Anvendelse af RatWalker-systemet til ganganalyse i en genetisk rottemodel af Parkinsons sygdom
Summary
Her beskriver vi RatWalker-systemet, bygget ved at redesigne MouseWalker-apparatet for at imødekomme den øgede størrelse og vægt af rotter. Dette system bruger frustreret total intern refleksion (FTIR), højhastighedsvideooptagelse og analysesoftware med åben adgang til at spore og kvantificere gangparametre.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse forårsaget af tab af dopaminerge (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta. Gangabnormiteter, herunder nedsat armsving, langsommere ganghastighed og kortere trin er almindelige hos PD-patienter og forekommer tidligt i sygdomsforløbet. Således vil kvantificeringen af motoriske mønstre i dyremodeller af PD være vigtig for fænotypisk karakterisering under sygdomsforløb og ved terapeutisk behandling. De fleste tilfælde af PD er idiopatiske; Identifikationen af arvelige former for PD afslørede imidlertid genmutationer og varianter, såsom funktionstabsmutationer i Pink1 og Parkin, to proteiner involveret i mitokondriel kvalitetskontrol, der kunne udnyttes til at skabe dyremodeller. Mens mus er resistente over for neurodegeneration ved tab af Pink1 og Parkin (enkelt og kombineret deletion), fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, hos rotter til nigral DA-neurontab og motorisk svækkelse. Her rapporterer vi nytten af FTIR-billeddannelse til at afdække gangændringer hos frit gående unge (2 måneder) hanrotter med kombineret tab af Pink1 og Parkin forud for udviklingen af grov visuelt tilsyneladende motorisk abnormitet, da disse rotter ældes (observeret ved 4-6 måneder), karakteriseret ved bagbenstræk som tidligere rapporteret hos Pink1 knockout (KO) rotter.
Introduction
PD, den mest almindelige aldersrelaterede neurodegenerative bevægelsesforstyrrelse, er forårsaget af tabet af DA-neuroner i substantia nigra pars compacta. Dette tab af nigrale DA-neuroner og DA-input i striatum fører til de observerede motoriske funktionsnedsættelser, der ses hos patienter med PD 1,2. De definerende motoriske egenskaber hos patienter med PD, kendt kollektivt som Parkinsonisme, omfatter stivhed, hvilende tremor, bradykinesi, postural ustabilitet og mikrografi3. Desuden forekommer gangforstyrrelser, som er almindelige hos PD-patienter, tidligt i sygdomsforløbet 1,4,5. Mens visse livsstile foreslås at hjælpe med at bremse udviklingen af PD, såsom sund kost og regelmæssig motion, er der i øjeblikket ingen kur mod PD, kun medicin til at håndtere symptomerne. Dette giver plads til behovet for yderligere undersøgelser i håb om forbedret terapi. Karakterisering af gangmønsteret i PD-dyremodeller er således et afgørende redskab til at karakterisere modellens relevans, samt hvordan terapeutiske behandlinger rettet mod at kontrollere PD forebygger eller forbedrer motoriske svækkelser.
Der er forskellige PD-dyremodeller, der er blevet brugt til at teste terapeutiske behandlinger, men hver enkelt har deres begrænsninger. For eksempel har dyremodeller behandlet med neurotoksinet 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) givet et stort væld af oplysninger om processer, der er vigtige for nigral DA-neurontab og efterfølgende striatale tilpasninger og peget på mitokondriernes rolle i PD-patogenese; MPTP-modellens patogenetiske baggrund er imidlertid af toksisk karakter snarere end en neurodegenerativ proces som i human PD6. Yderligere kemisk inducerbare modeller omfatter 6-hydroxydopamin (6-OHDA) og rotenon. 6-OHDA var det første middel, der blev brugt til at inducere PD ved selektiv akkumulering af lægemidlet i DA-neuronerne, som til sidst dræber neuronerne og fører til PD-lignende symptomer. Denne model blev først brugt til sporing af DA-udtømning ved at undersøge adfærd som reaktion på amfetamin og apomorphin7. Denne metode til PD-induktion har vist sig at være nyttig til screening af farmakologiske midler, der påvirker DA og dets receptorer8. Mens 6-OHDA-modellen er en fantastisk model til sporing af kvantificerbare motorunderskud, viser denne model ikke, hvordan det gradvise tab af neuroner og dannelse af Lewy-kroppe påvirker dyret. Den anden induktionsmetode, rotenon, har vist sig at have progressiv degeneration af nigrostriatale neuroner med tab af tyrosinhydroxylase og DA-transportør, hvilket giver mulighed for en bedre model til at spore tab af neuroner over tid9. De rotenonbehandlede rotter viste bradykinesi, postural ustabilitet og ustabil gang10. Denne metode har imidlertid vist sig at være meget variabel mellem forskellige stammer af rotter, hvilket har fremkaldt spørgsmålstegn ved, om rotenon er en pålidelig PD-model11,12,13. Mens ganganalyse har vist sig at være påvirket af induktion af PD hos rotter, er genetisk inducerede PD-rottemodeller hidtil ikke let blevet brugt til ganganalyse ved frit at gå ned ad en landingsbane.
En måde at analysere motorisk svækkelse hos frit gående gnavere er kinematisk ganganalyse, som kan udføres ved hjælp af FTIR-billeddannelse. Denne etablerede metode bruger en optisk berøringssensor baseret på FTIR, som registrerer og sporer gnavernes fodspor, når de bevæger sig ned ad landingsbanen14,15,16. Sammenlignet med andre metoder afhænger FTIR ikke af nogen markører på dyrets krop, der kan forstyrre poteaftrykkene. Generering af videodataene producerer digitale poteaftryk af alle fire lemmer, der kan kombineres for at skabe et dynamisk og reproducerbart gangmønster for forskellige gnavermodeller. Princippet for billeddannelsesbaseret ganganalyse er at tage hver enkelt pote og måle kontaktområdet over tid, når gnaveren går ned ad landingsbanen. Hver holdning er repræsenteret af en stigning i poteområdet (i bremsefasen) og et fald i poteområdet (i fremdriftsfasen). Dette fortsættes af svingfasen, hvilket er, når der ikke registreres noget potesignal. Efter evaluering af videoen genereres flere parametre, der kan bruges til at sammenligne wild-type (WT) versus PD-model. Nogle eksempler på parametrene er trinlængde (afstand poten dækker i et trin), svingvarighed (varighed poten ikke er i kontakt med landingsbanen), svinghastighed (trinlængde som funktion af svingvarighed) og trinmønster (diagonale trin, laterale trin eller bæltetrin).
For at demonstrere nytten af FTIR til at afdække tidlige gangmønsterændringer hos rotter brugte vi en genetisk rottemodel af PD. Mens de fleste tilfælde af PD er idiopatiske; identifikation af arvelige former for PD afdækkede genmutationer og varianter, såsom tab af funktionsmutationer i Pink1 og Parkin, to proteiner involveret i mitokondriel kvalitetskontrol17, der kunne udnyttes til at skabe dyremodeller18. Desværre er mus resistente over for neurodegeneration ved tab af disse proteiner (enkelt og kombineret)19,20,21. Hos rotter fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, til nigral DA-neurontab og motoriske svækkelser22, men uden fuldstændig penetrans. Derfor genererede vi en kombineret Pink1/Parkin double knockout (DKO) rottemodel, som viser den åbenlyse visuelt tilsyneladende fænotype for bagbenstræk, der er rapporteret hos hanrotterpå Pink1 KO 22, men nu med en højere hastighed: 100% versus 30-50% af hannerne mellem 4-6 måneder.
Mens denne metode fungerer godt til analyse af motoriske underskud hos mus14, var FTIR-billeddannelsesgangsystemspecifikationer for at imødekomme rotternes størrelse og vægt tidligere ikke tilgængelige ikke-kommercielt. Her forklarer vi, hvordan man bygger RatWalker, et modificeret FTIR-gangbilleddannelsessystem modelleret efter MouseWalker14, undtagen tilpasset rotternes størrelse og vægt. Dette system bruger en optisk effekt, FTIR, til at tilvejebringe en metode til at visualisere og efterfølgende registrere dyrefodspor til analyse. Kontakt af et dyrs fod med den optiske bølgeleder (platform) forårsager forstyrrelse i lysbanen, hvilket resulterer i en synlig spredningseffekt, som fanges ved hjælp af husholdningskvalitet, højhastighedsvideografi og behandling ved hjælp af open source-software. Denne undersøgelse demonstrerer kraften i FTIR-billeddannelse i at studere gangændringer i genetiske rottemodeller af PD. For eksempel, mens åbenlyse visuelt synlige motoriske ændringer (dvs. bagbenstræk) observeres hos mandlige DKO-rotter tidligst 4 måneder, er vi ved hjælp af FTIR i stand til at afdække gateabnormiteter hos han-DKO-rotter ved 2 måneders alderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gangforstyrrelser, herunder nedsat armsving, langsommere ganghastighed og kortere skridt, er et definerende træk ved PD og forekommer tidligt i sygdomsforløb 1,5. Flere metoder er blevet udviklet gennem årene til at observere og registrere fodfald til ganganalyse i gnavermodeller af PD, med manuelle teknikker til kvantificering af fodfaldsposition, hvilket fører til automatiserede tilgange, der er mere følsomme og i stand til at fange dynamiske parametre. No…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS og HF takker Michael J Fox Foundation for Parkinsons Research for støtte til deres arbejde med Parkinsons sygdom.
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson’s disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson’s disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson’s disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson’s Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson’s disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson’s disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson’s disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
