Summary
In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.
Abstract
Het netvlies zet lichtsignalen uit de omgeving om in elektrische signalen die worden doorgegeven aan de hersenen. Ziekten van het netvlies komen veel voor en veroorzaken slechtziendheid en blindheid. Begrijpen hoe dergelijke ziekten vorderen is van cruciaal belang voor het formuleren van nieuwe behandelingen. In vivo microscopie in diermodellen van ziekten is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van neurodegeneratie en heeft geleid tot belangrijke vooruitgang in de richting van behandelingen van aandoeningen variërend van de ziekte van Alzheimer tot beroerte. Aangezien het netvlies de enige structuur van het centrale zenuwstelsel is die inherent toegankelijk is voor optische benaderingen, leent het zich van nature voor in vivo beeldvorming. De inheemse optiek van de lens en het hoornvlies vormen echter enkele uitdagingen voor effectieve toegang tot beeldvorming.
Dit protocol schetst methoden voor in vivo beeldvorming met twee fotonen van cellulaire cohorten en structuren in het netvlies van de muis met cellulaire resolutie, toepasbaar voor zowel acute als chronische beeldvormingsexperimenten. Het presenteert voorbeelden van retinale ganglioncel (RGC), amacrinecel, microgliale en vasculaire beeldvorming met behulp van een reeks etiketteringstechnieken, waaronder adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren, transgene muizen en anorganische kleurstoffen. Belangrijk is dat deze technieken zich uitstrekken tot alle celtypen van het netvlies en dat voorgestelde methoden voor toegang tot andere cellulaire populaties van belang worden beschreven. Ook gedetailleerd zijn voorbeeldstrategieën voor handmatige beeldnabewerking voor weergave en kwantificering. Deze technieken zijn direct toepasbaar op studies van retinale functie in gezondheid en ziekte.
Introduction
In vivo visualisatie van het centrale zenuwstelsel vereist over het algemeen invasieve procedures zoals schedelverdunning en installatie van glazen ramen of optische relaislenzen. Het netvlies is de enige structuur in het zenuwstelsel die direct kan worden waargenomen zonder de noodzaak van invasieve voorbereiding, omdat het inheems licht uit de omgeving ontvangt. Het gemak van optische toegang tot het netvlies maakt het een aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van het centrale zenuwstelsel.
Live fluorescerende beeldvorming van het netvlies bij muizen is gebruikt om RGC-sterfte te volgen in modellen van glaucoom 1,2, oogzenuwletsel 1,3,4 en beroerte5, evenals veranderingen in microgliale activering 6,7,8 en vasculatuur9 bij degeneratieve omstandigheden. Intrinsieke signalen kunnen ook worden gebruikt om fotoreceptoren 10,11,12 en retinale pigmentepitheelcellen 13 te visualiseren. Veel benaderingen voor in vivo beeldvorming van het netvlies gebruiken ofwel zeer gespecialiseerde apparaten die specifiek zijn ontworpen voor oogheelkundige doeleinden6 of sterk gemodificeerde optische systemen om te corrigeren voor de inheemse aberraties van het hoornvlies en de lens 8,9,11,12,13,14.
Het huidige protocol demonstreert een benadering van in vivo beeldvorming van fluorescerende signalen in het netvlies met cellulaire resolutie, met behulp van een basismethode voor gedeeltelijke correctie voor de voorste optica van het muizenoog. Deze strategie vereist zeer kleine aanpassingen aan multifoton microscoopopstellingen die vaak worden gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen. Omdat deze aanpak eenvoudig in te stellen is en de muizen weinig stress hebben, is het bevorderlijk om time-lapse-experimenten uit te voeren gedurende zowel acute als chronische duur. Bovendien zijn genetische en op organische kleurstoffen gebaseerde procedures die individuele retinale componenten labelen, waaronder RGC's, amacrinecellen, microglia en vasculatuur, compatibel met deze beeldvormingstechniek en maken in vivo observatie mogelijk van celtypen en structuren die cruciaal zijn voor de retinale functie. Deze hulpmiddelen kunnen worden aangepast om de meeste andere neuronale celtypen te labelen, evenals gliale en vasculaire componenten van het netvlies.
Protocol
OPMERKING: De volgende procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Washington University in St. Louis. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de reagentia, apparatuur en dieren die in dit onderzoek worden gebruikt.
1. Adeno-geassocieerde virusinjectie
OPMERKING: Labeling van specifieke cellen in het netvlies kan worden bereikt in Cre transgene muislijnen met beperkte expressiepatronen. Deze sectie beschrijft intravitreale levering van AAV-vectoren die coderen voor Cre-afhankelijke expressie van een fluorescerend eiwit, waardoor specifieke retinale cellen worden gelabeld. Injecteer muizen (mannelijk en vrouwelijk), vanaf de leeftijd van 4 weken.
- De micropipettenaald voorbereiden
- Gebruik een micropipettetrekker om een borosilicaatglas capillaire naald te maken. Laad een glazen capillair in de micropipettetrekker en voer de Ramp Test uit, waarbij de resulterende waarde wordt geregistreerd. Gooi het glazen capillair weg dat is gebruikt voor de ramptest.
- Trek micropipettes met de volgende instellingen: warmte: Ramp Test waarde minus 10; trekkracht: 55; snelheid: 65; tijd: 120; luchtdruk: 500; zendtijd bij het begin van de trek: 20.
OPMERKING De instellingen moeten mogelijk worden aangepast voor verschillende trekkers. - Gebruik onder een ontleedmicroscoop een scheermesje om de punt van de getrokken micropipette te snijden op de plaats waar de glazen punt licht afbuigt onder kracht, ~ 10 mm van het uiteinde van het taps toelopende gedeelte. Snijd in een scherpe hoek zodanig dat de snede een afgeschuinde punt oplevert. Gooi botte tips weg.
- Injectiespuit voorbereiden
- Plaats een micropipette van geslepen glas in een 2 cm segment van ethylvinylacetaat (EVA) plastic buizen (0,05 "binnendiameter, 0,09" buitendiameter). Sluit het andere uiteinde van dit buissegment aan op een EVA-buis van 20 cm lang (0,02 "binnendiameter, 0,06" buitendiameter).
- Sluit de slang aan op een glazen spuit van 50 μL met een gecementeerde naald van 22 G. Verwijder de zuiger uit de glazen spuit en vul de spuit en aangesloten slang met minerale olie met behulp van een spuitnaald van 25 G. Laat 4 mm luchtruimte aan de punt van de micropipette.
- Intravitreale injectie van AAV
- Voer intravitreale injectie uit met standaard aseptische techniek, met behulp van steriele chirurgische handschoenen, schone laboratoriumjas, masker, steriel veld en geautoclaveerde instrumenten volgens institutionele protocollen voor overlevingschirurgie.
- Verwijder een aliquot AAV-vector uit de opslag bij -80 °C en ontdooi op ijs. Na het ontdooien, centrifugeer gedurende 10 s bij 2.000 × g om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Volg de richtlijnen voor anesthesie en gereguleerde stoffen van de institutionele Commissie Dierstudies. Voer met behulp van een hypodermische naald van 30 G een intraperitoneale (IP) injectie van 0,1 ml / 10 g lichaamsgewicht uit van een ketamine / xylazinecocktail (10 mg / ml ketamine, 1 mg / ml xylazine in zoutoplossing, effectieve dosis voor muis: 100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine). Breng de muis terug naar zijn kooi en wacht 5 minuten voordat de anesthesie effect heeft.
- Voer met behulp van een hypodermische naald van 30 G een subcutane injectie van meloxicam van 0,1 ml / 10 g lichaamsgewicht uit (0,5 mg / ml in 0,9% natriumchloride).
- Test de diepte van de anesthesie door het verlies van de hoornvliesreflex en de terugtrekkingsreflex naar de staart en teen teen te bevestigen. Als de corneareflex aanhoudt na verlies van de staart- en teenonttrekkingsreflex, breng dan een druppel van 0,5% proparacaïneoplossing aan op elk oog en wacht 10 s.
- Plaats de muis op zijn kant onder de stereomicroscoop. Gebruik een mini bulldog hemostatische klem om de huid superieur en inferieur aan de baan te grijpen en bevestig de klem aan de mediale canthus om de bol gedeeltelijk uit de baan te verplaatsen.
- Prik de laterale sclera door met de gesneden micropipette verbonden met de glazen spuit, ~ 1-2 mm achter de limbus. Vermijd het verstoren van de vasculatuur die omtrek direct na de limbus loopt. Voer de punctie uit onder een hoek loodrecht op de sclera en trek de micropipette onmiddellijk na het doorboren van de sclera lichtjes in om beschadiging van de lens te voorkomen.
- Gebruik de zuiger van de glazen spuit om 1-2 μL glasvocht op te zuigen, wat ongeveer overeenkomt met het vloeistofvolume dat bedoeld is voor injectie. Trek de micropipette uit het oog en werp de verwijderde glasvochthumor uit.
- Vul de punt van de micropipette met 1-2 μL AAV, waarbij ~4 mm luchtruimte overblijft tussen de virale vector en de minerale olie om vermenging te voorkomen. Steek de micropipette in het gat in de sclera die door de eerste punctie is ontstaan en druk langzaam op de zuiger van de glazen spuit om de virale vector in de loop van 20-30 s te injecteren. Visualiseer het vloeistofniveau van de virale vector in de punt van de micropipette en zorg ervoor dat u stopt met injecteren voordat er lucht in het oog komt.
- Houd de micropipette 10 s in dezelfde positie en trek vervolgens de micropipette in. Verwijder de bulldog hemostatische klem.
- Breng oxytetracycline / polymyxin B antibioticum oftalmische zalf aan op het geïnjecteerde oog. Plaats de muis op een verwarmingskussen en controleer het herstel van de anesthesie (zie 3.4.3).
- Breng de muis terug naar de behuizing en voer postoperatieve zorg uit volgens de richtlijnen van de instelling. Wacht 2-3 weken voor virale gemedieerde expressie van fluoroforen voordat u zich afbeeldt.
2. Microscoop opstelling
OPMERKING: Een schema van het lichtpad van de microscoop is weergegeven in figuur 1.
- "Always-On"-apparatuur: Deze instrumenten moeten altijd aan blijven staan, tenzij ze worden aangepast of onderhouden. Stel de hoge temperatuur van het laserkoelsysteem in op 20,0 °C. Schakel de hoofdvoeding in op de ultrasnelle Ti:Sapphire-laser, geef tijd voor het voltooien van de opstartprocessen van het systeem en draai de toets "Laser Enable" in de positie "Aan".
- Configuratie van emissielichtpaden
- Configureer het pad voor het verzamelen van fluorescentie-emissies om golflengten te bemonsteren met behulp van geschikte dichroïsche en bandpasfiltersets voor de fluoroforen van belang.
OPMERKING: In dit manuscript gebruikte Twitch2b imaging een filterkubus bestaande uit een 505 long pass dichroic en 480/40 en 535/30 band pass filterparen. GFP werd in beeld gebracht met behulp van een rood/groene filterkubus bestaande uit een 560 long pass filter met 525/50 en 605/70 band pass filters. Evans Blue werd afgebeeld met behulp van een 560 short pass filter. Het vervangen van emissiefilters stelt het emissielichtpad bloot aan strooiruimtelicht dat fotomultiplicatorbuizen (PMT's) kan beschadigen. Zorg ervoor dat PMT's zijn uitgeschakeld en schakel kamerverlichting uit voordat u het lichtpad van de collectie wijzigt, omdat blootstelling aan licht de PMT-functie nadelig kan beïnvloeden.
- Configureer het pad voor het verzamelen van fluorescentie-emissies om golflengten te bemonsteren met behulp van geschikte dichroïsche en bandpasfiltersets voor de fluoroforen van belang.
- Het opstarten van beeldacquisitie
OPMERKING: Directe blootstelling aan de laser met twee fotonen is gevaarlijk, vooral voor het oog, omdat rood licht geen knipperreactie zal veroorzaken. Er moet goed op worden gelet dat de laser langs het lichtpad wordt gesloten en dat er fail-safes zijn om de gebruiker te beschermen tegen blootstelling via de oogstukken of emissies van het microscoopobjecten. Gebruikers moeten begrijpen onder welke omstandigheden de laser zal uitzenden van het doel en de juiste voorzorgsmaatregelen nemen om zichzelf niet aan dergelijke gevaren bloot te stellen.- Schakel het gegevensverzamelingsapparaat, de computer, de Pockels-cel, de microscoop en de podiumcontroller, de mechanische sluitercontroller en de PMT-hoofdvoeding in. Houd PMT's in de status "Uitgeschakeld" totdat ze klaar zijn voor beeldacquisitie en afgeschermd zijn van strooilicht. Open de laserbesturingsinterface op de computer en de software voor beeldacquisitie. Schakel de laser in vanaf de computerinterface en zorg voor modusvergrendeling.
- Stel de gewenste lasergolflengte in. Zorg ervoor dat laserlicht de Pockels Cell binnenkomt door de lasersluiter te openen en wacht 30 minuten voordat het laservermogen stabiliseert.
- Het meten van het laservermogen op het objectief en het instellen van het maximale laserpercentage
OPMERKING: Laserstraling zendt uit van de objectieflens tijdens de vermogensmeting. Sluit het gordijn van de microscoopbehuizing en draag de juiste oogbescherming voordat u de beeldsluiter inschakelt. Meet het laservermogen op het moment van de eerste installatie van het systeem om de uitgangscurve voor elke golflengte van belang vast te stellen en daarna maandelijks om de stabiliteit van het excitatievermogen te verifiëren.- Schakel de optische vermogensmeter in en selecteer de meetgolflengte die overeenkomt met de lasergolflengte. Plaats de detector van de optische vermogensmeter op het microscooppodium en manoeuvreer deze direct onder de objectieflens in de X-Y-afmetingen. Gebruik de gemotoriseerde focusschijf met Z-dimensie om de objectieflens te verlagen totdat de detector van de vermogensmeter ~1 mm onder de objectieflens staat.
- Schakel over van epifluorescentieverlichting naar de laser als het excitatielichtpad van de microscoop. Schakel de mechanische sluiter in.
- Start in de beeldacquisitiesoftware een puntscan om de beeldsluiter te openen en stuur de laser naar de optische vermogensmeter. Stel het laservermogen in de scansoftware in op 100%. Optimaliseer de X-Y- en Z-posities van de vermogensmeterdetector totdat de hoogste laservermogensmeting is bereikt.
- Meet het laservermogen bij het objectief van 0,1% tot 100% op de Pockels Cell en neem metingen met intervallen van 10%. Noteer het Pockels Cell-percentage dat overeenkomt met 45 mW vermogen bij het doel. Stel dit percentage in als het maximale laservermogen in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen.
OPMERKING: Het hoogste vermogen dat werd waargenomen voor in vivo retinale beeldvorming van muizen zonder zichtbare schade aan het doelweefsel was 45 mW, zoals getest door histologische kleuring twee weken na beeldvorming. Duidelijke retinale schade is duidelijk na beeldvorming met 55 mW bij het doel. - Schakel de beeldsluiter uit en breng het excitatielichtpad terug naar epifluorescentie.
3. Voorbereiding van de muis voor beeldacquisitie
- Verdovende muis voor beeldvorming
OPMERKING: Zorg voor een goede opruiming van afvalgassen om de blootstelling aan isofluraan te beperken. Zorg ervoor dat de uitlaatpoort van de anesthesie-inductiekamer is aangesloten op een passieve opruimgasfilterbus en dat de uitlaat van het anesthesieneusstuk van de muis is aangesloten op een actieve opruimgasfilterbus met vacuüm dat wordt geleverd door een gasevacuatieapparaat. Volg de richtlijnen van de fabrikant voor het controleren van het gewicht van de filterbus voor vervanging.- Verdoof de muis met de ketamine/xylazine cocktail zoals hierboven beschreven in stap 1.3.3. U kunt ook anesthesie induceren via isofluraaninhalatie als u ook isofluraan gebruikt voor onderhoud van de anesthesie (beeldvormingssessie > 30 min). Stel het anesthesieapparaat voor kleine dieren in om de inductiekamer te vullen met 5% isofluraan gemengd met kamerlucht bij een stroomsnelheid van 0,5 l/min. Plaats de muis in de inductiekamer en laat 15 s voor de muis verdoofd worden.
- Schakel de isofluraanverdamper over op 0% en leid de anesthesiestroom naar het neusstuk. Voer een 5 seconden "O2 flush" van de inductiekamer uit. Haal de muis uit de inductiekamer en bevestig deze in de hoofdhouder (zie punt 3.3) en bevestig het neusstuk.
- Gebruik een mengsel van 1% isofluraan met kamerlucht met een debiet van 0,5 l/min voor onderhoud van de anesthesie. Controleer de ademhalingsfrequentie met intervallen van 5 minuten tijdens de anesthesie en pas het isofluraanpercentage aan om een ademhalingsfrequentie van ~ 60 ademhalingen / min te behouden.
OPMERKING: Deze instellingen (% isofluraan, debiet) kunnen ook worden gebruikt voor het onderhoud van anesthesie geïnduceerd door de ketamine / xylazine cocktail.
- Pupilverwijding
- Bereid een oplossing van 1% w/v atropine en 2,5% m/v fenylefrinehydrochloride in water. Bewaar de dilatatoroplossing bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Breng met behulp van een wegwerppipetoogdruppel een druppel van de dilatatoroplossing aan op elk oog dat in beeld wordt gebracht. Doe de kamerverlichting uit en wacht 5 minuten tot de pupil verwijdt. Wanneer de pupil is verwijd, dep de dilatatoroplossing weg met pluisvrij weefsel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de dilatatoroplossing niet in de neusgaten komt. - Breng een grote druppel glijmiddel ooggel aan op elk oog dat in beeld wordt gebracht. Als beide ogen in beeld moeten worden gebracht, brengt u een klein stukje plastic kleeffilm aan over de ooggel op het niet-beeldvormende oog om uitdroging te voorkomen. Als u slechts één oog afbeeldt, breng dan glijmiddel oogzalf aan op het oog dat niet in beeld wordt gebracht.
- Muis positioneren voor beeldvorming
- Om de muis in de beeldkophouder te bevestigen, draait u de hoofdarm van de hoofdhouder totdat de oorstukbalk onder een hoek van 60° of meer onder horizontaal is gekanteld. Zet de onderste gehoorgangpen vast in de naar binnen geschoven positie en de bovenste gehoorgangpen in de teruggetrokken positie.
- Terwijl de muis naar de bijtbalk is gericht, monteer je één oor op de verlengde onderste pin en steek je de pin in de gehoorgang. Maak de schroef los die de bovenste gehoorgangpen vastzet en steek de pin uit in de andere gehoorgang. Draai de schroef vast om de kop vast te zetten.
- Schuif de bijtbalk naar de kop van de muis. Til voorzichtig de kop van de muis op en laat vervolgens de maxillaire snijtanden van de muis in het gat van de bijtbalk zakken. Trek de bijtstang met zachte kracht in om de kop van de muis vast te zetten en zet de positie van de bijtbalk vast door de schroef aan te draaien.
- Als u isofluraan gebruikt, schuift u het neusstuk door de gleuf op de bijtbalk voordat u de snijtanden van de muis vastzet. Zet de stand van de bijtbalk vast en draai deze vast zoals in stap 3.3.3. Draai het neusstuk vast met de twee schroeven op het bovenvlak totdat het goed op de neus van de muis past, maar de snuit niet vernauwt.
- Breng de muis in de hoofdhouder over naar het microscoopstadium onder het objectief. Draai de hoofdarm van de hoofdhouder totdat de pupil van het oog recht omhoog is gericht, in lijn met het lichtpad (figuur 2).
- Plaats een #1.5 coverslip in de compacte filterhouder en bevestig de houder aan het microscooppodium. Laat de coverslip naar het oog zakken en maak contact met de glijmiddelooggel, zodat de coverslip horizontaal direct boven het hoornvlies ligt (figuur 2). Zorg ervoor dat de coverslip het hoornvlies niet raakt.
OPMERKING: Zorg er op de microscoop voor dat het excitatielichtpad is ingesteld op epifluorescentie en dat het pad van het emissielicht is ingesteld op het oculair. Schakel de epifluorescentieverlichting in op het laagste vermogen en open de sluiter van de illuminator. Kies de golflengte van de epifluorescentieverlichting en het fluorescentiefilter die overeenkomen met de fluorofoor die wordt afgebeeld. - Manoeuvreer het podium in de X-Y-dimensies en het objectief in de Z-positie met behulp van de podiumregeling en gemotoriseerde focusaandrijving totdat het widefield excitatielicht het hoornvlies volledig bedekt. Als u door het oculair kijkt, blijft u de Z-positie van het podium aanpassen totdat de fluorescerende cellen of structuren in het netvlies in beeld komen. Verhoog het vermogen van de epifluorescentieverlichting als het monstersignaal onvoldoende helder is om individuele cellen of interessante structuren via het oculair op te lossen.
OPMERKING: Als u problemen ondervindt bij het lokaliseren van het netvlies, is de iris een oriëntatiepunt met een hoog contrast om op te verankeren en vervolgens naar beneden te richten op het netvlies. Met deze stap kan ook worden geverifieerd of de pupil maximaal is verwijd. - Verkrijg een beeldgebied op de as met de muislens. Pas de hoek van de muis aan met behulp van de verschillende vrijheidsgraden op de hoofdhouder totdat alleen uitzetting of samentrekking van onscherp licht optreedt bij het aanpassen van het brandpuntsvlak. Schakel de epifluorescentieverlichting uit en sluit de sluiter van de illuminator.
OPMERKING: Significante X-Y parallax van onscherp licht tijdens het scrollen door de Z-richting brandpuntsvlakken geeft aan dat het netvlies niet op de as staat ten opzichte van het beeldbepalende lichtpad.
4. Twee-foton beeldacquisitie
- Parameters voor het instellen en verkrijgen van afbeeldingen
OPMERKING: Schakel de kamerverlichting uit en bedek strooilichtbronnen in de kamer. Zorg ervoor dat de epifluorescentieverlichting is uitgeschakeld en dat de sluiter van de illuminator is gesloten.- Schakel het excitatielichtpad naar de laser en het emissielichtpad naar de PMT's.
- Stel in de beeldacquisitiesoftware een framegrootte in van 512 x 512 en framegemiddelde van 3. Stel de stappen per plak in op -8 μm. Wijs z-stepping aan om bovenaan de stapel te beginnen en naar beneden te gaan, waardoor de activering van fotoreceptoren met twee fotonenlasers wordt geminimaliseerd.
OPMERKING: De stapgrootte kan worden verkleind om de Z-resolutie te verhogen tegen een hogere beeldtijd, maar stappen van 8 μm zijn voldoende om cel somata in deze beeldvormingsconfiguratie op te lossen. - Schakel de PMT's in en schakel ze in. Stel de PMT-spanning in op 680 V. Schakel de excitatiesluiter in.
OPMERKING: Aangedreven PMT's zijn gevoelig voor lichte schade. Zorg ervoor dat de epifluorescentieverlichting is uitgeschakeld, het gordijn van de microscoopbehuizing is getrokken en de kamerverlichting is uitgeschakeld. - Begin met een live beeldvoorbeeld van het doelweefsel, te beginnen met 1% laservermogen. Pas de helderheid van het beeldscherm automatisch aan om de interessante cellen of structuren te visualiseren. Pas de scanfase automatisch aan. Als het doelweefsel zwak of onduidelijk is, verhoogt u het laservermogenspercentage totdat structuren zichtbaar worden zonder de in stap 2.4.4 vastgestelde limiet voor 45 mW te overschrijden.
OPMERKING: Voor een 16-bits afbeelding geeft een weergavewaarde van ~1000 bij het automatisch aanpassen van de helderheid in een Z-vlak met interessante structuren aan dat er voldoende helderheid van het voorbeeld is. - Manoeuvreer het microscoopstadium in de X-Y-richting om te centreren op een gewenst beeldgebied en navigeer vervolgens naar het Z-vlak met de interessante structuren in focus.
OPMERKING: Beeldvorming naast de oogzenuwkop maakt het mogelijk om te dienen als een ondubbelzinnig oriëntatiepunt voor chronische beeldvormingsexperimenten. - Als dit een chronisch time-lapse-experiment is, moet u een eerdere afbeelding openen op de acquisitiecomputer en deze als referentie gebruiken om hetzelfde interessegebied te vinden. Zorg ervoor dat de beeldhoek vergelijkbaar is met die van eerdere afbeeldingen om dezelfde set cellen met minimale parallax te verkrijgen.
OPMERKING: Verdere aanpassing van de positie van de muiskop is waarschijnlijk vereist om dezelfde cellen in beeld te brengen als in eerdere tijdstippen (figuur 3). - Stel de Z-limieten van de afbeeldingsstack in door naar de bovenste en onderste Z-vlakken van belang te navigeren en de afbeelding te verkrijgen. Na voltooiing van de beeldacquisitie schakelt u de PMT's en de emissiesluiter uit. Schakel het emissielichtpad terug naar het oculair en het excitatielichtpad naar epifluorescentieverlichting. Verwijder de muis uit de microscoopfase.
- Systeemsoftware en hardware afsluiten
- Sluit de software voor het verkrijgen van afbeeldingen af. Schakel de laser in de computerinterface uit. Sluit hardware af in omgekeerde opstartvolgorde, met uitzondering van de "Always-On" -apparatuur.
- Muis herstel
- Verwijder de hoofdhouder en muis uit de microscoopfase. Stel indien van toepassing de isofluraanverdamper in op 0%. Verwijder de muis uit de hoofdhouder.
- Veeg glijmiddel ooggel voorzichtig af met een pluisvrij weefsel en breng witte vaseline-minerale olie glijmiddel oogzalf aan op beide ogen. Plaats de muis op het warmwatercirculatierooster (ingesteld op 37 °C), blijf de muis verzorgen en controleer de ademhalingsfrequentie totdat de muis wakker wordt en de ambulante capaciteit terugkrijgt. Breng de muis terug naar de behuizing.
- Beoordeel indien van toepassing de activiteit en morbiditeit van dieren 24 uur na intravitreale injectie. Na voltooiing van het onderzoek euthanaseert u de muis met een overdosis tribroomethanol (250 mg/kg) en voert u transcardiale perfusie uit met 4% paraformaldehyde om netvliesweefsel te behouden.
5. Beeldverwerking en -analyse
- Multichannel-gegevens desinterleave en samenvoegen
- Aangezien bepaalde softwareprogramma's voor het verkrijgen van afbeeldingen meerkanaalsafbeeldingen opslaan in een interleaved-indeling, opent u het .tif afbeeldingsbestand met behulp van software, zoals Fiji (https://imagej.net/Fiji), om de kanalen te scheiden.
- Selecteer in het menu Afbeelding van Fiji de optie Stapels | Hulpmiddelen | Deinterleave. Voer het aantal kanalen in waaruit de afbeelding bestaat en klik op OK.
- Als u de gescheiden kanalen wilt samenvoegen tot één bestand, gaat u naar Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen. Plaats de gede-inter-interleaved beeldkanalen in afzonderlijke kleurkanalen en klik op OK om de meerkanaals samengestelde afbeelding te maken. Sla deze samengestelde afbeelding op als een nieuw .tif bestand.
- Kwantificering van fluorescentie-intensiteit in meerkanaalsbeelden
OPMERKING: Fluorescentie-intensiteit binnen aangewezen gebieden van belang (ROIs) kan worden gekwantificeerd in single-image vliegtuigen met behulp van Fiji. Kwantificering van ratiometrische uitlezingen kan worden bereikt door de fluorescentie-intensiteit in verschillende kanalen van een samengesteld beeld binnen dezelfde ROI te meten. Voor chronische beeldvormingsexperimenten is het het beste om biosensoren te gebruiken op basis van excitatie of emissieverhoudingsgewijze outputs.- Ga in Fiji naar Analyseren | Hulpmiddelen | ROI Manager. Open de samengestelde afbeelding in Fiji. Blader naar het z-segment dat overeenkomt met de structuur van belang en gebruik de gereedschappen Selectie (zoals Rechthoekselectie, Ovaalselectie, Polygoonselectie) om de ROI's te schetsen.
- Druk op T op het toetsenbord om elke selectie toe te voegen aan de ROI Manager. Na voltooiing van de ROI-selectie klikt u op Meten in de ROI Manager om verschillende gegevens van de ROI's vast te leggen, zoals de waarde Gebied en Gemiddelde intensiteit.
- Kopieer de metingen voor het momenteel geselecteerde kanaal dat is vastgelegd in het venster Resultaten naar een spreadsheet. Schakel over naar het volgende kanaal in het venster Samengestelde afbeelding en klik op Meten om metingen voor dat kanaal binnen dezelfde set ROI's te verkrijgen. Ga binnen de ROI Manager naar Meer | Sla de ROI's op en sla ze op als een .zip bestand.
- Maximale intensiteitsprojecties voor weergave
- Om weergaven van de beeldgegevens te maken, gebruikt u de Z-projectfunctie in Fiji. Selecteer in het menu Afbeelding de optie Stapelen | Z-project. Kies alleen de frames waarbinnen interessegebieden aanwezig zijn om de achtergrond te verkleinen.
- Als verwijdering van PMT-opnameruis gewenst is, gebruikt u de mediane filterfunctie. Selecteer in het menu Proces de optie Proces | Filters | Mediaan. Kies een waarde van 1,0 om ruimtelijke details te behouden.
- Als u projecties met maximale intensiteit wilt maken die zijn gericht op afzonderlijke cellen, herhaalt u dit proces door alleen de afbeeldingskaders te kiezen die overeenkomen met de gewenste cel.
OPMERKING: Dit kan het vermogen om cellulaire prieeltjes op te lossen aanzienlijk verbeteren (figuur 4). Metingen van fluorescentie-intensiteit moeten worden uitgevoerd in single-image vlakken en niet op maximale intensiteitsprojecties.
Representative Results
Verschillende transgene, virale vector of anorganische kleurstof-etiketteringsbenaderingen kunnen worden gebruikt om specifiek verschillende retinale celtypen en -structuren in vivo te visualiseren met behulp van een eenvoudige aanpassing van een eenvoudige multifotonenmicroscoop. Om RGC's en amacrinecellen te visualiseren, kregen VGlut2-Cre en VGat-Cre transgene muizen respectievelijk een intravitreale injectie van een Cre-afhankelijk AAV-expressieconstruct dat codeert voor Twitch2b, een cytoplasmatische fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) -gebaseerde Ca2 + -sensor die cyaan en gele fluorescerende eiwitten bevat (respectievelijk CFP en YFP) en het Ca2 + bindingsdomein van troponine15 . Bij VGlut2-Cre muizen zijn RGC-soma's duidelijk waarneembaar en fascikels van axonen zijn vaak zichtbaar (figuur 3).
Opgemerkt moet worden dat het traject van axonen en het negatieve beeld van de vasculatuur het heel eenvoudig maakt om de oogzenuwkop bij VGlut2-Cre-muizen te identificeren, wat nuttig is als een mijlpaal in chronische beeldvormingsexperimenten (figuur 3). Hoewel amacrinecellen minder helder lijken dan RGC's, mogelijk vanwege hun kleinere somagrootte en / of minder efficiënte AAV-transductie, zijn hun soma's nog steeds gemakkelijk zichtbaar in de binnenste nucleaire laag. In tegenstelling tot RGC's worden amacrinecelneurieten vaker waargenomen in de binnenste plexivormen (figuur 4). Retinale microglia kunnen worden afgebeeld in de Cx3cr1-GFP transgene muislijn6. Microglia associëren met de vasculatuur, waardoor het mogelijk is om hetzelfde gebied te vinden in time-lapse beeldvormingsexperimenten.
Deze benadering kan worden gebruikt om de dynamiek van fijne microgliaprocessen te volgen, een procedure met een betere ruimtelijke resolutie in enkelvlaksbeelden, of als projecties met maximale intensiteit worden voorbereid die zich richten op individuele cellen (figuur 5). De slechte axiale resolutie veroorzaakt door optische aberratie door de muislens verhindert onderzoek van fijne details in de z-dimensie. Om te bepalen of deze beeldvormingstechniek degeneratieve veranderingen in cellulaire ultrastructuur kan waarnemen, werd 1 μL van 50 mM N-methyl-D-aspartaat (NMDA) in het glasvocht geïnjecteerd om excitotoxische laesie te induceren. Een dag na de injectie vertoonden de microglia korte processen of amoeboïde morfologie (figuur 5) in overeenstemming met eerdere rapporten16. Opgemerkt moet worden dat cellen in de Cx3cr1-GFP transgene lijn meer uniforme en complete fluorescerende eiwitexpressie vertoonden in het cellulaire cohort dan in experimenten met AAV-gemedieerde levering van fluorescerende eiwitexpressiecassettes. De voordelen van gevarieerde en spaarzame versus volledige en uniforme etikettering moeten worden overwogen bij het ontwerpen van experimenten.
Om retinale vasculatuur te labelen zoals eerder beschreven8, werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 200 μL Evans blauwe kleurstof (20 mg / ml in steriele zoutoplossing) 30-60 minuten vóór beeldvorming. Dit leidde tot een sterke etikettering van bloedvaten afkomstig van de oogzenuwkop (figuur 6). Verrassend genoeg bleef het fluorescerende signaal van een enkele injectie minstens zeven dagen bestaan. Twee verschillende methoden werden gebruikt om de afmetingen van de in vivo beelden te schatten. Eerst werden dezelfde retinale gebieden in vivo en na fixatie in afgeplatte retinale wholemounts in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie (figuur 7). Willekeurige celparen werden geselecteerd uit vier verschillende in vivo monsters, en de ware afstand tussen celparen werd gemeten in confocale scans en gematcht met in vivo pixelafstand om een gemiddelde pixelgrootte van 0,99 μm te verkrijgen met 1x digitale vergroting. Het gebruik van vergelijkbare methoden die in vivo beelden correleren met confocale wholemount-scans heeft aangetoond dat een enkele hoofdpositie beeldvorming mogelijk maakt over een ongeveer 650 mm2-patch van het netvlies.
Herpositionering van de hoofdhouder langs één torsieas kan toegang bieden tot een lineair gebied van het netvlies met een lengte van 2,2 mm (niet weergegeven). Verder werden fluorescerende microsferen met een diameter van 1 of 2 μm geïnjecteerd in de ogen van muizen en hun diameter werd gemeten als half-maximum van lijnscans over de volledige breedte van in vivo beelden met 10x digitale zoom. Dit gaf een iets grotere schatting van de pixelgrootte, maar met meer variantie (figuur 7). Over het algemeen is confocale beeldvorming van wholemount-monsters na voltooiing van in vivo experimenten de meest consistente methode om schaal toe te wijzen aan individuele afbeeldingen, omdat variantie in cornea- en lenseigenschappen de beeldschaal van monster tot monster kan veranderen.
Figuur 1: Lichtpad schematisch. De basiscomponenten van de twee-fotonenmicroscoop die in dit protocol wordt gebruikt, bestaan uit een Pockels Cell om het laservermogen te moduleren, een lenspaar om de diameter van de laserstraal te verkleinen om overeen te komen met de achterste opening van het microscoopdoel en een paar galvo-scanspiegels voor straalbesturing. Voor elk belangrijk optisch onderdeel is een paar stuurspiegels aanwezig. De scherpstelling wordt geregeld door een motor die de objectiefsteun aandrijft. Het emissielichtpad kan worden aangepast voor verschillende fluoroforen door dichroïsche en barrièrefilters te vervangen. Een algemene opstelling voor cyaan / geel / rood beeldvorming wordt weergegeven waarin een dichroïsche spiegel met korte doorgang rood licht naar de eerste PMT leidt, en een dichroïsche spiegel met lange doorgang in combinatie met geschikte banddoorlaatfilters wordt gebruikt om cyaan- en gele emissies te scheiden. Afkorting: PMT = photomultiplier tube. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Positionering van muizen voor in vivo beeldvorming. Om de muis met de pupil op de as met het lichtpad te positioneren, wordt de verdoofde muis eerst in een hoofdhouder gehouden, wordt het hoofd gedraaid en schuin gezet, wordt een grote druppel glijmiddelooggel op het oog geplaatst en wordt de muis op het podium geplaatst. Een coverslip wordt in de coversliphouder loodrecht op het lichtpad gemonteerd en naar beneden naar het oog gebracht. De coverslip mag geen contact maken met het hoornvlies of de muiskop (links), wat duidelijk zal zijn als de coverslip wordt afgebogen. De coverslip moet echter ook dicht genoeg zijn om taille van de druppel te voorkomen (rechts), omdat dit een demagnificerend effect op het monster zal hebben. Na het aanbrengen van de gel-onderdompeling en het vastzetten van de coverslip, moet het podium direct onder het microscoopdoel op zijn plaats worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beeldvorming van retinale ganglioncellen. Voor beeldweergave worden projecties met maximale intensiteit gemaakt met de z-vlakken die interessante cellen bevatten, en resulterende beelden worden mediaangefilterd om PMT-opnameruis te verwijderen. Twee voorbeelden van retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene muizen te injecteren, worden getoond, met name het CFP-signaal. Beelden werden verkregen tijdens sessies met een tussenpoos van vier dagen en vasculaire oriëntatiepunten werden gebruikt om terug te keren naar hetzelfde gebied in de buurt van de oogzenuwkop. De oogzenuwkop is naar de onderkant van het beeld gericht. Hoewel beide monsters enige variatie in oriëntatie vertonen (regio's met verminderde intensiteit worden aangegeven met pijlen), zijn de meeste cellen op beide tijdstippen aanwezig. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: PMT = fotomultiplicatorbuis; AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beeldvorming van amacrinecellen. Amacrinecellen werden gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b te injecteren in VGat-Cre transgene muizen. Het CFP-signaal van Twitch 2b wordt specifiek weergegeven. Kleine projecties met maximale intensiteit gericht op de diepten van de binnenste nucleaire laag duiden op amacrinecel soma's, terwijl focussen op de binnenste plexivorm amacrine celneurieten (pijl) oplost. De oogzenuwkop is rechts van het beeld georiënteerd. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGat = vesiculaire gamma aminoboterzuurtransporter; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; INL = binnenste nucleaire laag; IPL = binnenste plexiforme laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beeldvorming van microglia. De transgene muislijn Cx3cr1-GFP werd gebruikt om microglia te labelen. Een projectie met maximale intensiteit van het volledige scanvolume toont veel microglia, sommige met fijne procesdetails die kunnen worden opgelost. Merk op dat cellen linksonder in het veld minder vervorming vertonen in de maximale projectie dan cellen rechtsboven als gevolg van parallax in dit gebied. Projecties met maximale intensiteit die alleen de cel van belang bevatten, verminderen deze parallax (midden, verpakt in overeenkomstige kleuren) aanzienlijk. Bovendien kan deze beeldvormingsstrategie de dynamiek van fijne microglia-procesremodellering (onderste panelen) documenteren. Relatief gezien kunnen veel microglia worden gezien met korte processen of amoeboïde morfologie een dag na een excitotoxische laesie door intravitreale injectie van 50 mM NMDA (rechts). Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; Cx3cr1 = Cx3 chemokine receptor 1; NMDA = N-methyl-D-aspartaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Etikettering van vasculaire oriëntatiepunten. Muizen werden geïnjecteerd met 200 μL van 20 mg / ml Evans blauw intraperitoneaal 30-60 minuten voorafgaand aan de eerste beeldvormingssessie. Projecties met maximale intensiteit van volledige dikte tonen blijvende fluorescentie in de retinale vasculatuur die ten minste zeven dagen aanhield. Schaalbalk = ongeveer 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Afbeeldingsafmetingen. Retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene muizen te injecteren, werden in vivo in beeld gebracht en hetzelfde gebied werd vervolgens in beeld gebracht door confocale laserscanmicroscopie na fixatie en wholemount-voorbereiding van het netvlies. Geel fluorescerend eiwitkanaal wordt voor beide weergegeven. Gekleurde pijlparen geven dezelfde cel aan in beide preparaten (bovenste panelen). Enkelvlaksopname van fluorescerende microsferen met een diameter van 2 μm die intravitreaal worden geïnjecteerd en in vivo worden afgebeeld (linkeronderpaneel). Microsferen bezinkten niet en waren dus in constante beweging waardoor het meten van axiale resolutie onmogelijk werd. Pixelgroottes berekend op basis van halve maximale metingen over de volledige breedte van in vivo fluorescerende microsferen of correlatieve confocale metingen van 2-4 netvliezen per groep (rechtsonder). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Calciumactiviteit geïnduceerd door twee-fotonen scannen. Retinale ganglioncellen gelabeld door AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b te injecteren in VGlut2-Cre transgene muizen, YFP is pseudogekleurd magenta en CFP groen, afgebeeld in een enkel vlak als een tijdreeks op 4,22 Hz. Alle RGC's hadden een vergelijkbare start-YFP/CFP-ratio. De meesten reageerden met een toename van de FRET-ratio (exclusief de oranje cel), en één handhaafde een hoge YFP / CFP-ratio gedurende de tijdreeks (gele cel). YFP/CFP-verhoudingen werden genormaliseerd naar het gemiddelde van het eerste frame en gekleurde cirkels komen overeen met gekleurde sporen. Sterretjes geven tijdspunten aan met representatieve afbeeldingen aan de linkerkant. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; EF1α = rekfactor-1alpha; FLEX = flip-excisie; VGlut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2; YFP = geel fluorescerend eiwit; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; RGC's = retinale ganglioncellen; FRET = fluorescentie resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De hierin beschreven beeldvormingsprocedure met twee fotonen maakt longitudinale in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis mogelijk. Herhaalbare beelden van hetzelfde gebied van het netvlies kunnen worden verkregen gedurende een continue periode van maximaal 6 of meer h onder isofluraan. De muis kan ook op verschillende dagen worden afgebeeld met behulp van cellulaire en vasculaire oriëntatiepunten om hetzelfde beeldgebied te lokaliseren (figuur 3). Het gebruik van een heldere gel-onderdompeling in combinatie met dekglas voor dit doel is eerder toegepast op een reeks procedures, waaronder visualisatie van het netvlies voor subretinale injectie, laser-geïnduceerde retinale letselmodellen en fundusbeeldvorming 20,21,22.
De anatomie van het oog biedt unieke uitdagingen voor in vivo beeldvorming, omdat de hoge optische kracht van het hoornvlies en de lens van de muis directe beeldvorming door de pupil zonder correctie belemmert. Verschillende andere in vivo beeldvormingsmethoden zijn gebaseerd op het gebruik van een plano-concave contactlens voor correctie van de voorste optiek van het muizenoog 7,17,18,19. Met alleen optische correctie aan het hoornvlies resulteert het hoge optische vermogen van de muislens in een onvermijdelijke hoeveelheid parallax, met name van structuren in het perifere scanveld, die zich manifesteren als uitrekken en translatiebeweging in de X-Y-dimensie op verschillende Z-vlakken. Om beeldparallax-gerelateerde vervorming in X- en Y-dimensies te minimaliseren, is het van cruciaal belang dat het muisoog zo is georiënteerd dat het raakvlak met het netvlies in het beeldvormingsgebied loodrecht staat op het microscooplichtpad. De hier beschreven opstelling is bevorderlijk voor nauwkeurige manipulatie van de hoek van het oog om deze uitlijning te bereiken. Een verstelbare muiskophouder die rotatie langs twee assen mogelijk maakt, maakt eenvoudige handmatige aanpassingen van de hoek van het oog mogelijk terwijl de experimentator door de Z-dimensie scrolt om parallax te minimaliseren. Deze kanteling omzeilt ook het veldstopeffect van de pupil om grotere delen van het netvlies in beeld te brengen. De beperking van de hoofdhouder vermindert ook sterk bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling.
Er moet voor worden gezorgd dat de helderheid van het muizenoog behouden blijft, omdat de beeldkwaliteit verslechtert met opacificatie tijdens continue beeldvorming. Frequente hertoepassing van glijmiddelgel tijdens beeldvorming en zalftoepassing na elke beeldvormingssessie helpen voorkomen dat het oog uitdroogt en opaciteiten ontwikkelt. Sommige hoornvliesopaciteiten zullen spontaan verdwijnen na 24-48 uur. Het gebruik van heldere gel en coverglas zoals beschreven in dit protocol zorgt voor een vergelijkbare beeldkwaliteit en aberratiecorrectie als een contactlens7, terwijl het gemakkelijker is om de ooghoek aan te passen zonder dat het afdekglas opnieuw hoeft te worden uitgelijnd. Bovendien zorgt de gel voor een continue hydratatie van het oog, waardoor het mogelijk is om acute beeldvormingssessies van maximaal enkele uren uit te voeren. Ten slotte, omdat het afdekglas geen contact maakt met het hoornvlies, veroorzaakt het minimale irritatie van het oog dat de optische helderheid kan verminderen voor herhaalde beeldvormingssessies.
Een beperking van deze benadering is het feit dat optische aberraties niet volledig worden gecorrigeerd. Hoewel dit de axiale resolutie ernstig vermindert als gevolg van de zware parallax, kunnen kwantitatieve metingen van de soma worden verkregen in single-image vlakken. Opgemerkt moet worden dat aangezien de fluorescentiesignaalintensiteit van retinale neuronen afhankelijk is van de uitlijning van het monster met deze methode, excitatie- en emissieratiometrische sensoren meer geschikt zijn voor experimenten waarbij monsters chronisch worden vergeleken over verschillende beeldvormingssessies. Een benadering om optische aberraties op systeemniveau te corrigeren is adaptieve optica, die subcellulaire resolutie in het netvliesmogelijk maakt 8,9,14,21. Adaptieve optica vereist echter zeer gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide expertise om te implementeren.
Alternatieve benaderingen voor twee-fotonen in vivo retinale beeldvorming zijn confocale microscopie of oftalmoscopie6. De hier gepresenteerde aanpak moet gemakkelijk te vertalen zijn naar widefield- of confocale microscopie. Beeldvorming met één foton is misschien robuuster en vormt minder risico op beschadiging van het netvlies vanwege de hoge energie van de twee-fotonenlaser die nodig is om een efficiënt tweefotoneneffect te bereiken door het hoornvlies en de lens van het oog. Om laserschade met twee fotonen te voorkomen, moet de drempel voor maximaal laservermogen empirisch worden bepaald door wholemount retinas te onderzoeken na voltooiing van beeldvormingsexperimenten en immunostaining voor celtypen in de afgebeelde lagen. In het hier gepresenteerde systeem werden RGC's gelabeld met de pan-RGC-marker, Rbpms, en dichtheden waren normaal tot 45 mW beeldvermogen, terwijl 55 mW een significant verlies van RGC's veroorzaakte (niet getoond).
Een nadeel van beeldvorming met één foton is het feit dat deze aanpak de inheemse visuele circuits van het netvlies zeer sterk zal stimuleren in vergelijking met beeldvorming met twee fotonen23. Eerdere experimenten met retinale wholemounts of oogschelppreparaten hebben aangetoond dat laserscanning met twee fotonen circuitactivering uitlokt die grotendeels van voorbijgaande aard is24. Hier laat beeldvorming van RGC-activiteit met de Ca2+ sensor Twitch2b zien dat het begin van laserscanning Ca2+ verhogingen induceert, die in de loop van 5-20 s in de meeste RGC's terugkeren naar de basislijn (figuur 8). Gezien het feit dat het laservermogen in dit protocol in het bereik ligt van eerdere experimenten die in vivo retinale lichtrespons8 rapporteren, is de momenteel beschreven methode waarschijnlijk vatbaar voor opnames van circuitactiviteit in het netvlies. Dergelijke overwegingen zijn belangrijk voor experimenten die kunnen worden beïnvloed door circuitactiviteit.
Dit protocol demonstreert in vivo beeldvorming van twee soorten retinale neuronen, RGC's en amacrinecellen. Vergelijkbare etikettering van andere belangrijke celtypen kan worden bereikt, waaronder horizontale cellen (Cx57-Cre25), bipolaire cellen (Chx10-Cre26; mGluR6-GFP27), kegelfotoreceptoren (S- of M-opsine-Cre28), staaffotoreceptoren (Nrl-Cre29), Müller-glia (Foxg1-Cre26) en pericyten (NG2-DsRed9). Transgene muizen zijn ook beschikbaar om discrete subsets van RGC's te labelen (bijv. KCNG4-Cre voor αRGCs30; OPN4-Cre voor ipRGCs31; JAM-B-CreER voor J-RGC's32) en amacrinecellen (bijv. ChAT-Cre voor starburst-amacrinecellen26 en neuropeptide-promotordrivers voor verschillende amacrinecelsubtypen 3,34). Virale vectoren kunnen worden gebruikt om specifieke celpopulaties te targeten in plaats van transgene muizen. Intravitreale injecties van AAV2 met een alomtegenwoordig CAG-promotorelement labelen bijna uitsluitend RGC's, amacrinecellen en horizontale cellen25. Door de gemodificeerde AAV2.7m8-Y444F capsid te koppelen aan een ontworpen mGluR6 promotorconstructie kan een brede labeling van ON bipolaire cellen35. Subretinale injecties van AAV leiden tot een verrijking van fotoreceptoren, waarbij serotype AAV2/5 de hoogste transductie-efficiëntieheeft 36. Shh10, een gemodificeerd AAV6 capsid eiwit, gecombineerd met glial fibrillaire zure eiwitbevorderaars is specifiek aangetoond voor Müller glia37.
Het vermogen om cellen in het centrale zenuwstelsel te observeren met een volledig niet-invasieve benadering kan worden gebruikt om zowel basiseigenschappen van neurale circuits8 als mechanismen van neurodegeneratie 3,4,5,6,38 te bestuderen. Veel verblindende ziekten richten zich op cellulaire populaties in het netvlies, en in vivo beeldvormingsbenaderingen bij muizen zijn gebruikt om oogzenuwletsel 1,3,4, maculaire degeneratie13, beroerte5, glaucoom 2,6 en uveïtis7 te bestuderen. Bovendien manifesteren veel neurodegeneratieve aandoeningen van het centrale zenuwstelsel zich in het netvlies, waaronder de ziekte van Alzheimer39, multiple sclerose40 en de ziekte van Parkinson41. Daarom kan deze gemakkelijk toegankelijke techniek voor in vivo beeldvorming van het netvlies worden toegepast als een hulpmiddel om een breed scala aan neurodegeneratieve aandoeningen te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award aan P.R.W. en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen aan de Washington University School of Medicine in St. Louis), National Glaucoma Research (een programma van BrightFocus Foundation) en het McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. wordt ondersteund door een Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Dit werk werd ook ondersteund door het Hope Center Viral Vectors Core aan de Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
