD Life Science R510-31
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) RWD Life Science R510-31S
ketamine HCl (100 mg/mL) Vedco NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter ThorLabs M32M26S
MaiTai GUI software Spectra-Physics NA
MATLAB software MathWorks NA R2015b
meloxicam (5 mg/mL) Boehringer Ingelheim NDC 0010-6013-01 Analgesic
Micorscope Objective Edmund Optics 46-404 Mitutoyo WE715042319
micropipette puller Sutter Flaming/Brown Model P-97
Mineral oil Fisher BP2629-1
Mini bulldog hemostatic clamp Fine Science Tools 18053-28
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD McMaster Carr 1883T1
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD McMaster Carr 1883T4
Mouse head holder Narishige SGM-4
No. 5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
Optic Posts 1/2" ThorLabs TR3-P5
Optical power meter kit ThorLabs PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery Scientifica COO-LED3ULLGs
Phenylephrine hydrochloride Sigma P6126 For pupil dilator solution
Pockels cell Conoptics 350-80-02
Pockels cell amplifier Conoptics Model 302RM
Proparacaine hydrochloride Sigma 1571001 For eye immobilization
Red & Far Red short pass filter Cube Chroma custom 560 short pass
Rotating 1/2" post clamp ThorLabs SWC
ScanImage package Vidrio Technologies Freeware Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB
sodium chloride solution, sterile (0.9%) Fresenius Kabi NDC 63323-186-01
Stereomicroscope Leica S9 E
Tabletop centrifuge Oxford Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment Zoetisus NA For use after intravitreal injection
ThermoRack cooling system Solid State Cooling Systems ThermoRack 401 Set to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016962
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016963
VivoScope for In Vivo Imaging Scientifica S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment Stye NA For use after imaging
xylazine HCl (20 mg/mL) Akorn NDC 59399-110-20

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References

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माउस रेटिना के विवो इमेजिंग में ट्रांसप्युपिलरी टू-फोटॉन
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Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (168), e61970, doi:10.3791/61970 (2021).

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