Summary
Her beskriver vi RatWalker-systemet, bygget ved å redesigne MouseWalker-apparatet for å imøtekomme den økte størrelsen og vekten av rotter. Dette systemet bruker frustrert total intern refleksjon (FTIR), høyhastighets videoopptak og åpen tilgangsanalyseprogramvare for å spore og kvantifisere gangparametere.
Abstract
Parkinsons sykdom (PD) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse forårsaket av tap av dopaminerge (DA) nevroner i substantia nigra pars compacta. Gangavvik, inkludert redusert armsving, langsommere ganghastighet og kortere trinn er vanlige hos PD-pasienter og vises tidlig i sykdomsforløpet. Kvantifisering av motoriske mønstre i dyremodeller av PD vil derfor være viktig for fenotypisk karakterisering ved sykdomsforløp og ved terapeutisk behandling. De fleste tilfeller av PD er idiopatiske; Identifiseringen av arvelige former for PD avdekket imidlertid genmutasjoner og varianter, for eksempel tap av funksjonsmutasjoner i Pink1 og Parkin, to proteiner involvert i mitokondriell kvalitetskontroll som kunne utnyttes for å lage dyremodeller. Mens mus er resistente mot nevrodegenerasjon ved tap av Pink1 og Parkin (enkel og kombinert delesjon), hos rotter, fører Pink1, men ikke Parkin-mangel til nigral DA-nevrontap og motorisk funksjonsnedsettelse. Her rapporterer vi nytten av FTIR-avbildning for å avdekke gangforandringer hos fritt gående unge (2 måneder) hannrotter med kombinert tap av Pink1 og Parkin før utvikling av grov visuelt tydelig motorisk abnormitet når disse rottene eldes (observert ved 4-6 måneder), karakterisert ved at baklemmer drar som tidligere rapportert hos Pink1 knockout (KO) rotter.
Introduction
PD, den vanligste aldersrelaterte nevrodegenerative bevegelsesforstyrrelsen, skyldes tap av DA-nevroner i substantia nigra pars compacta. Dette tapet av nigral DA-nevroner og DA-inngangene i striatum fører til de observerte motoriske funksjonsnedsettelsene sett hos pasienter med PD 1,2. De definerende motoriske egenskapene til pasienter med PD, kjent kollektivt som parkinsonisme, inkluderer stivhet, hviletremor, bradykinesi, postural ustabilitet og mikrografi3. Videre opptrer gangforstyrrelser, som er vanlige hos PD-pasienter, tidlig i sykdomsforløpet 1,4,5. Mens visse livsstiler foreslås å bidra til å redusere utviklingen av PD, for eksempel sunn mat og regelmessig mosjon, er det for tiden ingen kur mot PD, bare medisiner for å håndtere symptomene. Dette gir rom for behovet for ytterligere undersøkelser i håp om forbedret terapi. Dermed er karakterisering av gangmønsteret i PD-dyremodeller et avgjørende verktøy for å karakterisere modellens relevans, samt hvordan terapeutiske behandlinger rettet mot å kontrollere PD forebygger eller forbedrer motoriske funksjonsnedsettelser.
Det finnes ulike PD-dyremodeller som har blitt brukt til å teste terapeutiske behandlinger, men hver har sine begrensninger. For eksempel har dyremodeller behandlet med nevrotoksin 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) gitt en stor mengde informasjon om prosesser som er viktige for nigral DA nevrontap og påfølgende striatale tilpasninger, og pekte på mitokondrienes rolle i PD-patogenesen; Den patogenetiske bakgrunnen til MPTP-modellen er imidlertid av giftig natur snarere enn en nevrodegenerativ prosess som i human PD6. Ytterligere kjemisk induserbare modeller inkluderer 6-hydroksydopamin (6-OHDA) og rotenon. 6-OHDA var det første middelet som ble brukt til å indusere PD ved selektiv akkumulering av stoffet i DA-nevronene, som til slutt dreper nevronene og fører til PD-lignende symptomer. Denne modellen ble først brukt til sporing av DA-uttømming ved å undersøke oppførselen som respons på amfetamin og apomorfin7. Denne metoden for PD-induksjon har vist seg å være nyttig for screening av farmakologiske midler som påvirker DA og dets reseptorer8. Mens 6-OHDA-modellen er en flott modell for sporing av kvantifiserbare motorunderskudd, viser denne modellen ikke hvordan det gradvise tapet av nevroner og dannelse av Lewy-legemer påvirker dyret. Den andre induksjonsmetoden, rotenon, har vist seg å ha progressiv degenerasjon av nigrostriatale nevroner med tap av tyrosinhydroksylase og DA-transportør, noe som muliggjør en bedre modell for å spore tap av nevroner over tid9. De rotenonbehandlede rottene viste bradykinesi, postural ustabilitet og ustø gange10. Imidlertid har denne metoden vist seg å være svært variabel mellom forskjellige stammer av rotter, noe som har provosert spørsmål om rotenon er en pålitelig PD-modell11,12,13. Mens ganganalyse har vist seg å bli påvirket av induksjon av PD hos rotter, har hittil genetisk induserte PD-rottemodeller ikke blitt lett brukt til ganganalyse ved å gå fritt nedover en rullebane.
En måte å analysere motorisk svekkelse hos fritt gående gnagere er kinematisk ganganalyse, som kan utføres ved å bruke FTIR-avbildning. Denne etablerte metoden bruker en optisk berøringssensor basert på FTIR, som registrerer og sporer fotavtrykkene til gnagere når de beveger seg nedover rullebanen14,15,16. Sammenlignet med andre metoder er ikke FTIR avhengig av markører på dyrets kropp som kan forstyrre poteavtrykkene. Generering av videodataene produserer digitale poteavtrykk av alle fire lemmer som kan kombineres for å skape et dynamisk og reproduserbart gangmønster for ulike gnagermodeller. Prinsippet for bildebasert ganganalyse er å ta hver enkelt pote og måle kontaktområdet over tid når gnageren går nedover rullebanen. Hver holdning er representert ved en økning i poteområdet (i bremsefasen) og en reduksjon i poteområdet (i fremdriftsfasen). Dette fortsetter av svingfasen, som er når det ikke oppdages potesignal. Etter evaluering av videoen genereres flere parametere som kan brukes til å sammenligne villtype (WT) versus PD-modell. Noen eksempler på parametrene er trinnlengde (avstand poten dekker i ett trinn), svingvarighet (varighet av tiden poten ikke er i kontakt med rullebanen), svinghastighet (trinnlengde som funksjon av svingvarighet) og trinnmønster (diagonale trinn, sidetrinn eller beltetrinn).
For å demonstrere nytten av FTIR for å avdekke tidlige endringer i gangmønster hos rotter, brukte vi en genetisk rottemodell av PD. Mens de fleste tilfeller av PD er idiopatiske; identifiseringen av arvelige former for PD avdekket genmutasjoner og varianter, for eksempel tap av funksjonsmutasjoner i Pink1 og Parkin, to proteiner involvert i mitokondriell kvalitetskontroll17, som kunne utnyttes for å lage dyremodeller18. Dessverre er mus resistente mot nevrodegenerasjon ved tap av disse proteinene (enkelt og kombinert)19,20,21. Hos rotter fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, til nigral DA nevrontap og motoriske funksjonsnedsettelser22, men uten fullstendig penetrans. Derfor genererte vi en kombinert Pink1/Parkin double knockout (DKO) rottemodell, som viser den åpenbare visuelt synlige bakkroppsdragende fenotypen rapportert hos mannlige Pink1 KO-rotter22, men nå med en høyere hastighet: 100% mot 30-50% av hannene mellom 4-6 måneder.
Selv om denne metoden fungerer bra for å analysere motoriske underskudd hos mus14, var spesifikasjoner for FTIR-bildegangsystem for å imøtekomme størrelsen og vekten til rotter tidligere utilgjengelig ikke-kommersielt. Her forklarer vi hvordan du bygger RatWalker, et modifisert FTIR-gangbildesystem modellert etter MouseWalker14, bortsett fra tilpasset rotters størrelse og vekt. Dette systemet benytter en optisk effekt, FTIR, for å gi en metode for å visualisere og deretter registrere dyreavtrykk for analyse. Kontakt av et dyrs fot med den optiske bølgelederen (plattformen) forårsaker forstyrrelser i lysbanen, noe som resulterer i en synlig spredningseffekt, som fanges opp ved hjelp av innenlands, høyhastighets videografi og behandling ved hjelp av åpen kildekode-programvare. Denne studien demonstrerer kraften til FTIR-avbildning i å studere gangendringer i genetiske rottemodeller av PD. For eksempel, mens åpenbare visuelt synlige motoriske forandringer (dvs. bakkroppsdraging) observeres hos DKO-hannrotter tidligst ved 4 måneder, kan vi ved bruk av FTIR avdekke portabnormaliteter hos DKO-hannrotter ved 2 måneders alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Gangapparat
MERK: RatWalker er modellert fra MouseWalker14, og ble designet med dimensjoner i forhold til forskjellen i trinnlengde mellom rotter og mus. Den består av en sidebelysning bakgrunnsbelysning, gangvei kabinett, optisk waveguide gangvei, speil og kamera (figur S1). LED-striper, orientert i forskjøvet stilling, ble brukt på hver side av gangveien og bakgrunnsbelysning bølgeledere for å imøtekomme det ekstra materialet. Materialene som trengs for å bygge det modifiserte gangapparatet, finnes i tabell S1.
- Bruk en bakgrunnsbelysning (figur S2) for å lage en silhuett av dyret som brukes av programvaren til å tildele posisjon, bevegelsesretning og morfometriske egenskaper. Konstruksjonen består av et lagdelt panel av en akryldiffusor, optisk bølgeleder, reflektor og LED-lysstrimler montert i en aluminiumsramme (tabell S1).
- Bruk en innhegning til gangvei (figur S3) for å lede dyret langs plattformen og lede dyret til hjemmeburet. Konstruksjonen består av klare akrylplater løsningsmiddel sveiset med diklormetan (tabell S2).
- Bruk gangveien (figur S4) for å gi mediet for å generere opplyste fotavtrykk. Gangveien er konstruert av klar akryl, som er sidebelyst med stripe-LED og plassert i aluminiumsvinkel (tabell S3).
- Plasser et speil (figur S5) rett under gangveien i en 45-graders vinkel for å reflektere undersiden av gangveien for videoopptak. Den er konstruert av et 1/4" tykt glassspeil støttet av akryl og vinklede braketter arrangert på rad (tabell S4).
- Utfør videografi med et stativmontert actionkamera med høy hastighet i hjemmet.
2. Oppsett av utstyr
- Juster bakgrunnsbelysningen, gangveien og speilet i henhold til figur S1, på toppen av en benkeplate, arbeidsbenk eller stabil vogn. Forsikre deg om at hver komponent er sentrert i forhold til gangveien.
- Bruk et nivå, og kontroller at komponentene er horisontalt loddet.
- Plasser gangveien på toppen av gangveien.
- Rengjør alle kontaktflater med 70% etanol. Sørg for å bruke et ikke-slipende håndkle for å forhindre riper på gangveien.
- Monter høyhastighetskameraet på et 57-tommers stativ og plasser det midtlinjen til speilet, fordelt langt nok til å fange hele gangveien innenfor synsfeltet. Fra videoinnstillingsmenyen må du sørge for at høyhastighetskameraet er satt til lineært opptak i 1080p-modus ved 120 bilder per sekund (fps) med alle typer automatisk justering eller optimaliseringer slått av.
- Koble til og slå på LED-stripelysene for bakgrunnsbelysning og gangvei. Det kan være nødvendig å dempe bakgrunnsbelysningen for å redusere bakgrunnsopptak.
3. Dyr akklimatisering
MERK: En uke før det første forsøket, kjør dyrene gjennom det modifiserte gangapparatet.
- Plasser et hjemmebur ved enden av gangveien.
- Med kabinettet installert og lysene av, plasser rotta i enden av gangveien overfor hjemmeburet og la den gå over gangveien på en utvunget måte.
- Kjør hver rotte gjennom det modifiserte gangapparatet flere ganger, til de jevnt kan krysse hele gangveien.
- Gjenta prosessen to dager før eksperimentet.
4. Gang prosedyre
- Plasser et hjemmebur i enden av gangveien før starten av hver løpetur for å tjene som et positivt signal for rotta å krysse gangveien.
- Slå av romlysene, slå på kameraet og start opptaket flere sekunder før rotta plasseres på plattformen.
MERK: Pass på at du bruker et minnekort som er offisielt anbefalt av kameraprodusenten. Et unotert minnekort kan fortsatt fungere, men er ikke garantert å fange opp med den påståtte bildefrekvensen. - Med kabinettet installert, plasser rotta i enden av gangveien overfor hjemmeburet og la den gå over gangveien på en utvunget måte.
- Stopp opptaket når dyret når enden av gangveien.
- Rengjør gangveien med 70% etanol og et ikke-slipende håndkle mellom løpeturene og etter at et dyr urinerer eller gjør fra seg, og la etanol fordampe før du introduserer et annet dyr.
- Kjør rottene gjennom gangveien totalt 7 ganger i løpet av hver observasjonsperiode, og ta de tre første løpene som scorer som bestått for analyse.
- Score et løp som passerer hvis dyret gjør fire eller flere påfølgende skritt i retning av hjemmeburet uten avbrudd på grunn av pelsstell, pause eller villfarne bevegelser.
MERK: Det er god praksis å registrere dyrenes masse før hver runde med tiltak. I vår studie veide WT (n = 7) og DKO (n = 8) henholdsvis 200,3 ± 21,67 g og 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, Unpaired t-test med Welchs korreksjon). Vi ser ikke noe problem med rotter i noen alder eller størrelse.
5. Forhåndsbehandling av video
MERK: Videoene som er tatt av høyhastighetskameraet, gjengis i mp4-format med 120 fps og en oppløsning på 1080p. For å lette byrden på den analytiske programvaren nedstrøms, må du først trimme unødvendige opptak og fjerne lyden fra hver video ved hjelp av LosslessCut-programvare (versjon 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), og deretter konvertere mp4-videostrømmen til en png-bildesekvens ved hjelp av åpen kildekode-programvaren FFmpeg (versjon 4.2, http://ffmpeg.org/). Merk: andre Lossless-formater som tiff kan brukes i stedet for png.
- Opprett en katalog for videoene på en PC som kjører Windows 7 eller høyere, og overfør deretter videoene fra høyhastighetskameraets lagringsenhet til den nyopprettede katalogen. I tillegg kopierer du ffmpeg.exe til samme sted.
- I LosslessCut drar du videoene til grensesnittet for å åpne. Kast lyden, sett start- og sluttklippepunktene til å inkludere bare den analytisk relevante delen av videoen, sett opptaksrammeformatet til png og eksporter. Når videoen er eksportert, gir du videofilen nytt navn ved å bruke en navnekonvensjon etterfulgt av "_trimmed".
- For å batchkonvertere videoene til bildesekvenser, åpne en ledetekst, sett arbeidskatalogen til plasseringen av videoene med "cd [bane til katalog]", og kjør følgende kommandoer:
for %i i (*) do mkdir "%~ni_cropped"
for %i i (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - Etter at batchprosessen er fullført, åpner du hver bildesekvens i ImageJ Fiji23 og beskjærer sekvensen til interesseområdet (ROI) som omfatter området av gulvet der rotta observeres.
- For å redusere bakgrunnen fra gangveibelysningen, øk fargebalansen minimum av cyankanalen til 76.
- Lagre som bildesekvens og endre "_trimmed" -suffikset til "_cropped", og lagre filene i deres respektive "_cropped" -mappe.
6. Gangbehandling
MERK: Gangdata behandles og kvantifiseres ved hjelp av den fritt tilgjengelige programvaren, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Pakk ut og installer MouseWalker-programvaren på en PC som kjører et 64-biters Windows-miljø med Microsoft Excel installert.
- Etter å ha startet MouseWalker.exe, utfør en innledende skalakalibrering for hvert sett med kjøringer. Last inn en bildesekvens, og bruk landemerker eller en linjal som er tatt opp i videoen, og mål to punkter med kjent avstand. Beregn antall piksler per centimeter i videorammen og skriv inn denne verdien i parameterdelen av innstillingsskjemaet sammen med bildefrekvensen for videooppkjøp.
- På samme måte måler du hodet, halen og føttene til rotta for å bestemme hodelengde, maksimal halebredde og -område, minimum og maksimum fotområde og andre funksjoner som er nødvendige for å fullføre delen for sporingsparametere i MouseWalker-innstillingsskjemaet. Se http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ for brukerhåndbok og annen dokumentasjon.
- Hvis du vil hente brødtekstområdeverdiene, åpner du den samme bildesekvensen i ImageJ, tegner en markering som viser rotten, og utfører et bildepunktantall for interesseområder (ROI).
- Parametere og innstillinger brukt for denne publikasjonen (figur S6).
MERK: Parametere er gitt for illustrasjon og er avhengig av omfanget av videoen, anskaffelsesmaskinvaren og forholdene. Programvarekalibrering og -justering kreves hver gang kameraet eller utstyret plasseres på nytt. Registrering av en måleenhet i anskaffelsen forbedrer nøyaktigheten og letter kalibreringen. - Etter kalibrering laster du inn hver bildesekvens. Hvis du velger auto, starter den autonome tildelingen av fotavtrykk.
- Bla gjennom hver ramme i sekvensen, og korriger feiltildelte fotavtrykk manuelt. Lagre når dette trinnet er fullført.
- Til slutt velger du evaluer for å behandle fotavtrykkposisjonen og trykkdataene. En serie grafer, bilder og et regneark med kvantitative gangmålinger eksporteres til en resultatmappe.
7. Dataanalyse
- Bruk regnearket som eksporteres på slutten av hver evaluering, som inneholder kvantitative gangdata for hver kjøring. Sammenkoble data fra hver kjøring og gjennomsnitt per rotte. Plott gjennomsnittsdataene og test for signifikans ved hjelp av GraphPad Prism versjon 7.0a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedlikehold av rottekoloni
Generering og karakterisering av Pink1 og Parkin single KO-rotter er beskrevet tidligere22. Pink1 og Parkin enkelt KO rotter ble hentet fra SAGE Labs (og nå tilgjengelig fra Envigo). DKO-rotter ble generert ved å krysse Pink1-/- rotter med Parkin-/- rotter for å få Pink1+/-/Parkin+/- rotter, som ble blandet for å oppnå Pink1-/-/Parkin-/- rotter (vil være tilgjengelig fra Envigo). For å bekrefte delesjon av 26 bp i Park6 (genkoding Pink1) ble genotyping utført ved bruk av 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' forward og 5'-CCACCCACTACCACTTACT-3' reversprimere. Sletting av 5 bp i Park2 (genkodende Parkin) ble testet etter at DNA ble amplifisert ved hjelp av en fremover 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGA-3' og omvendt 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3'. PCR-prøver (amplified Polymerase Chain Reaction) ble sendt til ACGT Inc (Wheeling, IL) for sekvensering (figur S7). Alle rottene ble holdt på Long Evans Hooded (LEH) bakgrunn. DKO-rotter var levedyktige og fruktbare; Det var imidlertid høy dødelighet blant DKO-dammene ved fødselen (ca. 30 %). Bare hannrotter ble brukt i disse forsøkene. Rotter ble holdt i et temperaturkontrollert miljø med en 12-timers lys / mørk syklus og fri tilgang til rotte chow og vann.
Resultater
For å tjene som et eksempel på nytten av FTIR ganganalysesystem for rotter, tilpasset fra14, utførte vi ganganalyse på mannlige WT og Pink1 / Parkin DKO-rotter ved 2 måneders alder for å avgjøre om bruk av kinematisk ganganalyse kunne avdekke subtile motoriske funksjonsnedsettelser som ikke ble observert med menneskelig synsoppfattelse før utseendet av grovmotoriske problemer fra 4 måneders alder.
I likhet med tidligere gangstudier hos mus14, var det tilpassede FTIR-systemet i stand til å vise fotavtrykksmønsteret skapt av den gående rotten, samt banen skapt av kroppssenteret (figur 1A). Til tross for den økte vekten av DKO-rottene sammenlignet med WT (figur 1B), var fottrykket som ble påført gangflaten (visualisert som varmekart) som bestemt av intensiteten til FTIR-signalet, uendret (figur 1C). Ved vurdering av flere gangparametere som funksjon av ganghastighet (figur 1D-H), observerte vi at ganghastighet og skrittlengde var lik mellom WT- og DKO-rotter (figur 1D). Variasjonen mellom WT- og DKO-rotter ble imidlertid tydelig i holdningsfase og svingvarighet ved lavere ganghastighet (figur 1E, F). Brøkdelen av trinnsyklusen der benet er i holdningsfasen (holdningsvarighet/periode) er driftsfaktoren, og denne parameteren fremhever mer tid brukt i svingfasen enn i holdningsfasen når driftsfaktoren avtar, typisk for løping (figur 1G). Igjen fremheves forskjellene ved lavere hastigheter. Videre, mens svinghastigheten øker med økt hastighet hos WT-dyr, er korrelasjonen avstumpet hos DKO-rotter (figur 1H).
FTIR-ganganalysen tillot også plott av holdningsfasespor av hvert ben i forhold til kroppen hos fritt gående rotter (figur 2A, B). Holdningssporene normaliseres til kroppslengde og defineres som fotens posisjon i forhold til kroppssenteret fra potetouchdown (fremre ekstremposisjon, AEP) til slutten av holdningsfasen (posterior extreme position, PEP). Ved sammenligning av poteposisjoneringen observerte vi signifikante endringer i AEP (venstre baklem) og PEP (høyre baklem) som tyder på at venstre baklem er nærmere kroppen under potetouchdown (AEP), mens høyre baklem er lenger unna kroppen under potestart (PEP) i DKO sammenlignet med WT-rotter (figur 2C).
Flere tilleggsparametere ble signifikant endret hos DKO-rotter sammenlignet med WT. Spesielt ble det avdekket endringer i baklemmenes svingmønster. Svinghastigheten til både venstre og høyre baklem var økt hos DKO-rotter sammenlignet med WT-rotter (figur 3A), mens svingvarigheten for både venstre og høyre baklem ble redusert (figur 3B). Det er verdt å merke seg at skrittlengden var uendret (figur 4).
Figur 1. Fotavtrykksmønster og trinnparameteranalyse. Representative fotavtrykksmønstre for (A) WT og (B) DKO-rotter som viser (øverste panel) fotavtrykkvarmekart som representerer pikselintensitet og horisontal linje som representerer kroppsbanen samt (nederste panel) individuelle føtter merket med forskjellige farger: venstre forside (LF, gul), venstre bakre (LH, blå), høyre forside (RF, oransje) og høyre bakre (RF, grønn). (C) Gjennomsnittlig ganghastighet for hver WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotte. Gjennomsnitt med SEM. Ikke signifikant. (VG Nett) Trinnparametere som funksjon av hastighet i WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter. Lineære regresjonslinjer og R-kvadratverdier inkludert. (D) Skrittlengden øker med hastigheten hos WT- og DKO-rotter. (E) Svingvarigheten er omvendt proporsjonal med hastigheten hos WT-rotter, men ikke hos DKO-rotter (er ikke signifikante). (F) Holdningsvarigheten reduseres med hastigheten hos WT- og DKO-rotter. (G) Vaktfaktor er omvendt proporsjonal med hastigheten hos DKO-rotter, men ikke WT-rotter (er ikke signifikante). (H) Svinghastigheten øker lineært med hastigheten hos WT-rotter, men ikke DKO-rotter (er ikke signifikante). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Stancespor og poteposisjoneringsanalyse. (A) Representativ gangsporanalyse for en WT-rotte (før og etter bakgrunnskorreksjon) visualisert med nese (rød solid), hodekontur (blå stiplet), halekontur (grønn stiplet), kroppssenter (hvit stiplet) og fotavtrykk (sirkler: grønn, RF og lyseblå, LH). (B) Representative plott av holdningsspor for fritt vandrende WT- og DKO-rotter. (C) Poteposisjonering i rotter i WT (n = 7) og DKO (n = 8) er vist. AEP, fremre ekstrem posisjon; PEP, bakre ekstrem posisjon; L, venstre; R, ikke sant; F, forpote; H, bakpote. Gjennomsnitt med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (p < 0,05*, 0,001***) ved bruk av toveis ANOVA og Sidaks multiple sammenligningstest. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Hindpaw svingparametere endret i DKO-rotter. Forpote- og bakpotemålinger av (A) hastigheten potene beveger seg med og (B) tidspotene er luftbårne i WT (n = 7) og DKO (n = 8) rotter. L, venstre; R, ikke sant; F, forpote; H, bakpote. Gjennomsnitt med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (p < 0,01**) ved bruk av Students uparede tosidige t-test med Welchs korreksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Skrittlengde uendret hos DKO-rotter. Forpote- og bakpotemålinger av steglengde hos rotter i WT (n = 7) og DKO (n = 8). L, venstre; R, ikke sant; F, forpote; H, bakpote. Gjennomsnitt med SEM. Signifikant sammenlignet med WT (ikke signifikant) ved bruk av Students uparede tosidige t-test med Welchs korreksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gangforstyrrelser, inkludert redusert armsving, langsommere ganghastighet og kortere trinn, er et definerende trekk ved PD, og opptrer tidlig i sykdomsforløp 1,5. Flere metoder har blitt utviklet gjennom årene for å observere og registrere fotfall for ganganalyse i gnagermodeller av PD, med manuelle teknikker for å kvantifisere fotfallposisjon som fører til automatiserte tilnærminger som er mer følsomme og i stand til å fange dynamiske parametere. Noen statiske tilnærminger innebærer å "blekke" gnagerpoter med en indikator som skal spores på medier plassert på en gangvei24,25,26. Restfotfallene kvantifiseres senere for hånd. Disse metodene brukes ofte i forbindelse med videoopptak for manuell kinematisk scoring. Autonome metoder for å fange og kvantifisere gangmønstre ble introdusert mer nylig15,16, og er tilgjengelig kommersielt. Autonom gangkvantifisering legger tidsattributter til ellers statiske fotavtrykk, slik at etterforskere kan lete etter abnormiteter som tilskrives hastighet og tid i tillegg til avstand og vinkel27. Trykk er også kvantifiserbart når det kombineres med FTIR-metoden.
Avvik i gangmønster er også rapportert i toksininduserte rottemodeller av PD. Spesielt er gangendringer rapportert i 6-OHDA-lesjonsmodellen ved bruk av en kommersiell ganganalyseplattform28,29,30. Den mest fremtredende endringen i denne modellen har vært nedgang i ganghastighet og tråkkfrekvens. Videre har den kommersielle ganganalyseplattformen blitt brukt til å vurdere en rekke dynamiske og statiske gangparametere av PD-modeller, for eksempel virkningen av ensidige 6-OHDA-induserte lesjoner og hvordan transplantasjon av dopaminerge nevroner redder gangendringene31. I tillegg har en studie analysert forholdet mellom parametere fra 6-OHDA-lesjoner i skadede versus uskadde sider av hjernen, mens man korrigerer for hastighet i relaterte parametere som bakbenets trinnsyklus, bakbenets utskriftsområde og trinnsekvens, som alle er signifikant endret når man sammenligner forskjellige typer lesjoner med saltvannskontroller32 . Det er imidlertid viktig å merke seg at den patogenetiske bakgrunnen til toksininduserte modeller er av giftig natur snarere enn en nevrodegenerativ prosess som i human PD6, og som sådan kan gangvurdering etter lesjonsinduksjon etterligne avansert PD når nevroner går tapt, men gjøre studier i tidlige motoriske endringer vanskeligere.
Ganggeometri har blitt målt i Pink1 KO, Parkin KO og DJ-1 KO rotter22, modeller av arvelig PD, som viser et progressivt nigralt dopaminergt nevrontap med aldring. Gangen ble målt ved hjelp av det kommersielle NeuroCube-apparatet, hvor rottene får lov til å gå i en sirkel og se på geometri og dynamiske egenskaper. Pink1 og DJ-1 KO rotter viste kortere varighet i skritt, sving og holdning sammenlignet med WT ved 4 og 8 måneder.
Fordi kommersielle ganganalysesystemer er kostbare og kommer med proprietære analyserørledninger, søkte vi et åpent alternativ for vår studie av arvelige rottemodeller av PD. MouseWalker-systemet14, som leveres med byggeinstruksjoner og programvare med åpen tilgang, fanger opp alle parametrene til kommersielt utstyr designet for smågnagere. Siden plattformen var for liten til konsekvent å oppnå farbare resultater med voksne rotter, dvs. fire uavbrutte trinn under bevegelse i ganghastighet, skalerte vi maskinvaren på nytt for å imøtekomme rotter. I tillegg benyttet vi et hjemmekamera i stedet for en kommersiell høyhastighets videoløsning.
Lavere bildetetthet var en potensiell fallgruve ved å bruke et actionkamera i stedet for et høyhastighetskamera. Imidlertid øker kvalitetsterskelen i innenlandsk videografi raskt og kan ta opp med 120 bilder per sekund i høy oppløsning. Videre kan linseforvrengning korrigeres under opptak av kameraprogramvare som produserer et konsekvent lineært synsfelt (FOV).
Vi var i utgangspunktet bekymret for trykkdynamikken ved å bruke en lignende tykkelse av akryl for gangveien med en bredere base og tyngre dyr, og programvarens evne til å behandle video av større dyr i en bredere FOV. Vi spekulerer i at masseområdet mellom mus og rotter faller innenfor følsomhetsområdet til AKRYL FTIR-plattformen, slik at vi kan måle rotter gjennom hele livssyklusen. Videre er det mulig at potensiell pikselfortynning kan oppveies av det høyere overflatearealet av rottenes poteavtrykk i forhold til området fanget i FOV, hvis det er noen signifikant forskjell i det hele tatt. Med riktig kalibrering, som dokumentert her, var den fritt tilgjengelige programvaren14 i stand til å behandle rottegangvideo som beskrevet.
Med denne protokollen kunne vi demonstrere at FTIR-musegangssystemet14 modifisert her for rotter kan oppdage endringer i gangen før den visuelle observasjonen av baklemmer som drar i hannrotter. Det er verdt å merke seg at den åpenbare visuelt synlige motoriske svekkelsen (bakekstremitetsdraging) observert hos DKO-rotter tidligere er rapportert hos hannrotter i Pink1 KO22. Mens mannlige DKO-rotter utviser visuelt observerbare baklemmer som drar fra 4-6 måneders alder, avdekket ganganalysen bevegelsesendringer ved 2 måneders alder. Spesielt ble det funnet endringer i bakbenets gangparametere. DKO-rotter utviser økt svinghastighet i bakbenet (både venstre og høyre) og en tilhørende reduksjon i bakbenets (både venstre og høyre) svingvarighet. Videre plasserer DKO-rottene venstre bakpote nærmere kroppen under potetouchdown, mens høyre bakpote er lenger unna kroppen under potestart. Selv om vi ikke avdekket endringer i skritt- eller holdningsvarighet hos DKO-rotter etter 2 måneder, var svingvarigheten kortere hos DKO-rotter som er tilsvarende rapportert hos Pink1 og DJ-1 KO rotter22. Samlet sett antyder disse endringene at bakbenets gangparametere endres før utviklingen av baklemmer som drar i hannrotter av DKO. Fremtidige langsgående gangstudier som sporer utviklingen av bevegelsesendringer, vil bidra til å finne ut alderen der gangendringer blir signifikante.
I denne studien viste vi at et FTIR mus gangsystem14 modifisert her for studier av rotter kan brukes til å skille endringer i gangparametere hos 2 måneder gamle mannlige DKO-rotter, en modell for arvelig PD, sammenlignet med aldersmatchede WT-rotter. Tidligere studier med PD-pasienter viste redusert skrittlengde og lavere gjennomsnittlig svingetid, samt økt skritttidsvariabilitet og svingtidsvariabilitet4. Våre funn av endringer i svingtid hos DKO-rotter, og tidligere rapporter om svingtidsendringer i Pink1 KO og DJ-1 KO rotter22, synes derfor relevante for PD-progresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
KS og HF takker Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research for støtte i arbeidet med Parkinsons sykdom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al.
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F.
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
