Summary
In vivo-avbildning är ett kraftfullt verktyg för studier av biologi vid hälsa och sjukdom. Detta protokoll beskriver transpupillär avbildning av musens näthinna med ett standard tvåfotonmikroskop. Det visar också olika in vivoimaging-metoder för att fluorescerande märka flera cellulära kohorter i näthinnan.
Abstract
Näthinnan omvandlar ljussignaler från omgivningen till elektriska signaler som sprids till hjärnan. Sjukdomar i näthinnan är vanliga och orsakar synskador och blindhet. Att förstå hur sådana sjukdomar utvecklas är avgörande för att formulera nya behandlingar. In vivo-mikroskopi i djurmodeller av sjukdom är ett kraftfullt verktyg för att förstå neurodegeneration och har lett till viktiga framsteg mot behandlingar av tillstånd som sträcker sig från Alzheimers sjukdom till stroke. Med tanke på att näthinnan är den enda strukturen i centrala nervsystemet som i sig är tillgänglig genom optiska tillvägagångssätt, lämpar den sig naturligtvis för in vivo-avbildning. Den inbyggda optiken i linsen och hornhinnan utgör dock vissa utmaningar för effektiv bildåtkomst.
Detta protokoll beskriver metoder för in vivo tvåfotonavbildning av cellulära kohorter och strukturer i musens näthinna vid cellulär upplösning, tillämplig för både akut- och kronisk varaktighetsavbildningsexperiment. Den presenterar exempel på retinal ganglioncell (RGC), amakrin cell, mikroglial och vaskulär avbildning med hjälp av en serie märkningstekniker inklusive adenoassocierade virus (AAV) vektorer, transgena möss och oorganiska färgämnen. Det är viktigt att dessa tekniker sträcker sig till alla celltyper i näthinnan, och föreslagna metoder för att komma åt andra cellulära populationer av intresse beskrivs. Detaljerade är också exempelstrategier för manuell bildbehandling för visning och kvantifiering. Dessa tekniker är direkt tillämpliga på studier av näthinnans funktion vid hälsa och sjukdom.
Introduction
In vivo-visualisering av centrala nervsystemet kräver i allmänhet invasiva procedurer som skallförtunning och installation av glasfönster eller optiska relälinser. Näthinnan är den enda strukturen i nervsystemet som kan observeras direkt utan behov av invasiv beredning eftersom den naturligt tar emot ljus från miljön. Den enkla optiska åtkomsten till näthinnan gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera centrala nervsystemet.
Levande fluorescerande avbildning av näthinnan hos möss har använts för att spåra RGC-död i modeller av glaukom 1,2, optisk nervskada 1,3,4 ochstroke 5, samt förändringar i mikroglialaktivering 6,7,8 och vaskulatur 9 under degenerativa tillstånd. Inneboende signaler kan också användas för att visualisera fotoreceptorer 10,11,12 och retinala pigmentepitelceller 13. Många metoder för in vivo-avbildning av näthinnan använder antingen högspecialiserade enheter som är speciellt utformade för oftalmologiska ändamål6 eller mycket modifierade optiska system för att korrigera för hornhinnans och linsens ursprungliga avvikelser 8,9,11,12,13,14.
Detta protokoll visar ett tillvägagångssätt för in vivo-avbildning av fluorescerande signaler i näthinnan vid cellulär upplösning, med hjälp av en grundläggande metod för delvis korrigering för musögats främre optik. Denna strategi kräver mycket små anpassningar av multifotonmikroskopinställningar som vanligtvis används för in vivo-avbildning av hjärnan. Eftersom detta tillvägagångssätt är enkelt att ställa in, och mössen är under liten stress, bidrar det till att utföra time-lapse-experiment under både akuta och kroniska varaktigheter. Dessutom är genetiska och organiska färgämnesbaserade procedurer som märker enskilda retinala komponenter, inklusive RGCs, amakrina celler, microglia och vaskulatur, kompatibla med denna avbildningsteknik och möjliggör in vivo-observation av celltyper och strukturer som är kritiska för retinal funktion. Dessa verktyg kan anpassas för att märka de flesta andra neuronala celltyper samt gliala och vaskulära komponenter i näthinnan.
Protocol
OBS: Följande procedur utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Washington University i St. Louis. Se materialförteckningen för mer information om reagenser, utrustning och djur som används i denna studie.
1. Adenoassocierad virusinjektion
OBS: Märkning av specifika celler i näthinnan kan åstadkommas i Cre transgena muslinjer med begränsade uttrycksmönster. Detta avsnitt beskriver intravitreal leverans av AAV-vektorer som kodar för Cre-beroende uttryck av ett fluorescerande protein, vilket märker specifika retinala celler. Injicera möss (man och kvinna), från 4 veckors ålder.
- Förbereda mikropipettnålen
- Använd en mikropipettdragare för att skapa en borosilikatglaskapillärnål. Ladda en glaskapillär i mikropipettdragaren och utför ramptestet och registrera det resulterande värdet. Kassera glaskapillären som används för ramptestet.
- Dra mikropipetter med följande inställningar: värme: Ramptestvärde minus 10; dra: 55; hastighet: 65; tid: 120; lufttryck: 500; Sändningstid vid dragets början: 20.
OBS Inställningarna kan behöva justeras för olika avdragare. - Under ett dissekerande mikroskop, använd ett rakblad för att skära spetsen på den dragna mikropipetten på den plats där glasspetsen avböjs något under kraft, ~ 10 mm från slutet av den avsmalnande sektionen. Skär i en skarp vinkel så att snittet ger en fasad spets. Kassera trubbiga spetsar.
- Förbereda injektionsspruta
- Montera en skuren glasmikropipett i ett 2 cm segment av etylvinylacetat (EVA) plaströr (0,05 "innerdiameter, 0,09" ytterdiameter). Anslut den andra änden av detta slangsegment till en 20 cm lång EVA-slang (0,02 "innerdiameter, 0,06" ytterdiameter).
- Anslut slangen till en 50 μl glasspruta med en 22 G cementerad nål. Ta bort kolven från glassprutan och fyll på sprutan och den anslutna slangen med mineralolja med en 25 G sprutnål. Lämna 4 mm luftutrymme vid mikropipettens spets.
- Intravitreal injektion av AAV
- Utför intravitreal injektion med standard aseptisk teknik, med sterila kirurgiska handskar, ren labbrock, mask, sterilt fält och autoklaverade instrument enligt institutionella protokoll för överlevnadskirurgi.
- Ta bort en alikvot av AAV-vektorn från lagringen vid -80 °C och tina på is. Efter upptining, centrifugera i 10 s vid 2 000 × g för att avlägsna eventuella luftbubblor.
- Följ riktlinjerna för anestesi och kontrollerade ämnen från den institutionella kommittén för djurstudier. Använd en 30 G hypodermisk nål, utför en 0,1 ml / 10 g kroppsvikt intraperitoneal (IP) injektion av en ketamin / xylazincocktail (10 mg / ml ketamin, 1 mg / ml xylazin i saltlösning, effektiv dos till mus: 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin). Sätt tillbaka musen i buren och låt anestesin träda i kraft 5 minuter.
- Använd en 30 G hypodermisk nål, utför en 0,1 ml/10 g kroppsvikt subkutan injektion av meloxikam (0,5 mg/ml i 0,9% natriumklorid).
- Testa anestesidjupet genom att bekräfta förlust av hornhinnereflex och abstinensreflex till svans och tå nypa. Om hornhinnereflexen kvarstår efter förlust av svans- och tåabstinensreflex, applicera en droppe 0,5% proparacainlösning på varje öga och vänta i 10 s.
- Placera musen på sidan under stereomikroskopet. Använd en mini-bulldogghemostatisk klämma för att ta tag i huden överlägsen och sämre än banan och säkra klämman vid den mediala canthusen för att delvis förskjuta jordklotet upp ur omloppsbanan.
- Punktera lateral sclera med den skurna mikropipetten ansluten till glassprutan, ~ 1-2 mm bakre till limbus. Undvik att störa kärlen som löper omkrets omedelbart bakom limbus. Utför punkteringen i en vinkel vinkel vinkelrätt mot sclera och dra tillbaka mikropipetten något omedelbart efter genomträngning av sclera för att undvika att skada linsen.
- Använd kolven på glassprutan för att dra upp 1-2 μl glasaktig humor, vilket ungefär motsvarar vätskevolymen avsedd för injektion. Dra ut mikropipetten från ögat och mata ut den borttagna glaskroppen.
- Fyll spetsen på mikropipetten med 1-2 μL AAV och lämna ~ 4 mm luftutrymme mellan virusvektorn och mineraloljan för att undvika blandning. Sätt in mikropipetten i hålet i sclera som skapades av den första punkteringen och tryck långsamt på kolven på glassprutan för att injicera virusvektorn under 20-30 s. Visualisera vätskenivån hos virusvektorn i mikropipettens spets och var noga med att sluta injicera innan någon luft kommer in i ögat.
- Håll mikropipetten i samma position i 10 s och dra sedan tillbaka mikropipetten. Ta bort bulldoggen hemostatisk klämma.
- Applicera oxytetracyklin/polymyxin B antibiotikum oftalmisk salva på det injicerade ögat. Placera musen på en värmedyna och övervaka dess återhämtning från anestesi (se 3.4.3).
- Sätt tillbaka musen till dess hölje och utför postoperativ vård enligt institutionella riktlinjer. Tillåt 2-3 veckor för virusmedierat uttryck av fluoroforer före avbildning.
2. Inställning av mikroskop
OBS: Ett schema över mikroskopets ljusväg visas i figur 1.
- "Alltid på" -utrustning: Dessa instrument ska alltid vara på såvida de inte genomgår justering eller underhåll. Ställ in laserkylsystemets höga temperatur på 20,0 °C. Slå på huvudströmmen till den ultrasnabba Ti: Sapphire-lasern, ge tid för att slutföra systemstartprocesser och vrid "Laser Enable" -tangenten till "On" -läget.
- Konfiguration av utsläppsljusväg
- Konfigurera uppsamlingsvägen för fluorescensemission för att ta provvåglängder med hjälp av lämpliga dikroiska filteruppsättningar och bandpassfilter för de fluoroforer som är av intresse.
OBS: I detta manuskript använde Twitch2b-avbildning en filterkub bestående av en 505 long pass dichroic och 480/40 och 535/30 band pass filterpar. GFP avbildades med hjälp av en röd/grön filterkub bestående av ett 560 långt passfilter med 525/50 och 605/70 bandpassfilter. Evans Blue avbildades med ett 560 kort passfilter. Byte av emissionsfilter utsätter emissionsljusvägen för strörumsljus som kan skada fotomultiplikatorrör (PMT). Se till att PMT:er är avstängda och stäng av rumsbelysningen innan du ändrar uppsamlingsljusvägen eftersom ljusexponering kan påverka PMT-funktionen negativt.
- Konfigurera uppsamlingsvägen för fluorescensemission för att ta provvåglängder med hjälp av lämpliga dikroiska filteruppsättningar och bandpassfilter för de fluoroforer som är av intresse.
- Starta bildförvärv
OBS: Direkt exponering för tvåfotonlasern är farlig, särskilt för ögat eftersom långt rött ljus inte kommer att framkalla ett blinksvar. Vederbörlig försiktighet bör vidtas för att säkerställa att lasern är stängd längs ljusvägen och att felskåp finns på plats för att skydda användaren från exponering via ögonbitarna eller utsläpp från mikroskopmålet. Användare bör förstå under vilka förhållanden lasern kommer att avge från målet och vidta lämpliga försiktighetsåtgärder för att inte utsätta sig för sådana faror.- Slå på datainsamlingsenheten, datorn, Pockels-cellen, mikroskop- och scenstyrenheten, den mekaniska slutarregulatorn och PMT-huvudeffekten. Håll PMT:er i tillståndet "Inaktiverad" tills de är redo för bildinsamling och skyddade från ströljus. Öppna laserkontrollgränssnittet på datorn och bildförvärvsprogrammet. Slå på lasern från datorgränssnittet och se till att du låser läget.
- Ställ in önskad laservåglängd. Se till att laserljuset kommer in i Pockels-cellen genom att öppna laserluckan och låt 30 minuter för laserkraften stabiliseras.
- Mätning av lasereffekt vid målet och inställning av maximal laserprocent
OBS: Laserstrålning avger från objektivlinsen under effektmätning. Stäng mikroskopets kapslingsgardin och använd lämpligt ögonskydd innan du aktiverar bildslutaren. Mät lasereffekten vid tidpunkten för den första systeminstallationen för att fastställa uteffektskurvan för varje våglängd av intresse och därefter varje månad för att verifiera stabiliteten hos excitationseffekten.- Slå på den optiska effektmätaren och välj den mätvåglängd som motsvarar laservåglängden. Placera den optiska effektmätardetektorn på mikroskopsteget och manövrera den direkt under objektivlinsen i X-Y-dimensionerna. Använd Z-dimension motoriserad fokusdrivning och sänk objektivlinsen tills effektmätardetektorn är ~ 1 mm under objektivlinsen.
- Byt från epifluorescensbelysning till lasern som mikroskopets excitationsljusväg. Aktivera den mekaniska slutaren.
- I bildförvärvsprogramvaran startar du en punktsökning för att öppna bildslutaren och skickar lasern till den optiska effektmätaren. Ställ in lasereffekten på 100% i skanningsprogramvaran. Optimera X-Y- och Z-positionerna för effektmätardetektorn tills den högsta lasereffektmätningen uppnås.
- Mät lasereffekten vid målet från 0,1% till 100% på Pockels Cell, gör mätningar med 10% intervall. Registrera Pockels Cell-procentandel motsvarande 45 mW effekt vid målet. Ställ in denna procentsats som maximal lasereffekt i bildförvärvsprogramvaran.
OBS: Den högsta effekten som observerades för retinal avbildning av mus in vivo utan synliga skador på målvävnaden var 45 mW, vilket analyserades genom histologisk färgning två veckor efter avbildning. Uppenbara näthinneskador är uppenbara efter avbildning med 55 mW vid målet. - Inaktivera bildslutaren och återställ excitationsljusvägen till epifluorescens.
3. Förberedelse av mus för bildförvärv
- Bedövande mus för avbildning
OBS: Se till att avgaserna rensas på rätt sätt för att minska exponeringen för isofluran. Se till att avgasporten i anestesiinduktionskammaren är ansluten till en passiv rensningsgasfilterbehållare och att utloppet från mustestesinosstycket är anslutet till en aktiv rensningsgasfilterbehållare med vakuum som tillhandahålls av en gasevakueringsapparat. Följ tillverkarens riktlinjer för övervakning av filterbehållarens vikt för utbyte.- Bedöva musen med ketamin/xylazincocktail enligt beskrivningen ovan i steg 1.3.3. Alternativt kan du inducera anestesi via isofluraninhalation om du också använder isofluran för underhåll av anestesi (bildbehandling > 30 min). Ställ in den lilla djuranestesianordningen för att fylla induktionskammaren med 5% isofluran blandad med rumsluft med en flödeshastighet på 0,5 L / min. Placera musen i induktionskammaren och låt 15 s för musen bedövas.
- Byt isofluranförångaren till 0% och rikta anestesiflödet till nässtycket. Utför en 5-sekunders "O2-spolning " av induktionskammaren. Ta ut musen ur induktionskammaren och säkra den i huvudhållaren (se avsnitt 3.3) och fäst nässtycket.
- Använd en blandning av 1% isofluran med rumsluft med en flödeshastighet på 0,5 L/min för underhåll av anestesi. Övervaka andningsfrekvensen med 5 minuters intervall under hela anestesi, justera isofluranprocenten för att upprätthålla en andningsfrekvens på ~ 60 andetag / min.
OBS: Dessa inställningar (% isofluran, flödeshastighet) kan också användas för underhåll av anestesi inducerad av ketamin / xylazincocktail.
- Pupillutvidgning
- Bered en lösning av 1% w / v atropin och 2,5% w / v fenylefrinhydroklorid i vatten. Förvara dilatorlösningen vid rumstemperatur skyddad mot ljus.
- Använd en engångspipett ögondroppare och applicera en droppe av dilatorlösningen på varje öga som kommer att avbildas. Stäng av rumsbelysningen och vänta 5 min tills pupillen utvidgas. När pupillen är utvidgad, torka bort dilatorlösningen med luddfri vävnad.
OBS: Se till att dilatorlösningen inte kommer in i näsborrarna. - Applicera en stor droppe smörjmedel ögongel på varje öga som kommer att avbildas. Om båda ögonen ska avbildas, applicera en liten bit plastplastfolie över ögongelén på det icke-bildande ögat för att förhindra uttorkning. Om du bara avbildar ett öga, applicera smörjmedel ögonsalva på ögat som inte kommer att avbildas.
- Positioneringsmus för avbildning
- För att säkra musen i bildhuvudhållaren, vrid huvudhållarens huvudarm tills hörsnäckans stång lutas i en vinkel på 60 ° eller mer under horisontalplanet. Fäst den nedre hörselgångens stift i det inåtriktade utsträckta läget och det övre hörselgångens stift i det uttagna läget.
- Med musen vänd mot bettstången monterar du ett öra på den förlängda nedre stiftet och sätter in stiftet i hörselgången. Lossa skruven som håller fast den övre hörselgångsstiftet och förläng stiftet i den andra hörselgången. Dra åt skruven för att säkra huvudet.
- Skjut bitstången mot musens huvud. Lyft försiktigt mushuvudet och sänk sedan musens maxillära snedställningar i hålet i bettstången. Dra tillbaka bettstången med mild kraft för att säkra mushuvudet och säkra bettstångens position genom att dra åt skruven.
- Om du använder isofluran, skjut nässtycket genom spåret på bettstången innan du säkrar musens framtänder. Säkra och dra åt bitstångspositionen som i steg 3.3.3. Dra åt nässtycket med de två skruvarna på dess övre yta tills det sitter tätt på musens näsa, men förtränger inte nosen.
- Överför musen, i huvudhållaren, till mikroskopsteget under målet. Vrid huvudhållarens huvudarm tills ögats pupill är orienterad rakt upp, i linje med ljusbanan (figur 2).
- Placera en täckskiva #1.5 i den kompakta filterhållaren och fäst hållaren i mikroskopsteget. Sänk täckglaset mot ögat och kom i kontakt med smörjmedelets ögongel, så att täckglaset ligger horisontellt omedelbart ovanför hornhinnan (figur 2). Se till att täckglaset inte vidrör hornhinnan.
OBS: På mikroskopet, se till att excitationsljusvägen är inställd på epifluorescens och att emissionsljusvägen är inställd på okular. Slå på epifluorescensbelysningen med sin lägsta effekt och öppna belysningsluckan. Välj den epifluorescensbelysningsvåglängd och fluorescensfilter som motsvarar fluoroforen som avbildas. - Manövrera scenen i X-Y-dimensionerna och målet i Z-positionen med hjälp av scenkontrollen och motoriserad fokusdrivning tills widefield-excitationsljuset helt täcker hornhinnan. Titta genom okularet, fortsätt att justera scenens Z-position tills de fluorescerande cellerna eller strukturerna i näthinnan kommer i fokus. Öka epifluorescensbelysningens effekt om provsignalen inte är tillräckligt ljus för att lösa enskilda celler eller strukturer av intresse genom okularet.
OBS: Om du har problem med att hitta näthinnan är iris ett landmärke med hög kontrast att förankra på och sedan fokusera ner mot näthinnan. Detta steg möjliggör också verifiering av att pupillen är maximalt utvidgad. - Skaffa ett bildområde på axeln med muslinsen. Justera musens vinkel med de olika frihetsgraderna på huvudhållaren tills endast expansion eller sammandragning av ofokuserat ljus inträffar när du justerar fokalplanet. Stäng av epifluorescensbelysningen och stäng belysningsluckan.
OBS: Signifikant X-Y-parallax av ofokuserat ljus medan du rullar genom Z-riktningens fokalplan indikerar att näthinnan inte är på axeln med avseende på bildljusvägen.
4. Förvärv av tvåfotonbilder
- Parametrar för bildinställning och insamling
OBS: Stäng av rumsbelysningen och täck över ströljuskällor i rummet. Se till att epifluorescensbelysningen är avstängd och att belysningsluckan är stängd.- Byt excitationsljusvägen till lasern och emissionsljusvägen till PMT: erna.
- I bildförvärvsprogramvaran ställer du in en ramstorlek på 512 x 512 och rammedelvärdet på 3. Ställ in stegen per skiva på -8 μm. Ange z-steg för att börja högst upp i stacken och gå nedåt, vilket minimerar tvåfotonlaseraktivering av fotoreceptorer.
OBS: Stegstorleken kan minskas för att öka Z-upplösningen till en kostnad av ökad bildtid, men 8 μm steg är tillräckliga för att lösa cellsomata i denna bildkonfiguration. - Slå på och aktivera PMT: erna. Justera PMT-spänningen till 680 V. Aktivera excitationsslutaren.
OBS: Drivna PMT: er är mottagliga för ljusskador. Se till att epifluorescensbelysningen är släckt, att mikroskopets kapslingsgardin är ritad och att rumsbelysningen är släckt. - Börja en förhandsgranskning av målvävnaden i realtid, med början med 1 % lasereffekt. Justera skärmens ljusstyrka automatiskt för att visualisera de celler eller strukturer som är av intresse. Justera skanningsfasen automatiskt. Om målvävnaden är svag eller oklar, öka lasereffektprocenten tills strukturerna blir synliga utan att överskrida den gräns som anges i steg 2.4.4 motsvarande 45 mW.
För en 16-bitars bild indikerar ett visningsvärde på ~ 1000 vid automatisk justering av ljusstyrka i ett Z-plan som innehåller strukturer av intresse tillräcklig ljusstyrka för provet. - Manövrera mikroskopsteget i X-Y-riktningen för att centrera på ett önskat bildområde och navigera sedan till Z-planet med strukturerna av intresse i fokus.
OBS: Avbildning intill det optiska nervhuvudet gör att det kan fungera som ett entydigt landmärke för kroniska avbildningsexperiment. - Om detta är ett kroniskt tidsfördröjningsexperiment, ha en tidigare bild öppen på förvärvsdatorn och använd den som referens för att hitta samma intresseområde. Se till att bildvinkeln liknar den för tidigare bilder för att få samma uppsättning celler med minimal parallax.
OBS: Ytterligare justering av mushuvudets position krävs sannolikt för att avbilda samma celler som i tidigare tidpunkter (figur 3). - Ställ in Z-gränserna för bildstacken genom att navigera till de översta och nedersta Z-planen av intresse och hämta bilden. När bildförvärvet är klart, inaktivera PMT: erna och utsläppsluckan. Byt emissionsljusvägen tillbaka till okularet och excitationsljusvägen till epifluorescensbelysning. Ta bort musen från mikroskopsteget.
- Avstängning av systemprogramvara och hårdvara
- Avsluta programvaran för bildförvärv. Stäng av lasern i datorns gränssnitt. Stäng av hårdvara i omvänd startordning, med undantag för "Always-On" -utrustningen.
- Mus återhämtning
- Ta bort huvudhållaren och musen från mikroskopsteget. Om tillämpligt, ställ in isofluranförångaren på 0%. Ta bort musen från huvudhållaren.
- Torka försiktigt av smörjmedelsögongel med en luddfri vävnad och applicera vit petrolatum-mineralolja smörjmedel ögonsalva på båda ögonen. Placera musen på den cirkulerande värmedynan för varmt vatten (inställd på 37 °C), fortsätt att ta hand om musen och övervaka dess andningsfrekvens tills musen vaknar och återfår ambulatorisk kapacitet. Sätt tillbaka musen till dess hölje.
- Om tillämpligt, bedöm djuraktivitet och sjuklighet vid 24 timmar efter intravitreal injektion. Efter avslutad studie, avliva musen med en överdos av tribrometanol (250 mg/kg) och utför transkardiell perfusion med 4% paraformaldehyd för att bevara näthinnevävnad.
5. Bildbehandling och analys
- Deinterfoliera och slå samman flerkanalsdata
- Eftersom vissa bildförvärvsprogram lagrar flerkanaliga bilder i ett interfolierat format, öppna .tif bildfilen med hjälp av programvara, till exempel Fiji (https://imagej.net/Fiji), för att separera kanalerna.
- I bildmenyn i Fiji väljer du Staplar | Verktyg | Deinterleave. Ange antalet kanaler som komponerar bilden och klicka på OK.
- För att slå samman de separerade kanalerna till en enda fil, gå till Bild | Färg | Slå samman kanaler. Placera de deinterfolierade bildkanalerna i separata färgkanaler och klicka på OK för att skapa den flerkanaliga sammansatta bilden. Spara den här sammansatta bilden som en ny .tif-fil.
- Kvantifiering av fluorescensintensitet i flerkanaliga bilder
OBS: Fluorescensintensitet inom utsedda regioner av intresse (ROI) kan kvantifieras i enbildsplan med Fiji. Kvantifiering av ratiometriska avläsningar kan uppnås genom att mäta fluorescensintensiteten i olika kanaler i en sammansatt bild inom samma ROI. För kroniska avbildningsexperiment är det bäst att använda biosensorer baserade på excitations- eller utsläppsratiometriska utgångar.- I Fiji, gå till Analysera | Verktyg | ROI-chef. Öppna den sammansatta bilden i Fiji. Bläddra till z-segmentet som motsvarar den intressanta strukturen och använd markeringsverktygen (till exempel Rektangelmarkering, Ovalmarkering, Polygonmarkering) för att beskriva ROI:erna.
- Tryck på T på tangentbordet för att lägga till varje val i ROI Manager. När du har slutfört ROI-valet klickar du på Mät i ROI Manager för att registrera olika data från ROI : erna som Area och Mean Intensity value.
- Kopiera måtten för den valda kanalen som registrerats i fönstret Resultat till ett kalkylblad. Byt till nästa kanal i fönstret Sammansatt bild och klicka på Mät för att få mätningar för den kanalen inom samma uppsättning ROI: er. Inom ROI Manager, gå till Mer | Spara och spara avkastningen på investeringen som en .zip fil.
- Projektioner med maximal intensitet för visning
- För att skapa visningar av bilddata, använd Z-project-funktionen i Fiji. I menyn Bild väljer du Stapla | Z-projektet. Välj bara de ramar inom vilka intresseområden finns för att minska bakgrunden.
- Om du vill ta bort PMT-skottbrus använder du funktionen Medianfilter. I menyn Process väljer du Process | Filter | Median. Välj värdet 1,0 för att behålla rumsliga detaljer.
- För att skapa projektioner med maximal intensitet som fokuserar på enskilda celler, upprepa denna process och välj endast de bildramar som motsvarar cellen av intresse.
OBS: Detta kan avsevärt förbättra förmågan att lösa cellulära arbors (Figur 4). Mätningar av fluorescensintensiteten bör utföras i enbildsplan och inte på prognoser med maximal intensitet.
Representative Results
Olika transgena, virala vektor- eller oorganiska färgmärkningsmetoder kan användas för att specifikt visualisera flera retinala celltyper och strukturer in vivo med hjälp av en enkel anpassning av ett grundläggande multifotonmikroskop. För att visualisera RGCs och amakrina celler fick VGlut2-Cre respektive VGat-Cre transgena möss en intravitreal injektion av en Cre-beroende AAV-uttryckskonstruktion som kodar för Twitch2b, en cytoplasmatisk fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserad Ca 2+ -sensor som innehåller cyan och gula fluorescerande proteiner (CFP respektive YFP) och Ca2+ bindningsdomänen för troponin 15 . Hos VGlut2-Cre-möss är RGC-somas tydligt urskiljbara och fasciklar av axoner är ofta uppenbara (figur 3).
Det bör noteras att axonernas bana och den negativa bilden av vaskulaturen gör det väldigt enkelt att identifiera det optiska nervhuvudet hos VGlut2-Cre-möss, vilket är användbart som ett landmärke i kroniska bildexperiment (Figur 3). Även om amakrina celler verkar mindre ljusa än RGCs, möjligen på grund av deras mindre soma-storlek och / eller mindre effektiv AAV-transduktion, är deras somas fortfarande lätt uppenbara i det inre kärnskiktet. I motsats till RGCs observeras amakrina cellneuriter oftare i de inre plexiformskikten (figur 4). Retinal microglia kan avbildas i Cx3cr1-GFP transgena muslinje6. Microglia associerar med vaskulaturen, vilket gör det möjligt att hitta samma region i time-lapse-avbildningsexperiment.
Detta tillvägagångssätt kan användas för att spåra dynamiken i fina mikrogliaprocesser, ett förfarande som har bättre rumslig upplösning i enplansbilder, eller om projektioner med maximal intensitet förbereds med fokus på enskilda celler (figur 5). Den dåliga axiella upplösningen som orsakas av optisk aberration genom muslinsen utesluter undersökning av fina detaljer i z-dimensionen. För att avgöra om denna avbildningsteknik kan observera degenerativa förändringar i cellulär ultrastruktur injicerades 1 μL av 50 mM N-metyl-D-aspartat (NMDA) i glaskroppen för att inducera excitotoxisk lesion. En dag efter injektionen visade mikroglia korta processer eller amoeboidmorfologi (figur 5) i enlighet med tidigare rapporter16. Det bör noteras att celler i den transgena linjen Cx3cr1-GFP uppvisade mer enhetligt och fullständigt fluorescerande proteinuttryck över den cellulära kohorten än i experiment med AAV-medierad leverans av fluorescerande proteinuttryckskassetter. Fördelarna med varierad och gles kontra fullständig och enhetlig märkning bör beaktas vid utformningen av experiment.
För att märka retinal vaskulatur som tidigare beskrivits8 injicerades möss intraperitonealt med 200 μL Evans blått färgämne (20 mg / ml i steril saltlösning) 30-60 min före avbildning. Detta ledde till stark märkning av blodkärl som härrör från synnervhuvudet (figur 6). Överraskande kvarstod den fluorescerande signalen för en enda injektion i minst sju dagar. Två olika metoder användes för att uppskatta dimensionerna på in vivo-bilderna. Först avbildades samma näthinneregioner in vivo och efter fixering i tillplattade retinala helheter med konfokalmikroskopi (figur 7). Slumpmässiga cellpar valdes från fyra olika in vivo-prover, och det verkliga avståndet mellan cellpar mättes i konfokala skanningar och matchades med in vivo pixelavstånd för att få en genomsnittlig pixelstorlek på 0,99 μm med 1x digital förstoring. Genom att använda liknande metoder som korrelerar in vivo-bilder med konfokala helmonterade skanningar har det visat sig att en enda huvudposition möjliggör avbildning över en ungefär 650 mm2 fläck av näthinnan.
Omplacering av huvudhållaren längs en vridaxel kan ge åtkomst till ett linjärt område av näthinnan 2,2 mm i längd (visas inte). Vidare injicerades fluorescerande mikrosfärer med en diameter på 1 eller 2 μm i mössens ögon och deras diameter mättes som halvbredd av linjeskanningar från in vivo-bilder med 10x digital zoom. Detta gav en något större uppskattning av pixelstorleken, men med mer varians (figur 7). Sammantaget är konfokal avbildning av helhetsprover efter slutförandet av in vivo-experiment den mest konsekventa metoden för att tilldela skala till enskilda bilder, eftersom varians i hornhinne- och linsegenskaper kan ändra bildskalan från prov till prov.
Bild 1: Ljusvägsschema. De grundläggande komponenterna i tvåfotonmikroskopet som används i detta protokoll består av en Pockels-cell för att modulera laserkraft, ett linspar för att minska laserstrålediametern för att matcha mikroskopmålets bakre bländare och ett par galvo-skanningsspeglar för strålstyrning. Ett par styrspeglar finns före varje större optisk komponent. Fokus styrs av en motor som driver objektivfästet. Emissionsljusvägen kan anpassas för olika fluoroforer genom att byta ut dikroiska filter och barriärfilter. En allmän inställning för cyan / gul / röd avbildning visas där en kort pass dikroisk spegel leder rött ljus till den första PMT, och en lång pass dikroisk spegel i kombination med lämpliga bandpassfilter används för att separera cyan och gula utsläpp. Förkortning: PMT = fotomultiplikatorrör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Positionering av möss för avbildning in vivo. För att placera musen med pupillen på axeln med ljusvägen hålls den bedövade musen först fast i en huvudhållare, huvudet roteras och vinklas, en stor droppe smörjmedelsögongel placeras på ögat och musen placeras på scenen. En täckskiva monteras i täckglashållaren vinkelrätt mot ljusbanan och sänks ner mot ögat. Täckglaset ska inte komma i kontakt med hornhinnan eller mushuvudet (vänster), vilket kommer att framgå om täckglaset avböjs. Täckglaset bör dock också vara tillräckligt nära för att undvika midjenedgång på droppen (höger), eftersom detta kommer att ha en demagnerande effekt på provet. Efter applicering av gelens nedsänkning och säkring av täckglaset bör scenen flyttas på plats direkt under mikroskopmålet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Avbilda retinala ganglionceller. För bildvisning skapas projektioner med maximal intensitet med z-plan som innehåller celler av intresse, och resulterande bilder medianfiltreras för att ta bort PMT-bildbrus. Två exempel på retinala ganglionceller märkta genom att injicera AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgena möss visas, särskilt CFP-signalen. Bilder förvärvades vid sessioner med fyra dagars mellanrum, och vaskulära landmärken användes för att återvända till samma region nära synnervhuvudet. Det optiska nervhuvudet är orienterat mot botten av bilden. Även om båda proverna visar en viss varians i orientering (regioner med minskad intensitet indikeras med pilar), är de flesta celler närvarande vid båda tidpunkterna. Skalstreck = cirka 50 μm. Förkortningar: PMT = fotomultiplikatorrör; AAV = adenoassocierat virus; EF1α = töjningsfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulär glutamattransportör 2; CFP = cyanfluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avbilda amakrina celler. Amakrina celler märktes genom att injicera AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGat-Cre transgena möss. CFP-signalen för Twitch 2b visas specifikt. Små projektioner med maximal intensitet fokuserade på djupet av det inre kärnskiktet indikerar amakrina cellsomas, medan fokus på den inre plexiformen löser amakrina cellneuriter (pil). Det optiska nervhuvudet är orienterat mot bildens högra sida. Skalstreck = cirka 50 μm. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; EF1α = töjningsfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGat = vesikulär gammaaminosmörsyratransportör; CFP = cyanfluorescerande protein; INL = inre kärnskikt; IPL = inre plexiformskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Imaging microglia. Den transgena muslinjen Cx3cr1-GFP användes för att märka microglia. En projektion med maximal intensitet av hela skanningsvolymen visar många mikroglia, vissa med fina processdetaljer som kan lösas. Observera att celler längst ned till vänster i fältet har mindre förvrängning i den maximala projektionen än de längst upp till höger på grund av parallax i denna region. Projektioner med maximal intensitet som endast innehåller cellen av intresse minskar signifikant denna parallax (centrum, boxad i motsvarande färger). Dessutom kan denna bildstrategi dokumentera dynamiken i fin mikrogliaprocessombyggnad (nedre paneler). Jämförelsevis kan många mikroglia ses med korta processer eller amoeboidmorfologi en dag efter en excitotoxisk lesion genom intravitreal injektion av 50 mM NMDA (höger). Skalstreck = cirka 50 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; Cx3cr1 = Cx3 kemokinreceptor 1; NMDA = N-metyl-D-aspartat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Märkning av kärlmärken. Möss injicerades med 200 μL 20 mg/ml Evans blå intraperitonealt 30-60 min före den första avbildningssessionen. Projektioner med maximal intensitet med full tjocklek visar varaktig fluorescens i retinal vaskulatur som kvarstod i minst sju dagar. Skalstreck = cirka 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Bildmått. Retinala ganglionceller märkta genom att injicera AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgena möss avbildades in vivo, och samma region avbildades sedan med konfokal laserskanningsmikroskopi efter fixering och fullständig beredning av näthinnan. Gul fluorescerande proteinkanal visas för båda. Färgade pilpar indikerar samma cell i båda preparaten (övre paneler). Enplansbild av fluorescerande mikrosfärer med en diameter på 2 μm injiceras intravitret och avbildas in vivo (nedre vänstra panelen). Mikrosfärer bosatte sig inte och var därmed i konstant rörelse vilket omöjliggjorde mätning av axiell upplösning. Pixelstorlekar beräknade från halvmaximala mätningar i full bredd av fluorescerande mikrosfärer in vivo eller korrelativa konfokala mätningar tagna från 2-4 näthinnor per grupp (nere till höger). Skalstreck = 50 μm. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; EF1α = töjningsfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulär glutamattransportör 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Kalciumaktivitet inducerad genom tvåfotonskanning. Retinala ganglionceller märkta genom att injicera AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgena möss, YFP är pseudofärgad magenta och CFP-grön, avbildad i ett enda plan som en tidsserie vid 4,22 Hz. Alla RGCs hade ett liknande startförhållande mellan YFP och CFP. De flesta svarade med en ökning av FRET-förhållandet (exklusive den orange cellen), och en upprätthöll ett högt YFP / CFP-förhållande under hela tidsserien (gul cell). YFP/CFP-förhållanden normaliserades till det första bildrutegenomsnittet och färgade cirklar matchar med färgade spår. Asterisker indikerar tidpunkter med representativa bilder som visas till vänster. Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; EF1α = töjningsfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulär glutamattransportör 2; YFP = gult fluorescerande protein; CFP = cyanfluorescerande protein; RGCs = retinala ganglionceller; FRET = fluorescensresonansenergiöverföring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Tvåfotonavbildningsproceduren som beskrivs häri möjliggör longitudinell in vivo-avbildning av musens näthinna. Repeterbara bilder av samma näthinneregion kan erhållas under en kontinuerlig period på upp till 6 eller mer h under isofluran. Musen kan också avbildas på olika dagar med hjälp av cellulära och vaskulära landmärken för att lokalisera samma bildområde (figur 3). Användningen av en klar gelfördjupning i kombination med täckglas för detta ändamål har tidigare tillämpats på en rad procedurer, inklusive visualisering av näthinnan för subretinal injektion, laserinducerade retinala skademodeller och fundusavbildning20,21,22.
Ögats anatomi innebär unika utmaningar för in vivo-avbildning, eftersom den höga optiska kraften hos mushornhinnan och linsen hindrar direkt avbildning genom pupillen utan korrigering. Flera andra in vivo-avbildningsmetoder förlitar sig på användningen av en plano-konkav kontaktlins för korrigering av musögats främre optik 7,17,18,19. Med endast optisk korrigering vid hornhinnan resulterar muslinsens höga optiska effekt i en oundviklig mängd parallax, särskilt av strukturer i det perifera skanningsfältet, vilket manifesteras som sträckning och translationell rörelse i X-Y-dimensionen vid olika Z-plan. För att minimera bildparallaxrelaterad distorsion i X- och Y-dimensioner är det avgörande att musögat är orienterat så att tangentplanet till näthinnan vid bildområdet är vinkelrätt mot mikroskopets ljusväg. Inställningen som beskrivs här bidrar till exakt manipulation av ögonvinkeln för att uppnå denna inriktning. En justerbar mushuvudhållare som tillåter rotation längs två axlar möjliggör enkla manuella justeringar av ögonvinkeln när experimenteraren bläddrar genom Z-dimensionen för att minimera parallax. Denna lutning kringgår också pupillens fältstoppseffekt för att möjliggöra avbildning av större områden i näthinnan. Huvudhållarens fasthållning minskar också kraftigt rörelseartefakter orsakade av andning.
Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla klarheten i musögat, eftersom bildkvaliteten försämras med opacifiering under kontinuerlig avbildning. Frekvent applicering av smörjmedelsgel under avbildning och salva applicering efter varje bildsession hjälper till att förhindra att ögat torkar och utvecklar opaciteter. Vissa hornhinnoropaciteter kommer spontant att lösa sig efter 24-48 timmar. Användningen av klar gel och täckglas som beskrivs i detta protokoll ger liknande bildkvalitet och aberrationskorrigering som en kontaktlins7, samtidigt som det möjliggör enklare justeringar av ögonvinkeln utan att behöva justera täckglaset igen. Dessutom ger gelén kontinuerlig hydrering till ögat, vilket gör det möjligt att utföra akuta avbildningssessioner på upp till flera timmar. Slutligen, eftersom täckglaset inte kommer i kontakt med hornhinnan, orsakar det minimal irritation i ögat som kan minska optisk klarhet för upprepade bildsessioner.
En begränsning av detta tillvägagångssätt är det faktum att optiska avvikelser inte är helt korrigerade. Medan detta allvarligt minskar axiell upplösning på grund av den tunga parallaxen, kan kvantitativa mätningar av soma erhållas i enbildsplan. Det bör noteras att eftersom fluorescenssignalintensiteten hos retinala neuroner är beroende av provjustering med denna metod, är excitations- och emissionskvotmetriska baserade sensorer mer lämpliga för experiment som jämför prover kroniskt över olika bildsessioner. Ett tillvägagångssätt för att korrigera optiska avvikelser på systemnivå är adaptiv optik, vilket möjliggör subcellulär upplösning i näthinnan 8,9,14,21. Adaptiv optik kräver dock högspecialiserad utrustning och omfattande expertis att implementera.
Alternativa tillvägagångssätt för tvåfotoner in vivo retinal avbildning är konfokalmikroskopi eller oftalmoskopi6. Det tillvägagångssätt som presenteras här bör vara lätt att översätta till widefield- eller konfokalmikroskopi. Enkel fotonavbildning är kanske mer robust och utgör mindre risk att skada näthinnan på grund av hög energi hos den tvåfotonlaser som krävs för att uppnå effektiv tvåfotoneffekt genom hornhinnan och linsen i ögat. För att undvika laserskador med två fotoner bör tröskeln för maximal lasereffekt bestämmas empiriskt genom att undersöka helmonterade näthinnor efter avslutad avbildningsexperiment och immunfärgning för celltyper i de avbildade skikten. I systemet som presenteras här märktes RGCs med pan-RGC-markören, Rbpms, och densiteter var normala upp till 45 mW bildeffekt, medan 55 mW orsakade en betydande förlust av RGCs (visas inte).
En nackdel med enfotonavbildning är det faktum att detta tillvägagångssätt mycket kraftigt kommer att stimulera näthinnans inbyggda visuella kretsar jämfört med tvåfotonavbildning23. Tidigare experiment med retinala wholemounts eller ögonmusslor har visat att tvåfotonlaserskanning framkallar kretsaktivering som till stor del är övergående24. Här visar avbildning av RGC-aktivitet med Ca 2+ -sensorn Twitch2b att laserskanningens början inducerar Ca 2+ -höjder, som återgår till baslinjen under5-20 s i de flesta RGCs (Figur 8). Med tanke på att lasereffekten i detta protokoll ligger inom intervallet för tidigare experiment som rapporterar in vivo retinalt ljussvar8, är den för närvarande beskrivna metoden sannolikt mottaglig för inspelningar av kretsaktivitet i näthinnan. Sådana överväganden är viktiga för experiment som kan påverkas av kretsaktivitet.
Detta protokoll visar in vivo-avbildning av två typer av retinala neuroner, RGCs och amakrina celler. Liknande märkning av andra större celltyper kan uppnås, inklusive horisontella celler (Cx57-Cre 25), bipolära celler (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), konfotoreceptorer (S- eller M-opsin-Cre 28), stavfotoreceptorer (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) och pericyter (NG2-DsRed9). Transgena möss är också tillgängliga för att märka diskreta delmängder av RGCs (t.ex. KCNG4-Cre för αRGCs30; OPN4-Cre för ipRGCs31; JAM-B-CreER för J-RGCs 32) och amakrina celler (t.ex. ChAT-Cre för starburst amacrine celler26 och neuropeptidpromotordrivrutiner för olika amakrina cellsubtyper 3,34). Virala vektorer kan användas för att rikta in sig på specifika cellpopulationer i stället för transgena möss. Intravitreala injektioner av AAV2 med ett allestädes närvarande CAG-promotorelement märker nästan uteslutande RGCs, amakrina celler och horisontella celler25. Parning av den modifierade AAV2.7m8-Y444F-kapsiden med en konstruerad mGluR6-promotorkonstruktion möjliggör bred märkning av ON bipolära celler35. Subretinala injektioner av AAV leder till en anrikning av fotoreceptorer, där serotyp AAV2/5 har den högsta transduktionseffektiviteten36. Shh10, ett modifierat AAV6-kapsidprotein, parat med glialfibrillära sura proteinpromotorelement har visat sig specifikt för Müller glia37.
Förmågan att observera celler i centrala nervsystemet med ett helt icke-invasivt tillvägagångssätt kan användas för att studera både grundläggande egenskaper hos neurala kretsar8, liksom mekanismer för neurodegeneration 3,4,5,6,38. Många bländande sjukdomar riktar sig mot cellulära populationer i näthinnan, och in vivo-avbildningsmetoder hos möss har använts för att studera optisk nervskada 1,3,4, makuladegeneration13, stroke5, glaukom 2,6 och uveit7. Dessutom manifesterar sig många neurodegenerativa tillstånd i centrala nervsystemet i näthinnan inklusive Alzheimers sjukdom39, multipel skleros40 och Parkinsons sjukdom41. Därför kan denna lättillgängliga teknik för in vivo-avbildning av näthinnan tillämpas som ett verktyg för att studera en bred uppsättning neurodegenerativa tillstånd.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award till P.R.W. och ett obegränsat bidrag till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid Washington University School of Medicine i St. Louis), National Glaucoma Research (ett program av BrightFocus Foundation) och McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. stöds av ett institutionellt nationellt forskningstjänstpris T32 EY013360. Detta arbete stöddes också av Hope Center Viral Vectors Core vid Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
