Summary
Здесь мы описываем систему RatWalker, построенную путем перепроектирования аппарата MouseWalker для размещения увеличенных размеров и веса крыс. Эта система использует разочарованное полное внутреннее отражение (FTIR), высокоскоростной захват видео и программное обеспечение для анализа с открытым доступом для отслеживания и количественной оценки параметров походки.
Abstract
Болезнь Паркинсона (БП) является прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, вызванным потерей дофаминергических (DA) нейронов в черной субстанции pars compacta. Аномалии походки, в том числе уменьшение раскачивания рук, более медленная скорость ходьбы и более короткие шаги, распространены у пациентов с БП и появляются на ранней стадии заболевания. Таким образом, количественная оценка двигательных паттернов на животных моделях БП будет иметь важное значение для фенотипической характеристики во время течения заболевания и при терапевтическом лечении. Большинство случаев БП являются идиопатическими; однако идентификация наследственных форм БП выявила генные мутации и варианты, такие как мутации потери функции в Pink1 и Parkin, двух белках, участвующих в контроле качества митохондрий, которые могут быть использованы для создания животных моделей. В то время как мыши устойчивы к нейродегенерации при потере Pink1 и Parkin (одиночная и комбинированная делеция), у крыс дефицит Pink1, но не Parkin, приводит к потере нейронов NIGRAL DA и двигательным нарушениям. Здесь мы сообщаем о полезности FTIR-визуализации для выявления изменений походки у свободно идущих молодых (в возрасте 2 месяцев) самцов крыс с комбинированной потерей Pink1 и Parkin до развития грубой визуально видимой двигательной аномалии по мере старения этих крыс (наблюдаемой в 4-6 месяцев), характеризующейся перетаскиванием задних конечностей, как ранее сообщалось у нокаутирующих крыс Pink1 (KO).
Introduction
БП, наиболее распространенное возрастное нейродегенеративное двигательное расстройство, вызвано потерей нейронов DA в черной субстанции pars compacta. Эта потеря нигральных нейронов DA и входов DA в полосатое тело приводит к наблюдаемым нарушениям двигательной функции, наблюдаемым у пациентов с PD 1,2. Определяющие двигательные характеристики пациентов с БП, известные как паркинсонизм, включают ригидность, тремор покоя, брадикинезию, постуральную нестабильность и микрографию3. Кроме того, нарушения походки, которые часто встречаются у больных БП, появляются в начале течения заболевания 1,4,5. В то время как определенные образы жизни предлагаются, чтобы помочь замедлить прогрессирование БП, такие как здоровое питание и регулярные физические упражнения, в настоящее время нет лекарства от БП, только лекарства для управления симптомами. Это оставляет место для необходимости дальнейшего исследования в надежде на улучшение терапии. Таким образом, характеристика характера походки на животных моделях БП является важным инструментом для характеристики актуальности модели, а также того, как терапевтические методы лечения, направленные на контроль БП, предотвращают или улучшают двигательные нарушения.
Существуют различные модели БП на животных, которые использовались для тестирования терапевтического лечения, однако каждая из них имеет свои ограничения. Например, животные модели, обработанные нейротоксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP), дали большое количество информации о процессах, важных для потери нейронов NIGRAL DA и последующих стриатальных адаптаций, и указали на роль митохондрий в патогенезе БП; однако патогенетический фон модели MPTP имеет токсическую природу, а не нейродегенеративный процесс, как у человека PD6. Дополнительные химически индуцируемые модели включают 6-гидроксидофамин (6-OHDA) и ротенон. 6-OHDA был первым агентом, используемым для индуцирования БП путем селективного накопления препарата в нейронах DA, что в конечном итоге убивает нейроны и приводит к симптомам, подобным БП. Эта модель была впервые использована для отслеживания истощения DA путем изучения поведения в ответ на амфетамин и апоморфин7. Этот метод индукции БП оказался полезным для скрининга фармакологических агентов, воздействующих на ДА и его рецепторы8. Хотя модель 6-OHDA является отличной моделью для отслеживания количественного моторного дефицита, эта модель не показывает, как постепенная потеря нейронов и образование тел Леви влияют на животное. Было показано, что другой метод индукции, ротенон, имеет прогрессирующую дегенерацию нигростриатальных нейронов с потерей тирозингидроксилазы и транспортера DA, что позволяет лучше отслеживать потерю нейронов с течением времени9. Крысы, обработанные ротеноном, показали брадикинезию, постуральную нестабильность и неустойчивую походку10. Тем не менее, было обнаружено, что этот метод широко варьируется между различными штаммами крыс, что вызвало сомнения в том, является ли ротенон надежной моделью PD 11,12,13. В то время как было показано, что на анализ походки влияет индукция БП у крыс, на сегодняшний день генетически индуцированные модели крыс бП не были легко использованы для анализа походки при свободном хождении по взлетно-посадочной полосе.
Одним из способов анализа двигательных нарушений у свободно ходячих грызунов является кинематический анализ походки, который может быть выполнен с использованием FTIR-визуализации. Этот установленный метод использует оптический сенсорный датчик на основе FTIR, который записывает и отслеживает следы грызунов, когда они движутся по взлетно-посадочной полосе 14,15,16. По сравнению с другими методами, FTIR не зависит от каких-либо маркеров на теле животного, которые могли бы помешать отпечаткам лап. Генерация видеоданных производит цифровые отпечатки лап всех четырех конечностей, которые могут быть объединены для создания динамического и воспроизводимого рисунка ходьбы для различных моделей грызунов. Принцип анализа походки на основе визуализации заключается в том, чтобы взять каждую отдельную лапу и измерить область контакта с течением времени, когда грызун идет по взлетно-посадочной полосе. Каждая стойка представлена увеличением площади лап (в фазе торможения) и уменьшением площади лапы (в фазе движения). Это происходит за счет фазы свинга, когда сигнал лапы не обнаружен. После оценки видео генерируется несколько параметров, которые можно использовать для сравнения модели дикого типа (WT) и PD. Некоторыми примерами параметров являются длина шага (расстояние, которое лапа преодолевает за один шаг), продолжительность качелей (продолжительность времени, в течение которого лапа не соприкасается с взлетно-посадочной полосой), скорость свинга (длина шага в зависимости от длительности качелей) и схема шага (диагональные шаги, боковые шаги или шаги пояса).
Чтобы продемонстрировать полезность FTIR для выявления ранних изменений характера походки у крыс, мы использовали генетическую крысиную модель БП. В то время как большинство случаев БП являются идиопатическими; идентификация наследственных форм БП выявила генные мутации и варианты, такие как мутации потери функции в Pink1 и Parkin, двух белках, участвующих в контроле качества митохондрий17, которые могут быть использованы для создания животных моделей18. К сожалению, мыши устойчивы к нейродегенерации при потере этих белков (одиночных и комбинированных)19,20,21. У крыс дефицит Pink1, но не Parkin, приводит к потере нейронов NIGRAL DA идвигательным нарушениям 22, но без полной пенетрации. Поэтому мы создали комбинированную модель крыс с двойным нокаутом Pink1 / Parkin (DKO), которая отображает явный визуально видимый фенотип перетаскивания задних конечностей, зарегистрированный у самцов крыс Pink1 KO22, но теперь с более высокой скоростью: 100% против 30-50% самцов в возрасте от 4 до 6 месяцев.
Хотя этот метод хорошо работает для анализа двигательного дефицита у мышей14, спецификации системы FTIR-визуализации походки для учета размера и веса крыс ранее были недоступны некоммерчески. Здесь мы объясняем, как построить RatWalker, модифицированную систему визуализации походки FTIR, смоделированную по образцу MouseWalker14, за исключением адаптированной для размера и веса крыс. Эта система использует оптический эффект, FTIR, чтобы обеспечить метод визуализации и последующей записи следов животных для анализа. Контакт ноги животного с оптическим волноводом (платформой) вызывает нарушение светового пути, что приводит к видимому эффекту рассеяния, который фиксируется с помощью высокоскоростной видеосъемки и обработки с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Это исследование демонстрирует силу FTIR-визуализации в изучении изменений походки в генетических моделях БП у крыс. Например, в то время как явные визуально видимые двигательные изменения (т.е. волочение задними конечностями) наблюдаются у самцов крыс DKO не ранее 4 месяцев, с помощью FTIR мы можем обнаружить аномалии ворот у самцов крыс DKO в возрасте 2 месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского центра Университета Небраски (IACUC).
1. Походка аппарата
ПРИМЕЧАНИЕ: Смоделированный на основе MouseWalker14, RatWalker был разработан с размерами, пропорциональными разнице в длине шага между крысами и мышами. Он состоит из подсветки боковой подсветки, корпуса дорожки, оптической волноводной дорожки, зеркала и камеры (рисунок S1). Светодиодные ленты, ориентированные в шахматном порядке, использовались с каждой стороны дорожки и волноводы подсветки для размещения дополнительного материала. Материалы, необходимые для создания модифицированного аппарата походки, можно найти в таблице S1.
- Используйте подсветку (рисунок S2) для создания силуэта животного, который используется программным обеспечением для определения положения, направления движения и морфометрических качеств. Конструкция состоит из слоистой панели акрилового диффузора, оптического волновода, рефлектора и светодиодных лент, собранных в стандартной алюминиевой раме (таблица S1).
- Используйте вольер (рисунок S3), чтобы направить животное вдоль платформы и направить животное в домашнюю клетку. Конструкция состоит из прозрачных акриловых листов растворителем, сваренных дихлорметаном (таблица S2).
- Используйте дорожку (рисунок S4), чтобы предоставить среду для создания освещенных следов. Дорожка построена из прозрачного акрила, который боковой освещен ленточными светодиодами и размещен под алюминиевым углом (таблица S3).
- Поместите зеркало (рисунок S5) непосредственно под дорожкой под углом 45 градусов, чтобы отразить нижнюю сторону дорожки для видеосъемки. Он построен из стеклянного зеркала толщиной 1/4 дюйма, поддерживаемого акрилом, и угловых кронштейнов, расположенных в ряд (таблица S4).
- Выполняйте видеографию с помощью высокоскоростной экшн-камеры, установленной на штативе, отечественного качества.
2. Настройка оборудования
- Выровняйте подсветку, дорожку и зеркало в соответствии с рисунком S1 поверх столешницы, верстака или конюшневой тележки. Убедитесь, что каждый компонент центрирован по отношению к дорожке.
- Используя уровень, убедитесь, что компоненты расположены горизонтально отвесом.
- Поместите ограждение дорожки поверх дорожки.
- Очистите все контактные поверхности 70% этанолом. Обязательно используйте неабразивное полотенце, чтобы предотвратить царапины на дорожке.
- Установите высокоскоростную камеру на 57-дюймовый штатив и поместите ее посередине к зеркалу, расположенному достаточно далеко, чтобы захватить всю дорожку внутри поля зрения. В меню настроек видео убедитесь, что высокоскоростная камера настроена на линейную съемку в режиме 1080p со скоростью 120 кадров в секунду (fps) с выключенным любым типом автоматической настройки или оптимизации.
- Подключите и включите светодиодные ленты для подсветки и дорожки. Возможно, потребуется затемнить подсветку, чтобы уменьшить захват фона.
3. Акклиматизация животных
ПРИМЕЧАНИЕ: За неделю до первого эксперимента пропустите животных через модифицированный аппарат походки.
- Расположите домашнюю клетку на конечной точке дорожки.
- Установив вольер и выключив свет, поместите крысу в конце дорожки напротив домашней клетки и позвольте ей ходить по дорожке непринужденным образом.
- Пропустите каждую крысу через модифицированный аппарат походки несколько раз, пока они не смогут плавно пересечь всю дорожку.
- Повторите процесс за два дня до эксперимента.
4. Процедура походки
- Поместите домашнюю клетку в конце дорожки перед началом каждого пробега, чтобы служить положительным сигналом для крысы, чтобы пересечь дорожку.
- Выключите свет в комнате, включите камеру и начните запись за несколько секунд до того, как крыса будет помещена на платформу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте карту памяти, которая официально рекомендована производителем камеры. Незарегистрированная карта памяти может по-прежнему работать, но не гарантируется захват с предполагаемой частотой кадров. - Установив вольер, поместите крысу в конце дорожки напротив домашней клетки и позвольте ей ходить по дорожке невынужденным образом.
- Прекратите запись, как только животное достигнет конечной точки дорожки.
- Очистите дорожку, используя 70% этанола и неабразивное полотенце между пробежками и после того, как животное помочится или испражняется, затем дайте этанолу испариться перед введением другого животного.
- Пропустите крыс через дорожку в общей сложности 7 раз в течение каждого периода наблюдения, принимая первые три пробега, которые оцениваются, как проходящие для анализа.
- Оцените пробежку как проходную, если животное делает четыре или более последовательных шага в направлении домашней клетки без перерыва из-за груминга, паузы или ошибочных движений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей практикой является регистрация массы животных перед каждым раундом мер. Для нашего исследования WT (n = 7) и DKO (n = 8) весили 200,3 ± 21,67 г и 296,6 ± 3,85 г соответственно (p = 0,004, непарный t-тест с поправкой Уэлча). Мы не видим проблемы с крысами любого возраста или размера.
5. Предварительная обработка видео
ПРИМЕЧАНИЕ: Видео, снятые высокоскоростной камерой, визуализируются в формате mp4 со скоростью 120 кадров в секунду и разрешением 1080p. Чтобы облегчить нагрузку на аналитическое программное обеспечение, сначала обрежьте ненужные кадры и удалите аудио из каждого видео с помощью программного обеспечения LosslessCut (версия 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), а затем преобразуйте видеопоток mp4 в последовательность изображений png с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом FFmpeg (версия 4.2, http://ffmpeg.org/). Примечание: другие форматы Lossless, такие как tiff, могут быть использованы вместо png.
- Создайте каталог для видео на компьютере под управлением Windows 7 или более поздней версии, а затем перенесите видео с запоминающего устройства высокоскоростной камеры во вновь созданный каталог. Кроме того, скопируйте ffmpeg.exe в то же место.
- В LosslessCut перетащите видео в интерфейс, чтобы открыть. Отбросьте аудио, установите начальную и конечную точки вырезания, чтобы включить только аналитически значимую часть видео, установите формат кадра захвата png и экспортируйте. После экспорта видео переименуйте видеофайл, используя любое соглашение об именовании, за которым следует «_trimmed».
- Чтобы пакетно преобразовать видео в последовательности изображений, откройте командную строку, задайте в рабочем каталоге расположение видео с помощью «cd [путь к каталогу]» и выполните следующие команды:
для %i в (*) do mkdir "%~ni_cropped"
для %i в (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
для /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - После завершения пакетного процесса откройте каждую последовательность изображений в ImageJ Fiji23 и обрежьте последовательность в интересующую область (ROI), охватывающую область пола, в которой наблюдается крыса.
- Чтобы уменьшить фон от освещения дорожки, увеличьте минимальный цветовой баланс голубого канала до 76.
- Сохраните как последовательность изображений и измените суффикс «_trimmed» на «_cropped», сохранив файлы в соответствующей папке «_cropped».
6. Обработка походки
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные походки обрабатываются и количественно оцениваются с помощью свободно доступного программного обеспечения MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Распакуйте и установите программное обеспечение MouseWalker на компьютер под управлением 64-разрядной среды Windows с установленным Microsoft Excel.
- После запуска MouseWalker.exe выполните начальную калибровку шкалы для каждого набора запусков. Загрузите последовательность изображений и с помощью ориентиров или линейки, запечатленной в видео, измерьте две точки известного расстояния. Рассчитайте количество пикселей на сантиметр в видеокадре и введите это значение в раздел параметров формы настроек вместе с частотой кадров получения видео.
- Аналогичным образом, измерьте голову, хвост и ноги крысы, чтобы определить длину головы, максимальную ширину и площадь хвоста, минимальную и максимальную площадь стопы и другие функции, необходимые для завершения раздела параметров отслеживания формы настроек MouseWalker. Смотрите http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ руководство пользователя и другую документацию.
- Чтобы получить значения области тела, откройте ту же последовательность изображений в ImageJ, нарисуйте выделение, описывающее крысу, и выполните подсчет пикселей интересующей области (ROI).
- Параметры и настройки, используемые для этой публикации (рисунок S6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры приведены для иллюстрации и зависят от масштаба видео, оборудования для сбора и условий. Калибровка и настройка программного обеспечения требуется каждый раз при перемещении камеры или оборудования. Захват измерительного устройства в пределах сбора повышает точность и облегчает калибровку. - После калибровки загрузите каждую последовательность изображений. При выборе авто начнется автономное назначение следов.
- Прокрутите каждый кадр последовательности, вручную исправляя пропущенные следы. Сохраните после завершения этого шага.
- Наконец, выберите evaluate для обработки данных о положении занимаемой площади и давлении. Серия графиков, изображений и электронная таблица с количественными метриками походки будут экспортированы в папку результатов.
7. Анализ данных
- Используйте электронную таблицу, экспортированную в конце каждой оценки, которая содержит количественные данные походки для каждого прогона. Объединяйте данные из каждого пробега и среднее значение на крысу. Построение средних данных и проверка значимости с помощью GraphPad Prism версии 7.0a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Содержание крысиной колонии
Поколение и характеристика одиночных крыс Пинк1 и Паркина были описаны ранее22. Одиночные крысы Pink1 и Parkin были получены из SAGE Labs (и теперь доступны от Envigo). Крысы DKO были получены путем скрещивания крыс Pink1-/- с крысами Parkin-/- для получения Крыс Pink1+/-/Parkin+/- крыс, которые были скрещены для получения Крыс Pink1-/-/Parkin-/- (будет доступно от Envigo). Для подтверждения делеции 26 bp в Park6 (ген, кодирующий Pink1), генотипирование проводили с использованием 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' вперед и 5'-CCACCACCCACACCACTTACTTACT-3' обратных праймеров. Делеция 5 bp в Park2 (ген, кодирующий Parkin) была проверена после того, как ДНК была амплифицирована с использованием прямого 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGA-3' и обратного 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'. Образцы амплифицированной полимеразной цепной реакции (ПЦР) были отправлены в ACGT Inc (Wheeling, IL) для секвенирования (рисунок S7). Все крысы содержались на фоне Long Evans Hooded (LEH). Крысы DKO были жизнеспособными и плодовитыми; однако во время родов наблюдался высокий уровень смертности среди плотин ДКО (примерно 30%). В этих экспериментах использовались только самцы крыс. Крыс держали в среде с контролируемой температурой с 12-часовым циклом света / темноты и свободным доступом к крысиным чау и воде.
Результаты
Чтобы служить примером полезности системы анализа походки FTIR для крыс, адаптированной с14, мы провели анализ походки на самцах крыс WT и Pink1 / Parkin DKO в возрасте 2 месяцев, чтобы определить, может ли использование кинематического анализа походки выявить тонкие двигательные нарушения, не наблюдаемые с зрительным восприятием человека до появления грубых двигательных проблем, начиная с 4-месячного возраста.
Подобно предыдущим исследованиям походки на мышах14, адаптированная система FTIR смогла отобразить рисунок следа, созданный ходячей крысой, а также путь, созданный центром тела (рисунок 1A). Несмотря на повышенный вес крыс DKO по сравнению с WT (рисунок 1B), давление ног, приложенное к поверхности ходьбы (визуализированное как тепловые карты), определяемое интенсивностью сигнала FTIR, было неизменным (рисунок 1C). После оценки нескольких параметров походки в зависимости от скорости ходьбы (рисунок 1D-H) мы заметили, что скорость ходьбы и длина шага были одинаковыми между крысами WT и DKO (рисунок 1D). Тем не менее, различия между крысами WT и DKO стали очевидными в фазе стойки и продолжительности качелей при более медленных скоростях ходьбы (рисунок 1E, F). Часть цикла шага, где нога находится в фазе стойки (продолжительность стоя / период), является дежурным фактором, и этот параметр выделяет больше времени, проведенного в фазе поворота, чем в фазе стойки, поскольку коэффициент нагрузки уменьшается, типичный для бега (рисунок 1G). Опять же, различия выделяются на более низких скоростях. Кроме того, в то время как скорость качелей увеличивается с увеличением скорости у животных WT, корреляция притупляется у крыс DKO (рисунок 1H).
Анализ походки FTIR также позволил получить графики следов фазы стойки каждой ноги относительно тела у свободно ходячих крыс (рисунок 2A, B). Следы стойки нормируются к длине тела и определяются как положение стопы относительно центра тела от приземления лапы (переднее крайнее положение, AEP) до конца фазы стойки (заднее экстремальное положение, PEP). При сравнении положения лапы мы наблюдали значительные изменения в AEP (левый задний край) и PEP (правый задний сlimb), предполагая, что левая задняя конечность находится ближе к телу во время приземления лапы (AEP), в то время как правая задняя конечность находится дальше от тела во время взлета лапы (PEP) у DKO по сравнению с крысами WT (рисунок 2C).
Несколько дополнительных параметров были значительно изменены у крыс DKO по сравнению с WT. В частности, были выявлены изменения в паттернах свинга задних конечностей. Скорость поворота как левой, так и правой задних конечностей была увеличена у крыс DKO по сравнению с крысами WT (рисунок 3A), в то время как продолжительность колебаний как левой, так и правой задних конечностей была уменьшена (рисунок 3B). Следует отметить, что длина шага не изменилась (рисунок 4).
Рисунок 1. Анализ структуры занимаемой площади и параметров шага. Репрезентативные шаблоны следов для крыс (A) WT и (B) DKO, показывающие (верхняя панель) тепловую карту следа, представляющую интенсивность пикселей и горизонтальную линию, представляющую траекторию тела, а также (нижнюю панель) отдельные ноги, помеченные различными цветами: левый передний (LF, желтый), левый задний (LH, синий), правый передний (RF, оранжевый) и правый задний (RH, зеленый). (C) Средняя скорость ходьбы для каждой крысы WT (n = 7) и DKO (n = 8). Среднее с SEM. Не значительно. (Д-Н) Параметры шага в зависимости от скорости у крыс WT (n = 7) и DKO (n = 8). Линии линейной регрессии и значения квадратов R включены. (D) Длина шага увеличивается со скоростью у крыс WT и DKO. (E) Продолжительность колебаний обратно пропорциональна скорости у крыс WT, но не у крыс DKO (не являются значительными). (F) Продолжительность стойки уменьшается со скоростью у крыс WT и DKO. (G) Коэффициент дежурства обратно пропорционален скорости у крыс DKO, но не у крыс WT (не является значительным). (H) Скорость качания линейно увеличивается со скоростью у крыс WT, но не у крыс DKO (не являются значительными). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Анализ следов стойки и позиционирования лап. (A) Репрезентативный анализ пешеходной дорожки для крысы WT (до и после коррекции фона), визуализированной с носом (красное твердое тело), контуром головы (синий пунктир), контуром хвоста (зеленым пунктирным), центром тела (белым пунктиром) и следами (круги: зеленый, RF и светло-синий, LH). (B) Репрезентативные участки следов стойки для свободно ходячих крыс WT и DKO. (C) Показано позиционирование лап у крыс WT (n = 7) и DKO (n = 8). AEP, переднее крайнее положение; ПЭП, заднее крайнее положение; L, слева; Р, справа; F, передний план; H, hindpaw. Среднее значение с SEM. Значимое по сравнению с WT (p < 0,05*, 0,001***) с использованием двустороннего ANOVA и множественного сравнительного теста Сидака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Параметры качелей Hindpaw изменены у крыс DKO. Передние и задние измерения скорости (A), с которой двигаются лапы, и (B) времени лап находятся в воздухе у крыс WT (n = 7) и DKO (n = 8). L, слева; Р, справа; F, передний план; H, hindpaw. Среднее значение с SEM. Значимое по сравнению с WT (p < 0,01**) с использованием непарного двуххвостого t-теста Стьюдента с коррекцией Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Длина шага неизмененная у крыс DKO. Передние и задние измерения длины шага у крыс WT (n = 7) и DKO (n = 8). L, слева; Р, справа; F, передний план; H, hindpaw. Среднее значение с SEM. Значимое по сравнению с WT (не значимое) с использованием непарного двуххвостого t-теста Стьюдента с коррекцией Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нарушения походки, включая уменьшение раскачивания рук, более медленную скорость ходьбы и более короткие шаги, являются определяющей чертой БП и возникают на ранней стадии заболевания 1,5. За прошедшие годы было разработано несколько методов для наблюдения и регистрации шагов для анализа походки в моделях БП грызунов, при этом ручные методы количественной оценки положения пешеходного падения приводят к автоматизированным подходам, которые являются более чувствительными и способными захватывать динамические параметры. Некоторые статические подходы включают в себя «подкрашивание» лап грызунов индикатором, который будет отслеживаться на носителях, размещенных на дорожке 24,25,26. Остаточные показатели позже количественно оцениваются вручную. Эти методы часто используются в сочетании с видеозаписью для ручной кинематической оценки. Автономные методы захвата и количественной оценки паттернов походки были введены совсем недавно15,16 и доступны в продаже. Автономная количественная оценка походки добавляет временные атрибуты к статическим следам, позволяя исследователям искать аномалии, связанные со скоростью и временем, в дополнение к расстоянию и углу27. Давление также поддается количественной оценке в сочетании с методом FTIR.
Аномалии характера походки также были зарегистрированы в моделях БП, индуцированных токсинами. В частности, изменения походки были зарегистрированы в модели поражения 6-OHDA с использованием коммерческой платформы анализа походки 28,29,30. Наиболее заметным изменением в этой модели было снижение скорости ходьбы и частоты педалирования. Кроме того, коммерческая платформа для анализа походки была использована для оценки ряда динамических и статических параметров походки моделей БП, таких как влияние односторонних 6-OHDA-индуцированных поражений и то, как трансплантация дофаминергических нейронов спасает изменения походки31. Кроме того, исследование проанализировало соотношение параметров от поражений 6-OHDA в поврежденных и неповрежденных сторонах мозга, при этом с поправкой на скорость в связанных параметрах, таких как цикл шага задних конечностей, область печати задних конечностей и последовательность шагов, все из которых значительно изменяются при сравнении различных типов поражений с физиологическим контролем32 . Тем не менее, важно отметить, что патогенетический фон моделей, индуцированных токсинами, имеет токсическую природу, а не нейродегенеративный процесс, как у человека PD6, и поэтому оценка походки после индукции поражения может имитировать прогрессирующую БП при потере нейронов, но затрудняет исследования ранних двигательных изменений.
Геометрия походки была измерена у крыс Pink1 KO, Parkin KO и DJ-1 KO22, моделей наследственной БП, которые демонстрируют прогрессирующую нигральную дофаминергическую потерю нейронов со старением. Походка измерялась с помощью коммерческого аппарата NeuroCube, где крысам разрешалось ходить по кругу, глядя на геометрию и динамические особенности. Крысы Pink1 и DJ-1 KO показали более короткую продолжительность шага, свинга и стойки по сравнению с WT в 4 и 8 месяцев.
Поскольку коммерческие системы анализа походки являются дорогостоящими и поставляются с запатентованными аналитическими конвейерами, мы искали открытую альтернативу для нашего изучения наследственных крысиных моделей БП. Система MouseWalker14, которая поставляется с инструкциями по сборке и программным обеспечением открытого доступа, фиксирует все параметры коммерческого оборудования, предназначенного для мелких грызунов. Поскольку платформа была слишком мала, чтобы последовательно достигать проходимых результатов со взрослыми крысами, то есть четырех непрерывных шагов во время передвижения со скоростью ходьбы, мы перемасштабировали оборудование для размещения крыс. Кроме того, мы использовали отечественную экшн-камеру вместо коммерческого высокоскоростного видеорешения.
Более низкая плотность кадров была потенциальной ловушкой использования экшн-камеры вместо высокоскоростной камеры. Тем не менее, порог качества в отечественной видеосъемке быстро растет и способен записывать со скоростью 120 кадров в секунду в высоком разрешении. Кроме того, искажения объектива могут быть исправлены во время записи программным обеспечением камеры, создающим последовательно линейное поле зрения (FOV).
Первоначально мы были обеспокоены динамикой давления использования аналогичной толщины акрила для дорожки с более широким основанием и более тяжелыми животными, а также способностью программного обеспечения обрабатывать видео более крупных животных в более широком FOV. Мы предполагаем, что диапазон массы между мышами и крысами находится в пределах чувствительности акриловой ftir-платформы, позволяющей измерять крыс в течение всего их жизненного цикла. Кроме того, возможно, что потенциальное разбавление пикселей может быть компенсировано более высокой площадью поверхности отпечатков лап крыс относительно площади, захваченной в FOV, если вообще есть какая-либо существенная разница. При правильной калибровке, как описано здесь, свободно доступное программное обеспечение14 смогло обрабатывать видео походки крыс, как описано.
С помощью этого протокола мы смогли продемонстрировать, что система14 походки мыши FTIR, модифицированная здесь для крыс, может обнаруживать изменения в походке до визуального наблюдения за перетаскиванием задних конечностей у самцов крыс DKO. Следует отметить, что явное визуально очевидное двигательное нарушение (волочение задних конечностей), наблюдаемое у крыс DKO, ранее сообщалось у самцов одиночных крыс Pink1KO 22. В то время как самцы крыс DKO демонстрируют визуально наблюдаемое перетаскивание задних конечностей, начиная с 4-6-месячного возраста, анализ походки выявил изменения локомоции в возрасте 2 месяцев. В частности, были обнаружены изменения параметров походки задних конечностей. Крысы DKO демонстрируют повышенную скорость качания задних конечностей (как влево, так и вправо) и связанное с этим уменьшение продолжительности качания задних конечностей (как влево, так и вправо). Кроме того, крысы DKO помещают левую заднюю лапу ближе к телу во время приземления лапы, в то время как правая задняя лапа находится дальше от их тела во время взлета лапы. Хотя мы не обнаружили изменений в шаге или продолжительности стойки у крыс DKO через 2 месяца, продолжительность колебаний была короче у крыс DKO, как аналогично сообщается у крыс Pink1 и DJ-1 KO22. В целом, эти изменения свидетельствуют о том, что параметры задней дуги изменяются до развития перетаскивания задних конечностей у самцов крыс DKO. Будущие исследования продольной походки, отслеживающие развитие изменений опорно-двигательного аппарата, помогут точно определить возраст, в котором изменения походки становятся значительными.
В этом исследовании мы показали, что система походки FTIR мышей14 , модифицированная здесь для изучения крыс, может быть использована для различения изменений параметров походки у 2-месячных самцов крыс DKO, модель наследственной БП, по сравнению с крысами WT, соответствующими возрасту. Предыдущие исследования у пациентов с БП выявили уменьшение длины шага и более низкое среднее время качания, а также повышенную вариабельность времени шага и вариабельность времени свинга4. Таким образом, наши результаты изменений времени качелей у крыс DKO и предыдущие сообщения об изменениях времени колебаний у крыс Pink1 KO и DJ-1 KO22, по-видимому, имеют отношение к прогрессированию PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
KS и HF благодарят Фонд Майкла Джей Фокса для исследований Паркинсона за поддержку их работы по болезни Паркинсона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al.
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F.
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
