Summary
כאן אנו מתארים את מערכת RatWalker, שנבנתה על ידי תכנון מחדש של מנגנון MouseWalker כדי להתאים לגודל ולמשקל המוגדלים של חולדות. מערכת זו משתמשת בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת (FTIR), לכידת וידאו במהירות גבוהה ותוכנת ניתוח בגישה פתוחה כדי לעקוב אחר פרמטרים של הליכה ולכמת אותם.
Abstract
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת הנגרמת על ידי אובדן של נוירונים דופמינרגיים (DA) בחומר השחור pars compacta. הפרעות הליכה, כולל ירידה בנדנוד הזרוע, מהירות הליכה איטית יותר וצעדים קצרים יותר שכיחות בקרב חולי פרקינסון ומופיעות בשלב מוקדם במהלך המחלה. לפיכך, כימות הדפוסים המוטוריים במודלים של פרקינסון בבעלי חיים יהיה חשוב לאפיון פנוטיפי במהלך המחלה ובטיפול הטיפולי. רוב המקרים של פרקינסון הם אידיופתיים; עם זאת, זיהוי צורות תורשתיות של פרקינסון חשף מוטציות גנטיות ווריאנטים, כגון מוטציות אובדן תפקוד ב- Pink1 ופרקין, שני חלבונים המעורבים בבקרת איכות מיטוכונדריאלית שניתן לרתום ליצירת מודלים של בעלי חיים. בעוד עכברים עמידים לניוון עצבי עם אובדן פינק1 ופרקין (מחיקה יחידה ומשולבת), בחולדות, מחסור ב-Pink1 אך לא בפרקין מוביל לאובדן נוירון DA ניגלי ולפגיעה מוטורית. כאן, אנו מדווחים על התועלת של הדמיית FTIR כדי לחשוף שינויים בהליכה בחולדות זכרים צעירים (בני חודשיים) בהליכה חופשית עם אובדן משולב של Pink1 ופרקין לפני התפתחות של חריגה מוטורית גסה הנראית לעין ככל שחולדות אלה מזדקנות (נצפו בגיל 4-6 חודשים), המאופיינות בגרירת גפיים אחוריות כפי שדווח בעבר בחולדות נוקאאוט Pink1 (KO).
Introduction
מחלת פרקינסון, הפרעת התנועה הניוונית הנפוצה ביותר הקשורה לגיל, נגרמת על-ידי אובדן נוירוני DA ב-substantia nigra pars compacta. אובדן זה של נוירוני DA ניגרליים וקלט DA לתוך הסטריאטום מוביל לליקויים בתפקוד המוטורי שנצפו בחולים עם PD 1,2. המאפיינים המוטוריים המגדירים של חולי פרקינסון, המכונים פרקינסוניזם, כוללים קשיחות, רעד במנוחה, ברדיקינזיה, חוסר יציבות יציבה ומיקרוגרפיה3. יתר על כן, הפרעות הליכה, השכיחות בחולי פרקינסון, מופיעות בשלב מוקדם במהלך המחלה 1,4,5. בעוד שאורח חיים מסוים מוצע לעזור להאט את התקדמות מחלת הפרקינסון, כגון אכילה בריאה ופעילות גופנית סדירה, כיום אין תרופה לפרקינסון, אלא רק תרופות לניהול התסמינים. זה משאיר מקום לצורך בחקירה נוספת בתקווה לשיפור הטיפולים. לפיכך, אפיון דפוס ההליכה במודלים של חולי פרקינסון הוא כלי חיוני לאפיון הרלוונטיות של המודל, כמו גם כיצד טיפולים טיפוליים שמטרתם לשלוט בפרקינסון מונעים או משפרים ליקויים מוטוריים.
ישנם מודלים שונים של חולי פרקינסון בבעלי חיים ששימשו לבדיקת טיפולים טיפוליים, אולם לכל אחד מהם יש את המגבלות שלו. לדוגמה, מודלים של בעלי חיים שטופלו ברעלן העצבי 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP) הניבו שפע רב של מידע על תהליכים החשובים לאובדן נוירונים מסוג DA ניגלי ולהתאמות סטריאטליות לאחר מכן, והצביעו על תפקיד המיטוכונדריה בפתוגנזה של פרקינסון; עם זאת, הרקע הפתוגנטי של מודל MPTP הוא בעל אופי רעיל ולא תהליך נוירודגנרטיבי כמו במחלת פרקינסון6 אנושית. מודלים כימיים נוספים כוללים 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) ורוטנון. 6-OHDA היה החומר הראשון ששימש להשראת פרקינסון על ידי הצטברות סלקטיבית של התרופה בנוירוני DA, אשר בסופו של דבר הורגת את הנוירונים ומובילה לתסמינים דמויי פרקינסון. מודל זה שימש לראשונה למעקב אחר דלדול DA על ידי בחינת ההתנהגות בתגובה לאמפטמין ואפומורפין7. שיטה זו של השראת פרקינסון הוכחה כשימושית לסינון של חומרים פרמקולוגיים המשפיעים על DA והקולטנים שלה8. בעוד מודל 6-OHDA הוא מודל נהדר למעקב אחר ליקויים מוטוריים הניתנים לכימות, מודל זה אינו מראה כיצד אובדן הדרגתי של נוירונים והיווצרות של גופי לוי משפיעים על החיה. השיטה השנייה של אינדוקציה, רוטנון, הוכחה כניוון מתקדם של נוירונים ניגרוסטריאטליים עם אובדן של טירוזין הידרוקסילאז וטרנספורטר DA, מה שמאפשר מודל טוב יותר לעקוב אחר אובדן נוירונים לאורך זמן9. החולדות שטופלו ברוטנון הראו ברדיקינזיה, חוסר יציבות יציבה והליכה לא יציבה10. עם זאת, שיטה זו נמצאה משתנה מאוד בין זנים שונים של חולדות, מה שעורר את השאלה אם רוטנון הוא מודל PD אמין 11,12,13. בעוד שניתוח הליכה הוכח כמושפע מהשראת פרקינסון בחולדות, עד כה, מודלים גנטיים של חולדות PD לא שימשו בקלות לניתוח הליכה על ידי הליכה חופשית לאורך מסלול.
אחת הדרכים לנתח פגיעה מוטורית במכרסמים ההולכים בחופשיות היא ניתוח הליכה קינמטית, אשר יכול להתבצע באמצעות הדמיית FTIR. שיטה מבוססת זו משתמשת בחיישן מגע אופטי המבוסס על FTIR, אשר מתעד ועוקב אחר עקבותיהם של המכרסמים כשהם נעים במורד המסלול14,15,16. בהשוואה לשיטות אחרות, FTIR אינו תלוי בסמנים כלשהם על גוף החיה שעלולים להפריע לטביעות הכפות. הפקת נתוני הווידאו מייצרת הדפסי כפות דיגיטליות של כל ארבעת הגפיים שניתן לשלב ליצירת דפוס הליכה דינמי וניתן לשחזור עבור דגמי מכרסמים שונים. העיקרון של ניתוח הליכה מבוסס הדמיה הוא לקחת כל כף בודדת ולמדוד את אזור המגע לאורך זמן כאשר המכרסם הולך במורד המסלול. כל עמידה מיוצגת על ידי עלייה בשטח הכף (בשלב הבלימה) וירידה בשטח הכף (בשלב ההנעה). זה נמשך על ידי שלב הנדנדה, אשר כאשר אין אות כף זוהה. לאחר הערכת הסרטון, נוצרים מספר פרמטרים שניתן להשתמש בהם כדי להשוות מודל מסוג פרא (WT) לעומת PD. כמה דוגמאות לפרמטרים הם אורך צעד (מרחק שהכף מכסה בצעד אחד), משך הנדנדה (משך הזמן שהכף אינה באה במגע עם המסלול), מהירות הנדנדה (אורך צעד כפונקציה של משך הנדנדה) ותבנית צעד (צעדים אלכסוניים, צעדים רוחביים או מדרגות חגורה).
כדי להדגים את התועלת של FTIR כדי לחשוף שינויים מוקדמים בדפוסי ההליכה בחולדות, השתמשנו במודל גנטי של חולדות של פרקינסון. בעוד שרוב המקרים של פרקינסון הם אידיופתיים; זיהוי צורות תורשתיות של פרקינסון חשף מוטציות גנטיות ווריאנטים, כגון מוטציות אובדן תפקוד בפינק1 ופרקין, שני חלבונים המעורבים בבקרת איכות מיטוכונדריאלית17, שניתן לרתום ליצירת מודלים של בעלי חיים18. למרבה הצער, עכברים עמידים לניוון עצבי לאחר אובדן חלבונים אלה (בודדים ומשולבים)19,20,21. בחולדות, מחסור ב-Pink1 אך לא ב-Parkin מוביל לאיבוד נוירונים מסוג DA ניגלי ולליקויים מוטוריים22, אך ללא חדירה מלאה. לכן, יצרנו מודל משולב של חולדות Pink1/Parkin double knockout (DKO), אשר מציג את פנוטיפ גרירת הגפיים האחוריות הגלוי לעין שדווח בחולדות Pink1 KO זכרים22 אך כעת בשיעור גבוה יותר: 100% לעומת 30-50% מהזכרים בין 4-6 חודשים.
בעוד ששיטה זו פועלת היטב לניתוח ליקויים מוטוריים בעכברים14, מפרטי מערכת ההליכה של הדמיה FTIR כדי להתאים לגודל ולמשקל של חולדות לא היו זמינים בעבר באופן לא מסחרי. כאן אנו מסבירים כיצד לבנות את RatWalker, מערכת דימות הליכה FTIR שונה שעוצבה על פי המודל של MouseWalker14, למעט התאמה לגודל ולמשקל של חולדות. מערכת זו משתמשת באפקט אופטי, FTIR, כדי לספק שיטה להמחיש ולאחר מכן להקליט טביעות רגל של בעלי חיים לניתוח. מגע כף רגלו של בעל חיים עם מדריך הגל האופטי (פלטפורמה) גורם לשיבוש בנתיב האור וכתוצאה מכך לאפקט פיזור נראה לעין, אשר נלכד באמצעות וידאו ועיבוד במהירות גבוהה ברמה ביתית באמצעות תוכנת קוד פתוח. מחקר זה מדגים את כוחה של דימות FTIR בחקר שינויים בהליכה במודלים גנטיים של חולדות של פרקינסון. לדוגמה, בעוד ששינויים מוטוריים גלויים לעין (כלומר גרירת גפיים אחוריות) נצפים בחולדות DKO זכרים בגיל 4 חודשים לכל המוקדם, באמצעות FTIR אנו מסוגלים לחשוף חריגות שער בחולדות DKO זכרים בגיל חודשיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (IACUC).
1. מנגנון הליכה
הערה: ה-RatWalker, שעוצב בהשראת MouseWalker14, תוכנן עם ממדים ביחס להבדל באורך הצעד בין חולדות ועכברים. הוא מורכב מתאורה אחורית עם תאורה צדדית, מתחם שבילים, מסלול הליכה אופטי, מראה ומצלמה (איור S1). פסי LED, המכוונים במצב מדורג, שימשו בכל צד של השביל ומדריכי גלים עם תאורה אחורית כדי להכיל את החומר הנוסף. החומרים הדרושים לבניית מנגנון ההליכה המותאם נמצאים בטבלה S1.
- השתמשו בתאורה אחורית (איור S2) כדי ליצור צללית של החיה, אשר התוכנה משתמשת בה כדי להקצות מיקום, כיוון תנועה ואיכויות מורפומטריות. הבנייה מורכבת מלוח שכבתי של מפזר אקרילי, מדריך גל אופטי, רפלקטור ופסי תאורת LED המורכבים בתוך מסגרת אלומיניום (טבלה S1).
- השתמשו במתחם שבילים (איור S3) כדי להדריך את החיה לאורך הרציף ולכוון אותה לכלוב הביתי. הבנייה מורכבת מיריעות אקריליק שקופות ממס מרותך בדיכלורומתאן (טבלה S2).
- השתמשו בשביל ההליכה (איור S4) כדי לספק את המדיום ליצירת טביעות רגל מוארות. השביל בנוי מאקריליק שקוף, המואר צדדית בנורות LED רצופות ושוכן בזווית אלומיניום (טבלה S3).
- מקמו מראה (איור S5) ישירות מתחת לשביל בזווית של 45 מעלות כדי לשקף את החלק התחתון של השביל לצורך צילום וידאו. הוא בנוי ממראת זכוכית בעובי 1/4 אינץ' הנתמכת על ידי אקריליק, וסוגרים זוויתיים מסודרים בשורה (טבלה S4).
- בצע צילום וידאו באמצעות מצלמת אקשן במהירות גבוהה המותקנת על חצובה, באיכות ביתית.
2. הגדרת ציוד
- יישרו את התאורה האחורית, שביל ההליכה והמראה לפי איור S1, על גבי משטח עבודה, שולחן עבודה או עגלה יציבה. ודא שכל רכיב ממורכז ביחס לשביל.
- באמצעות רמה, ודא כי הרכיבים הם אינסטלציה אופקית.
- מקם את מתחם השביל על גבי השביל.
- נקו את כל שטחי המגע עם 70% אתנול. הקפידו להשתמש במגבת לא שוחקת כדי למנוע גירוד של השביל.
- הרכיבו את המצלמה המהירה על חצובה בגודל 57 אינץ' ומקמו אותה בקו האמצע מול המראה, במרווח מספיק גדול כדי ללכוד את כל השביל בתוך שדה הראייה. מתפריט הגדרות הווידאו, ודא שהמצלמה במהירות גבוהה מוגדרת לרכישה ליניארית במצב 1080p בקצב של 120 פריימים לשנייה (fps) כאשר כל סוג של התאמה אוטומטית או אופטימיזציות כבויות.
- חבר והפעל את נורות פס ה- LED עבור התאורה האחורית והשביל. ייתכן שיהיה צורך לעמעם את התאורה האחורית כדי להפחית את לכידת הרקע.
3. התאקלמות בעלי חיים
הערה: שבוע לפני הניסוי הראשון, הפעל את החיות דרך מנגנון ההליכה השונה.
- מקמו כלוב ביתי בקצה השביל.
- כאשר המתחם מותקן והאורות כבויים, הניחו את החולדה בקצה השביל מול הכלוב הביתי ואפשרו לה לחצות את השביל בצורה לא מאולצת.
- הפעל כל חולדה דרך מנגנון ההליכה שונה מספר פעמים, עד שהם יכולים לחצות בצורה חלקה את כל השביל.
- חזור על התהליך יומיים לפני הניסוי.
4. נוהל הליכה
- הניחו כלוב ביתי בסוף השביל לפני תחילת כל ריצה כדי לשמש רמז חיובי לחולדה לחצות את השביל.
- כבו את אורות החדר, הפעילו את המצלמה והתחילו להקליט מספר שניות לפני שהחולדה מונחת על הרציף.
הערה: הקפד להשתמש בכרטיס זיכרון המומלץ באופן רשמי על-ידי יצרן המצלמה. כרטיס זיכרון שאינו רשום עשוי עדיין לפעול, אך לא מובטח שהוא יילכד בקצב הפריימים כביכול. - עם התקנת המכלאה, הניחו את החולדה בקצה השביל מול הכלוב הביתי ואפשרו לה לחצות את השביל בצורה לא מאולצת.
- הפסק להקליט ברגע שהחיה מגיעה לקצה השביל.
- נקו את השביל באמצעות 70% אתנול ומגבת לא שוחקת בין ריצות ולאחר שבעל חיים משתין או עושה את צרכיו, ואז אפשרו לאתנול להתאדות לפני החדרת בעל חיים אחר.
- הריצו את החולדות דרך שביל ההליכה בסך הכל 7 פעמים במהלך כל תקופת תצפית, ולקחו את שלוש הריצות הראשונות שקיבלו ציון עובר לניתוח.
- ציון ריצה כעובר אם בעל החיים עושה ארבעה צעדים רצופים או יותר לכיוון הכלוב הביתי ללא הפרעה עקב טיפוח, השתהות או תנועות שגויות.
הערה: מומלץ לרשום את המסה של בעלי החיים לפני כל סבב של מדידות. במחקר שלנו, WT (n = 7) ו- DKO (n = 8) שקלו 200.3 ± 21.67 גרם ו- 296.6 ± 3.85 גרם, בהתאמה (p = 0.004, מבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש). איננו רואים בעיה עם חולדות בכל גיל או גודל.
5. עיבוד מקדים של וידאו
הערה: הסרטונים שצולמו על ידי המצלמה במהירות גבוהה מוצגים בפורמט mp4 ב- 120 fps וברזולוציה של 1080p. כדי להקל על העומס על התוכנה האנליטית במורד הזרם, תחילה חתוך קטעים מיותרים והפשט את האודיו מכל סרטון באמצעות תוכנת LosslessCut (גרסה 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), ולאחר מכן המר את זרם הווידאו mp4 לרצף תמונות png באמצעות תוכנת הקוד הפתוח FFmpeg (גרסה 4.2, http://ffmpeg.org/). הערה: ניתן להשתמש בתבניות אחרות ללא אובדן נתונים, כגון tiff, במקום png.
- צור ספריה עבור סרטוני הווידאו במחשב שבו פועל Windows 7 ואילך ולאחר מכן העבר את סרטוני הווידאו מהתקן האחסון של המצלמה במהירות גבוהה לספריה החדשה שנוצרה. בנוסף, העתק ffmpeg.exe לאותו מיקום.
- ב- LosslessCut, גרור את הסרטונים לממשק כדי לפתוח. מחק את האודיו, הגדר את נקודות החיתוך של ההתחלה והסיום כך שיכללו רק את החלק הרלוונטי מבחינה אנליטית של הסרטון, הגדר את פורמט מסגרת הלכידה ל- PNG וייצוא. לאחר ייצוא הסרטון, שנה את שם קובץ הווידאו באמצעות כל מוסכמה למתן שמות ואחריה "_trimmed".
- כדי להמיר את הסרטונים באצווה לרצפי תמונות, פתח שורת פקודה, הגדר את ספריית העבודה למיקום הסרטונים באמצעות "cd [path to directory]" והפעל את הפקודות הבאות:
עבור %i ב- (*) לעשות MKDIR "%~ni_cropped"
עבור %i ב- (*) לעשות MKDIR "%~ni_trimmed"
עבור /f "אסימונים=1 delims=." %a ב- ('dir /B *_trimmed. MP4') לעשות ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - לאחר השלמת תהליך האצווה, פתחו כל רצף תמונות ב-ImageJ Fiji23 וחתכו את הרצף לאזור העניין (ROI) המקיף את שטח הרצפה שבתוכו נצפית החולדה.
- כדי להפחית את הרקע מתאורת השביל, הגדל את איזון הצבעים המינימלי של תעלת הציאן ל- 76.
- שמור כרצף תמונות ושנה את הסיומת "_trimmed" ל- "_cropped", תוך שמירת הקבצים בתיקיית "_cropped" המתאימה להם.
6. עיבוד הליכה
הערה: נתוני הליכה מעובדים ומכומתים באמצעות התוכנה הזמינה באופן חופשי, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- פרק והתקן את תוכנת MouseWalker במחשב שבו פועלת סביבת Windows של 64 סיביות שבה מותקן Microsoft Excel.
- לאחר השקת MouseWalker.exe, בצע כיול בקנה מידה ראשוני עבור כל קבוצה של ריצות. טען רצף תמונות ובאמצעות ציוני דרך או סרגל שצולם בסרטון, מדוד שתי נקודות של מרחק ידוע. חשב את מספר הפיקסלים לסנטימטר במסגרת הווידאו והזן ערך זה באזור הפרמטרים של טופס ההגדרות יחד עם קצב המסגרות של רכישת הווידאו.
- באופן דומה, מדדו את הראש, הזנב והרגליים של החולדה כדי לקבוע את אורך הראש, רוחב ושטח הזנב המרביים, שטח כף הרגל המינימלי והמקסימלי ותכונות אחרות הדרושות להשלמת מקטע פרמטרי המעקב בטופס ההגדרות של MouseWalker. עיין http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ לקבלת המדריך למשתמש ותיעוד נוסף.
- לקבלת ערכי אזור הגוף, פתחו את אותו רצף תמונות ב- ImageJ, ציירו בחירה המתארת את החולדה ובצעו ספירת פיקסלים של אזור עניין (ROI).
- פרמטרים והגדרות ששימשו לפרסום זה (איור S6).
הערה: פרמטרים מסופקים להמחשה ותלויים בקנה המידה של הווידאו, חומרת הרכישה והתנאים. יש צורך בכיול והתאמת תוכנה בכל פעם שהמצלמה או הציוד ממוקמים מחדש. לכידת מכשיר מדידה בתוך הרכישה משפרת את הדיוק ומקלה על הכיול. - לאחר הכיול, טענו כל רצף תמונות. בחירה אוטומטית תתחיל את המשימה האוטונומית של טביעות רגל.
- גלול לאורך כל מסגרת ברצף, ותקן ידנית טביעות רגליים שהוקצו שלא הוקצו. שמור לאחר השלמת שלב זה.
- לבסוף, בחר הערכה כדי לעבד את מיקום טביעת הרגל ואת נתוני הלחץ. סדרה של גרפים, תמונות וגיליון אלקטרוני עם מדדי הליכה כמותיים תייצא לתיקיית תוצאות.
7. ניתוח נתונים
- השתמש בגיליון האלקטרוני המיוצא בסוף כל הערכה המכיל נתוני הליכה כמותיים עבור כל ריצה. שרשור נתונים מכל ריצה וממוצע לכל חולדה. התווה את הנתונים הממוצעים ובדוק מובהקות באמצעות GraphPad Prism גרסה 7.0a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחזוקת מושבת חולדות
הדור והאפיון של חולדות KO בודדות מסוג Pink1 ו-Parkin תוארו בעבר22. חולדות ה-KO הבודדות Pink1 ו-Parkin התקבלו ממעבדות SAGE (וזמינות כעת מ-Envigo). חולדות DKO נוצרו על ידי חציית חולדות Pink1-/- עם חולדות פרקין-/- כדי להשיג חולדות Pink1+/-/Parkin+/- שעברו הכלאה כדי להשיג חולדות Pink1-/-/Parkin-/- (יהיו זמינות מ-Envigo). כדי לאשר את המחיקה של 26 bp ב-Park6 (גן המקודד Pink1), בוצע גנוטיפ באמצעות פריימרים הפוכים 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' קדימה ו-5'-CCACCACCCACTACCACTTACT-3'. מחיקה של 5 bp ב-Park2 (גן המקודד פרקין) נבדקה לאחר שה-DNA הוגבר באמצעות 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGTGA-3' קדימה והיפוך 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'. דגימות תגובת שרשרת פולימראז מוגברת (PCR) נשלחו ל-ACGT Inc (Wheeling, IL) לצורך ריצוף (איור S7). כל החולדות הוחזקו על רקע Long Evans Hooded (LEH). חולדות DKO היו בנות קיימא ופוריות; עם זאת, היה שיעור תמותה גבוה בקרב סכרי DKO בזמן הפרידה (כ-30%). רק חולדות זכרים שימשו בניסויים אלה. חולדות הוחזקו בסביבה מבוקרת טמפרטורה עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית לצ'או חולדות ומים.
תוצאות
כדי לשמש דוגמה לתועלת של מערכת ניתוח ההליכה FTIR עבור חולדות, המותאמת מגיל14, ביצענו ניתוח הליכה על חולדות WT זכרים ו- Pink1/Parkin DKO בגיל חודשיים כדי לקבוע אם השימוש בניתוח הליכה קינמטי יכול לחשוף ליקויים מוטוריים עדינים שלא נצפו בתפיסה חזותית אנושית לפני הופעת בעיות מוטוריות גסות החל מגיל 4 חודשים.
בדומה למחקרי הליכה קודמים בעכברים14, מערכת FTIR המותאמת הייתה מסוגלת להציג את תבנית טביעת הרגל שנוצרה על-ידי חולדה מהלכת, כמו גם את הנתיב שנוצר על-ידי מרכז הגוף (איור 1A). למרות המשקל המוגבר של חולדות DKO בהשוואה ל-WT (איור 1B), לחץ כף הרגל שהופעל על משטח ההליכה (בדמיון כמפות חום) כפי שנקבע על-ידי עוצמות אות ה-FTIR, לא השתנה (איור 1C). לאחר הערכה של כמה פרמטרים של הליכה כפונקציה של מהירות הליכה (איור 1D-H), ראינו שמהירות ההליכה ואורכי הצעדים היו דומים בין חולדות WT ו-DKO (איור 1D). אולם השונות בין חולדות WT ו-DKO באה לידי ביטוי בשלב העמידה ובמשך הנדנדה במהירויות הליכה איטיות יותר (איור 1E, F). החלק של מחזור הצעד שבו הרגל נמצאת בשלב העמידה (משך / תקופת עמידה) הוא גורם החובה, ופרמטר זה מדגיש יותר זמן המושקע בשלב הנדנדה מאשר בשלב העמידה ככל שגורם החובה פוחת, אופייני לריצה (איור 1G). שוב, ההבדלים מודגשים במהירויות נמוכות יותר. יתר על כן, בעוד שמהירויות הנדנדה עולות עם העלייה במהירות אצל חיות WT, המתאם קהה בחולדות DKO (איור 1H).
ניתוח ההליכה של FTIR אפשר גם לעקוב אחר עקבות שלב העמידה של כל רגל ביחס לגוף בחולדות שהולכות בחופשיות (איור 2A, B). עקבות העמידה מנורמלות לאורך הגוף ומוגדרות כמיקום כף הרגל ביחס למרכז הגוף מכף הרגל (תנוחת קיצוניות קדמית, AEP) ועד סוף שלב העמידה (תנוחת קיצוניות אחורית, PEP). לאחר השוואת מיקום הכפות, הבחנו בשינויים משמעותיים ב-AEP (גפה אחורית שמאלית) וב-PEP (גפה אחורית ימנית), מה שמרמז על כך שהגפה האחורית השמאלית קרובה יותר לגוף במהלך מגע כפות (AEP), בעוד שהגפה האחורית הימנית רחוקה יותר מהגוף במהלך המראה של כפות (PEP) ב-DKO בהשוואה לחולדות WT (איור 2C).
מספר פרמטרים נוספים השתנו באופן משמעותי בחולדות DKO בהשוואה ל-WT. בפרט, נחשפו שינויים בדפוסי נדנוד הגפיים האחוריות. מהירות הנדנדה של הגפה האחורית השמאלית והימנית עלתה בחולדות DKO בהשוואה לחולדות WT (איור 3A), בעוד שמשך הנדנדה של הגפיים האחוריות השמאלית והימנית ירד (איור 3B). יש לציין כי אורך הצעד לא השתנה (איור 4).
איור 1. ניתוח תבנית טביעת רגל ופרמטר צעד. תבניות טביעת רגל מייצגות עבור (A) WT ו- (B) חולדות DKO המציגות (לוח עליון) מפת חום של טביעת רגל המייצגת את עוצמת הפיקסלים וקו אופקי המייצג את נתיב הגוף, וכן (לוח תחתון) רגליים בודדות המסומנות בצבעים שונים: חזית שמאלית (LF, צהוב), אחורית שמאלית (LH, כחול), חזית ימנית (RF, כתום) ואחורית ימנית (RH, ירוק). (C) מהירות הליכה ממוצעת עבור כל חולדה WT (n = 7) ו- DKO (n = 8). ממוצע עם SEM. לא משמעותי. (ד-ח) פרמטרי צעד כפונקציה של מהירות בחולדות WT (n = 7) ו- DKO (n = 8). קווי רגרסיה ליניארית וערכי ריבוע R כלולים. (D) אורך הצעד גדל עם המהירות בחולדות WT ו-DKO. (E) משך הנדנדה עומד ביחס הפוך למהירות בחולדות WT, אך לא בחולדות DKO (אינן משמעותיות). (F) משך העמידה יורד עם המהירות בחולדות WT ו-DKO. (G) מקדם החובה עומד ביחס הפוך למהירות בחולדות DKO, אך לא בחולדות WT (אינן משמעותיות). (H) מהירות הנדנדה עולה באופן ליניארי עם המהירות בחולדות WT, אך לא בחולדות DKO (אינן משמעותיות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. עקבות עמדה וניתוח מיקום כפות. (A) ניתוח מסלול הליכה מייצג עבור חולדת WT (לפני ואחרי תיקון רקע) עם אף (אדום מוצק), מתאר ראש (כחול מקווקו), מתאר זנב (ירוק מקווקו), מרכז הגוף (לבן מקווקו) וטביעות רגליים (עיגולים: ירוק, RF ותכלת, LH). (B) חלקות מייצגות של עקבות עמדה להליכה חופשית של חולדות WT ו-DKO. (C) מיקום כפות בחולדות WT (n = 7) ו-DKO (n = 8) מוצגות. AEP, עמדה קיצונית קדמית; PEP, מיקום קיצוני אחורי; L, משמאל; ר', נכון; F, כפה קדמית; ח, כפה אחורית. ממוצע עם SEM. משמעותי בהשוואה ל-WT (p < 0.05*, 0.001***) באמצעות ANOVA דו-כיווני ומבחן ההשוואה המרובה של סידאק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. פרמטרי נדנדה אחורית השתנו בחולדות DKO. מדידות Forepaw ו-hindpaw של מהירות (A) שבה נעות כפות הרגליים וכפות הזמן (B) מוטסות בחולדות WT (n = 7) ו-DKO (n = 8). L, משמאל; ר', נכון; F, כפה קדמית; ח, כפה אחורית. ממוצע עם SEM. משמעותי בהשוואה ל- WT (p < 0.01**) באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג של סטודנט עם תיקון של וולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. אורך הצעד ללא שינוי בחולדות DKO. מדידות Forepaw ו-hindpaw של אורך הצעד בחולדות WT (n = 7) ו-DKO (n = 8). L, משמאל; ר', נכון; F, כפה קדמית; ח, כפה אחורית. ממוצע עם SEM. משמעותי בהשוואה ל-WT (לא משמעותי) באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג של סטודנט עם התיקון של וולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
נתון משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרעות הליכה, כולל ירידה בנדנוד הזרוע, מהירות הליכה איטית יותר וצעדים קצרים יותר, הן מאפיין מגדיר של מחלת פרקינסון, והן מתרחשות בשלב מוקדם במהלך המחלה 1,5. במהלך השנים פותחו מספר שיטות לתצפית ותיעוד של נפילות הליכה במודלים של מכרסמים של PD, כאשר טכניקות ידניות לכימות מיקום הנפילה מובילות לגישות אוטומטיות רגישות יותר ומסוגלות ללכוד פרמטרים דינמיים. חלק מהגישות הסטטיות כוללות "סימון בדיו" של כפות מכרסמים עם מחוון שיש לעקוב אחריו על מדיה המונחת על שביל24,25,26. העקבות השיוריות מכומתות מאוחר יותר ביד. שיטות אלה משמשות לעתים קרובות בשילוב עם צילום וידאו עבור ניקוד קינמטי ידני. שיטות אוטונומיות ללכידה וכימות של דפוסי הליכה הוצגו לאחרונה15,16, והן זמינות באופן מסחרי. כימות הליכה אוטונומי מוסיף תכונות זמן לטביעות רגל סטטיות, ומאפשר לחוקרים לחפש חריגות המיוחסות למהירות ולזמן בנוסף למרחק ולזווית27. לחץ ניתן לכימות גם כאשר הוא משולב עם שיטת FTIR.
הפרעות בדפוסי הליכה דווחו גם במודלים של חולדות המושרות על ידי רעלנים של פרקינסון. בפרט, שינויים בהליכה דווחו במודל נגע 6-OHDA באמצעות פלטפורמת ניתוח הליכה מסחרית28,29,30. השינוי הבולט ביותר בדגם זה היה ירידה במהירות ההליכה ובקצב ההליכה. יתר על כן, פלטפורמת ניתוח ההליכה המסחרית שימשה להערכת מספר פרמטרים דינמיים וסטטיים של הליכה של מודלים של PD, כגון ההשפעה של נגעים חד צדדיים הנגרמים על ידי 6-OHDA וכיצד השתלת נוירונים דופמינרגיים מצילה את שינויי ההליכה31. בנוסף, מחקר ניתח את היחס בין פרמטרים מנגעי 6-OHDA בצדדים פגועים לעומת לא פגועים במוח, תוך תיקון מהירות בפרמטרים קשורים כגון מחזור צעד בגפה האחורית, אזור טביעת הגפיים האחוריות ורצף צעדים, שכולם משתנים באופן משמעותי כאשר משווים סוגים שונים של נגעים לבקרות מי מלח32 . עם זאת, חשוב לציין כי הרקע הפתוגנטי של מודלים הנגרמים על ידי רעלן הוא בעל אופי רעיל ולא תהליך נוירודגנרטיבי כמו ב- PD6 אנושי, ולכן הערכת הליכה לאחר השראת נגעים עשויה לחקות פרקינסון מתקדם כאשר נוירונים אובדים, אך להקשות על מחקרים על שינויים מוטוריים מוקדמים.
גיאומטריית הליכה נמדדה בחולדות Pink1 KO, Parkin KO ו-DJ-1 KO22, מודלים של PD תורשתי, המציגים אובדן נוירונים דופמינרגי ניגרי מתקדם עם ההזדקנות. ההליכה נמדדה באמצעות מכשיר נוירוקיוב מסחרי, שבו מאפשרים לחולדות ללכת במעגל, תוך הסתכלות על גיאומטריה ותכונות דינמיות. חולדות Pink1 ו-DJ-1 KO הראו משך זמן קצר יותר בצעדים, נדנדה ועמידה בהשוואה ל-WT לאחר 4 ו-8 חודשים.
מכיוון שמערכות ניתוח הליכה מסחריות הן יקרות ומגיעות עם צינורות ניתוח קנייניים, חיפשנו חלופה פתוחה למחקר שלנו על מודלים תורשתיים של חולדות של פרקינסון. מערכת MouseWalker14, שמגיעה עם הוראות בנייה ותוכנה בגישה פתוחה, לוכדת את כל הפרמטרים של ציוד מסחרי המיועד למכרסמים קטנים. מאחר שהפלטפורמה הייתה קטנה מכדי להשיג באופן עקבי תוצאות סבירות עם חולדות בוגרות, כלומר ארבעה צעדים רצופים במהלך תנועה במהירות הליכה, שינינו את קנה המידה של החומרה כך שתתאים לחולדות. בנוסף, השתמשנו במצלמת אקשן ביתית במקום פתרון וידאו מסחרי מהיר.
צפיפות פריימים נמוכה יותר הייתה מלכודת פוטנציאלית של שימוש במצלמת פעולה במקום מצלמה במהירות גבוהה. עם זאת, סף האיכות בווידיאו המקומי עולה במהירות ומסוגל להקליט ברזולוציה גבוהה של 120 fps. יתר על כן, ניתן לתקן עיוות עדשה במהלך ההקלטה על ידי תוכנת מצלמה המייצרת שדה ראייה ליניארי עקבי (FOV).
בתחילה היינו מודאגים מדינמיקת הלחץ של שימוש בעובי דומה של אקריליק עבור השביל עם בסיס רחב יותר ובעלי חיים כבדים יותר, ומהיכולת של התוכנה לעבד וידאו של חיות גדולות יותר ב- FOV רחב יותר. אנו משערים שטווח המסה בין עכברים לחולדות נמצא בטווח הרגישות של פלטפורמת FTIR האקרילית המאפשרת לנו למדוד חולדות במהלך כל מחזור החיים שלהן. יתר על כן, ייתכן כי דילול פיקסלים פוטנציאלי עשוי להתקזז על ידי שטח הפנים הגבוה יותר של טביעות הרגליים של החולדות ביחס לאזור שנלכד ב- FOV, אם יש הבדל משמעותי בכלל. עם כיול נכון, כפי שתועד כאן, התוכנההחופשית 14 הייתה מסוגלת לעבד וידאו הליכה של חולדה כמתואר.
בעזרת פרוטוקול זה, הצלחנו להדגים כי מערכת ההליכה של עכבר FTIR14 ששונתה כאן עבור חולדות יכולה לזהות שינויים בהליכה לפני התצפית החזותית של גרירת גפיים אחוריות בחולדות DKO זכר. יש לציין כי הליקוי המוטורי הגלוי לעין (גרירת גפיים אחוריות) שנצפה בחולדות DKO דווח בעבר בחולדות KO בודדות של זכר Pink122. בעוד חולדות DKO זכרים מפגינים גרירת גפיים אחוריות הנראית לעין החל מגיל 4-6 חודשים, ניתוח ההליכה גילה שינויים בתנועה בגיל חודשיים. בפרט, נמצאו שינויים בפרמטרים של הליכה בגפיים האחוריות. חולדות DKO מציגות מהירות נדנדה מוגברת בגפה האחורית (מימין ומשמאל) וירידה נלווית במשך הנדנדה של הגפה האחורית (השמאלית והימנית). יתר על כן, חולדות ה-DKO מקרבות את כפותיהן האחוריות השמאלית לגופם במהלך הטאצ'דאון בכפות, בעוד שהכף האחורית הימנית רחוקה יותר מגופם במהלך המראת הכפות. בעוד שלא חשפנו שינויים במשך הצעד או העמידה בחולדות DKO לאחר חודשיים, משך הנדנדה היה קצר יותר בחולדות DKO כפי שמדווח באופן דומה בחולדות Pink1 ו-DJ-1 KO22. בסך הכל, שינויים אלה מצביעים על כך שהפרמטרים של ההליכה בגפיים האחוריות השתנו לפני התפתחות גרירת הגפיים האחוריות בחולדות DKO זכרים. מחקרי הליכה אורכיים עתידיים העוקבים אחר התפתחות שינויים בתנועה יסייעו לאתר את הגיל שבו שינויים בהליכה הופכים משמעותיים.
במחקר זה, הראינו כי מערכת הליכה של עכבר FTIR14 ששונתה כאן לחקר חולדות יכולה לשמש להבחנה בין שינויים בפרמטרים של הליכה בחולדות DKO זכרים בני חודשיים, מודל לפרקינסון תורשתי, בהשוואה לחולדות WT תואמות גיל. מחקרים קודמים בחולי פרקינסון חשפו אורך צעד מופחת וזמן נדנדה ממוצע נמוך יותר, כמו גם שונות מוגברת בזמן הצעד ושונות זמן הנדנדה4. לפיכך, הממצאים שלנו על שינויים בזמן הנדנדה בחולדות DKO, ודיווחים קודמים על שינויים בזמן הנדנדה בחולדות Pink1 KO ו-DJ-1 KO22, נראים רלוונטיים להתקדמות PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
KS ו- HF מודים לקרן מייקל ג'יי פוקס לחקר פרקינסון על תמיכתם בעבודתם על מחלת פרקינסון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson's disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, Suppl 1 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
