Summary

Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

Published: January 18, 2021
doi:

Summary

Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l’apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l’acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell’andatura.

Abstract

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva causata dalla perdita di neuroni dopaminergici (DA) nella pars compacta substantia nigra. Le anomalie dell’andatura, tra cui la diminuzione dell’oscillazione del braccio, la velocità di camminata più lenta e i passi più brevi sono comuni nei pazienti con PD e compaiono precocemente nel corso della malattia. Pertanto, la quantificazione dei pattern motori in modelli animali di PD sarà importante per la caratterizzazione fenotipica durante il decorso della malattia e dopo il trattamento terapeutico. La maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; tuttavia, l’identificazione di forme ereditarie di PD ha scoperto mutazioni e varianti genetiche, come mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali. Mentre i topi sono resistenti alla neurodegenerazione dopo la perdita di Pink1 e Parkin (delezione singola e combinata), nei ratti, Pink1 ma non la carenza di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e alla compromissione motoria. Qui, riportiamo l’utilità dell’imaging FTIR per scoprire i cambiamenti dell’andatura in ratti maschi giovani (2 mesi di età) che camminano liberamente con perdita combinata di Pink1 e Parkin prima dello sviluppo di una grossolana anomalia motoria visivamente apparente quando questi ratti invecchiano (osservati a 4-6 mesi), caratterizzati da trascinamento degli arti posteriori come precedentemente riportato nei ratti knockout (KO) Pink1.

Introduction

La PD, la più comune malattia neurodegenerativa del movimento legata all’età, è causata dalla perdita di neuroni DA nella substantia nigra pars compacta. Questa perdita di neuroni DA nigrali e gli input di DA nello striato portano alle compromissioni osservate della funzione motoria osservate nei pazienti con PD 1,2. Le caratteristiche motorie che definiscono i pazienti con PD, note collettivamente come parkinsonismo, includono rigidità, tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e micrografia3. Inoltre, i disturbi dell’andatura, che sono comuni nei pazienti con PD, compaiono precocemente nel corso della malattia 1,4,5. Mentre alcuni stili di vita sono suggeriti per aiutare a rallentare la progressione del PD, come un’alimentazione sana e un regolare esercizio fisico, attualmente non esiste una cura per il PD, solo farmaci per gestire i sintomi. Ciò lascia spazio alla necessità di ulteriori indagini nella speranza di migliorare le terapie. Pertanto, la caratterizzazione del modello di andatura nei modelli animali di PD è uno strumento cruciale per caratterizzare la rilevanza del modello e il modo in cui i trattamenti terapeutici volti a controllare il PD stanno prevenendo o migliorando le menomazioni motorie.

Ci sono vari modelli animali PD che sono stati utilizzati per testare trattamenti terapeutici, tuttavia ognuno ha i suoi limiti. Ad esempio, modelli animali trattati con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui processi importanti per la perdita dei neuroni DA nigrale e i successivi adattamenti striatali, e hanno indicato il ruolo dei mitocondri nella patogenesi della PD; tuttavia, il background patogenetico del modello MPTP è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6umano. Ulteriori modelli chimicamente inducibili includono 6-idrossidopamina (6-OHDA) e rotenone. 6-OHDA è stato il primo agente utilizzato per indurre PD mediante accumulo selettivo del farmaco nei neuroni DA, che alla fine uccide i neuroni e porta a sintomi simili a PD. Questo modello è stato utilizzato per la prima volta per il monitoraggio della deplezione di DA esaminando il comportamento in risposta all’anfetamina e all’apomorfina7. Questo metodo di induzione del PD si è dimostrato utile per lo screening di agenti farmacologici che hanno un impatto su DA e sui suoi recettori8. Mentre il modello 6-OHDA è un ottimo modello per tracciare i deficit motori quantificabili, questo modello non mostra come la graduale perdita di neuroni e la formazione di corpi di Lewy influiscano sull’animale. L’altro metodo di induzione, il rotenone, ha dimostrato di avere una progressiva degenerazione dei neuroni nigrostriatali con la perdita di tirosina idrossilasi e trasportatore DA, consentendo un modello migliore per tracciare la perdita di neuroni nel tempo9. I ratti trattati con rotenone hanno mostrato bradicinesia, instabilità posturale e andatura instabile10. Tuttavia, questo metodo è risultato essere ampiamente variabile tra diversi ceppi di ratti, il che ha provocato dubbi sul fatto che il rotenone sia o meno un modello PD affidabile11,12,13. Mentre l’analisi dell’andatura ha dimostrato di essere influenzata dall’induzione del PD nei ratti, fino ad oggi, i modelli di ratto PD geneticamente indotti non sono stati prontamente utilizzati per l’analisi dell’andatura camminando liberamente lungo una pista.

Un modo per analizzare la compromissione motoria nei roditori che camminano liberamente è l’analisi cinematica dell’andatura, che può essere eseguita utilizzando l’imaging FTIR. Questo metodo consolidato utilizza un sensore tattile ottico basato su FTIR, che registra e traccia le impronte dei roditori mentre si muovono lungo la pista14,15,16. Rispetto ad altri metodi, FTIR non dipende da alcun marcatore sul corpo dell’animale che potrebbe interferire con le impronte delle zampe. La generazione dei dati video produce impronte digitali di zampe di tutti e quattro gli arti che possono essere combinate per creare un modello di camminata dinamico e riproducibile per vari modelli di roditori. Il principio dell’analisi dell’andatura basata sull’imaging è quello di prendere ogni singola zampa e misurare l’area di contatto nel tempo mentre il roditore cammina lungo la pista. Ogni posizione è rappresentata da un aumento dell’area della zampa (nella fase di frenata) e una diminuzione dell’area della zampa (nella fase di propulsione). Questo è proceduto dalla fase di oscillazione, che è quando non viene rilevato alcun segnale di zampa. Dopo la valutazione del video, vengono generati diversi parametri che possono essere utilizzati per confrontare il modello wild-type (WT) rispetto al modello PD. Alcuni esempi di parametri sono la lunghezza del passo (distanza che la zampa copre in un passo), la durata dell’oscillazione (durata del tempo in cui la zampa non è in contatto con la pista), la velocità di oscillazione (lunghezza del passo in funzione della durata dell’oscillazione) e il modello di passo (passi diagonali, gradini laterali o gradini della cintura).

Per dimostrare l’utilità della FTIR per scoprire i primi cambiamenti del modello di andatura nei ratti, abbiamo usato un modello genetico di ratto di PD. Mentre la maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; l’identificazione di forme ereditarie di mutazioni e varianti genetiche scoperte per il PD, come le mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale17, che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali18. Sfortunatamente, i topi sono resistenti alla neurodegenerazione per perdita di queste proteine (singole e combinate)19,20,21. Nei ratti, il Pink1 ma non il deficit di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e a menomazioni motorie22, ma senza penetranza completa. Pertanto, abbiamo generato un modello combinato di ratto Pink1 / Parkin double knockout (DKO), che mostra il fenotipo di trascinamento degli arti posteriori visivamente evidente riportato nei ratti maschi Pink1 KO22, ma ora a un tasso più elevato: 100% contro 30-50% dei maschi tra 4-6 mesi.

Mentre questo metodo funziona bene per analizzare i deficit motori nei topi14, le specifiche del sistema di andatura di imaging FTIR per adattarsi alle dimensioni e al peso dei ratti non erano precedentemente disponibili non commerciali. Qui spieghiamo come costruire il RatWalker, un sistema di imaging dell’andatura FTIR modificato modellato sul MouseWalker14, tranne adattato per le dimensioni e il peso dei ratti. Questo sistema utilizza un effetto ottico, FTIR, per fornire un metodo per visualizzare e successivamente registrare le impronte degli animali per l’analisi. Il contatto del piede di un animale con la guida d’onda ottica (piattaforma) provoca interruzioni nel percorso della luce con conseguente effetto di dispersione visibile, che viene catturato utilizzando videografia domestica ad alta velocità ed elaborazione utilizzando software open source. Questo studio dimostra il potere dell’imaging FTIR nello studio dei cambiamenti dell’andatura nei modelli genetici di ratto di PD. Ad esempio, mentre i cambiamenti motori palesi visivamente evidenti (cioè il trascinamento degli arti posteriori) sono osservati nei ratti DKO maschi al più presto a 4 mesi, utilizzando FTIR siamo in grado di scoprire anomalie del gate nei ratti DKO maschi a 2 mesi di età.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università del Nebraska Medical Center. 1. Apparato di deambulazione NOTA: Modellato dal MouseWalker14, il RatWalker è stato progettato con dimensioni proporzionali alla differenza di lunghezza del passo tra ratti e topi. È costituito da una retroilluminazione laterale, un involucro per passerella, una passerella ottic…

Representative Results

Manutenzione delle colonie di rattiLa generazione e la caratterizzazione dei ratti Pink1 e Parkin single KO sono state descritte in precedenza22. I ratti KO singoli Pink1 e Parkin sono stati ottenuti da SAGE Labs (e ora disponibili da Envigo). I ratti DKO sono stati generati incrociando ratti Pink1-/- con ratti Parkin-/- per ottenere ratti Pink1+/-/Parkin+/-, che sono stati incrociati per ottenere ratti Pink1-/-/Parkin-<su…

Discussion

I disturbi dell’andatura, tra cui una diminuzione dell’oscillazione del braccio, una velocità di camminata più lenta e passi più brevi, sono una caratteristica distintiva della malattia di Parkinson e si verificano all’inizio del decorso della malattia 1,5. Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi metodi per osservare e registrare i passi per l’analisi dell’andatura nei modelli di PD dei roditori, con tecniche manuali per quantificare la posizione de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

KS e HF ringraziano la Michael J Fox Foundation for Parkinson’s Research per il sostegno al loro lavoro sulla malattia di Parkinson.

Materials

Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) Dimensions: 8'
Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) Dimensions: 8'
Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet Dimensions: 10'
Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) Dimensions: 8'
Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet Dimensions: 4'x8'
Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) Dimensions: 4'x8'
Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror Dimensions: 60"x12"
Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green) Dimensions: 16.4'
Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red) Dimensions: 16.4'
Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black Qty: 1
Tripod Dimensions: 57"
Qty: 1

References

  1. Behari, M., et al. Parkinson’s disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).
  2. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  3. Fahn, S. Description of Parkinson’s disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
  4. Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson’s disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
  5. Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
  6. Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson’s Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
  7. Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
  8. Beal, M. F. Experimental models of Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
  9. Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
  10. Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
  11. Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
  12. Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson’s disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
  13. Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
  14. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
  15. Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
  16. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  17. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson’s disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  18. Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson’s disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
  19. Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
  20. Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
  21. Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
  22. Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
  25. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  26. Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
  27. Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
  28. Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
  29. Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
  30. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  31. Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
  32. Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).

Play Video

Cite This Article
Stauch, K. L., Totusek, S., Farmer, T., Lamberty, B. G., Dyball, K. N., Almikhlafi, M. A., Fox, H. S. Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson’s Disease. J. Vis. Exp. (167), e62002, doi:10.3791/62002 (2021).

View Video