Summary
Her beskriver vi RatWalker-systemet, bygget ved at redesigne MouseWalker-apparatet for at imødekomme den øgede størrelse og vægt af rotter. Dette system bruger frustreret total intern refleksion (FTIR), højhastighedsvideooptagelse og analysesoftware med åben adgang til at spore og kvantificere gangparametre.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse forårsaget af tab af dopaminerge (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta. Gangabnormiteter, herunder nedsat armsving, langsommere ganghastighed og kortere trin er almindelige hos PD-patienter og forekommer tidligt i sygdomsforløbet. Således vil kvantificeringen af motoriske mønstre i dyremodeller af PD være vigtig for fænotypisk karakterisering under sygdomsforløb og ved terapeutisk behandling. De fleste tilfælde af PD er idiopatiske; Identifikationen af arvelige former for PD afslørede imidlertid genmutationer og varianter, såsom funktionstabsmutationer i Pink1 og Parkin, to proteiner involveret i mitokondriel kvalitetskontrol, der kunne udnyttes til at skabe dyremodeller. Mens mus er resistente over for neurodegeneration ved tab af Pink1 og Parkin (enkelt og kombineret deletion), fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, hos rotter til nigral DA-neurontab og motorisk svækkelse. Her rapporterer vi nytten af FTIR-billeddannelse til at afdække gangændringer hos frit gående unge (2 måneder) hanrotter med kombineret tab af Pink1 og Parkin forud for udviklingen af grov visuelt tilsyneladende motorisk abnormitet, da disse rotter ældes (observeret ved 4-6 måneder), karakteriseret ved bagbenstræk som tidligere rapporteret hos Pink1 knockout (KO) rotter.
Introduction
PD, den mest almindelige aldersrelaterede neurodegenerative bevægelsesforstyrrelse, er forårsaget af tabet af DA-neuroner i substantia nigra pars compacta. Dette tab af nigrale DA-neuroner og DA-input i striatum fører til de observerede motoriske funktionsnedsættelser, der ses hos patienter med PD 1,2. De definerende motoriske egenskaber hos patienter med PD, kendt kollektivt som Parkinsonisme, omfatter stivhed, hvilende tremor, bradykinesi, postural ustabilitet og mikrografi3. Desuden forekommer gangforstyrrelser, som er almindelige hos PD-patienter, tidligt i sygdomsforløbet 1,4,5. Mens visse livsstile foreslås at hjælpe med at bremse udviklingen af PD, såsom sund kost og regelmæssig motion, er der i øjeblikket ingen kur mod PD, kun medicin til at håndtere symptomerne. Dette giver plads til behovet for yderligere undersøgelser i håb om forbedret terapi. Karakterisering af gangmønsteret i PD-dyremodeller er således et afgørende redskab til at karakterisere modellens relevans, samt hvordan terapeutiske behandlinger rettet mod at kontrollere PD forebygger eller forbedrer motoriske svækkelser.
Der er forskellige PD-dyremodeller, der er blevet brugt til at teste terapeutiske behandlinger, men hver enkelt har deres begrænsninger. For eksempel har dyremodeller behandlet med neurotoksinet 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) givet et stort væld af oplysninger om processer, der er vigtige for nigral DA-neurontab og efterfølgende striatale tilpasninger og peget på mitokondriernes rolle i PD-patogenese; MPTP-modellens patogenetiske baggrund er imidlertid af toksisk karakter snarere end en neurodegenerativ proces som i human PD6. Yderligere kemisk inducerbare modeller omfatter 6-hydroxydopamin (6-OHDA) og rotenon. 6-OHDA var det første middel, der blev brugt til at inducere PD ved selektiv akkumulering af lægemidlet i DA-neuronerne, som til sidst dræber neuronerne og fører til PD-lignende symptomer. Denne model blev først brugt til sporing af DA-udtømning ved at undersøge adfærd som reaktion på amfetamin og apomorphin7. Denne metode til PD-induktion har vist sig at være nyttig til screening af farmakologiske midler, der påvirker DA og dets receptorer8. Mens 6-OHDA-modellen er en fantastisk model til sporing af kvantificerbare motorunderskud, viser denne model ikke, hvordan det gradvise tab af neuroner og dannelse af Lewy-kroppe påvirker dyret. Den anden induktionsmetode, rotenon, har vist sig at have progressiv degeneration af nigrostriatale neuroner med tab af tyrosinhydroxylase og DA-transportør, hvilket giver mulighed for en bedre model til at spore tab af neuroner over tid9. De rotenonbehandlede rotter viste bradykinesi, postural ustabilitet og ustabil gang10. Denne metode har imidlertid vist sig at være meget variabel mellem forskellige stammer af rotter, hvilket har fremkaldt spørgsmålstegn ved, om rotenon er en pålidelig PD-model11,12,13. Mens ganganalyse har vist sig at være påvirket af induktion af PD hos rotter, er genetisk inducerede PD-rottemodeller hidtil ikke let blevet brugt til ganganalyse ved frit at gå ned ad en landingsbane.
En måde at analysere motorisk svækkelse hos frit gående gnavere er kinematisk ganganalyse, som kan udføres ved hjælp af FTIR-billeddannelse. Denne etablerede metode bruger en optisk berøringssensor baseret på FTIR, som registrerer og sporer gnavernes fodspor, når de bevæger sig ned ad landingsbanen14,15,16. Sammenlignet med andre metoder afhænger FTIR ikke af nogen markører på dyrets krop, der kan forstyrre poteaftrykkene. Generering af videodataene producerer digitale poteaftryk af alle fire lemmer, der kan kombineres for at skabe et dynamisk og reproducerbart gangmønster for forskellige gnavermodeller. Princippet for billeddannelsesbaseret ganganalyse er at tage hver enkelt pote og måle kontaktområdet over tid, når gnaveren går ned ad landingsbanen. Hver holdning er repræsenteret af en stigning i poteområdet (i bremsefasen) og et fald i poteområdet (i fremdriftsfasen). Dette fortsættes af svingfasen, hvilket er, når der ikke registreres noget potesignal. Efter evaluering af videoen genereres flere parametre, der kan bruges til at sammenligne wild-type (WT) versus PD-model. Nogle eksempler på parametrene er trinlængde (afstand poten dækker i et trin), svingvarighed (varighed poten ikke er i kontakt med landingsbanen), svinghastighed (trinlængde som funktion af svingvarighed) og trinmønster (diagonale trin, laterale trin eller bæltetrin).
For at demonstrere nytten af FTIR til at afdække tidlige gangmønsterændringer hos rotter brugte vi en genetisk rottemodel af PD. Mens de fleste tilfælde af PD er idiopatiske; identifikation af arvelige former for PD afdækkede genmutationer og varianter, såsom tab af funktionsmutationer i Pink1 og Parkin, to proteiner involveret i mitokondriel kvalitetskontrol17, der kunne udnyttes til at skabe dyremodeller18. Desværre er mus resistente over for neurodegeneration ved tab af disse proteiner (enkelt og kombineret)19,20,21. Hos rotter fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, til nigral DA-neurontab og motoriske svækkelser22, men uden fuldstændig penetrans. Derfor genererede vi en kombineret Pink1/Parkin double knockout (DKO) rottemodel, som viser den åbenlyse visuelt tilsyneladende fænotype for bagbenstræk, der er rapporteret hos hanrotterpå Pink1 KO 22, men nu med en højere hastighed: 100% versus 30-50% af hannerne mellem 4-6 måneder.
Mens denne metode fungerer godt til analyse af motoriske underskud hos mus14, var FTIR-billeddannelsesgangsystemspecifikationer for at imødekomme rotternes størrelse og vægt tidligere ikke tilgængelige ikke-kommercielt. Her forklarer vi, hvordan man bygger RatWalker, et modificeret FTIR-gangbilleddannelsessystem modelleret efter MouseWalker14, undtagen tilpasset rotternes størrelse og vægt. Dette system bruger en optisk effekt, FTIR, til at tilvejebringe en metode til at visualisere og efterfølgende registrere dyrefodspor til analyse. Kontakt af et dyrs fod med den optiske bølgeleder (platform) forårsager forstyrrelse i lysbanen, hvilket resulterer i en synlig spredningseffekt, som fanges ved hjælp af husholdningskvalitet, højhastighedsvideografi og behandling ved hjælp af open source-software. Denne undersøgelse demonstrerer kraften i FTIR-billeddannelse i at studere gangændringer i genetiske rottemodeller af PD. For eksempel, mens åbenlyse visuelt synlige motoriske ændringer (dvs. bagbenstræk) observeres hos mandlige DKO-rotter tidligst 4 måneder, er vi ved hjælp af FTIR i stand til at afdække gateabnormiteter hos han-DKO-rotter ved 2 måneders alderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Gangart apparat
BEMÆRK: Modelleret fra MouseWalker14 blev RatWalker designet med dimensioner i forhold til forskellen i trinlængde mellem rotter og mus. Den består af baggrundsbelysning i siden, gangbro, optisk bølgeledergangbro, spejl og kamera (figur S1). LED-strimler, orienteret i forskudt position, blev brugt på hver side af gangbroen og baggrundsbelysningsbølgeledere for at rumme det ekstra materiale. De materialer, der er nødvendige for at bygge det modificerede gangapparat, findes i tabel S1.
- Brug baggrundsbelysning (figur S2) til at skabe en silhuet af dyret, som bruges af softwaren til at tildele position, bevægelsesretning og morfometriske kvaliteter. Konstruktionen består af et lagdelt panel af en akryldiffusor, optisk bølgeleder, reflektor, og LED-lysstrimler samlet i en aluminiumsramme (tabel S1).
- Brug en gangbro (figur S3) til at guide dyret langs platformen og lede dyret til hjemmeburet. Konstruktionen består af klare akrylplader svejset med dichlormethan (tabel S2).
- Brug gangbroen (figur S4) til at give mediet til at generere oplyste fodspor. Gangbroen er konstrueret af klar akryl, som er sidebelyst med bånd-LED'er og anbragt i aluminiumsvinkel (tabel S3).
- Placer et spejl (figur S5) direkte under gangbroen i en 45 graders vinkel for at reflektere undersiden af gangbroen til videografi. Det er konstrueret af et 1/4 "tykt glasspejl understøttet af akryl og vinklede beslag arrangeret i en række (tabel S4).
- Udfør videografi ved hjælp af et stativmonteret højhastighedsactionkamera i husholdningskvalitet.
2. Opsætning af udstyr
- Juster baggrundsbelysning, gangbro og spejl i henhold til figur S1 oven på en bordplade, arbejdsbord eller stabil vogn. Sørg for, at hver komponent er centreret i forhold til gangbroen.
- Brug et niveau til at sørge for, at komponenterne er vandret lodrettede.
- Placer gangbroens kabinet oven på gangbroen.
- Rengør alle kontaktflader med 70% ethanol. Sørg for at bruge et ikke-slibende håndklæde for at forhindre ridser på gangbroen.
- Monter højhastighedskameraet på et 57-tommers stativ, og placer det midt på linjen til spejlet, placeret langt nok til at fange hele gangbroen inde i synsfeltet. Fra videoindstillingsmenuen skal du sikre dig, at højhastighedskameraet er indstillet til lineær optagelse i 1080p-tilstand ved 120 billeder pr. sekund (fps) med enhver form for automatisk justering eller optimeringer slået fra.
- Tilslut og tænd LED-striplysene til baggrundsbelysning og gangbro. Det kan være nødvendigt at dæmpe baggrundsbelysningen for at reducere baggrundsoptagelse.
3. Akklimatisering af dyr
BEMÆRK: En uge før det første forsøg køres dyrene gennem det modificerede gangapparat.
- Placer et hjemmebur ved gangbroens endestation.
- Når indhegningen er installeret og lyset slukket, skal du placere rotten for enden af gangbroen modsat hjemmeburet og lade den gå over gangbroen på en utvungen måde.
- Kør hver rotte gennem det modificerede gangapparat flere gange, indtil de jævnt kan krydse hele gangbroen.
- Gentag processen to dage før eksperimentet.
4. Gangart procedure
- Placer et hjemmebur for enden af gangbroen før starten af hver løbetur for at tjene som et positivt signal til rotten om at krydse gangbroen.
- Sluk lyset i rummet, tænd kameraet, og begynd at optage flere sekunder, før rotten placeres på platformen.
BEMÆRK: Sørg for at bruge et hukommelseskort, der officielt anbefales af kameraproducenten. Et skjult hukommelseskort fungerer muligvis stadig, men det garanteres ikke, at det optages med den påståede billedhastighed. - Når anlægget er installeret, skal du placere rotten for enden af gangbroen modsat hjemmeburet og lade den gå over gangbroen på en utvungen måde.
- Stop optagelsen, når dyret når gangbroens endestation.
- Rengør gangbroen med 70% ethanol og et ikke-slibende håndklæde mellem løbeture, og efter at et dyr urinerer eller defecates, og lad derefter ethanol fordampe, før du introducerer et andet dyr.
- Kør rotterne gennem gangbroen i alt 7 gange i løbet af hver observationsperiode, idet de første tre kørsler, der scorer, passerer til analyse.
- Score et løb som passerende, hvis dyret tager fire eller flere på hinanden følgende skridt i retning af hjemmeburet uden afbrydelse på grund af pleje, pause eller vildfarne bevægelser.
BEMÆRK: Det er god praksis at registrere dyrenes masse før hver runde af foranstaltninger. I vores undersøgelse vejede WT (n = 7) og DKO (n = 8) henholdsvis 200,3 ± 21,67 g og 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, Uparret t-test med Welchs korrektion). Vi ser ikke noget problem med rotter af nogen alder eller størrelse.
5. Forbehandling af video
BEMÆRK: Videoerne, der er optaget af højhastighedskameraet, gengives i mp4-format ved 120 fps og en opløsning på 1080p. For at lette byrden på den analytiske software nedstrøms skal du først trimme unødvendige optagelser og fjerne lyden fra hver video ved hjælp af LosslessCut-software (version 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut) og derefter konvertere mp4-videostreamen til en png-billedsekvens ved hjælp af open source-softwaren FFmpeg (version 4.2, http://ffmpeg.org/). Bemærk: andre tabsfri formater såsom tiff kan bruges i stedet for png.
- Opret en mappe til videoerne på en pc, der kører Windows 7 eller nyere, og overfør derefter videoerne fra højhastighedskameraets lagerenhed til den nyoprettede mappe. Derudover skal du kopiere ffmpeg.exe til samme placering.
- I LosslessCut skal du trække videoerne til grænsefladen for at åbne. Kassér lyden, indstil start- og slutskæringspunkterne til kun at omfatte den analytisk relevante del af videoen, indstil optagelsesrammeformatet til png, og eksporter. Når videoen er eksporteret, skal du omdøbe videofilen ved hjælp af en hvilken som helst navngivningskonvention efterfulgt af "_trimmed".
- For at batchkonvertere videoerne til billedsekvenser skal du åbne en kommandoprompt, indstille arbejdsmappen til placeringen af videoerne med "cd [sti til mappe]" og køre følgende kommandoer:
For %i i (*) skal du gøre mkdir "%~ni_cropped"
For %i i (*) skal du gøre mkdir "%~ni_trimmed"
for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') gør ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - Når batchprocessen er afsluttet, skal du åbne hver billedsekvens i ImageJ Fiji23 og beskære sekvensen til det interesseområde (ROI), der omfatter det område af gulvet, inden for hvilket rotten observeres.
- For at reducere baggrunden fra gangbroens belysning skal du øge farvebalancen minimum af cyankanalen til 76.
- Gem som billedsekvens, og skift suffikset "_trimmed" til "_cropped", og gem filerne i deres respektive "_cropped" -mappe.
6. Behandling af gang
BEMÆRK: Gangdata behandles og kvantificeres ved hjælp af den frit tilgængelige software, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Udpak og installer MouseWalker-softwaren på en pc, der kører et 64-bit Windows-miljø med Microsoft Excel installeret.
- Når du har startet MouseWalker.exe, skal du udføre en indledende skalakalibrering for hvert sæt kørsler. Indlæs en billedsekvens, og brug landemærker eller en lineal, der er optaget i videoen, til at måle to punkter med kendt afstand. Beregn antallet af pixels pr. centimeter i videorammen, og indtast denne værdi i parameterafsnittet i indstillingsformularen sammen med billedhastigheden for videooptagelse.
- På samme måde skal du måle rottens hoved, hale og fødder for at bestemme hovedlængde, maksimal halebredde og areal, minimum og maksimum fodareal og andre funktioner, der er nødvendige for at fuldføre afsnittet om sporingsparametre i formularen MouseWalker-indstillinger. Se http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ brugervejledning og anden dokumentation.
- For at få kropsarealværdierne skal du åbne den samme billedsekvens i ImageJ, tegne en markering, der skitserer rotten, og udføre et område af interesse (ROI) pixeltælling.
- Parametre og indstillinger, der er anvendt til denne publikation (figur S6).
BEMÆRK: Parametre leveres til illustration og afhænger af omfanget af videoen, anskaffelseshardware og betingelser. Softwarekalibrering og -justering er påkrævet, hver gang kameraet eller udstyret flyttes. Indfangning af en måleenhed i anskaffelsen forbedrer nøjagtigheden og letter kalibreringen. - Efter kalibrering skal du indlæse hver billedsekvens. Hvis du vælger auto, starter den autonome tildeling af fodspor.
- Rul gennem hvert billede i sekvensen, og korriger manuelt forkert tildelte fodaftryk. Gem, når dette trin er fuldført.
- Til sidst skal du vælge evaluer for at behandle fodaftrykspositionen og trykdataene. En række grafer, billeder og et regneark med kvantitative gangmålinger eksporteres til en resultatmappe.
7. Dataanalyse
- Brug det regneark, der eksporteres i slutningen af hver evaluering, og som indeholder kvantitative gangdata for hver kørsel. Sammenkæd data fra hver kørsel og gennemsnit pr. rotte. Afbild middeldataene, og test signifikansen ved hjælp af GraphPad Prism version 7.0a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedligeholdelse af rottekoloni
Generering og karakterisering af Pink1 og Parkin single KO rotter er blevet beskrevet tidligere22. Pink1 og Parkin single KO rotter blev hentet fra SAGE Labs (og nu tilgængelig fra Envigo). DKO rotter blev genereret ved at krydse Pink1-/- rotter med Parkin-/- rotter for at opnå Pink1+/-/Parkin+/- rotter, som blev blandet for at opnå Pink1-/-/Parkin-/- rotter (vil være tilgængelig fra Envigo). For at bekræfte sletningen af 26 bp i Park6 (genkodning af Pink1) blev genotypning udført ved hjælp af 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' fremad og 5'-CCACCACCACTACTTACT-3' omvendte primere. Deletion af 5 bp i Park2 (gen, der koder for Parkin) blev testet, efter at DNA blev amplificeret under anvendelse af en fremadrettet 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGA-3' og omvendt 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'. Amplificerede polymerasekædereaktionsprøver (PCR) blev sendt til ACGT Inc (Wheeling, IL) til sekventering (figur S7). Alle rotter blev holdt på Long Evans Hooded (LEH) baggrund. DKO rotter var levedygtige og frugtbare; der var dog en høj dødelighed blandt DKO-dæmninger på fødselstidspunktet (ca. 30%). Kun hanrotter blev brugt i disse forsøg. Rotter blev holdt i et temperaturkontrolleret miljø med en 12-timers lys / mørk cyklus og fri adgang til rotte chow og vand.
Resultater
For at tjene som et eksempel på nytten af FTIR-ganganalysesystemet til rotter, tilpasset fra14, udførte vi ganganalyse på mandlige WT- og Pink1/Parkin DKO-rotter ved 2 måneders alderen for at afgøre, om brugen af kinematisk ganganalyse kunne afdække subtile motoriske svækkelser, der ikke blev observeret med menneskelig visuel opfattelse før fremkomsten af grovmotoriske problemer, der starter ved 4 måneders alderen.
I lighed med tidligere gangstudier i mus14 var det tilpassede FTIR-system i stand til at vise fodaftryksmønsteret skabt af den gående rotte samt stien skabt af kropscentret (figur 1A). På trods af DKO-rotternes øgede vægt sammenlignet med WT (figur 1B) var fodtrykket på gangfladen (visualiseret som varmekort) bestemt af intensiteterne af FTIR-signalet uændret (figur 1C). Ved vurdering af flere gangparametre som funktion af ganghastighed (figur 1D-H) observerede vi, at ganghastigheden og trinlængderne var ens mellem WT- og DKO-rotter (figur 1D). Variationen mellem WT- og DKO-rotter blev imidlertid tydelig i holdningsfase og svingvarighed ved langsommere ganghastigheder (figur 1E, F). Den brøkdel af trincyklussen, hvor benet er i holdningsfasen (holdningsvarighed / periode), er arbejdsfaktoren, og denne parameter fremhæver mere tid brugt i svingfasen end i holdningsfasen, da arbejdsfaktoren falder, typisk for løb (figur 1G). Igen fremhæves forskelle ved lavere hastigheder. Mens svinghastigheden øges med øget hastighed hos WT-dyr, svækkes korrelationen hos DKO-rotter (figur 1H).
FTIR-ganganalysen tillod også plots af stancefasespor af hvert ben i forhold til kroppen hos frit gående rotter (figur 2A, B). Holdningssporene normaliseres til kropslængde og defineres som fodens position i forhold til kroppens centrum fra pote-touchdown (forreste ekstreme position, AEP) til slutningen af holdningsfasen (posterior ekstrem position, PEP). Ved sammenligning af potepositioneringen observerede vi signifikante ændringer i AEP (venstre bagben) og PEP (højre bagben), hvilket tyder på, at venstre bagben er tættere på kroppen under pote touchdown (AEP), mens højre bagben er længere væk fra kroppen under potestart (PEP) i DKO sammenlignet med WT-rotter (figur 2C).
Flere yderligere parametre blev signifikant ændret i DKO-rotterne sammenlignet med WT. Især blev ændringer i bagbenets svingmønstre afdækket. Svinghastigheden for både venstre og højre bagben blev øget hos DKO-rotter sammenlignet med WT-rotter (figur 3A), mens svingvarigheden for både venstre og højre bagben blev reduceret (figur 3B). Det skal bemærkes, at trinlængden var uændret (figur 4).
Figur 1. Fodaftryksmønster og trinparameteranalyse. Repræsentative fodaftryksmønstre for (A) WT og (B) DKO rotter, der viser (øverste panel) fodaftryksvarmekort, der repræsenterer pixelintensitet og vandret linje, der repræsenterer kropsbanen samt (nederste panel) individuelle fødder mærket med forskellige farver: venstre for (LF, gul), venstre bagdel (LH, blå), højre for (RF, orange) og højre bagdel (RH, grøn). (C) Gennemsnitlig ganghastighed for hver WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotte. Gennemsnit med SEM. Ikke signifikant. (D-H) Trinparametre som funktion af hastigheden i WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter. Lineære regressionslinjer og R-kvadratværdier inkluderet. (D) Trinlængden øges med hastigheden hos WT- og DKO-rotter. (E) Svingvarigheden er omvendt proportional med hastigheden hos WT-rotter, men ikke hos DKO-rotter (er ikke signifikant). (F) Stance varighed falder med hastigheden i WT og DKO rotter. (G) Driftsfaktoren er omvendt proportional med hastigheden hos DKO-rotter, men ikke WT-rotter (er ikke signifikante). (H) Svinghastigheden stiger lineært med hastigheden hos WT-rotter, men ikke DKO-rotter (er ikke signifikante). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Stance spor og pote positionering analyse. (A) Repræsentativ gangstianalyse for en WT-rotte (før og efter baggrundskorrektion) visualiseret med næse (rødt fast stof), hovedkontur (blå stiplede), halekontur (grøn stiplede), kropscenter (hvid stiplede) og fodspor (cirkler: grøn, RF og lyseblå, LH). (B) Repræsentative observationsspor for frit gående WT- og DKO-rotter. (C) Pote positionering i WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter er vist. AEP, forreste ekstreme position; PEP, bageste ekstreme position; L, venstre; R, højre; F, forpote; H, bagpote. Gennemsnit med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (p < 0,05*, 0,001***) ved hjælp af tovejs ANOVA og Sidaks multiple sammenligningstest. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Hindpaw swing parametre ændret i DKO rotter. Forpote og bagpote måler den (A) hastighed, hvormed poterne bevæger sig, og (B) tidspoterne er luftbårne i WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter. L, venstre; R, højre; F, forpote; H, bagpote. Gennemsnit med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (p < 0,01**) ved hjælp af elevens uparrede tosidede t-test med Welchs korrektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Trinlængde uændret hos DKO rotter. Forpote- og bagpotemålinger af trinlængden hos WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter. L, venstre; R, højre; F, forpote; H, bagpote. Gennemsnitlig med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (ikke signifikant) ved hjælp af elevens uparrede tosidede t-test med Welchs korrektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gangforstyrrelser, herunder nedsat armsving, langsommere ganghastighed og kortere skridt, er et definerende træk ved PD og forekommer tidligt i sygdomsforløb 1,5. Flere metoder er blevet udviklet gennem årene til at observere og registrere fodfald til ganganalyse i gnavermodeller af PD, med manuelle teknikker til kvantificering af fodfaldsposition, hvilket fører til automatiserede tilgange, der er mere følsomme og i stand til at fange dynamiske parametre. Nogle statiske tilgange involverer "blæk" gnaverpoter med en indikator, der skal spores på medier placeret på en gangbro24,25,26. De resterende fodfald kvantificeres senere manuelt. Disse metoder bruges ofte i forbindelse med videooptagelse til manuel kinematisk scoring. Autonome metoder til at fange og kvantificere gangmønstre blev introduceret for nylig15,16 og er tilgængelige kommercielt. Autonom gangkvantificering tilføjer tidsmæssige attributter til ellers statiske fodaftryk, så efterforskere kan lede efter abnormiteter, der tilskrives hastighed og tid ud over afstand og vinkel27. Tryk kan også kvantificeres, når det kombineres med FTIR-metoden.
Der er også rapporteret om abnormiteter i gangmønster i toksininducerede rottemodeller af PD. Især er gangændringer blevet rapporteret i 6-OHDA-læsionsmodellen ved hjælp af en kommerciel ganganalyseplatform28,29,30. Den mest fremtrædende ændring i denne model har været fald i ganghastighed og kadence. Desuden er den kommercielle ganganalyseplatform blevet brugt til at vurdere en række dynamiske og statiske gangparametre for PD-modeller, såsom virkningen af ensidige 6-OHDA-inducerede læsioner, og hvordan transplantation af dopaminerge neuroner redder gangændringerne31. Derudover har en undersøgelse analyseret forholdet mellem parametre fra 6-OHDA-læsioner i skadede versus uskadte sider af hjernen, samtidig med at der korrigeres for hastighed i relaterede parametre såsom bagbenets trincyklus, bagbenets udskriftsområde og trinsekvens, som alle ændres signifikant, når man sammenligner forskellige typer læsioner med saltvandskontroller32 . Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at den patogenetiske baggrund for toksininducerede modeller er af toksisk karakter snarere end en neurodegenerativ proces som i human PD6, og som sådan kan gangvurdering efter læsionsinduktion efterligne avanceret PD, når neuroner går tabt, men gøre undersøgelser af tidlige motoriske ændringer vanskeligere.
Ganggeometri er blevet målt i Pink1 KO, Parkin KO og DJ-1 KO rotter22, modeller af arvelig PD, der udviser et progressivt nigralt dopaminergt neurontab med aldring. Gangart blev målt ved hjælp af det kommercielle NeuroCube-apparat, hvor rotterne får lov til at gå i en cirkel og se på geometri og dynamiske træk. Pink1 og DJ-1 KO rotter viste kortere varighed i skridt, sving og holdning sammenlignet med WT ved 4 og 8 måneder.
Fordi kommercielle ganganalysesystemer er dyre og leveres med proprietære analyserørledninger, søgte vi et åbent alternativ til vores undersøgelse af arvelige rottemodeller af PD. MouseWalker-systemet14, der leveres med byggeinstruktioner og software med åben adgang, fanger alle parametre for kommercielt udstyr designet til små gnavere. Da platformen var for lille til konsekvent at opnå acceptable resultater med voksne rotter, dvs. fire uafbrudte trin under bevægelse ved ganghastighed, skalerede vi hardwaren igen for at imødekomme rotter. Derudover brugte vi et indenlandsk actionkamera i stedet for en kommerciel højhastighedsvideoløsning.
Lavere billedtæthed var en potentiel faldgrube ved at bruge et actionkamera i stedet for et højhastighedskamera. Imidlertid stiger kvalitetstærsklen i indenlandsk videografi hurtigt og er i stand til at optage ved 120 fps i høj opløsning. Desuden kan linseforvrængning korrigeres under optagelse ved hjælp af kamerasoftware, der producerer et konsekvent lineært synsfelt (FOV).
Vi var oprindeligt bekymrede over trykdynamikken ved at bruge en lignende tykkelse af akryl til gangbroen med en bredere base og tungere dyr og softwarens evne til at behandle video af større dyr i en bredere FOV. Vi spekulerer i, at masseområdet mellem mus og rotter falder inden for følsomhedsområdet for akryl FTIR-platformen, hvilket giver os mulighed for at måle rotter i hele deres livscyklus. Desuden er det muligt, at potentiel pixelfortynding kan opvejes af det højere overfladeareal af rotternes poteaftryk i forhold til det areal, der er fanget i synsfeltet, hvis der overhovedet er nogen signifikant forskel. Med korrekt kalibrering, som dokumenteret her, var den frit tilgængelige software14 i stand til at behandle rottegangsvideo som beskrevet.
Med denne protokol var vi i stand til at demonstrere, at FTIR musegangsystem14 modificeret her til rotter kan detektere ændringer i gangart forud for den visuelle observation af bagbenstræk hos DKO-hanrotter. Det skal bemærkes, at den åbenlyse synssynlige motoriske svækkelse (bagbenstræk), der er observeret hos DKO-rotter, tidligere er blevet rapporteret hos hanrotter med Pink1 enkelt KO22. Mens han-DKO-rotter udviser visuelt observerbar bagbenstræk, der starter ved 4-6 måneders alderen, afslørede ganganalysen bevægelsesændringer ved 2 måneders alderen. Især blev der fundet ændringer i bagbenets gangparametre. DKO rotter udviser øget bagben (både venstre og højre) svinghastighed og et tilhørende fald i bagbenets (både venstre og højre) svingvarighed. Endvidere placerer DKO-rotterne deres venstre bagpote tættere på deres krop under pote-touchdown, mens højre bagpote er længere væk fra deres krop under potestart. Mens vi ikke afdækkede ændringer i skridt eller holdningsvarighed hos DKO-rotter efter 2 måneder, var svingvarigheden kortere hos DKO-rotter, som det ligeledes rapporteres i Pink1 og DJ-1 KO-rotter22. Samlet set tyder disse ændringer på, at bagbenets gangparametre ændres forud for udviklingen af bagbenstræk hos DKO-hanrotter. Fremtidige langsgående gangstudier, der sporer udviklingen af bevægelsesændringer, vil hjælpe med at bestemme den alder, hvor gangændringer bliver signifikante.
I denne undersøgelse viste vi, at et FTIR musegangsystem14 modificeret her til undersøgelse af rotter kan bruges til at skelne ændringer i gangparametre hos 2 måneder gamle DKO-hanrotter, en model for arvelig PD, sammenlignet med aldersmatchede WT-rotter. Tidligere undersøgelser af PD-patienter afslørede reduceret skridtlængde og lavere gennemsnitlig svingtid samt øget skridttidsvariabilitet og svingtidsvariation4. Således synes vores fund af ændringer i svingtid hos DKO rotter, og tidligere rapporter om svingtidsændringer i Pink1 KO og DJ-1 KO rotter22, relevante for PD progression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
KS og HF takker Michael J Fox Foundation for Parkinsons Research for støtte til deres arbejde med Parkinsons sygdom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al.
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F.
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
