Summary
ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。
Abstract
神経疾患に関する研究は、主にニューロンが疾患メカニズムに及ぼす影響に焦点を当てています。動物モデルの利用が限られていると、疾患に対する細胞型特有の貢献の研究に深刻な影響を及ぼす。さらに、動物モデルは通常、ヒト患者に見られる突然変異および疾患コースの変動性を反映していない。誘導多能性幹細胞(iPSC)の生成のためのリプログラミング方法は、患者固有の研究に革命をもたらし、疾患メカニズムを研究するための貴重なツールを作成しました。しかし、iPSC技術には、時間、労働コミットメント、クローン選択性、エピジェネティックマーカーの喪失などの欠点があります。これらの方法の最近の変更は、クローナル単離または多能性幹細胞状態をバイパスして、細胞系分線または特定の細胞タイプのより直接的な生成を可能にする。我々は、神経化媒体と組み合わせてレトロウイルスベクターを利用した皮膚線維芽細胞から誘導ニューロン前駆細胞(iNNC)を生成する迅速な直接変換方法を開発した。iNNCは、ニューロン(iN)オリゴデンドロサイト(iO)およびアストロサイト(iA)に分化することができる。iAの生産は、iNPCからの分化が5日しかかからなからず、迅速な薬物および疾患メカニズム検査を容易にする。さらに、iAは作業が容易で、多数の純粋な集団で生成されます。我々は、多数の神経変性疾患および神経変性疾患の潜在的な治療戦略を評価するために、マウスGFP+ニューロンおよび患者由来iAを用いて、再現性の高い共培養アッセイを開発した。重要なことに、iAアッセイは384ウェル形式にスケーラブルであり、1つのプレート内の複数の小分子の評価を容易にします。このアプローチは、多様な遺伝的背景を有する複数の患者細胞株の同時治療的評価を可能にする。iAの生産と保存が容易で、1つのアッセイで複数の化合物をスクリーニングする能力は、この方法論を個別化された医療に適応可能なものにします。
Introduction
潜在的な治療戦略の開発に役立つ神経疾患の基礎となる疾患メカニズムを理解することは重要です。動物モデルは、神経系の疾患を研究するためのゴールドスタンダードであったが、臨床環境への潜在的な治療法の直接翻訳は、多くの場合、限られた成功を示す1、2、3。翻訳の欠如の理由は、マウスの遺伝的背景と突然変異の変動の欠如、疾患の表型の不完全な表示、および近交系マウス株で十分に描かれていないヒト患者における薬物感受性または薬物感受性の変動である。さらに、多くの稀な神経疾患に対して、利用できる動物モデルは全くないか、または少数である。関連するヒト細胞タイプで直接疾患メカニズムを研究することは、研究を促進し、診療所への翻訳を改善する可能性があります。CNS障害の場合、生検が侵襲的であるか、疾患の終末期にのみ死後に取り戻すことができるため、原発性ヒト細胞を取り出し、非常に限られた源を表すのが困難である。過去15年間で、細胞リプログラミング技術の開発は、ヒトの神経学的および神経変性疾患を体型化する能力を急速に拡大してきました。
従来の細胞リプログラミング法では、線維芽細胞または他の細胞型を、3つの全ての胚芽層4から細胞型に分化することができる誘導多能性幹細胞(iPSC)への再プログラミングが含まれる。高橋と山中は、4つの幹細胞転写因子の再発現が体細胞をiPSC5にリダイレクトするのに十分であることを示した最初の人であった。iPSCは、さらに特定の細胞タイプに分けることができます。しかし、このプロセスの欠点は、安定した幹細胞クローンを生成および分離するのに労力がかかり、時間がかかることです。体細胞変異または母細胞の特定の異常は、幹細胞クローンにも維持され、研究結果に影響を与える可能性がある6.さらに、幹細胞へのリプログラミングプロセスは、細胞疾患のメカニズム4、7、8に影響を与える可能性のある貴重なエピジェネティックな変化を消去することを示唆しています。近年、研究者は、多能性幹細胞状態9、10、11、12をバイパスしながら、異なる細胞型のより直接的な生成を可能にする改変リプログラミング方法に焦点を当てた(13,14でレビュー)。初期のブレークスルーは、心筋細胞15に対する線維芽細胞のインビナトリアル・リプログラミングにおいて明らかにされ、ニューロン16および肝細胞17は、複数の系統特異的転写因子またはマイクロRNA18の異所性発現によって明らかにされた。これに続いて、神経疾患19,20をモデル化するために細胞を直接再プログラムする研究が行われた。前述のように、このような直接リプログラミングまたは変換プロトコルは、速度やクローン分離ステップの切り消しを含む古典的なiPSCプロトコルよりも潜在的な利点を有する。さらに、証拠は、これらのプロトコルが患者の年齢に関連するエピジェネティックな情報の多くを維持することを可能にすることを示唆し、おそらく同じことが病気関連マーカー7、8に当てはまる。
現在までに、神経疾患に関するほとんどのインビトロ研究は、主にニューロンに焦点を当ててきました。しかし、アストロサイトなどの他の細胞型は、よく知られています。 ミクログリアおよびオリゴデンドロサイトは、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、多発性硬化症(MS)、および他の神経疾患、ラット症候群(RTT)、睡眠障害、中毒、睡眠障害、中毒、アルツハイマー病などの神経変性疾患の進行に重要な役割を果たす てんかん、リソソーム貯蔵障害、うつ病、片頭痛および病理学的疼痛21、22、23、24、25、26。アストロサイトは中枢神経系(CNS)において最も豊富な細胞型であり、最近まで病理学的観点から広く無視されてきた。彼らは現在、健康なCNSのほぼすべての恒常性機能をサポートする上で重要な役割を果たすることが知られています。さらに、それらは重要な病理学的影響を有し、疾患メカニズムを理解し、治療戦略を評価する上で非常に価値があることが明らかである19。
現在の説明では、山中リプログラミング因子(Klf4、Oct3/4、Sox2およびc-Myc)とその後の神経化培地への暴露を発現するレトロウイルスベクターを用いて、ヒト患者線維芽細胞を誘導ニューロン前駆細胞(iNPC)に直接変換するためのプロトコルを詳述する。これまでの研究では、神経細胞への直接リプログラミングのための転写因子の異なる組み合わせを使用してきましたが(14でレビュー)が、記載されたプロトコルで使用される要因は、ウイルスベクターの家の生産におけるプラスミドとして広く利用可能であるか、またはウイルスリプログラミングキットを行う準備ができている市販品として利用可能です。得られたiNPCは、さらに誘発ニューロン(iN)27、オリゴデンドロサイト(iOs)24およびアストロサイト(iAS)19に分化して、神経疾患におけるその役割を研究することができる。我々のプロトコルは、人間のアストロサイト28の導出に利用されるほとんどの利用可能なプロトコルを使用するiPSCの時間のかかる生成を伴わない。直接再プログラムされたiNPCの約98%〜100%は、線維芽細胞からアストロサイト30への直接変換法を用いた2%と比較して、GFAP陽性アストロサイト29に分化することができる。最近、我々の説明されたリプログラミング法を用いた比較トランスクリプト法の研究は、ドナー線維芽細胞から再プログラムされたiNPCが、死後のアストロサイトおよび第一次アストロサイト29と一致した年齢と同様の転写および機能的レベルで老化特徴を保持できることを示している。このように、この変換プロトコルは、疾患のメカニズムを調査し、年齢関連神経変性疾患および神経疾患に対する新しい治療アプローチを評価するための強力なツールである。
ここでは、大規模な小分子スクリーニングアッセイに最も適したiNCCの生成とiAへのさらなる分化に利用されるプロトコルについて説明する。iAによる疾患メカニズムと薬物検査は、ニューロンとの共培養や代謝および生化学的分析などの異なる方法論を使用して行うことができます。このシステムの利点は、iPSCと比較したこれらの細胞株の速度とメンテナンスの容易さです。さらに、iNPCは、長期間にわたって一定の条件下で薬物検査を容易にするiAs分化のために小さな部分で凍結することができる。全体的に、より大きなサンプル数の比較は、より大きく、より代表的な患者集団における化合物の治療可能性を評価するための扉を開くこの方法で可能になる。
Protocol
| メディア | 試薬 | 混入する金額 | 最終濃度(%) |
| 線維芽細胞培地 | DMEM, 高グルコース, グルタマックス | 500 mL | 89 |
| 胎児牛血清 | 50 mL | 10 | |
| 抗生物質抗抗薬 | 5 mL | 1 | |
| ベースメディア | DMEM/F12 + グルタマックス | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 抗生物質抗抗薬 | 5 mL | 1 | |
| 変換メディア | ベースメディア | 50 mL | 99.9 |
| FGF | 1 μL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| EGF | 1 μL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| ヘパリン | 50 μL | 0.1 (5 μg/mL) | |
| 神経前駆細胞(NPC)培地 | DMEM/F12 + グルタマックス | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 抗生物質抗抗薬 | 5 mL | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| アストロサイトメディア | DMEM, 高グルコース, グルタマックス | 500 mL | 89 |
| 胎児牛血清 | 50 mL | 10 | |
| 抗生物質抗抗薬 | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| すべてのコンポーネントを混合した後、メディアをフィルタリングする必要があります。変換メディア(因子付き)は毎週新鮮に準備する必要があります。 | |||
表 1.プロトコルに含まれるすべてのセルタイプのメディアレシピ。 メディアは、大きなボリュームまたはシリンジと0.2 umシリンジフィルターのための滅菌真空ろ過システムのいずれかですべてのコンポーネントを混合した後にフィルタリングする必要があります。変換メディア(因子付き)は毎週新鮮に準備する必要があります。
1. ヒト線維芽細胞の神経前駆細胞への直接変換
注: このプロトコルの概略タイムラインは、Meyer (2014)19で確認できます。
- 細胞バンクまたは皮膚生検31から得ることができる原発性ヒト皮膚線維芽細胞を使用する。培養細胞を5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cで培養した。少なくとも1〜2個の通路用の通路細胞は、実験で使用する前に解凍後に行う。細胞の準備ができたら、6ウェルプレートのウェルにヒトフィブロネクチン(PBSで1:200希釈)を室温で15〜20分間コーティングします。
- 細胞がメッキする準備ができたら、フィブロネクチンを皿から取り出し、すぐに細胞溶液または2mLの線維芽細胞培地を添加する(表1)-培地を添加する前に皿を乾燥させないでください。細胞の成長の速さに応じて、プレート150,000(急速に成長)-ヒトフィブロネクチンコーティング6ウェルプレートの2つの井戸内の200,000(成長の遅い)線維芽細胞。
注:細胞は、ウイルス伝達のために約70%コンフルエントにして、トランスダクション後数日間同じプレートに保管できるようにする必要があります。変換のための次の日に選択肢を持つために、2つの異なる密度でシードすることが有益である可能性があります。 - 播種の翌日、顕微鏡下で線維芽細胞を確認し、細胞密度(70~85%)を検証する。そして最適な結果のために井戸全体に播種。
- 4つのレトロウイルスベクター(Oct3/4、Klf4、Sox2およびc-Myc)すべてを備えた1井戸を1つ変換 - 急速に成長する場合は10、遅く成長する線維芽細胞には15の感染の多重度(MOI)を使用します(トランスダクション効率は各ベクターの70%以上の陽性細胞を超えるはずです)。ウイルス混合に通常の線維芽細胞培地を1ウェルあたり1 mLの総体積に加え、5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。第二の井戸を未処理のままにし、細胞を組織培養器に戻します。
注:レトロウイルスベクターは、ベンダーによって購入したり、社内で作ることができ、プロトコルはオンライン32で利用可能です。 - トランスダクションの翌日、PBSで細胞1xを洗浄し、新鮮な線維芽細胞培地を1mL加える。
- 翌日、メディアを変換媒体に変更します。細胞1xをPBSで洗浄して残留線維芽細胞培地を取り除き、次いで1mLの変換培地を添加した。未処理のメディアを変換メディアにも変更してください。
注:いくつかの形態学的変化は、レトロウイルスベクター治療を受けていない線維芽細胞上の媒体を変更することによっても観察することができ、したがって、ウイルスベクターの効果を決定する際に、未処理の(任意)を有することが有用である。細胞は、変換培地に切り替えた2〜4日後に形態の変化を開始する必要があります。 - 顕微鏡下で細胞を観察し、形態の変化を観察する(図1)。細胞培地は、変換プロセス(変換媒体の1〜2mL、 表1)を通して毎日交換し、その後のiNPC培養のために交換する必要があります。培地の残りの30%で細胞が覆われたままであることを確認しながら、ウェルから慎重に培地の70%を除去することによって培地を変更します。
注: 成長要因のあるメディアは、準備から 1 週間以内に消費する必要があります。- 細胞を観察し、毎日メディアを変更し続けます(1〜2 mLの変換メディア)。
- いくつかの細胞株は、構造や緩い神経球のようなボールで成長する緩い上昇した丸い形成を形成し始める(補足図1および19、33)。これらのセルを取り外さないので注意してください。ボールが剥離した場合、6ウェルプレートの新しいフィブロネクチンコーティングでよくコーティングされたフィブロネクチンで回収し、再めっきすることができます。
注: それらが単独で拡張された場合、細胞は最初のプレートに比べて多様性が減少し、明らかに異なる細胞株を表す可能性があります。次の分割で、変換された残りのセルとこれらのセルを結合することをお勧めします。
- 変換培地中で約5〜6日後(困難な細胞株の場合は最大12日)、または細胞が非常に密になったとき、それらを1:2または最大1:3に通過させる。
注: 変換プロセス全体を通してセルを高密度に保つことが非常に重要です。
2. 変換および iNPC 分割手順
- セル剥離液(例えば、アキュターゼ)を温め、フィブロネクチン(PBSでは1:200、コーティング量1mL)で6ウェルの適切な数のウェルを室温で15〜20分間コーティングします。フィブロネクチンコーティングはマイナスの影響を受けることなく長くすることができますが、コーティング時間を短くしないように注意する必要があります。
- 細胞を取り外すことなくPBSで細胞を注意深く洗います(ウェルの壁を使用して細胞にPBSを優しく塗布してください)。慎重にピペットまたは吸引によってPBSを除去します。
- 0.5 mLの細胞剥離液を加え、組織培養インキュベーターで37°Cで2〜3分間インキュベートします。顕微鏡で確認し、ほとんどの細胞が剥離していることを確認します。すべてのセルが外れた場合は、2 mLの新鮮な変換培地を加え、2~3回ピペットを軽く上下に加え、束を解離します(必要に応じて)。
- 15 mLチューブに細胞を集め、さらに3 mLの培地を添加して、細胞剥離液をさらに希釈します。すべての細胞が収集されていることを確認するために、最初に余分な媒体で井戸を洗います。
- 室温で200×gで4分間の遠心分離機。
メモ: セルまたは iNPC の変換は、メディア内にセルデタッチ ソリューションが存在する場合に非常に敏感です。上清の遠心分離と離脱によって残留酵素を除去することが絶対に必要です。 - 細胞ペレットから上清を除去し、新鮮な培地の1 mLで細胞を再懸濁します。ピペットを2~3回上下に軽くして、細胞の塊を解決します。コーティングされた6-ウェルからフィブロネクチンを取り除き、すぐに各ウェルに新鮮な培地の1 mLを加えます(フィブロネクチンを乾燥させないでください)。分割比が1:2の場合、1つのウェルに0.5mLのセル懸濁液を加え、もう1つのウェルにもう1つの0.5mLを加えます。
- 培養培養器中の培養細胞を37°Cで培養する。
- 6ウェルを北東西方向(円形ではない)で穏やかに振って細胞を分配し、組織培養インキュベーターに入れます。
- 翌日顕微鏡下の細胞を観察し、培地(1~2mL)を交換します。セルを再び分割する準備が整うまで、メディアを毎日変更します。
注:この時点で、細胞増殖が加速し始め、細胞は2〜3日以内に2回目の分割の準備ができているはずです(非常に遅い成長ラインの場合は4日)。- この新しい分割では、変換メディア内の細胞の1ウェルをシードし、EGF/ヘパリンなしで増加した濃度でFGFのみを含むNPC培地に他のウェルをシードする(表1)。
注: 一部のセルラインは、約 10 日後に変換メディアで停滞状態に達し、NPC メディアに切り替えると、細胞の成長に役立つ場合があります。さらに、NPCは、NPCメディア19で成長すると、より具体的で、より小さい形状を有する。この時点で、iNPC は差別化とさらなる使用の準備ができています。
- この新しい分割では、変換メディア内の細胞の1ウェルをシードし、EGF/ヘパリンなしで増加した濃度でFGFのみを含むNPC培地に他のウェルをシードする(表1)。
- 毎日iNPCのメディア(1〜2 mL)を変更し続けます。
- 6ウェルの2つまたは3つのコンフルエントウェルを組み合わせることで、NPCを10cmの皿に拡大します。10 cmの皿のための媒体容積は12-15 mLである。
- 次の分割では、これらのセルをさらに3つまたは4つの10 cm皿(12〜15 mLのメディア)に拡大し、何世代にも及ぶ多数のセルストックを使用します。10cmの皿は、通常、増殖速度に応じて3〜4日ごとに1:3または1:4に分割されます。
3. NPCからの誘導アストロサイトの生成
- 新鮮なiNPCからアストロサイトを作るために、シードiNPC(10cmフィブロネクチン被覆プレート)を10mLアストロサイト培地(表1)に直接入れ、翌日10%程度の合流度になるようにします。培養細胞を5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cで培養した。
注:推奨されるシード密度は、通常、10 cmのNPCの皿の細胞再懸濁液の50 μLであり、分割比に基づいて最終体積に希釈される場合(例えば、1:3分割の場合は3 mL、1:4分割の場合は4 mLなど)です。 - めっきの3日後にiAsの培地(10mLアストロサイト培地)を変更する。細胞を5-7日間分化してください。
注:iAは複数の通路をうまく許容しないため、NPCを分割するたびに新鮮なアストロサイトを作る方が良いです。 - 実験のためにシードするには、ステップ2.1-2.7で説明されているようにトリプシンまたは細胞剥離溶液を使用してアストロサイトを分割します。推奨されるシード密度は 、表 2に示しています。
| プレートタイプ | アストロサイト・パー・ウェル |
| 384ウェル | 2500 |
| 96-ウェル | 10000 |
| 24-ウェル | 40000 |
| 6-ウェル | 150000 |
表 2.プレート面積あたりのiAsの推奨シード密度。 最も一般的な組織培養プレート上に単層を生成するために播種されたiAsの典型的な数。
4. 凍結NPC在庫からのアストロサイト分化のための部分の準備と解凍(ステップ3の代替)
注:培養中のiNPCを維持する代わりに、アストロサイトは冷凍ストックから直接製造することもできます。これを行うために、iNPCは小さな部分で凍結されます。 表3 は、10mLのアストロサイト培地を含む10cm皿に解凍する部分の体積を凍結および解凍することを示唆している。
| 部分サイズ | セル懸濁液(μL) | メディアの凍結(μL) | 総容量(μL) | デフロストイン |
| 4x | 400 | 400 | 800 | 10cmの皿2つ |
| 2x | 200 | 200 | 400 | 10cm皿1個 |
表 3.iNPC を分割して iA を生成する方法について説明します。 iNPC懸濁液および凍結培地の割合は、部分を生成する。なお、細胞懸濁液を凍結培地と混合した場合、最終的なDMSO濃度は10%となる。
- 凍結したiNPCストックからアストロサイトを作るためには、液体窒素貯蔵タンクから部分のストックバイアルを取り除き、37°Cで素早く解凍します。 細胞が解凍されるとすぐに、ピペット細胞溶液は5mLアストロサイト培地を含む15 mLチューブ内に含まれる。
- 200xgと室温で4分間の遠心分離機。上清を取り除き、新鮮なアストロサイト培地の1mLで再中断します。
- フィブロネクチンコーティング10cm皿に9mLの新鮮なアストロサイト培地を加え、1mLの細胞溶液を加えます。北東西の動きで細胞を穏やかに分配する。培養細胞を5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cで培養した。
Representative Results
このプロトコルは、山中因子を含むレトロウイルスを用いて、ヒト皮膚線維芽細胞から直接iNPCを迅速かつ容易に生成することを可能にする。この方法は、幹細胞状態とクローン選択の必要性をバイパスし、それによってクローンの変動を回避することを可能にする。細胞が変換プロセスを受けている間に留意する重要なステップは、線維芽細胞の播種密度、培地pH、および細胞を最適な合流度に保つことです。変換プロセス中の最適な分割合流と形態変化の例を 図1に示します。
図 1.山中因子のレトロウイルス混合を添加した後の変換プロセスの代表的な画像。 線維芽細胞を播種し、24時間後に山中因子で導入した。ウイルス(DPV)後2日間、メディアを変換メディアに変更した。細胞は、通過する準備が整うまで変換培地で培養した(13DPV)。細胞を、翌日の80%合流に達するために通過後に播種した(14DPV)。その後の通路は、ニューロン前駆細胞が急速に分裂し始めるまで、この密度を維持した。スケールバーは200 μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
変換プロセスが完了すると、NPCは線維芽細胞マーカーおよび形態の発現を強く低下させたり発現しなかったり、NPC特異的な細胞マーカーを発現させたりする(図2)。さらに、iN、iO、iA など、さまざまな細胞株を生成するためにも使用できます。
図 2.変換プロセスを経たセルは、セル固有のマーカーを表します。 患者線維芽細胞(A)は、ニューロン前駆細胞(iNPC(B)を誘導し、誘導アストロサイト(iAs(C)細胞を24ウェル組織培養処理プレートにおいてガラスカバーリップに播種した。細胞は、線維芽細胞特異的細胞マーカー(A)、ビメンチン(緑色)およびTE7(赤色)、iNPC特異的細胞マーカー(B)、ネスチン(赤)、およびiAs細胞マーカー(C)GFAP(紫色)およびiNPCマーカー(緑色)について免疫染色した。スケールバーは50μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
私たちの経験では、特にiAは純粋な集団(98%以上のGFAP陽性細胞29)で再現可能な多数で生成できるため、薬物および疾患メカニズム検査にとって非常に価値があります。iAは、分裂中に細胞の小さなアリコートを取るか、または以前に凍結したiNPC部分を取り、アストロサイト培地で直接めっきすることによってiNPCから分化することができる。このプロセスにおける重要な考慮事項は、iNpPc初期シード密度を低く保ち(図3 および 図4)、高密度が分化プロセスを妨げる(図4)、酸性化が健康なアストロサイトを活性化する可能性があるため、培地pHにさらなる注意を払うことが示されている。
図 3.iNPC からの iA 生成プロセスの代表的なイメージ。 iNPCは、低い播種密度でアストロサイト培地(表1)に播種される。良好なシード密度は、最初の日のポストシード(DPS)で約10%です(左)。しかし、この密度は細胞の増殖速度に応じて調整することができます。典型的なiAs形態は5 DPS(中央)後に観察することができる。場合によっては、異常なアストロサイト形態が観察され、長くスパイキーな拡張が見られます。この変化は、アストロサイトの活性化を示すものであり、疾患状態または誤った培養技術に二次的であり得る(右)。スケールバーは200 μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.iNPCの播種密度はiAsの分化効率に影響を与える。 対照iNPCラインは、アストロサイト培地において低(A)および高(B)密度で播種し、播種密度が分化に及ぼす影響を示した。5 DPSは、低密度線がアストロサイト特異的マーカーを表し、一方高密度線は、印が付いたiNPC様形態を有するiNPCおよびiAsマーカーの混合物を示す。スケールバーは50μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1.山中因子のレトロウイルス混合を添加した後の変換プロセスの追加図。 12DPV(通過の1日前)および19DPV(通過後6日)における変換プロセスの画像。なお、通過前後の細胞間の形態の違いは、12DPV細胞ではボール状の構造形態を有する。一節後、変換媒体(表1)細胞上で数日経過した後、細胞はNPC様形態を表示し始める。スケールバーは200 μmです。このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
Discussion
要約すると、直接変換は、患者の皮膚線維芽細胞から誘発されたニューロン前駆細胞を生成する迅速かつ容易な方法である。この方法は、その速度だけでなく、維持しやすい多数の細胞が生成されるために有利です。さらに、証拠の増加は、直接的なリプログラミング方法が古典的なiPSCリプログラミング技術と比較してより少ないエピジェネティックなマークを除去することを示唆している。iNPCのアストロサイトへの分化は、複数の独立した実験室19、29、33の間でも非常に簡単で再現性が高い。iNPCは小さな部分で凍結し、分化の目的のために直接解凍することができ、通過数を同様に保つことができるので、実験間の変動を減らすのに役立ちます。アストロサイトは、多くの神経疾患における疾患進行において重要な役割を果たすため、興味深い細胞タイプです。アストロサイトは、機械研究、代謝研究または薬物検査アッセイに使用することができ、通常は単層として栽培される。さらに、アストロサイトは、マウスまたはヒトニューロンとの共培養系で組み合わせて、アストロサイトが神経細胞の生存および形態に及ぼす影響を評価することができ、いずれも薬物検査34の良い読み出しである。
このプロトコルを正常に使用するには、いくつかの点と潜在的な制限を念頭に置く必要があります。例えばヒト皮膚線維芽細胞は、細胞分裂率ならびにウイルスベクターへの応答において大きく異なる。これらは標準化された細胞株ではないため、人類そのものと同じくらい可変的であり、各線は異なります。多くのリプログラミング方法に関しては、細胞分裂率が中程度から速い線維芽細胞と、ほとんど複製されていない細胞を再プログラムする方が簡単です。複製速度は、皮膚生検の品質および処理自体、ならびに繊維芽細胞の通過数および取り扱いによって影響を受ける可能性がある。原発性皮膚線維芽細胞を扱う場合、老化の誘発を避けるために細胞が密になりすぎないようにすることが重要です。線維芽細胞がうまく成長しない場合は、新しいストックまたはより低い通路を試してみるのが最善ですが、場合によっては病気自体も役割を果たす可能性があります。細胞分裂は、標準10%に比べて繊維芽細胞媒体中で15%または20%FBSを用いることで改善できる場合がある。
リプログラミングウイルスベクターの品質は、成功のために非常に重要です。私たちの手では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたは他の非統合ウイルスと比較してより効率的でした。しかし、これはウイルスベクターの品質と純度に依存する可能性があります。市販のレトロウイルスベクターキットは、通常、ウイルスベクター濃度を指定し、しばしば特定の細胞株に対する感染の多重度を指定する。一次線維芽細胞は、ウイルスベクターの取り込みを決定するために企業が使用する細胞株とは異なることを覚えておいてください。さらに、同じ市販キットを注文する場合でも、バッチ間の変動が一般的である。さらに、ウイルスベクターの取り込みは、線維芽細胞株間でも変化する。一部の行はより敏感であり、したがって、トランスデュースされた細胞は死ぬ可能性がありますが、他の細胞株はウイルス摂取に対してより耐性がある可能性があります。したがって、特定の細胞株のトランスダクション効率を決定することは、特に細胞株がゆっくりと成長しているか、または以前の変換が失敗した場合に重要です。我々の手では、変換に必要な特定のレトロウイルスベクターの量を評価する最良の方法は、ウイルスベクターのいくつかの希釈で免疫蛍光染色を行うことである。その後、トランスジーンを発現する細胞数をベクターごとにカウントし、70%以上の導入効率を目指す。我々の経験では、ほとんどの細胞株に類似したMOIを使用することができますが、MOIは必要に応じて調整することができます。
変換プロセス中に、セルを早く分割しないことが重要です。細胞が分割される準備ができるまでの時間は、一次細胞株とその特性、使用されるウイルスベクターの品質および媒体の品質を含む複数の要因に依存する。重要なのは、細胞が高密度に保たれている場合、変換の成功率ははるかに高くなります。細胞が形態を変え始めたとしても、細胞を早期に分割するよりも長く最初の細胞に残す方が良いです。分割が早すぎると、変換が進行しにくくなり、細胞が線維芽細胞のような形と行動に戻って分化する可能性があります。さらに、それらをあまりにも早く希釈すると、以前に観察されたNPCの小さくてコンパクトな細胞体と比較して、より細長い細胞体をもたらす可能性があります。したがって、最初の分割は常に保守的でなければなりません。細胞を希釈し過ぎるのに比べて、1:1または1:2分割で細胞を密に保つ方が良いです。最初の分割後に細胞死が予想される。注意してください、細胞は常に正常である分割後の最初の日に悪い(お世辞)見えます。細胞の形状に関する最良の判断は、2〜3日後に行われるべきです。重要なのは、成長要因とメディアコンポーネントの品質も重要です。十分に準備されたメディアが最大5〜7日間しか使用されないように、成長因子を含む少量のメディアを準備することが重要です。メディアを室温または37°Cで長期間保管しないでください。メディアの変更が行われるとすぐに、迅速に使用し、冷蔵します。さらに、2 mLではなく1 mLでメディアの量を少なく保つことは、特に変換に対してより耐性のある細胞株に役立ちます。細胞が急速にメディアを消費する場合、赤から黄色へのメディアの色の変化(酸性化速度)によって観察され得る、2 mLまでメディアの体積を調節する。急速なメディア消費は肯定的な兆候であり、多くの場合、増加した増殖と一緒に変換の後期段階で観察されます。
NPCはまた、メディアにおけるアキュクターゼの存在に非常に敏感であり、アキュベート潜伏時間を短くしておくことは非常に重要である。2~4分の潜伏期間を推奨し、顕微鏡下で頻繁に細胞をチェックし、細胞が剥離した時期を確認します。分裂後に細胞を遠心分離して、培地から酵素ミックスを除去することが不可欠である。また、細胞株は拡張培養時に変化し、発現プロファイルの変化につながる可能性がありますので、通過数を念頭に置いておくことも重要です。したがって、初期の通路で多くのセルストックを凍結することが重要です。細胞は10%DMSOおよび90%NPC媒体で凍結し、液体窒素中に長期保存されるべきである。この培地の血清の不足のために凍結チャンバーを使用してゆっくりと凍結し、一晩凍結したら、すぐに液体窒素に移す必要があります。このプロトコルではクローン選択は行われないが、培養および通過の延長が、良好な増殖および生存率を有する初期細胞集団の自然選択につながる可能性がある。そのため、実験を行う際には、通過数や取り扱いを念頭に置いておく必要があります。私たちは実験のために低い通路を使用することを好む、可能であれば、我々は20回以上細胞株を通過を超えない。NPCは急速に成長するため、実験のために、より低い通路で大量の在庫を凍結することができます。特に高い増殖速度を有する細胞株は、培地酸性化のリスクが高い。したがって、細胞株が異なる速度で成長するにつれて、拡散に基づいてメディアの量を調整する必要があります。細胞が高酸性培地中に連続的に残っている場合、対照および疾患細胞株の両方の健康に影響を与える可能性がある。これは、健康なアストロサイトでさえ反応し、さらなる分化および実験におけるその使用に影響を与える。
アストロサイト分化の場合、高密度は細胞の分化を防ぎ、より高い速度で増殖し続けるので、細胞を低密度に保つことが重要です。したがって、播種密度は、それらの増殖速度に依存する各細胞株に対して調整する必要があります。異なる播種密度を試し、適切な分化を確実にするためにアストロサイトマーカーで染色/RT-PCRを行うことをお勧めします。IAの品質は、ニューロンとの共培養アッセイを使用して健康的なコントロールと一緒に評価することができます。疾患病理が反応性表現型につながらない場合、ニューロンは数日間iAと接触して生存可能であり続けるべきである。アストロサイトの形態は、個々の細胞株間で大きく異なる可能性があり、同様に疾患表現型の影響を受ける可能性があります。さらに、アストロサイトが大きな影響を受ける疾患では、大きく細長い延長を有する反応性表現型を示す可能性がある。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、研究に重要なサンプルを寄付してくれたすべての患者と健康なボランティアに感謝します。さらに、ロシェル・ロドリゴの組織培養に関する継続的な専門家の技術支援と、共同研究者として彼女の研究室で技術を独自に確認してくれたローラ・フェライウオロに感謝します。この研究は、米国国立衛生補助金研究所R01 NS644912-4およびRC2 NS69476-01(A.L.S.)およびパッカードALS研究助成金P2ALSとヘルプリンク財団から資金を受け取りました。また.M、スイス国立科学財団から資金を受け取り、筋ジストロフィー協会、レット症候群研究信託、SCN2A財団の家族から若手研究者育成賞を受賞しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
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