Summary
Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.
Abstract
Adiposit farklılaşması ve işlevinin altında kalan mekanizmaların anlaşılması, ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre çizgilerinin kullanımından büyük ölçüde yararlanmıştır. Ancak bu kültürlü hücre çizgilerinin sınırlamaları vardır. Şu anda beyaz yağ depolarında var olduğu bilinen heterojen adiposit popülasyonlarının çeşitli fonksiyonel spektrumlarını tam olarak yakalaymıyorlar. Beyaz yağ dokusunun karmaşıklığını incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili bir model sağlamak için, birincil beyaz ve kahverengi adiposit atalarının yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonunu, kültürdeki hızlı genişlemelerini ve in vitro'yu olgun, tamamen işlevsel adipositlere ayırmalarını sağlayacak bir protokol geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Birincil hücreleri yetişkin fareler yerine yenidoğandan izole etmenin birincil avantajı, yağ depolarının aktif olarak gelişmesi ve bu nedenle çoğalan preadipositlerin zengin bir kaynağı olmasıdır. Bu protokol kullanılarak izole edilen birincil preadipositler, birleşmeye ulaştıktan sonra hızla farklılaşır ve yenidoğan farelerde gelişmiş yağ pedlerinin görünümünü doğru bir şekilde yansıtan zamansal bir pencere olan 4-5 gün içinde tamamen olgunlaşır. Bu strateji kullanılarak hazırlanan birincil kültürler, yüksek tekrarlanabilirlik ile genişletilebilir ve incelenebilir, genetik ve fenotipik ekranlar için uygun hale getirilebilir ve genetik fare modellerinin hücre otonom adiposit fenotiplerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, yağ dokusu in vitro karmaşıklığını incelemek için basit, hızlı ve ucuz bir yaklaşım sunar.
Introduction
Obezite, enerji alımı ve enerji harcaması arasındaki kronik dengesizlikten kaynaklanır. Obezite geliştikçe, beyaz adipositler hücre boyutunda mikroçevrimde hipoksi, hücre ölümü, iltihaplanma ve insülin direnci ile sonuçlanan büyük bir genişlemeye uğrar1. İşlevsel olmayan, hipertrofiked adipositler, insülin eylemini sönümledikleri diğer dokularda biriken fazla lipitleri düzgün bir şekildedepolayamazlar 2,3. Adiposit fonksiyonunu iyileştiren ve dokular arasında normal lipid bölünmesini geri kazandıran ajanların tip 2 diyabet gibi insülin direnci ile karakterize obezite ile ilişkili durumların tedavisi için faydalı olacağı öngörülmektedir. 3T3-L1, F442A ve 10T 1/2 gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanan adipositlerdeki fenotipik ekranlar, adipogenez düzenleyen genetik faktörleri tanımlamak ve anti-diyabetik özelliklere sahip anti-adipojenik molekülleri izole etmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri, hepsi sistemik homeostaz 8 ,9,10'akatkıda bulunan benzersiz özelliklere sahip beyaz, kahverengi, bej ve diğer adiposit alt tiplerini içeren yağ depolarında bulunan hücre tiplerinin heterojenliğini tam olarak yansıtmaz. Ayrıca, kültürlü hücre hatları genellikle dış uyaranlara karşı azalmış bir yanıt gösterir.
Buna karşılık, birincil adiposit kültürleri in vivo adipogenezin karmaşıklığını daha doğru bir şekilde rekapitüle eder ve birincil adipozitler sağlam işlevsel yanıtlar gösterir. Birincil preadipositler tipik olarak yetişkin farelerin yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir11,12,13,14. Bununla birlikte, yetişkin hayvanların yağ depoları öncelikle çok yavaş bir ciro oranına sahip tamamen olgun adipositlerden oluştuğundan15,16,17, bu yaklaşım düşük çoğalma oranına sahip sınırlı miktarda preadiposit verir. Bu nedenle, preadipositlerin yenidoğan farelerden izole edilmesi, in vitro olarak ayırt edilebilen büyük miktarlarda hızla büyüyen hücreler elde etmek için tercih edilir. Burada, in vitro'yu tamamen işlevsel birincil adipositlere genişletilebilen ve ayırt edilebilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositleri verimli bir şekilde izole etmek için Kahn ve ark.18'in birincil kahverengi adipositleri ile yapılan ilk çalışmalardan esinlenen bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1A). Yetişkin farelerin aksine, birincil hücreleri yenidoğandan izole etmenin avantajı, yağ depolarının hızla büyümesi ve böylece aktif olarak çoğalan zengin bir preadiposit kaynağıolmasıdır 17. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış hücreler, kültürlerin hızlı bir şekilde ölçeklendirilmesini sağlayan yüksek proliferatif kapasiteye sahiptir. Ek olarak, yenidoğan yavrularından gelen preadipositler, yetişkin atalardan daha yüksek farklılaşma potansiyeli gösterir, bu da farklılaşma derecesinde iyiden kuyuya değişkenliği azaltır ve böylece tekrarlanabilirliği arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Scripps Araştırma Enstitüsü ve Wisconsin Üniversitesi - Madison Tıp ve Halk Sağlığı Okulu'nun tüm IACUC yönergelerini takip eder.
1. Yağ depolarının toplanması ve sindirimi (gün 1)
- Her yavru için iki adet 1,5 mL tüp hazırlayın: biri kahverengi yağ dokusu (BAT) ve diğeri beyaz yağ dokusu (WAT) için. 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) + 200 μL 2x izolasyon tamponu (123 mM NaCl, Her tüpe 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2,5 mM glikoz, 100 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), penisilin-streptomisin ve % 4 yağ asidi içermeyen sığır serum albümin. Çözeltileri steril ve buz üzerinde tutun.
- Yavruları küçük odalara (örneğin, 6 kuyulu bir tabak kuyusu) yerleştirin ve hipotermik hale gelene kadar buza koyun. Yavrular ve buz arasında doğrudan temas olmadığından emin olun. Bilinç kaybını sağlamak için ucu olan bir pençe batırın ve keskin makas kullanarak kafa keserek yavruları ötenazi edin.
NOT: Farklı genotiplerle çalışıyorsanız, genotipleme için kuyruk biyopsisi (3 mm kesim) toplamak için ek bir tüp hazırlayın. Genotipleme hemen yapılırsa, ötanazili yavruları yağ depolarını toplamak için diseksiyona kadar buzda tutun. - Tüm depoları sindirmek için gereken kollajenaz miktarını hesaplayın ve tartın. Her tüpe 2x izolasyon tamponunda 50 μL 15 mg/mL kollajenaz tip I ekleyin. Tüm dokular toplanana kadar kollajenazı izolasyon tamponunda yeniden canlandırmayın.
- Deri altı WAT toplamak için, yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin (periton yırtılmalarından kaçının) ve cildi bacakların altına hafifçe çekin. Cildi almadan, kuadriseps'in içine veya üstüne bağlı açık (P1 veya daha genç) veya beyaz (P2 ve daha yaşlı), ince, uzun bir doku olarak görünecek yağ deposunu dikkatlice toplayın (Şekil 1B). Yağ deposunun PBS'de durulanması ve 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren tüplerden birine yerleştirin. Buzda kal.
NOT: P0 ve P1 fareleri en iyi verimi verir. P0-1 yavrularında, deri altı WAT deposu neredeyse şeffaftır. P2 farelerinde ve daha yaşlılarda, deponun tanımlanması daha kolaydır, çünkü zaten beyazlaşıyor, bu da tamamen olgun, lipid yüklü, beyaz adipositlerin varlığını gösteriyor. - Kesişen BAT toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin. BAT'ı - omuz bıçakları arasındaki derin kırmızı dokuyu - kaldırın ve vücuttan ayırmak için her yerinde dikkatlice kesiler yapın (Şekil 1B). Tutarlılık ve renk olup olmadığını kontrol edin; PBS ile durulayın; 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren diğer tüpe yerleştirin; ve buzda kal.
NOT: P2 farelerinden ve daha büyüklerden BAT toplarken, BAT'ı çevreleyen beyaz yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Cilt ve OMUZ BıÇAKLARI ARASINDA DAHA DERIN OLAN BAT arasında bulunan ince, yumuşak, beyaz bir adiposit tabakasından oluşur. - Tüm depolar toplandıktan sonra, her depoyu (4-6 kez) doğrudan tüplerin içinde küçük makas kullanarak hafifçe kıyın.
- 15 mg/mL'de 10x stok çözeltisi elde etmek için kollajenaz tip I'i uygun 2x izolasyon tampon hacminde yeniden depolar. Her tüpe 50 μL 10x kollajenaz ekleyin, tüm tüplere kollajenaz eklenene kadar tüpleri buzda tutun.
- Karıştırmak için tüpleri hızlı bir şekilde ters çevirin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın. Numuneleri bir çalkalayıcıda 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın (etkili numune karıştırma için 1.400 rpm frekans).
2. Kaplama preadipositleri (gün 1)
- Dokuları sindirdikten sonra tüpleri tekrar buza yerleştirin.
NOT: Bu adımdan itibaren tüm çalışmalar biyogüvenlik kabininde steril koşullarda gerçekleştirilir. - Sindirilen dokuları 100 μm hücre süzgeçlerinden yeni 50 mL tüplere süzün. Yalnızca WT fareleriyle çalışıyorsanız veya genotipler biliniyorsa, ilgili, ayrışmış BAT'leri bir araya getirin; WAT'ler için bunu tekrarlayın. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için, her tüpü 1 mL izolasyon ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) + %20 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM HEPES, %1 penisilin-streptomisin) ile durulayın ve hücre süzgecinden geçirin. Bilinmeyen genotiplerle çalışıyorsanız, 2.4.
NOT: FBS, hem preadiposit çoğalmasının hem de farklılaşmanın önemli bir belirleyicisidir. Lotlar arasında yüksek performans ve tutarlılık sağlamak için farklı FBS'leri titizlikle test edin. - BAT ve WAT süspansiyonlarını, her BAT örneği için 6 kuyulu bir plakanın 2-3 kuyularını ve her WAT örneği için 6 kuyulu bir plakanın 4-6 kuyularını plakalamak için seyreltin. Örneğin, 6 BCT ve 6 WAT bir araya getirilmişse, BAT hücre süspansiyonu 24-36 mL'ye kadar ve WAT hücre süspansiyonu 48-72 mL'ye kadar seyreltilir. Kuyu başına hücre süspansiyonlarının plakası 2 mL.
- Genotipleri bilinmeyen örnekler için her örneği ayrı tutun; 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunun üzerine 100 μm hücre süzgeci yerleştirin ve kuyu başına bir numune filtreleyin. Tüpü 1,5 mL izolasyon ortamı ile durulayın ve süzgeçten geçirerek son hacmi kuyu başına 2 mL'ye kadar yükseltin. Hücre süzgecini atın, kapağı plakaya yerleştirin ve plakayı inkübatöre aktarın.
NOT: Kuyulardaki ortam, yüzen kan hücreleri, hücre kalıntıları ve lislenmiş hücrelerden gelen lipitler nedeniyle bulanık görünmelidir. - Kaplamadan sonra 1-1,5 saat, medyayı aspire edin ve serumsuz 2 mL DMEM ile yıkayın. Kan hücrelerini kuyuların dibinden ayırmak için plakayı hafifçe çalkalayın. 3 yıkamadan sonra, 2 mL taze izolasyon ortamı ekleyin ve hücreleri inkübatöre aktarın (37 °C, % 5 CO2).
NOT: Mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Yüzen malzeme (kan hücreleri, hücresel döküntüler) minimum olmalıdır. Kahverengi preadipositler yarı saydam olmayan küçük hücreler olarak görünürken, beyaz preadipositler daha uzun bir form gösterecektir. Hem kahverengi hem de beyaz preadipositler plakaya sıkıca tutturulmalıdır.
3. Preadiposit kültürünün genişlemesi (2. günden 5. güne)
- Ertesi gün, ortamı aspire edin, hücreleri serumsuz 2 mL DMEM ile yıkayın ve izolasyon ortamının 2 mL'lik kısmını geri ekleyin.
- Hücreler % 80-90 birleştiğinde 3.1 adımını 2 günde bir tekrarlayın.
NOT: Birincil kahverengi preadipositler için% 80-90 izdihama ulaşmak 4-5 gün sürebilir. Birincil beyaz preadipositler için genellikle 2-3 gün sürer. Preadipositler% 60 izdihama ulaştığında, nakavt veya aşırı ifade deneyleri için viral parçacıklarla verimli bir şekilde enfekte olabilirler. Preadipositleri 8 saate kadar uygun bir viral yük ile enfekte edin. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için katyonik polimerlerin kullanımı, genellikle toksisite ve enfekte preadipositlerin adipojenik potansiyelinin önemli ölçüde azalmasıyla sonuç verdiği için önerilmez. - Hücreleri bölmek için, %0,1 w/v jelatin steril bir çözelti kullanarak yeni hedef plakaları kaplayın (damıtılmış suda çözünür; herhangi bir ısı kullanmayın). Kuyunun/yemeğin altını kaplayacak kadar ses seviyesi kullanın. Hücreler tohuma hazır olana kadar (en az 10 dk) 37 °C'de plakaları kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Hücre kültürü plakalarının kaplanması verim veya farklılaşma potansiyelini etkilemez, ancak farklılaşan adipositlerin bakımını ve işlenmesini önemli ölçüde kolaylaştırır. - Hücreler alt birleştiğinde (%85-95) ortamı aspire edin, PBS ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için 3 dakika boyunca tripsin ekleyin. İzolasyon ortamının 2,5x trypsin hacmini ekleyerek tripsin aktivitesini engelleyin. Hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak ve yeni bir tüpe aktarmak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı boru. Kuyuları 1 mL izolasyon ortamı ile yıkayın ve ilk koleksiyona ekleyin.
- Hücreleri 800-1200 g'da 5 dakika santrifüj × ,süpernatantı aspire edin ve izolasyon ortamının 3-5 mL'sinde hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri sayın ve istediğiniz son yoğunluğa seyreltin.
NOT: Örneğin, 50.000-80.000 hücre/mL (sırasıyla 6, 12 ve 24 kuyu plakaları için 2,5, 1 ve 0,5 mL) 72-96 saat içinde tamamen birleştiği kuyulara neden olacaktır. - 3.3. adımda kaplama çözeltisini epire edin ve fazla jelatinleri PBS ile yıkayın. Hücreleri tohumlayın ve plakaları tamamen bir araya gelene kadar inkübatöre geri verin.
4. Beyaz ve kahverengi preadipositlerin farklılaşması (gün 7 - 12)
- Preadipositler birleştiğinde, ortamı aspire edin ve DMEM'de 170 nM insülin, 1 μM deksametazon ve 0,5 mM 3-izobutil-1-metilklasin içeren% 10 FBS'den oluşan farklılaşma ortamı ile değiştirin. BAT preadipositlerini ayırt ediyorsanız, 1 nM triiyodotiron (T3) ekleyin. Adipojenik farklılaşmanın indüklenme gününü farklılaşmanın 0.
NOT: Hem beyaz hem de kahverengi preadipositler izdihama ulaştıktan sonra kendiliğinden farklılaşabilir. Bununla birlikte, adipozit farklılığını en üst düzeye çıkarmak için, yukarıda açıklanan geleneksel pro-adipojenik kokteyl (ayrıca BAT preadipositleri için T3) kullanılmalıdır. - 48 saat (farklılaşmanın 2. günü) sonra, ortamı DMEM'de% 10 FBS ve 170 nM insülinden (ayrıca BAT için 1 nM T3) oluşan bakım ortamı ile yenileyin.
NOT: 2. günde mikroskop altındaki hücrelerde biriken küçük lipit damlacıkları standart parlak alan kullanılarak gözlemlenebilir. - Deneyler için hücreler kullanılana kadar 4.2 adımlarını her 2 günde bir yineleyin.
NOT: Farklılaşmanın 4 veya 5. gününde hücrelerin çoğunluğu lipit yüklü olarak görünecektir. Ölümcül olarak farklılaşan adipositler kültürde daha uzun süre tutulabilir veya bu aşamada deneyler için kullanılabilir.
5. Biyoenergetik deneyler için yeniden kaplama
NOT: Amaç biyoenergetik çalışmalarını 96 kuyu formatında olgun adipositlerde yapmaksa aşağıdaki adımların atılması gerekmektedir. İdeal olarak, tamamen farklılaşmış hücreler (4 veya 5. gün) kullanılmalıdır. Aşağıda açıklanan prosedür 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusundan başlar.
- Tripsin sindirimden önce, 96 kuyu plakaları için kaplama hazırlayın. Her kuyuya 50 μL% 0.1 jelatin ekleyin. Hücreler tohuma hazır olana kadar plakayı bir doku kültürü inkübatörde bırakın.
- 4 veya 5 günlük farklılaşmada, ortamı aspire edin, 1 mL PBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu için) 300 μL ekleyin. Trypsin'in kuyunun altını tamamen kapladığından emin olmak için plakayı hafifçe eğin; oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır. 700 μL bakım ortamı ile tripsin eylemini engelleyin, hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için pipet yukarı ve aşağı ve hücre süspansiyonunu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 1200 × g'da santrifüj edin. Üstnatant çıkarın, peletin 1 mL bakım ortamında yeniden biriktirin ve hücreleri sayın.
NOT: 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusu yaklaşık 1,5-1,8 milyon hücre vermelidir. - Kahverengi adipositler için 60.000 ila 80.000 hücre/mL ve beyaz adipositler için 100.000 ila 120.000 hücre/mL nihai konsantrasyona sahip olacak şekilde hücreleri seyreltin. Jelatin kaplı 96 kuyu plakalarında kuyu başına hücre süspansiyonunun plakası 100 μL.
NOT: 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusu, iki adede kadar 96 kuyu plakası için yeterli hücre sağlar. Biyoenergetik deneyler için, oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlamak ve test sırasında kuyularda oksijen tükenmesini önlemek için düşük yoğunluklu kaplamaya (%30-40 izdiham) ihtiyaç vardır. - Hücrelerin plakanın altına en az 48 saat yapışmasına izin verin. Hücreler plakada 48 saatten fazla tutulursa, 2 gün sonra ortamı yenileyin.
- Tahlil günü, ortamı aspire edin ve tahlil ortamı ile değiştirin. CO 2 kontrollü olmayan bir inkübatörde 37 °C'de1saat kuluçkaya yatırın ve üreticinin talimatlarına göre tahlil işlemi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün Bölüm 1'i, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilen hücrelerin heterojen bir süspansiyonu sağlayacaktır. Sindirilmiş dokuların hücre süzgeci ile filtrelanması (bölüm 2) sindirilmemiş dokuyu uzaklaştıracaktır. Bununla birlikte, bazı hücresel döküntüler, kan hücreleri ve olgun adipozitler geçecektir (Şekil 1C). Kaplamadan sonra nazik yıkamalar 1 saat, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili olmayan hücreleri uzaklaştırır (Şekil 1C). Bölüm 3'te, adiposit öncülleri deneysel plan için gerekli hücre sayısını elde etmek için genişletilir. Yenidoğan yavrulardan izole edilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositler yüksek proliferatif kapasiteye sahip olsa da, beyaz preadipositlerin verimi genellikle depo başına kahverengi preadipositlerin iki katıdır(Şekil 2A). Bu nedenle, senkronize kültürler isteniyorsa, beyaz preadipositlerin başlangıç yoğunluğu buna göre hesaplanmalıdır. Bölüm 4, tamamen olgun adipositler elde etmek için yönergeler sunar.
Farklılaşmanın sonunda, hücreler sırasıyla lipit damlacıkları ve ekspres klasik beyaz ve kahverengi adiposit belirteçleri ile dolu görünecektir (Şekil 2B,C). Bölüm 5'te açıklandığı gibi biyoenergetik çalışmalar için hem beyaz hem de kahverengi adipositler kullanılabilir. Bazal koşullar altında primer beyaz ve kahverengi adipositlerin mitokondriyal stres testinde ve ayrıca mitokondriyal fonksiyonun bilinen uyarıcılarına (örneğin norepinefrin) yanıt olarak oksijen tüketiminin karşılaştırmalı analizi Şekil 2D'degösterilmiştir. İzolasyon üzerine, doğrudan biyoenergetik deneyler için kullanılacak plakalardaki birincil beyaz ve kahverengi adipositleri ayırt etmek de mümkündür19. Bu durumda, preadipositler izole edilir ve bölüm 1 ve 2'de açıklandığı gibi kaplanır. Hücreler birleştiğinde, terminal farklılaşmasına ulaşana ve biyoenergetik analize hazır olana kadar bölüm 4'te açıklandığı gibi farklılaşmaya teşvik edilirler. Bu prosedür 24 kuyulu plaka formatı için yaygındır, ancak 96 kuyu plakaları için daha azdır.
Şekil 1: Yağ pedlerinin toplanması ve işlenmesi. (A) Birincil beyaz (üst) ve kahverengi (alt) adiposit izolasyonunun şematik gösterimi. (B) Deri altı beyaz (üst) ve kahverengi (alt) yağ depoları. P0 farelerinde, deri altı WAT neredeyse görünmezdir, ancak doğumdan sonra ~2. Buna karşılık BAT, P0'da bile belirgin bir koyu renge sahiptir. Yaşlı yavrularda BAT, doku parçalandığında çıkarılmasını gerektiren ince bir yüzeysel WAT tabakası ile çevrilidir. (C) 100 μm hücre süzgecinden filtrasyondan sonra, ilk yıkamalardan sonra ve izolasyondan sonra 24 saat birincil beyaz ve kahverengi öncü hücrelerin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: WAT = beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Adiposit atalarının farklılaşması. (A) Yenidoğan (P0) yavrusu başına elde edilen ortalama deri altı WAT ve BAT preadiposit sayısı. (B) Ölümcül farklılaştırılmış beyaz ve kahverengi adipositlerin temsili görüntüleri. Floresan görüntüleme için hücreler sırasıyla nötr lipitleri ve çekirdekleri lekelendirmek için Nil Kırmızısı ve Hoechst 33342 ile inkübe edildi. Ölçek çubukları = 100 μm.(C) Klasik adiposit belirteçlerinin, beyaz bej belirteçlerin ve kahverengiye özgü belirteçlerin 6 gün boyunca ayırt edilen birincil beyaz ve kahverengi adipozitlerde gen ekspresyon analizi (n=3). Her gen için BAT ekspresyyhi WAT seviyelerine göredir (1 olarak ayarlanır). (D) Mitokondriyal stres testinde ve norepinefrine yanıt olarak beyaz ve kahverengi adipositlerin OCR'si (n=3). Kahverengi adipositler ayrılmamış solunum ve norepinefrine karşı sağlam bir yanıt gösterirken, beyaz adipositler çok az ayrılmamış solunum gösterir ve adrenerjik stimülasyona önemli bir yanıt vermez. *s<0.05; **s<0.01, iki kuyruklu öğrencinin t-testi ile belirlenir. Kısaltmalar: WAT = beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu; OCR = oksijen tüketim oranı; Oligo = oligomycin; FCCP = karbonil siyanür-4-(trifluoromethoxy)fenilhidrozon; RAA = rotenon, antimycin A; PPARφ = peroksiom proliferatör aktif reseptör gama; Acrp30 = 30 kDa'lık adiposit kompleman ile ilgili protein; Fabp4 = yağ asidi bağlayıcı protein 4; Glut4 = glikoz taşıyıcı 4; Cd36 = farklılaşma kümesi 36; Retn = resistin; Slc27a1 = çözünen taşıyıcı ailesi 27 üye 1; Ear2 = eozinofil ilişkili, ribonülaz A ailesi 2; Pgc1a = PPARφ koaktivatör 1alpha; Prdm16 = pozitif düzenleyici etki alanı I-bağlayıcı faktör 1 (PRDI-BF1) ve retinoblastoma protein etkileşimli çinko parmak geni 1 (RIZ1) 16 içeren homolog etki alanı; Eva1 = epitel V benzeri antijen 1; Cidea = hücre ölümü indükleyen DNA parçalanma faktörü-alfa benzeri efektör A; Ucp1 = ayırma proteini 1; Dio2 = tip 2 deiodinaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yağ dokusu sistemik insülin duyarlılığı ve glikoz homeostaz için kritiktir20. Obeziteye bağlı adiposit disfonksiyonu tip 2 diyabetin başlangıcı ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Bu nedenle, yağ dokusunun temel biyolojisinin ve fizyolojisinin daha iyi anlaşılması metabolik bozukluklar için yeni tedavilerin tasarlanmasını sağlayabilir. Yağ depolarından izole olgun adipositlerin doğrudan fonksiyonel ve transkripsiyonel analizinin tamamlayıcısı olarak21,22, kültürlü birincil adipositlerin yağ dokusu patofizyolojisinin birçok yönünü yeniden özetlediği gösterilmiştir, adipokinlerin salgılanması, pro-enflamatuar uyaranlara yanıt olarak insüline direnç ve termojenik programın indüksiyonudahil 23,24,25. Önceki protokoller adiposit öncüllerinin yetişkin farelerden izolasyonu tanımlamış olsa da11,12, bu protokol hücrelerin yenidoğan yavrularından verimli bir şekilde izole edilmesini sağlayan bir yöntem sağlar. Bu strateji, daha yüksek farklılaşma potansiyeline sahip beyaz ve kahverengi adiposit atalarının önemli ölçüde daha büyük bir popülasyonunu verir, çünkü doğum sonrası yağ depoları yetişkin farelerin yağ depolarına kıyasla hala nispeten farklılaşmamıştır26. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak izole edilen hücreler zaten taahhüt edilir ve olgun hücrelerin belirteçlerini ifade eden ve lipid depolama ve termojenik kapasite de dahil olmak üzere benzersiz fizyolojik özelliklerini sergileyen tamamen işlevsel farklılaştırılmış adipositler verir.
Primer hücreler süresiz in vitro olarak genişletilemez. Ek olarak, birincil preadipositler kültürdeki birkaç pasajdan sonra adipojenik potansiyellerini kaybetmeye başlar. Bunun nedeni, sürekli hücre kültürünün daha az kararlı, daha proliferatif hücrelerin içsel bir zenginleşmesiyle sonuçlanmasıdır. Bu nedenle, bu protokolün bir sınırlaması, preadipositlerin kullanılabileceği zaman penceresidir. Hücrelerin izolasyon zamanından itibaren 7-8 gün içinde farklılaşması için indüklenirse adipojenik potansiyel tamamen korunur. Adiposit progenitörleri özellikle enzymatic sindirime karşı dirençlidir, ancak yine de kollajenaz tedavisini doğru bir şekilde zamanlamak önemlidir. Dokuların aşırı doyması, hücre sağkalımının azalmasına ve hücrelerin plakaya yapışma yeteneğinin azalmasına neden olabilir. Genişleme aşaması boyunca, hem beyaz hem de kahverengi preadipositler güçlü bir şekilde yapışır ve güçlü yıkamaları ve sık medya değişimini tolere edebilir. Bununla birlikte, preadipositlerin ayırt etmek için indüklendiğinde kaplamalı plakaların kullanılması önerilir. Olgun, lipid yüklü adipositler yüzey yapışmasını ve hücre-hücre etkileşimlerini azaltmış, bu da hafifçe ele alınmadığı sürece farklılaşma sırasında kopma eğilimine neden olur. Protokolün en hassas adımı farklılaşmanın indüksiyonudur. FBS, insülin, T3 ve diğer ilaçlar, en yüksek ölçüde farklılaşma elde etmek için test edilmeli ve son konsantrasyonları optimize edilmelidir. Adipogenez'i daha da uyarmak için bir PPARφ agonisti (örneğin rosiglitazone) da eklenebilir.
Farklılaşma koşullarının deneysel ihtiyaçlara uyarlanabileceğini belirtmek önemlidir. Örneğin, beyaz ve/veya kahverengi adiposit farklılığını artıran proteinleri/bileşikleri tanımlamak için tasarlanmış genetik veya kimyasal kütüphanelere sahip ekranlarda, preadipositler DMEM'de% 10 FBS ve sadece 170 nM insülin içeren minimum izin verilen bir ortam kullanılarak ayırt etmek için uyarılabilir. Farklılaşma testleri için ideal test pencerelerini belirlemek için farklılaşma kokteylinin her bileşeninin değerlendirilmesi önerilir. T3 ve deksametazon birincil beyaz ve kahverengi adiposit farklılaşması için dağıtılabilir. Bu koşullar kontrol hücrelerinde düşük bir farklılaşma oranı sağlayacak, böylece tahlil penceresini artıracak ve pro-adipojenik faktörleri tespit etme yeteneğini en üst düzeye çıkaracaktır. Birincil kahverengi ve beyaz adipozit kültürleri, kahverengi ve beyaz yağ dokusunun in vivo çalışmasını tamamlamak için genetik manipülasyon ve metabolik streslere yanıt olarak adiposit hücre-otonom fonksiyonunu sorgulamak için güçlü bir araçtır. Bu nedenle, adiposit fonksiyon in vitro tekrarlanabilir, yüksek verimli incelemeler etkinleştirmek için birincil preadipositlerin izolasyonu ve kültürü için protokollere ihtiyaç vardır. Burada açıklanan strateji, tamamen olgun adipositlere ayırt edilebilen ve çeşitli deneysel manipülasyonlar altında test edilebilen birincil beyaz ve kahverengi preadipositlerin incelenmesine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Madrid, İspanya'daki Centro Nacional de Biotecnología'daki Cristina Godio'ya, Scripps Araştırma Enstitüsü'nden Mari Gantner'e, La Jolla'ya ve Baltimore Johns Hopkins Üniversitesi'nden Anastasia Kralli'ye, Kahn ve ark.18'inilk çalışmalarına dayanarak bu protokolün optimize edilmesine yardımcı oldukları için minnettarlar. Bu çalışma NIH tarafından FINANSE EdİlDİ DK114785 ve DK121196 E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
