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Neuroscience

Anwendung des RatWalker-Systems zur Ganganalyse in einem genetischen Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Published: January 18, 2021 doi: 10.3791/62002
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Hier beschreiben wir das RatWalker-System, das durch die Neugestaltung des MouseWalker-Geräts erstellt wurde, um der zunehmenden Größe und dem Gewicht von Ratten gerecht zu werden. Dieses System verwendet frustrierte Totalreflexion (FTIR), Hochgeschwindigkeits-Videoaufzeichnung und Open-Access-Analysesoftware, um Gangparameter zu verfolgen und zu quantifizieren.

Abstract

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die durch den Verlust von dopaminergen (DA) Neuronen in der Substantia nigra pars compacta verursacht wird. Ganganomalien, einschließlich verminderter Armschwingung, langsamerer Gehgeschwindigkeit und kürzerer Schritte, sind bei Parkinson-Patienten häufig und treten früh im Krankheitsverlauf auf. Daher wird die Quantifizierung von motorischen Mustern in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit für die phänotypische Charakterisierung während des Krankheitsverlaufs und bei der therapeutischen Behandlung wichtig sein. Die meisten Fälle von Parkinson sind idiopathisch; Die Identifizierung erblicher Formen der Parkinson-Krankheit deckte jedoch Genmutationen und -varianten auf, wie z. B. Funktionsverlust-Mutationen in Pink1 und Parkin, zwei Proteinen, die an der mitochondrialen Qualitätskontrolle beteiligt sind und zur Erstellung von Tiermodellen genutzt werden könnten. Während Mäuse bei Verlust von Pink1 und Parkin (einfache und kombinierte Deletion) resistent gegen Neurodegeneration sind, führt bei Ratten ein Pink1-Mangel, aber nicht ein Parkin-Mangel, zu einem nigralen DA-Neuronenverlust und einer motorischen Beeinträchtigung. Hier berichten wir über den Nutzen der FTIR-Bildgebung zur Aufdeckung von Gangveränderungen bei frei gehenden jungen (2 Monate alten) männlichen Ratten mit kombiniertem Verlust von Pink1 und Parkin vor der Entwicklung einer groben visuell sichtbaren motorischen Anomalie mit zunehmendem Alter dieser Ratten (beobachtet nach 4-6 Monaten), gekennzeichnet durch das Ziehen der Hinterbeine, wie zuvor bei Pink1 Knockout (KO) Ratten berichtet.

Introduction

Parkinson, die häufigste altersbedingte neurodegenerative Bewegungsstörung, wird durch den Verlust von DA-Neuronen in der Substantia nigra pars compacta verursacht. Dieser Verlust von nigralen DA-Neuronen und die DA-Einträge in das Striatum führen zu den beobachteten motorischen Funktionsbeeinträchtigungen, die bei Patienten mit PD 1,2 beobachtet wurden. Zu den charakteristischen motorischen Merkmalen von Patienten mit Parkinson, die zusammen als Parkinsonismus bezeichnet werden, gehören Rigidität, Ruhetremor, Bradykinesie, Haltungsinstabilität und Mikrographie3. Darüber hinaus treten Gangstörungen, die bei Parkinson-Patienten häufig sind, früh im Krankheitsverlaufauf 1,4,5. Während bestimmte Lebensstile vorgeschlagen werden, um das Fortschreiten der Parkinson-Krankheit zu verlangsamen, wie gesunde Ernährung und regelmäßige Bewegung, gibt es derzeit keine Heilung für Parkinson, nur Medikamente zur Behandlung der Symptome. Dies lässt Raum für die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen in der Hoffnung auf verbesserte Therapeutika. Daher ist die Charakterisierung des Gangmusters in Parkinson-Tiermodellen ein entscheidendes Werkzeug, um die Relevanz des Modells zu charakterisieren und zu bestimmen, wie therapeutische Behandlungen zur Kontrolle der Parkinson-Krankheit motorische Beeinträchtigungen verhindern oder verbessern.

Es gibt verschiedene PD-Tiermodelle, die verwendet wurden, um therapeutische Behandlungen zu testen, aber jedes hat seine Grenzen. Zum Beispiel haben Tiermodelle, die mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) behandelt wurden, eine große Fülle von Informationen über Prozesse geliefert, die für den nigralen DA-Neuronenverlust und nachfolgende striatale Anpassungen wichtig sind, und auf die Rolle der Mitochondrien bei der PD-Pathogenese hingewiesen. Der pathogenetische Hintergrund des MPTP-Modells ist jedoch eher toxischer Natur als ein neurodegenerativer Prozess wie bei der humanen PD6. Weitere chemisch induzierbare Modelle sind 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und Rotenon. 6-OHDA war der erste Wirkstoff, der verwendet wurde, um Parkinson durch selektive Akkumulation des Arzneimittels in den DA-Neuronen zu induzieren, was schließlich die Neuronen abtötet und zu Parkinson-ähnlichen Symptomen führt. Dieses Modell wurde zuerst für die Verfolgung der DA-Depletion verwendet, indem das Verhalten als Reaktion auf Amphetamin und Apomorphin7 untersucht wurde. Diese Methode der Parkinson-Induktion hat sich als nützlich für das Screening pharmakologischer Wirkstoffe erwiesen, die DA und seine Rezeptoren beeinflussen8. Während das 6-OHDA-Modell ein großartiges Modell ist, um quantifizierbare motorische Defizite zu verfolgen, zeigt dieses Modell nicht, wie sich der allmähliche Verlust von Neuronen und die Bildung von Lewy-Körpern auf das Tier auswirken. Es wurde gezeigt, dass die andere Induktionsmethode, Rotenon, eine fortschreitende Degeneration von nigrostriatalen Neuronen mit dem Verlust von Tyrosinhydroxylase und DA-Transporter aufweist, was ein besseres Modell zur Verfolgung des Verlusts von Neuronen im Laufe der Zeit ermöglicht9. Die mit Rotenon behandelten Ratten zeigten Bradykinesie, Haltungsinstabilität und unsicheren Gang10. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Methode zwischen verschiedenen Rattenstämmen sehr unterschiedlich ist, was die Frage aufgeworfen hat, ob Rotenon ein zuverlässiges PD-Modellist oder nicht 11,12,13. Während gezeigt wurde, dass die Ganganalyse durch die Induktion von Parkinson bei Ratten beeinflusst wird, wurden genetisch induzierte PD-Rattenmodelle bisher nicht ohne weiteres für die Ganganalyse verwendet, indem sie frei auf einer Landebahn liefen.

Eine Möglichkeit, motorische Beeinträchtigungen bei frei gehenden Nagetieren zu analysieren, ist die kinematische Ganganalyse, die mit Hilfe von FTIR-Bildgebung durchgeführt werden kann. Diese etablierte Methode verwendet einen optischen Berührungssensor auf Basis von FTIR, der die Fußabdrücke der Nagetiere aufzeichnet und verfolgt, während sie sich auf der Landebahn14,15,16 bewegen. Im Vergleich zu anderen Methoden hängt FTIR nicht von Markern am Körper des Tieres ab, die die Pfotenabdrücke stören könnten. Durch die Generierung der Videodaten werden digitale Pfotenabdrücke aller vier Gliedmaßen erzeugt, die zu einem dynamischen und reproduzierbaren Laufmuster für verschiedene Nagetiermodelle kombiniert werden können. Das Prinzip der bildgebenden Ganganalyse besteht darin, jede einzelne Pfote zu nehmen und die Kontaktfläche im Laufe der Zeit zu messen, während das Nagetier die Landebahn hinuntergeht. Jede Haltung wird durch eine Vergrößerung der Pfotenfläche (in der Bremsphase) und eine Abnahme der Pfotenfläche (in der Antriebsphase) dargestellt. Dem geht die Schwungphase voraus, in der kein Pfotensignal erkannt wird. Nach der Auswertung des Videos werden mehrere Parameter generiert, mit denen Wildtyp (WT) mit PD-Modell verglichen werden kann. Einige Beispiele für die Parameter sind die Schrittlänge (die Strecke, die die Pfote in einem Schritt zurücklegt), die Schwungdauer (die Zeit, in der die Pfote keinen Kontakt mit der Landebahn hat), die Schwunggeschwindigkeit (Schrittlänge als Funktion der Schwungdauer) und das Schrittmuster (diagonale Schritte, seitliche Schritte oder Gürtelschritte).

Um den Nutzen von FTIR zur Aufdeckung früher Veränderungen des Gangmusters bei Ratten zu demonstrieren, verwendeten wir ein genetisches Rattenmodell der Parkinson-Krankheit. Während die meisten Fälle von Parkinson idiopathisch sind; Die Identifizierung erblicher Formen von Parkinson deckte Genmutationen und -varianten auf, wie z.B. Funktionsverlust-Mutationen in Pink1 und Parkin, zwei Proteinen, die an der mitochondrialen Qualitätskontrollebeteiligt sind 17, die zur Erstellung von Tiermodellen genutzt werden könnten18. Leider sind Mäuse resistent gegen Neurodegeneration, wenn diese Proteine (einzeln und kombiniert) verloren gehen19,20,21. Bei Ratten führt ein Pink1-Mangel, nicht aber ein Parkin-Mangel, zu einem nigralen DA-Neuronenverlust und motorischen Beeinträchtigungen22, jedoch ohne vollständige Penetranz. Daher haben wir ein kombiniertes Pink1/Parkin-Doppel-Knockout-Rattenmodell (DKO) erstellt, das den offensichtlichen, visuell sichtbaren Phänotyp des Ziehens der Hinterbeine zeigt, der bei männlichen Pink1-KO-Ratten22 berichtet wurde, aber jetzt mit einer höheren Rate: 100% gegenüber 30-50% der Männchen zwischen 4-6 Monaten.

Während diese Methode gut für die Analyse von motorischen Defiziten bei Mäusengeeignet ist 14, waren FTIR-Bildgebungs-Gangsystemspezifikationen zur Berücksichtigung der Größe und des Gewichts von Ratten bisher nicht kommerziell verfügbar. Hier erklären wir, wie man den RatWalker baut, ein modifiziertes FTIR-Gangbildgebungssystem, das dem MouseWalker14 nachempfunden ist, außer dass es an die Größe und das Gewicht von Ratten angepasst ist. Dieses System nutzt einen optischen Effekt, FTIR, um eine Methode zur Visualisierung und anschließenden Aufzeichnung von Tierfußabdrücken für die Analyse bereitzustellen. Der Kontakt des Fußes eines Tieres mit dem Lichtwellenleiter (Plattform) führt zu einer Unterbrechung des Lichtwegs, was zu einem sichtbaren Streueffekt führt, der mit Hochgeschwindigkeits-Videografie und Verarbeitung mit Open-Source-Software erfasst wird. Diese Studie zeigt die Leistungsfähigkeit der FTIR-Bildgebung bei der Untersuchung von Gangveränderungen in genetischen Rattenmodellen der Parkinson-Krankheit. Während zum Beispiel bei männlichen DKO-Ratten frühestens nach 4 Monaten sichtbare visuell sichtbare motorische Veränderungen (z.B. Ziehen der Hinterbeine) beobachtet werden, können wir mit FTIR Gate-Anomalien bei männlichen DKO-Ratten im Alter von 2 Monaten aufdecken.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des University of Nebraska Medical Center genehmigt.

1. Gangvorrichtung

HINWEIS: Der RatWalker basiert auf dem MouseWalker14 und wurde mit Abmessungen entwickelt, die proportional zum Unterschied in der Schrittlänge zwischen Ratten und Mäusen sind. Es besteht aus einer seitlichen Hintergrundbeleuchtung, einem Gehweggehäuse, einem Lichtwellenleiterlauf, einem Spiegel und einer Kamera (Abbildung S1). LED-Streifen, die versetzt ausgerichtet waren, wurden auf jeder Seite des Laufstegs und Hintergrundbeleuchtungswellenleiter verwendet, um das zusätzliche Material aufzunehmen. Die Materialien, die für den Bau des modifizierten Gangapparates benötigt werden, sind in Tabelle S1 aufgeführt.

  1. Verwenden Sie eine Hintergrundbeleuchtung (Abbildung S2), um eine Silhouette des Tieres zu erstellen, die von der Software verwendet wird, um Position, Bewegungsrichtung und morphometrische Eigenschaften zuzuweisen. Die Konstruktion besteht aus einer geschichteten Platte aus einem Acryldiffusor, einem Lichtwellenleiter, einem Reflektor und LED-Lichtstreifen, die in einem Aluminiumrahmen montiert sind (Tabelle S1).
  2. Verwenden Sie ein Gehweggehege (Abbildung S3), um das Tier entlang der Plattform zu führen und das Tier zum Hauskäfig zu führen. Die Konstruktion besteht aus durchsichtigen Acrylglasplatten, die mit Dichlormethan verschweißt sind (Tabelle S2).
  3. Verwenden Sie den Laufsteg (Abbildung S4), um das Medium zum Erzeugen von beleuchteten Fußabdrücken bereitzustellen. Der Laufsteg besteht aus klarem Acryl, das seitlich mit Streifen-LEDs beleuchtet und im Aluminiumwinkel untergebracht ist (Tabelle S3).
  4. Platzieren Sie einen Spiegel (Abbildung S5) in einem 45-Grad-Winkel direkt unter dem Gehweg, um die Unterseite des Laufstegs für die Videografie zu reflektieren. Es besteht aus einem 1/4" dicken Glasspiegel, der von Acryl getragen wird, und abgewinkelten Halterungen, die in einer Reihe angeordnet sind (Tabelle S4).
  5. Führen Sie Videoaufnahmen mit einer auf einem Stativ montierten Hochgeschwindigkeits-Action-Kamera in häuslicher Qualität durch.

2. Einrichtung der Ausrüstung

  1. Richten Sie die Hintergrundbeleuchtung, den Laufsteg und den Spiegel gemäß Abbildung S1 auf einer Arbeitsplatte, einer Werkbank oder einem stabilen Wagen aus. Stellen Sie sicher, dass jede Komponente in Bezug auf den Laufsteg zentriert ist.
  2. Stellen Sie mithilfe einer Ebene sicher, dass die Komponenten horizontal senkrecht angeordnet sind.
  3. Platzieren Sie die Gehwegverkleidung oben auf dem Gehweg.
  4. Reinigen Sie alle Kontaktflächen mit 70% Ethanol. Achten Sie darauf, ein nicht scheuerndes Handtuch zu verwenden, um ein Kratzen des Gehwegs zu vermeiden.
  5. Montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera auf einem 57-Zoll-Stativ und platzieren Sie sie in der Mitte des Spiegels, weit genug voneinander entfernt, um den gesamten Gehweg innerhalb des Sichtfelds zu erfassen. Stellen Sie im Menü "Videoeinstellungen" sicher, dass die Hochgeschwindigkeitskamera auf lineare Erfassung im 1080p-Modus mit 120 Bildern pro Sekunde (fps) eingestellt ist, wobei alle Arten von automatischer Anpassung oder Optimierungen deaktiviert sind.
  6. Schließen Sie die LED-Lichtbänder für die Hintergrundbeleuchtung und den Gehweg an und schalten Sie sie ein. Es kann notwendig sein, die Hintergrundbeleuchtung zu dimmen, um die Hintergrundaufnahme zu reduzieren.

3. Akklimatisierung der Tiere

HINWEIS: Führen Sie die Tiere eine Woche vor dem ersten Versuch durch den modifizierten Gangapparat.

  1. Positionieren Sie einen Heimkäfig am Ende des Gehwegs.
  2. Wenn das Gehege installiert und die Lichter ausgeschaltet sind, platzieren Sie die Ratte am Ende des Gehwegs gegenüber dem Hauskäfig und lassen Sie sie ungezwungen über den Gehweg laufen.
  3. Führen Sie jede Ratte mehrmals durch den modifizierten Gangapparat, bis sie den gesamten Gehweg glatt überqueren kann.
  4. Wiederholen Sie den Vorgang zwei Tage vor dem Experiment.

4. Gangverfahren

  1. Stellen Sie vor Beginn jedes Laufs einen Heimkäfig am Ende des Gehwegs auf, um der Ratte als positives Signal zu dienen, den Gehweg zu durchqueren.
  2. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, schalten Sie die Kamera ein und starten Sie die Aufnahme einige Sekunden, bevor die Ratte auf die Plattform gesetzt wird.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eine Speicherkarte verwenden, die offiziell vom Kamerahersteller empfohlen wird. Eine nicht aufgeführte Speicherkarte funktioniert möglicherweise noch, es ist jedoch nicht garantiert, dass sie mit der angegebenen Bildrate aufnimmt.
  3. Wenn das Gehege installiert ist, platzieren Sie die Ratte am Ende des Gehwegs gegenüber dem Hauskäfig und lassen Sie sie ungezwungen über den Gehweg laufen.
  4. Stoppen Sie die Aufnahme, sobald das Tier das Ende des Gehwegs erreicht hat.
  5. Reinigen Sie den Gehweg mit 70% Ethanol und einem nicht scheuernden Handtuch zwischen den Läufen und nachdem ein Tier uriniert oder defäkiert hat, und lassen Sie dann Ethanol verdampfen, bevor Sie ein anderes Tier einführen.
  6. Führen Sie die Ratten während jedes Beobachtungszeitraums insgesamt 7 Mal durch den Gehweg und nehmen Sie die ersten drei Läufe, die für die Analyse als bestanden eingestuft werden.
  7. Bewerten Sie einen Lauf als bestanden, wenn das Tier vier oder mehr aufeinanderfolgende Schritte in Richtung des Heimkäfigs macht, ohne dass es aufgrund von Fellpflege, Pausen oder fehlerhaften Bewegungen unterbrochen wird.
    HINWEIS: Es empfiehlt sich, die Masse der Tiere vor jeder Messrunde zu erfassen. Für unsere Studie wogen WT (n = 7) und DKO (n = 8) 200,3 ± 21,67 g bzw. 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, ungepaarter t-Test mit Welch-Korrektur). Wir sehen kein Problem mit Ratten jeden Alters oder jeder Größe.

5. Video-Vorverarbeitung

HINWEIS: Die von der Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommenen Videos werden im MP4-Format mit 120 fps und einer Auflösung von 1080p gerendert. Um die nachgelagerte Analysesoftware zu entlasten, schneiden Sie zuerst unnötiges Filmmaterial und entfernen Sie den Ton aus jedem Video mit der LosslessCut-Software (Version 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), und konvertieren Sie dann den MP4-Videostream mit der Open-Source-Software FFmpeg (Version 4.2, http://ffmpeg.org/) in eine PNG-Bildsequenz. Hinweis: Andere verlustfreie Formate wie tiff können anstelle von png verwendet werden.

  1. Erstellen Sie ein Verzeichnis für die Videos auf einem PC mit Windows 7 oder höher und übertragen Sie die Videos dann vom Speichergerät der Hochgeschwindigkeitskamera in das neu erstellte Verzeichnis. Kopieren Sie außerdem ffmpeg.exe an denselben Speicherort.
  2. Ziehen Sie in LosslessCut die Videos auf die Benutzeroberfläche, um sie zu öffnen. Verwerfen Sie die Audiodaten, legen Sie die Anfangs- und Endschnittpunkte so fest, dass sie nur den analytisch relevanten Teil des Videos enthalten, legen Sie das Aufnahmebildformat auf png fest und exportieren Sie. Sobald das Video exportiert wurde, benennen Sie die Videodatei mit einer beliebigen Namenskonvention gefolgt von "_trimmed" um.
  3. Um die Videos im Stapel in Bildsequenzen zu konvertieren, öffnen Sie eine Eingabeaufforderung, legen Sie das Arbeitsverzeichnis mit "cd [Pfad zum Verzeichnis]" auf den Speicherort der Videos fest und führen Sie die folgenden Befehle aus:
    for %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
    for %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
    for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
  4. Nachdem der Batch-Prozess abgeschlossen ist, öffnen Sie jede Bildsequenz in ImageJ Fiji23 und schneiden Sie die Sequenz auf die Region of Interest (ROI) zu, die den Bereich des Bodens umfasst, in dem die Ratte beobachtet wird.
  5. Um den Hintergrund durch die Gehwegbeleuchtung zu reduzieren, erhöhen Sie die minimale Farbbalance des Cyan-Kanals auf 76.
  6. Speichern Sie als Bildsequenz und ändern Sie das Suffix "_trimmed" in "_cropped" und speichern Sie die Dateien im entsprechenden Ordner "_cropped".

6. Gangverarbeitung

HINWEIS: Die Verarbeitung und Quantifizierung der Gangdaten erfolgt mit der frei verfügbaren Software MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.

  1. Entpacken und installieren Sie die MouseWalker-Software auf einem PC mit einer 64-Bit-Windows-Umgebung, auf dem Microsoft Excel installiert ist.
  2. Führen Sie nach dem Start von MouseWalker.exe eine erste Skalenkalibrierung für jeden Satz von Durchläufen durch. Laden Sie eine Bildsequenz und messen Sie mit Orientierungspunkten oder einem Lineal, das im Video aufgenommen wurde, zwei Punkte mit bekannter Entfernung. Berechnen Sie die Anzahl der Pixel pro Zentimeter im Video-Frame und geben Sie diesen Wert zusammen mit der Video-Erfassungs-Framerate in den Parameterbereich des Einstellungsformulars ein.
  3. Messen Sie in ähnlicher Weise den Kopf, den Schwanz und die Füße der Ratte, um die Kopflänge, die maximale Schwanzbreite und -fläche, die minimale und maximale Fußfläche und andere Merkmale zu bestimmen, die zum Ausfüllen des Abschnitts mit den Tracking-Parametern des MouseWalker-Einstellungsformulars erforderlich sind. Das Benutzerhandbuch und andere Dokumentationen finden Sie http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/.
  4. Um die Werte für den Körperbereich zu erhalten, öffnen Sie dieselbe Bildsequenz in ImageJ, zeichnen Sie eine Auswahl, die die Ratte umreißt, und führen Sie eine ROI-Pixelzählung (Region of Interest) durch.
  5. Parameter und Einstellungen, die für diese Publikation verwendet werden (Abbildung S6).
    HINWEIS: Die Parameter dienen der Veranschaulichung und sind abhängig von der Größe des Videos, der Erfassungshardware und den Bedingungen. Jede Software-Kalibrierung und -Anpassung ist jedes Mal erforderlich, wenn die Kamera oder das Gerät neu positioniert wird. Die Erfassung eines Messgeräts innerhalb der Erfassung verbessert die Genauigkeit und erleichtert die Kalibrierung.
  6. Laden Sie nach der Kalibrierung jede Bildsequenz. Wenn Sie Auto auswählen, wird die autonome Zuweisung von Fußabdrücken gestartet.
  7. Scrollen Sie durch die einzelnen Frames der Sequenz und korrigieren Sie manuell falsch zugewiesene Footprints. Speichern Sie, sobald dieser Schritt abgeschlossen ist.
  8. Wählen Sie abschließend Bewerten aus, um die Footprint-Position und die Druckdaten zu verarbeiten. Eine Reihe von Grafiken, Bildern und eine Tabelle mit quantitativen Gangmetriken werden in einen Ergebnisordner exportiert.

7. Datenanalyse

  1. Verwenden Sie die Tabelle, die am Ende jeder Auswertung exportiert wird und quantitative Gangdaten für jeden Lauf enthält. Verketten Sie Daten aus jedem Durchlauf und den Durchschnitt pro Ratte. Zeichnen Sie die Mittelwerte auf und testen Sie die Signifikanz mit GraphPad Prism Version 7.0a.

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Representative Results

Erhaltung der Rattenkolonie
Die Generierung und Charakterisierung von Pink1- und Parkin-Einzel-KO-Ratten wurde bereits22 beschrieben. Die einzelnen KO-Ratten Pink1 und Parkin wurden von SAGE Labs bezogen (und sind jetzt bei Envigo erhältlich). DKO-Ratten wurden durch Kreuzung von Pink1-/-Ratten mit Parkin-/- Ratten erzeugt, um Pink1+/-/Parkin+/- Ratten zu erhalten, die gekreuzt wurden, um Pink1-/-/Parkin-/- Ratten zu erhalten (wird bei Envigo erhältlich sein). Um die Deletion von 26 bp in Park6 (Gen, das für Pink1 kodiert) zu bestätigen, wurde eine Genotypisierung unter Verwendung von 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' Vorwärts- und 5'-CCACCACCCACTACCACTTACT-3' Reverse-Primern durchgeführt. Die Deletion von 5 bp in Park2 (Gen, das für Parkin kodiert) wurde getestet, nachdem die DNA mit einem vorwärts 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGA-3' und umgekehrt 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3' amplifiziert wurde. Proben der amplifizierten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden zur Sequenzierung an ACGT Inc (Wheeling, IL) geschickt (Abbildung S7). Alle Ratten wurden auf dem Long Evans Hooded (LEH) Hintergrund gehalten. DKO-Ratten waren lebensfähig und fruchtbar; Zum Zeitpunkt der Geburt war jedoch eine hohe Sterblichkeitsrate bei den DKO-Staudämmen zu verzeichnen (ca. 30 %). In diesen Experimenten wurden nur männliche Ratten verwendet. Die Ratten wurden in einer temperaturkontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Rattenfutter und Wasser gehalten.

Ergebnisse
Um als Beispiel für die Nützlichkeit des FTIR-Ganganalysesystems für Ratten zu dienen, das ab14 Jahren adaptiert wurde, führten wir eine Ganganalyse an männlichen WT- und Pink1 / Parkin-DKO-Ratten im Alter von 2 Monaten durch, um festzustellen, ob die Verwendung der kinematischen Ganganalyse subtile motorische Beeinträchtigungen aufdecken könnte, die bei der menschlichen visuellen Wahrnehmung vor dem Auftreten von grobmotorischen Problemen ab einem Alter von 4 Monaten nicht beobachtet wurden.

Ähnlich wie bei früheren Gangstudien an Mäusen14 war das angepasste FTIR-System in der Lage, das von der gehenden Ratte erzeugte Fußabdruckmuster sowie den vom Körperzentrum erzeugten Pfad darzustellen (Abbildung 1A). Trotz des erhöhten Gewichts der DKO-Ratten im Vergleich zu WT (Abbildung 1B) blieb der Fußdruck, der auf die Lauffläche ausgeübt wurde (visualisiert als Heatmap), wie er durch die Intensitäten des FTIR-Signals bestimmt wurde, unverändert (Abbildung 1C). Bei der Beurteilung mehrerer Gangparameter als Funktion der Gehgeschwindigkeit (Abbildung 1D-H) beobachteten wir, dass die Gehgeschwindigkeit und die Schrittlängen zwischen WT- und DKO-Ratten ähnlich waren (Abbildung 1D). Die Variation zwischen WT- und DKO-Ratten zeigte sich jedoch in der Standphase und der Schwungdauer bei langsameren Gehgeschwindigkeiten (Abbildung 1E, F). Der Anteil des Schrittzyklus, in dem sich das Bein in der Standphase befindet (Standdauer / Periode), ist der Tastfaktor, und dieser Parameter zeigt an, dass mehr Zeit in der Schwungphase verbracht wird als in der Standphase, da der Tastfaktor abnimmt, was für das Laufen typisch ist (Abbildung 1G). Auch hier werden Unterschiede bei niedrigeren Geschwindigkeiten hervorgehoben. Während die Schwunggeschwindigkeiten bei WT-Tieren mit zunehmender Geschwindigkeit zunehmen, ist die Korrelation bei DKO-Ratten abgestumpft (Abbildung 1H).

Die FTIR-Ganganalyse ermöglichte auch Diagramme von Standphasenspuren jedes Beines relativ zum Körper bei frei gehenden Ratten (Abbildung 2A, B). Die Standspuren werden auf die Körperlänge normiert und sind definiert als die Position des Fußes relativ zur Körpermitte vom Aufsetzen der Pfote (anterior extreme position, AEP) bis zum Ende der Standphase (posteriore extreme position, PEP). Beim Vergleich der Pfotenpositionierung beobachteten wir signifikante Veränderungen bei AEP (linkes Hinterbein) und PEP (rechtes Hinterbein), was darauf hindeutet, dass das linke Hinterbein während des Pfotenaufsetzens (AEP) näher am Körper ist, während das rechte Hinterbein während des Pfotenstarts (PEP) bei DKO im Vergleich zu WT-Ratten weiter vom Körper entfernt ist (Abbildung 2C).

Mehrere zusätzliche Parameter wurden bei den DKO-Ratten im Vergleich zu WT signifikant verändert. Insbesondere wurden Veränderungen in den Schwungmustern der Hinterbeine aufgedeckt. Die Schwunggeschwindigkeit sowohl der linken als auch der rechten Hinterbeine war bei DKO-Ratten im Vergleich zu WT-Ratten erhöht (Abbildung 3A), während die Schwingungsdauer sowohl der linken als auch der rechten Hinterbeine verringert war (Abbildung 3B). Bemerkenswert ist, dass die Schrittlänge unverändert blieb (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1. Analyse von Footprint-Mustern und Schrittparametern. Repräsentative Fußabdruckmuster für (A) WT- und (B) DKO-Ratten, die (oberes Bild) eine Fußabdruck-Heatmap zeigen, die die Pixelintensität darstellt, und eine horizontale Linie, die den Körperpfad darstellt, sowie (unteres Bild) einzelne Füße, die mit verschiedenen Farben beschriftet sind: linke Vorderseite (LF, gelb), linke Hinterhand (LH, blau), rechte Vorderseite (RF, orange) und rechte Hinterhand (RH, grün). (C) Durchschnittliche Gehgeschwindigkeit für jede WT (n = 7) und DKO (n = 8) Ratte. Mittelwert mit SEM. Nicht signifikant. (D-H) Stufenparameter als Funktion der Geschwindigkeit bei WT (n = 7) und DKO (n = 8) Ratten. Lineare Regressionsgeraden und R-Quadrat-Werte enthalten. (D) Die Schrittlänge nimmt bei WT- und DKO-Ratten mit der Geschwindigkeit zu. (E) Die Schwingungsdauer ist bei WT-Ratten umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit, nicht jedoch bei DKO-Ratten (sind nicht signifikant). (F) Die Standdauer nimmt bei WT- und DKO-Ratten mit der Geschwindigkeit ab. (G) Der Tastfaktor ist umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit bei DKO-Ratten, nicht aber bei WT-Ratten (sind nicht signifikant). (H) Die Schwingungsgeschwindigkeit nimmt bei WT-Ratten linear mit der Geschwindigkeit zu, nicht jedoch bei DKO-Ratten (sind nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2. Standspuren und Pfotenpositionierungsanalyse. (A) Repräsentative Laufspuranalyse für eine WT-Ratte (vor und nach der Hintergrundkorrektur), visualisiert mit Nase (rot durchgehend), Kopfkontur (blau gestrichelt), Schwanzkontur (grün gestrichelt), Körpermitte (weiß gestrichelt) und Fußabdrücken (Kreise: grün, RF und hellblau, LH). (B) Repräsentative Parzellen von Standspuren für frei laufende WT- und DKO-Ratten. (C) Pfotenstellung bei WT (n = 7) und DKO (n = 8) Ratten sind dargestellt. AEP, vordere Extremposition; PEP, posteriore Extremposition; L, links; R, rechts; F, Vorderpfote; H, hindpaw. Signifikant im Vergleich zu WT (p < 0,05*, 0,001***) unter Verwendung der Zwei-Wege-ANOVA und des Mehrfachvergleichstests von Sidak. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Hindpaw-Swing-Parameter bei DKO-Ratten verändert. Vorderpfoten- und Hinterpfotenmessungen der (A) Geschwindigkeit, mit der sich die Pfoten bewegen, und der (B) Zeitpfoten sind in der Luft bei WT (n = 7) und DKO (n = 8) Ratten. L, links; R, rechts; F, Vorderpfote; H, hindpaw. Signifikant im Vergleich zu WT (p < 0,01**) unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen t-Tests von Student mit Welch-Korrektur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Schrittlänge unverändert bei DKO-Ratten. Vorderpfoten- und Hinterpfotenmessungen der Schrittlänge bei WT (n = 7) und DKO (n = 8) Ratten. L, links; R, rechts; F, Vorderpfote; H, hindpaw. Mittelwert mit SEM. Signifikant im Vergleich zu WT (nicht signifikant) unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen t-Tests von Student mit Welch-Korrektur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Gangstörungen, einschließlich verminderter Armschwingung, langsamerer Gehgeschwindigkeit und kürzerer Schritte, sind ein bestimmendes Merkmal der Parkinson-Krankheit und treten früh im Krankheitsverlaufauf 1,5. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Trittfrequenz für die Ganganalyse in Nagetiermodellen der Parkinson-Krankheit zu beobachten und aufzuzeichnen, wobei manuelle Techniken zur Quantifizierung der Trittposition zu automatisierten Ansätzen führen, die empfindlicher sind und dynamische Parameter erfassen können. Einige statische Ansätze beinhalten das "Einfärben" der Pfoten von Nagetieren mit einem Indikator, der auf Medien verfolgt wird, die auf einem Gehweg24,25,26 platziert sind. Die Resttritte werden später von Hand quantifiziert. Diese Methoden werden häufig in Verbindung mit Videoaufnahmen für die manuelle kinematische Vertonung verwendet. Autonome Methoden zur Erfassung und Quantifizierung von Gangmustern wurden in jüngerer Zeiteingeführt 15,16 und sind kommerziell erhältlich. Die autonome Gangquantifizierung fügt ansonsten statischen Fußabdrücken zeitliche Attribute hinzu, so dass die Forscher nach Anomalien suchen können, die zusätzlich zu Distanz und Winkel auf Geschwindigkeit und Zeit zurückzuführensind 27. Der Druck ist auch quantifizierbar, wenn er mit der FTIR-Methode gekoppelt ist.

Anomalien des Gangmusters wurden auch in Toxin-induzierten Rattenmodellen der Parkinson-Krankheit berichtet. Insbesondere wurden Gangveränderungen im 6-OHDA-Läsionsmodell unter Verwendung einer kommerziellen Ganganalyseplattform28,29,30 berichtet. Die auffälligste Änderung in diesem Modell war die Verringerung der Gehgeschwindigkeit und der Trittfrequenz. Darüber hinaus wurde die kommerzielle Ganganalyseplattform verwendet, um eine Reihe von dynamischen und statischen Gangparametern von PD-Modellen zu bewerten, wie z. B. die Auswirkungen von einseitigen 6-OHDA-induzierten Läsionen und wie die Transplantation von dopaminergen Neuronen die Gangveränderungen rettet31. Darüber hinaus hat eine Studie das Verhältnis von Parametern von 6-OHDA-Läsionen in verletzten und unverletzten Seiten des Gehirns analysiert, während die Geschwindigkeit in verwandten Parametern wie dem Schrittzyklus der Hinterbeine, dem Abdruckbereich der Hinterbeine und der Schrittsequenz korrigiert wurde, die alle signifikant verändert werden, wenn verschiedene Arten von Läsionen mit Kochsalzkontrollen verglichen werden32 . Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der pathogenetische Hintergrund von toxininduzierten Modellen eher toxischer Natur ist als ein neurodegenerativer Prozess wie bei der menschlichen PD6, und als solcher könnte die Gangbeurteilung nach Läsionsinduktion fortgeschrittene Parkinson-Krankheit nachahmen, wenn Neuronen verloren gehen, aber Studien zu frühen motorischen Veränderungen erschweren.

Die Ganggeometrie wurde bei Pink1 KO, Parkin KO und DJ-1 KORatten 22 gemessen, Modellen der erblichen Parkinson-Krankheit, die mit zunehmendem Alter einen fortschreitenden nigralen dopaminergen Neuronenverlust aufweisen. Der Gang wurde mit dem kommerziellen NeuroCube-Gerät gemessen, bei dem die Ratten im Kreis laufen und Geometrie und dynamische Merkmale betrachten können. Pink1- und DJ-1-KO-Ratten zeigten eine kürzere Dauer in Schritt, Schwung und Haltung im Vergleich zu WT nach 4 und 8 Monaten.

Da kommerzielle Ganganalysesysteme teuer sind und mit proprietären Analyse-Pipelines ausgestattet sind, suchten wir nach einer offenen Alternative für unsere Studie über erbliche Rattenmodelle von Parkinson. Das MouseWalker-System14, das mit Bauanleitung und Open-Access-Software geliefert wird, erfasst alle Parameter kommerzieller Geräte, die für kleine Nagetiere entwickelt wurden. Da die Plattform zu klein war, um mit erwachsenen Ratten durchgehend passable Ergebnisse zu erzielen, d.h. vier ununterbrochene Schritte während der Fortbewegung in Schrittgeschwindigkeit, haben wir die Hardware neu skaliert, um Ratten unterzubringen. Darüber hinaus haben wir eine inländische Action-Kamera anstelle einer kommerziellen Hochgeschwindigkeits-Videolösung verwendet.

Eine geringere Bilddichte war ein potenzieller Fallstrick bei der Verwendung einer Action-Kamera anstelle einer Hochgeschwindigkeitskamera. Die Qualitätsschwelle in der häuslichen Videografie steigt jedoch rasant an und ist in der Lage, mit 120 fps in hoher Auflösung aufzunehmen. Darüber hinaus kann die Linsenverzerrung während der Aufnahme durch eine Kamerasoftware korrigiert werden, die ein konsistent lineares Sichtfeld (FOV) erzeugt.

Wir waren zunächst besorgt über die Druckdynamik bei der Verwendung einer ähnlichen Acrylstärke für den Gehweg mit einer breiteren Basis und schwereren Tieren sowie über die Fähigkeit der Software, Videos von größeren Tieren in einem breiteren Sichtfeld zu verarbeiten. Wir spekulieren, dass der Massenbereich zwischen Mäusen und Ratten in den Empfindlichkeitsbereich der Acryl-FTIR-Plattform fällt, die es uns ermöglicht, Ratten während ihres gesamten Lebenszyklus zu messen. Darüber hinaus ist es möglich, dass eine mögliche Pixelverdünnung durch die größere Oberfläche der Pfotenabdrücke der Ratten im Verhältnis zu der im Sichtfeld erfassten Fläche ausgeglichen wird, wenn es überhaupt einen signifikanten Unterschied gibt. Bei richtiger Kalibrierung, wie hier dokumentiert, war die frei verfügbare Software14 in der Lage, Rattengangvideos wie beschrieben zu verarbeiten.

Mit diesem Protokoll konnten wir zeigen, dass das hier für Ratten modifizierte FTIR-Maus-Gangsystem14 Gangänderungen vor der visuellen Beobachtung des Ziehens der Hinterbeine bei männlichen DKO-Ratten erkennen kann. Bemerkenswert ist, dass die offensichtliche visuell sichtbare motorische Beeinträchtigung (Ziehen der Hinterbeine), die bei DKO-Ratten beobachtet wurde, bereits bei männlichen Pink1-Einzel-KO-Ratten berichtet wurde22. Während männliche DKO-Ratten ab einem Alter von 4-6 Monaten ein visuell beobachtbares Ziehen der Hinterbeine zeigen, deckte die Ganganalyse Veränderungen der Fortbewegung im Alter von 2 Monaten auf. Insbesondere wurden Veränderungen in den Gangparametern der Hinterbeine festgestellt. DKO-Ratten zeigen eine erhöhte Schwunggeschwindigkeit der Hinterbeine (sowohl links als auch rechts) und eine damit verbundene Abnahme der Schwungdauer der Hinterbeine (sowohl links als auch rechts). Darüber hinaus platzieren die DKO-Ratten ihre linke Hinterhand während des Pfotenaufsetzens näher an ihrem Körper, während die rechte Hinterseite während des Pfotenstarts weiter von ihrem Körper entfernt ist. Während wir bei DKO-Ratten nach 2 Monaten keine Veränderungen in der Schritt- oder Standdauer aufdeckten, war die Schwingungsdauer bei DKO-Ratten kürzer, wie in ähnlicher Weise bei Pink1- und DJ-1-KO-Rattenberichtet wird 22. Insgesamt deuten diese Veränderungen darauf hin, dass die Gangparameter der Hinterbeine vor der Entwicklung des Ziehens der Hinterbeine bei männlichen DKO-Ratten verändert sind. Zukünftige longitudinale Gangstudien, die die Entwicklung von Fortbewegungsveränderungen verfolgen, werden dazu beitragen, das Alter zu bestimmen, in dem Gangänderungen signifikant werden.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass ein FTIR-Maus-Gangsystem14 , das hier für die Untersuchung von Ratten modifiziert wurde, verwendet werden kann, um Veränderungen der Gangparameter bei 2 Monate alten männlichen DKO-Ratten, einem Modell für erbliche Parkinson, im Vergleich zu altersangepassten WT-Ratten zu unterscheiden. Frühere Studien an Parkinson-Patienten zeigten eine reduzierte Schrittlänge und eine niedrigere durchschnittliche Schwungzeit sowie eine erhöhte Schrittzeitvariabilität und Schwungzeitvariabilität4. Daher scheinen unsere Befunde über Veränderungen der Schwungzeit bei DKO-Ratten und frühere Berichte über Veränderungen der Schwingungszeit bei Pink1 KO- und DJ-1 KO-Ratten22 für die PD-Progression relevant zu sein.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

KS und HF danken der Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research für die Unterstützung ihrer Arbeit zur Parkinson-Krankheit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) Dimensions: 8'
Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) Dimensions: 8'
Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet Dimensions: 10'
Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) Dimensions: 8'
Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet Dimensions: 4'x8'
Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) Dimensions: 4'x8'
Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror Dimensions: 60"x12"
Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green) Dimensions: 16.4'
Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red) Dimensions: 16.4'
Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black Qty: 1
Tripod Dimensions: 57"
Qty: 1

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References

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Neuroscience Heft 167 Lokomotorik Ganganalyse Parkinson-Krankheit Parkin Pink1
Anwendung des RatWalker-Systems zur Ganganalyse in einem genetischen Rattenmodell der Parkinson-Krankheit
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