Summary
우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.
Abstract
신경 장애에 대 한 연구는 주로 질병 메커니즘에 신경의 영향에 초점을 맞추고. 동물 모델의 제한된 가용성은 질병에 대한 세포 유형특정 기여도에 대한 연구에 심각한 영향을 미칩니다. 더욱이, 동물 모형은 일반적으로 인간적인 환자에서 보인 돌연변이 및 질병 과정에 있는 가변성을 반영하지 않습니다. 유도 된 다능성 줄기 세포의 생성을위한 재프로그래밍 방법 (iPSC) 환자 특정 연구에 혁명과 질병 메커니즘을 공부하기위한 귀중한 도구를 만들었습니다. 그러나 iPSC 기술은 시간, 노동 약속, 복제 선택성 및 후성 유전학 적 마커의 손실과 같은 단점이 있습니다. 이러한 방법의 최근 수정은 복제 절연 또는 다능성 줄기 세포 상태를 우회하여 세포 계보 또는 특정 세포 유형의 보다 직접적인 생성을 허용합니다. 우리는 신경질화 매체와 결합하여 레트로 바이러스 벡터를 이용한 피부 섬유아세포로부터 유도된 신경 전구 세포(iNPC)를 생성하는 신속한 직접 변환 방법을 개발했습니다. iNPC는 뉴런(iN) 올리고드엔드로키테(iOs) 및 성상세포(iA)로 분화될 수 있다. iA 생산은 iNPC로부터의 분화로 5일밖에 걸리지 않으며 신속한 약물 및 질병 메커니즘 테스트를 용이하게 합니다. 또한 iA는 작업하기 쉽고 순수 인구에서 대량으로 생성됩니다. 우리는 수많은 신경 및 신경 퇴행성 질환에 대한 잠재적 인 치료 전략을 평가하기 위해 마우스 GFP + 뉴런 및 환자 파생 iA를 사용하여 매우 재현 가능한 동배 분석서를 개발했습니다. 중요한 것은, iA 애법은 한 플레이트에서 다중 소분자의 평가를 용이하게 하는 384웰 형식으로 확장가능하다. 이 접근은 다양한 유전 배경을 가진 다중 참을성 있는 세포주의 동시 치료 평가를 허용합니다. iA의 간편한 생산 및 저장 및 한 분석기로 여러 화합물을 선별할 수 있는 용량은 개인화된 의학에 적응할 수 있는 이 방법론을 렌더링합니다.
Introduction
근본적인 질병 기계장치를 이해하는 것은 잠재적인 치료 전략의 발달에 원조로 신경학상 질병에 중요합니다. 동물 모델은 역사적으로 신경계의 질병을 연구하기위한 금 본위제였지만, 잠재적 인 치료법을 임상 설정으로 직접 번역하는 것은 종종 제한된 성공1,2,3을보여줍니다. 번역의 부족에 대한 이유는 마우스의 유전 배경과 돌연변이의 가변성의 부족, 질병 표현형의 불완전한 표시 및 약물 감도의 변화 또는 근친 마우스 긴장에서 잘 그림되지 않는 인간 환자에서 복용. 또한, 많은 희귀 한 신경 장애에 대 한, 아니 또는 몇 가지 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 관련 인간 세포 모형에서 직접 질병 기계장치를 공부하는 것은 연구를 촉진하고 진료소에 번역을 향상할 수 있었습니다. CNS 무질서를 위해, 1 차적인 인간 세포는 생검이 침략적이거나 질병의 말기에서 사후 회수될 수 있기 때문에 아주 한정된 근원을 회수하고 표현하기 어렵습니다. 지난 15년 동안 세포 재프로그래밍 기술의 개발은 체외에서 인간의 신경 및 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 능력을 급속히 확장했습니다.
세포 재프로그래밍의 전통적인 방법은 3개의 세균층4에서 세포 모형으로 분화할 수 있는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSCs)로 섬유아세포 또는 그밖 세포 모형을 재프로그래밍하는 관련시킵니다. 다카하시와 야마나카는 4개의 줄기세포 전사인의 재발현이 iPSC5가되기 위해 체세포를 리디렉션하기에 충분하다는 것을 최초로 보여주었다. iPSC는 특정 세포 유형으로 더 분화될 수 있습니다. 그러나, 이 과정의 단점은 안정적인 줄기 세포 클론을 생성하고 분리하는 데 노동 집약적이고 시간이 많이 소요된다는 것이다. 모세포의 체세포 돌연변이 또는 특정 수버랜시스는 줄기세포 클론에서 도유지되고 연구6의결과에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 증가하는 증거는 줄기 세포에 대한 재프로그래밍 과정이 세포 질환메커니즘4,7,8에영향을 미칠 수있는 귀중한 후생 유전학 적 변화를 지우는 것을 시사한다. 최근 몇 년 동안, 연구자들은 만능 줄기 세포 상태9,10,11,12 (13,14에서검토됨)를 우회하면서 다른 세포 유형의 보다 직접적인 생성을 허용하는 수정된 재프로그래밍 방법에 초점을 맞췄다. 초기 돌파구는 여러 계보 특이적 전사 인자 또는 microRNAs18의자궁 발현에 의해 카포아세포15,뉴런16 및 간세포17에 섬유아세포의 결합 재프로그래밍에서 밝혀졌다. 이것은 신경 장애19,20을모델링하기 위하여 세포를 직접 재프로그래밍하는 연구 결과에 선행되었습니다. 위에서 언급했듯이, 이러한 직접 리프로그래밍 또는 변환 프로토콜은 클론 격리 단계의 속도 및 절제를 포함한 고전적인 iPSC 프로토콜에 비해 잠재적인 이점이 있습니다. 더욱이, 증거는 이러한 프로토콜이 환자의 나이와 관련된 후성 유전학 정보의 더 큰 양을 유지하는 것을 허용하고 가능성이 동일한 질병 관련마커에대해 사실 보유 제안7,8.
현재까지, 신경 장애에 대 한 대부분의 체 외 연구는 주로 뉴런에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 성상세포와 같은 다른 세포 유형이 잘 알려져 있습니다. 마이크로글리아와 올리고드렌드로키테스는 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병(HD), 다발성 경화증(MS), 그리고 Rett 증후군(RTT 증후군), 재발 증후군(RTT) 증후군과 같은 기타 신경병리학 및 신경퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 합니다. 간질, 리소소피 저장 장애, 우울증, 편두통 및 병리학적 통증21,22,23,24,25,26. 성상세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 풍부한 세포 유형이며 최근까지 병리학적 관점에서 광범위하게 무시되었습니다7. 그(것)들은 지금 건강한 CNS의 거의 모든 근종 기능을 지원하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 추가적으로, 그(것)들이 중요한 병리학적인 충격이 있고 질병 기계장치를 이해하고 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요하다는 것은 명백합니다19.
현재 설명에서, 우리는 야마나카 재프로그래밍 인자 (Klf4, Oct3/4, Sox2 및 c-Myc)를 표현하는 레트로 바이러스 벡터를 사용하여 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간 환자 섬유 아세포의 직접 변환을위한 프로토콜을 자세히 설명하고 신경 화 미디어에 후속 노출. 이전 연구는 신경 세포에 직접 재프로그래밍을 위한 전사 요인의 다른 조합을 사용 했습니다 (에서 검토 14),하지만 설명 된 프로토콜에 사용 되는 요인은 광범위 하 게 바이러스 벡터의 집 생산에 대 한 플라스미드로 사용할 수, 또는 시판 되 고 바이러스 재프로그래밍 키트를 갈 준비가. 결과 iNPc는 유도된 뉴런(iNs)27,올리고원드로키테(iOs)24 및 성상세포(iAS)19로 더욱 분화하여 신경질환에서의 역할을 연구할 수 있다. 우리의 프로토콜은 대부분의 사용 가능한 프로토콜이 인간 성상세포28의파생을 위해 사용하는 시간이 많이 소요되는 iPSC 생성을 포함하지 않습니다. 직접 재프로그래밍된 iNPC의 약 98%~100%는 섬유아세포에서 성상세포30으로직접 변환 방법을 사용하는 2%에 비해 GFAP 양성 성상세포(29)로 분화할 수 있다. 최근에는, 우리의 기술된 재프로그래밍 방법을 이용한 비교 전사 연구는 기증자 섬유아세포로부터 재프로그래밍된 iNPCs가 연령과 일치하는 포스트모템 성상세포 및 1차성상세포(29)와유사한 전사 및 기능적 수준에서 노화 기능을 유지할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 이 변환 프로토콜은 질병 기계장치를 조사하고 나이 관련 신경 퇴행성 및 신경 장애에 대한 새로운 치료 접근을 평가하는 강력한 도구입니다.
여기서 우리는 iNPC를 생성하고 더 큰 규모의 작은 분자 선별 분석에 가장 적합한 iA로 의분화를 생성하는 데 이용된 프로토콜을 설명합니다. iA를 이용한 질병 메커니즘 및 약물 검사는 뉴런이나 대사 및 생화학적 분석을 이용한 공동 배양과 같은 다른 방법론을 사용하여 수행할 수 있다. 이 시스템의 장점은 iPSC에 비해 이러한 세포주의 유지 보수의 속도와 용이성입니다. 더욱이, iNPC는 오랜 기간 동안 일정한 조건에서 약물 검사를 용이하게 하는 iA 분화를 위해 작은 부분으로 동결될 수 있다. 전반적으로, 더 큰 견본 수의 비교는 더 크고 더 대표적인 참을성 있는 인구에 있는 화합물의 치료 잠재력을 평가하기 위하여 문을 여는 이 쪽으로 가능하게 됩니다.
Protocol
| 미디어 | 시약 | 혼합금액 | 최종 농도(%) |
| 섬유아세포 미디어 | DMEM, 높은 포도당, 글루타맥스 | 500 mL | 89 |
| 태아 소 세럼 | 50mL | 10 | |
| 항생제 항진균제 | 5 mL | 1 | |
| 베이스 미디어 | DMEM/F12 + 글루타맥스 | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 항생제 항진균제 | 5 mL | 1 | |
| 변환 미디어 | 베이스 미디어 | 50mL | 99.9 |
| FGF | 1 μL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| EGF | 1 μL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| 덤플링을 | 50 μL | 0.1 (5 μg/mL) | |
| 신경 전구 세포 (NPC) 미디어 | DMEM/F12 + 글루타맥스 | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 항생제 항진균제 | 5 mL | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| 성상세포 미디어 | DMEM, 높은 포도당, 글루타맥스 | 500 mL | 89 |
| 태아 소 세럼 | 50mL | 10 | |
| 항생제 항진균제 | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| 모든 구성 요소를 혼합한 후 미디어를 필터링해야 합니다. 변환 미디어(요인)는 매주 신선하게 준비해야 합니다. | |||
표 1. 프로토콜에 포함된 모든 셀 유형에 대한 미디어 레시피입니다. 미디어는 큰 볼륨 또는 주사기 및 0.2 um 주사기 필터에 대한 멸균 진공 여과 시스템과 모든 구성 요소를 혼합 한 후 필터링해야합니다. 변환 미디어(요인)는 매주 신선하게 준비해야 합니다.
1. 성인 인간 섬유아세포를 신경 전구 세포로 직접 변환
참고: 이 프로토콜의 회로도 타임라인은 Meyer (2014)19에서검토할 수 있습니다.
- 세포 은행또는 피부 생검에서 얻을 수 있는 1 차적인 인간 피부 섬유아세포를 사용하31. 배양 세포37°C에서 5%CO2 조직 배양 배양인. 적어도 1-2 개의 구절에 대한 통로 세포는 실험에서 사용하기 전에 해동을 게시합니다. 세포가 준비되면, 15-20 분 동안 실온에서 인간 섬유 네틴 (1:200 PBS에서 희석)와 6 웰 플레이트의 우물을 코팅합니다.
- 세포가 도금될 준비가 되면, 접시에서 섬유네틴을 제거하고 즉시 세포 용액 또는 섬유아세포 매체의 2mL(표1)를첨가하여- 미디어를 첨가하기 전에 접시가 건조하게 하지 않는다. 세포가 얼마나 빨리 자라는지에 따라, 판 150,000 (빠르게 성장하는) - 200,000 (느린 성장) 인간 섬유 넥틴의 두 우물에서 섬유 아세포 는 각각 6 웰 플레이트를 코팅.
참고: 세포는 바이러스 성 트랜스포이션을 위해 약 70% 컨실수 있어야 트랜스듀션 후 며칠 동안 동일한 접시에 보관할 수 있어야 합니다. 변환을 위해 다음 날 선택을 하기 위해 두 가지 밀도에서 씨앗을 하는 것이 유익할 수 있습니다. - 파종 후 날, 현미경의 밑에 섬유아세포를 확인하고 세포 조밀도를 확인합니다 (70-85% 사이) 심지어 최적의 결과를 위해 우물 전체에 걸쳐 시드.
- 네 개의 레트로바이러스 벡터(Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc)를 모두 잘 트랜스듀- 빠르게 성장하는 것을 위해 10의 감염(MOI) 또는 15의 감염(MOI)을 사용하며, 느린 섬유아세포에 대해 (트랜스듀션 효율은 각 벡터에 대해 70% 이상의 양성 세포를 초과해야 함). 일반 섬유아세포 배지를 웰당 총 1mL의 총 부피에 추가하고 5% CO2 조직 배양 배양 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 두 번째 잘 치료되지 않은 상태로 두고 세포를 조직 배양 인큐베이터로 되돌려 보십시오.
참고 : Retroviral 벡터는 공급 업체에 의해 구입하거나 사내에서 만들 수 있습니다, 프로토콜은 온라인으로 사용할 수 있습니다32. - 트랜스듀션 다음날 PBS로 셀 1x를 세척하고 신선한 섬유아세포 배지 1mL를 추가합니다.
- 다음 날, 중간을 변환 매체로 변경합니다. PBS로 셀 1x를 세척하여 잔류 섬유아세포 배지를 제거한 다음 변환 배지 1mL를 추가합니다. 처리되지 않은 미디어의 미디어를 변환 매체로 변경합니다.
참고: 레트로바이러스 벡터 치료를 받지 않은 섬유아세포상에서 의한 매체를 변경하여일부 형태학적 변화가 관찰될 수 있으므로 바이러스 벡터의 효과를 결정할 때 치료되지 않은 우물(선택 사항)이 도움이 될 것이다. 셀은 변환 매체로 전환한 후 2-4일 후에 형태 변경을 시작해야 합니다. - 현미경의 밑에 세포를 관찰하고 형태학에 있는 변경을 감시합니다(그림 1). 셀 미디어는 변환 프로세스(변환 매체의 1-2mL, 표 1)와후속 iNPC 배양에 대해 매일 교체해야 합니다. 세포가 매체의 나머지 30%에서 덮여 있는지 확인하면서 우물에서 매체의 70%를 신중하게 제거하여 배지를 변경합니다.
참고: 성장 요인이 있는 미디어는 준비 후 1주일 이내에 소비해야 합니다.- 세포를 계속 관찰하고 매일 미디어를 변경합니다(변환 매체의 1-2mL).
- 일부 세포주는 구조 또는 느슨한 뉴런 구체(보충 도 1 및 19, 33)와같은 공에서 자라는 느슨한 둥근 형성을 형성하기 시작합니다. 이 세포를 분리하지 않도록주의하십시오. 공이 분리되면 6웰 플레이트의 잘 코팅된 새로운 섬유네틴으로 채취하고 다시 도금할 수 있습니다.
참고: 그(것)들이 그 자체로 확장되는 경우에, 세포는 초기 판에 비교된 다양성을 감소시키고 명백하게 다른 세포주를 나타낼 수 있습니다. 다음 분할 라운드에서 변환된 셀의 나머지 부분과 이러한 세포를 결합하는 것이 좋습니다.
- 변환 매체에서 약 5-6 일 후 (어려운 세포주를 위한 12 일까지) 또는 세포가 매우 조밀해질 때, 그(것)들을 1:2 또는 최대 1:3를 통과합니다.
참고: 변환 프로세스 전반에 걸쳐 세포를 고밀도로 유지하는 것이 매우 중요합니다.
2. 변환 및 iNPC 분할 절차
- 세포 분리 용액(예를 들어, Accutase)을 따뜻하게 하고 실온에서 15-20분 동안 섬유네틴(PBS1:200, 코팅 부피 1mL)을 사용한 6웰의 적절한 수의 웰을 코팅합니다. 섬유넥틴 코팅은 부정적인 영향 없이 더 길 수 있지만 코팅 시간을 단축하지 않도록주의해야 합니다.
- 세포를 분리하지 않고 PBS로 조심스럽게 셀을 씻으십시오 (우물의 벽을 사용하여 PBS를 세포에 부드럽게 적용하십시오). 파이펫이나 포부로 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
- 세포 분리 용액0.5mL를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 2-3분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 대부분의 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오. 모든 세포가 벗겨진 경우 2mL의 신선한 변환 매체를 추가하고 2-3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 넣고 덩어리를 해리시화합니다(필요한 경우).
- 15mL 튜브에서 세포를 수집하고 3mL의 추가 미디어를 추가하여 세포 분리 용액을 더욱 희석시합니다. 모든 세포가 수집되었는지 확인하기 위해 먼저 여분의 미디어로 우물을 씻으부으려면 하십시오.
- 상온에서 200 x g에서 4 분 동안 원심 분리기.
참고: 세포 또는 iNPC 변환은 미디어에 세포 분리 솔루션의 존재에 매우 민감합니다. 상류효소의 원심분리 및 철수에 의해 잔류 효소를 제거하는 것은 절대적으로 필요하다. - 세포 펠릿에서 상체를 제거하고 신선한 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 부드럽게 위아래로 2-3 번 피펫하여 세포 덩어리를 해결합니다. 코팅 된 6 웰에서 fibronectin을 제거하고 즉시 각 우물에 신선한 매체 1 mL을 추가하십시오 (섬유 네틴을 건조시키지 마십시오). 1:2의 분할 비율을 위해, 셀 서스펜션의 0.5 mL을 하나의 우물에 넣고 다른 0.5 mL을 두 번째로 잘 넣습니다.
- 조직 배양 배양인 인큐베이터에서 37°C의 배양 세포.
- 동남-서방향(원형이 아닌)에서 6웰을 부드럽게 흔들어 세포를 분배하고 조직 배양 배양배 인큐베이터에 넣습니다.
- 현미경의 밑에 세포를 관찰하고 그 다음날 을 바꾸고 매체를 변경합니다 (1-2 mL). 세포가 다시 분할 될 준비가 될 때까지 매일 미디어를 변경합니다.
참고: 이 시점에서 세포 증식은 가속화되기 시작해야 하며, 세포는 2-3일 이내에 두 번째 분할을 준비해야 합니다(매우 느린 성장 라인의 경우 4일).- 이 새로운 분할에서, 변환 매체에서 세포의 하나 우물을 종자 하나 잘 및 EGF/heparin 없이 증가 된 농도에서 만 FGF를 포함 하는 NPC 매체에서 다른 잘(표 1).
참고: 일부 세포주는 약 10일 후에 변환 매체에 있는 정체된 상태에 도달하고 NPC 매체로 전환하는 것은 세포 성장에 도움이 될 수 있습니다. 또한 NPC미디어(19)에서성장하면 NPC 미디어가 더 구체적이고 작은 형태를 가지고 있다. 이 시점에서 iNPC는 차별화 및 추가 사용에 대한 준비가 되어 있습니다.
- 이 새로운 분할에서, 변환 매체에서 세포의 하나 우물을 종자 하나 잘 및 EGF/heparin 없이 증가 된 농도에서 만 FGF를 포함 하는 NPC 매체에서 다른 잘(표 1).
- 매일 iNPC의 미디어(1-2mL)를 계속 변경하십시오.
- 6웰의 2~3개의 컨실업 웰을 결합하여 NPC를 10cm 요리로 확장합니다. 10cm 요리의 미디어 볼륨은 일반적으로 12-15 mL입니다.
- 다음 분할에서, 더 세포 주식의 많은 수세대에 대한 서너 10cm 요리 (12-15 mL 의 미디어)로 이러한 세포를 확장. 10cm 요리는 일반적으로 확산 속도에 따라 3-4 일마다 1 :3 또는 1 :4로 나뉩니다.
3. NPC에서 유도 된 성상세포 생성
- 신선한 iNPc에서 성상세포를 만들기 위해, 종자 iNPC (10cm fibronectin 코팅 플레이트에서) 직접 10 mL 성상 세포 매체(표 1)에서다음 날 약 10 %의 합류가 되도록합니다. 배양 세포37°C에서 5%CO2 조직 배양 배양인.
참고: 권장 시종 밀도는 일반적으로 NPC의 10cm 접시의 세포 회수의 50 μL이며, 분할 비율(예: 1:3 분할용 3mL, 1:4 분할용 4mL)에 따라 최종 부피로 희석됩니다. - 도금 후 3일 이내에 iA의 배지(10mL 성상세포 배지)를 변경한다. 5-7 일 동안 세포를 분화 유지합니다.
참고 : iA는 여러 구절을 잘 용납하지 않으므로 NPC를 분할 할 때마다 신선한 성상세포를 만드는 것이 좋습니다. - 실험을 위해 시드하려면 2.1-2.7 단계에 설명된 바와 같이 트립신 또는 세포 분리 용액을 사용하여 성상세포를 분할한다. 권장 시딩 밀도는 표 2에포함되어 있습니다.
| 플레이트 타입 | 우물 당 성상세포 |
| 384웰 | 2500 |
| 96웰 | 10000 |
| 24웰 | 40000 |
| 6-웰 | 150000 |
표 2. 플레이트 영역당 iA의 시드 밀도를 권장합니다. 가장 일반적인 조직 배양 판에 단층층을 생성하기 위해 시드 된 iA의 전형적인 수.
4. 냉동 된 NPC 주식에서 성상 세포 분화를위한 준비 및 해동 부분 (3 단계 에 대한 대안)
참고: 문화에서 iNPc를 유지하는 대신, 성상세포는 냉동 된 주식에서 직접 생산 될 수 있습니다. 이렇게 하려면 iNPC가 더 작은 부분으로 동결됩니다. 표 3에서는 10mL의 애스트로세포 매체를 함유한 10cm 접시에 해동될 부분에 대한 동결 및 해동 량을 보여 주어 있다.
| 부분 크기 | 세포 현탁액 (μL) | 동결 매체(μL) | 총 부피(μL) | 해동 |
| 4배 | 400 | 400 | 800 | 10cm 요리 2개 |
| 2x | 200 | 200 | 400 | 10cm 접시 1개 |
표 3. iA를 생성하기 위해 iNPC를 분할하는 방법에 대한 지침입니다. iNPC 서스펜션 및 동결 매체의 비율을 생성하여 일부를 생성합니다. 최종 DMSO 농도는 세포 현탁액이 동결 매체와 혼합될 때 10%입니다.
- 냉동 iNPC 주식에서 성상 세포를 만들기 위해 액체 질소 저장 탱크에서 부분 스톡 바이알을 제거하고 37 °C에서 신속하게 해동하십시오. 세포가 해동되는 즉시, 5mL 성상세포 매체를 포함하는 15mL 관내 파이펫 세포 용액.
- 200 x g 및 실온에서 4 분 동안 원심 분리기. 상체를 제거하고 신선한 성상세포 배지의 1 mL에서 다시 중단합니다.
- 10cm 접시를 코팅한 섬유네틴에 9mL의 신선한 성구 세포를 추가하고 1mL의 셀 용액을 추가합니다. 동남-서동 운동에서 세포를 부드럽게 분배합니다. 배양 세포37°C에서 5%CO2 조직 배양 배양인.
Representative Results
이 프로토콜은 야마나카 인자를 포함하는 레트로 바이러스를 사용하여 인간 피부 섬유아세포에서 직접 iNPC의 신속하고 쉬운 생성을 허용합니다. 이 방법은 줄기 세포 상태와 클로날 선택의 필요성을 우회하여 복제 변화를 피할 수 있게 한다. 세포가 변환 과정을 겪고있는 동안 명심해야 하는 중요한 단계는 섬유아세포 파종 밀도, 미디어 pH 및 세포를 최적의 연결성으로 유지하는 것입니다. 변환 프로세스 중 최적의 분할 연결 성 및 형태 변경의 예는 도 1에서찾을 수 있습니다.
그림 1. 야마나카 요인의 레트로 바이러스 혼합을 추가 한 후 변환 과정의 대표적인 이미지. 섬유아세포는 야마나카 요인으로 24시간 후에 씨를 뿌리고 변형되었습니다. 이틀 간의 포스트 바이러스(DPV), 미디어가 전환 매체로 변경되었습니다. 세포는 통과 할 준비가 될 때까지 변환 매체에서 배양되었다 (13 DPV). 세포는 다음 날(14DPV)에 80%의 합류에 도달하기 위해 후통로를 시드하였다. 후속 구절은 신경 전구 세포가 급속하게 분할하기 시작할 때까지 이 조밀도를 유지했습니다. 스케일 바는 200 μm입니다.
변환 과정이 완료되면, NPC는 섬유아세포 마커 및 형태의 발현이 강하게 감소하거나 발현이 없음을 나타내며, NPC 특이적 세포마커(그림 2)를발현한다. 또한 iN, iOs 및 iA와 같은 다른 세포주를 생성하는 데에도 사용할 수 있습니다.
그림 2. 변환 과정을 거치는 세포는 세포 별 마커를 표현한다. 환자 섬유아세포(A), 유도된 신경 전구 세포(iNpCs(B) 및 유도된 성상세포(iA(C) 세포는 24개의 잘 조직 배양된 플레이트에서 유리 커버립에 시드하였다. 세포는 섬유아세포 특이적 세포 마커(A), 비멘틴(green) 및 TE7(빨간색), iNPC 특이세포 마커(B), 네신(red), iA 세포 마커(C) GFAP(보라색) 및 iNPC 마커 네스티인(green)에 대해 면역염색하였다. 스케일 바는 50 μm입니다.
우리의 경험에서, 특히 iA는 재현 가능한 큰 수에 순수한 인구 (98% 이상의 GFAP 양성 세포29)에서생성될 수 있기 때문에 약물 및 질병 기계장치 테스트에 매우 유용합니다. iA는 분할 중 세포의 작은 알리쿼트 또는 이전에 냉동 된 iNPC 부분을 복용하고 성상 세포 에서 직접 도금함으로써 iNPc로부터 분화 될 수 있습니다. 이 과정에서 중요한 고려 사항은 iNPC 초기 종자밀도(도 3 및 도 4)를낮게 유지하고 있으며, 고밀도가 분화 과정(도4)을저해하고 산성화가 건강한 성상세포도 활성화할 수 있기 때문에 미디어 pH에 추가적인 주의를 기울이고 있다.
그림 3. iNPC에서 iA 생성 프로세스의 대표적인 이미지. iNPc는 낮은 파종 밀도에서 천체 세포 (표 1)에서 시드됩니다. 좋은 시드 밀도는 첫날 포스트 시드 (DPS)에 약 10 %입니다 (왼쪽); 그러나, 이 밀도는 세포의 성장 속도에 따라 조정될 수 있다. 일반적인 iAs 형태는 5DPS(중간) 후에 관찰될 수 있다. 경우에 따라, 비정상적인 성상세포 형태는 길고 뾰족한 확장과 함께 관찰 될 수 있습니다. 이 변화는 성상세포 활성화를 나타내며 질병 상태 또는 잘못된 배양 기술 (오른쪽)에 이차적 일 수 있습니다. 스케일 바는 200 μm입니다.
그림 4. iNPC 시드 밀도는 iAs 분화 효율에 영향을 미칩니다. 제어 iNPC 라인은 분화에 대한 파종 밀도의 효과를 보여주기 위해 천체 세포 매체에서 낮은 (A) 및 높은 (B) 밀도로 시드되었다. 5 DPS, 저밀도 라인은 성상세포 특이적 마커를 발현하고, 고밀도 선은 표시된 iNPC와 iA 마커의 혼합물을 나타내며 표시된 iNPC와 같은 형태. 스케일 바는 50 μm입니다.
보충 도 1. 야마나카 요인의 레트로 바이러스 혼합을 추가 한 후 변환 과정의 추가 수치. 12DPV(통과 1일 전)와 19DPV(통과 후 6일)에서 변환 과정의 이미지. 12 DPV 세포에서 통과 전후 세포 간의 형태에 대한 차이는 볼과 같은 구조 형태를 갖는다. 변환 매체(표 1)에서 통과 및 며칠 후 세포는 NPC와 같은 형태를 표시하기 시작합니다. 스케일 바는 200 μm입니다.
Discussion
요약하자면, 직접 변환은 환자 피부 섬유아세포로부터 유도된 뉴런 전구세포를 생성하는 빠르고 쉬운 방법입니다. 이 방법은 유지 보수가 용이한 다수의 세포뿐만 아니라 그것의 속도 때문에 유리하다. 더욱이, 증가하는 증거는 직접 재프로그래밍 방법이 고전적인 iPSC 재프로그래밍 기술에 비해 더 적은 후성 유전학 마크를 제거한다는 것을 건의합니다, 따라서 질병 환경을 더 온전하게 남겨4,7,8. iNPc를 성상세포로 분화하는 것은 매우 직선적이며 여러독립 실험실(19,29,33)사이에서도 매우 즉각적으로 재현할 수 있다. iNPC는 작은 부분에서 동결및 분화 목적을 위해 직접 해동될 수 있으며, 이는 통로 수를 유사하게 유지될 수 있기 때문에 실험 간의 변동을 줄이는 데 도움이 됩니다. 성상 세포는 많은 신경 질환에서 질병 진행에 중요 한 역할을 하 고 따라서 함께 작동 하는 흥미로운 세포 유형. 성상 세포는 기계학 연구, 신진 대사 연구 또는 약물 검사 에 사용할 수 있으며 일반적으로 단층으로 재배됩니다. 더욱이, 성상세포는 마우스 또는 인간 뉴런과 공동 배양 시스템에 결합될 수 있고, 성상세포가 신경 생존과 형태학에 미치는 영향을 평가할 수 있으며, 둘 다 약물검사34에대한 좋은 판독제이다.
이 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 몇 가지 점과 잠재적 인 제한을 염두에 두어야 합니다. 예를 들어 인간의 피부 섬유아세포는 바이러스 벡터에 대한 반응뿐만 아니라 세포 분열 속도에서 크게 다릅니다. 이들은 표준화된 세포주가 아니기 때문에, 인류 자체만큼이나 가변적이며, 각 선은 다르다. 많은 재프로그래밍 방법에 관해서는, 간신히 복제되는 세포 대 중간 세포 분열 비율이 있는 섬유아세포를 재프로그래밍하는 것이 더 쉽습니다. 복제 율은 섬유아세포의 통과 수와 취급 자체에 의해 피부 생검 품질 및 처리 자체에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 1 차적인 피부 섬유아세포로 일할 때, 세포가 노화의 유도를 피하기 위하여 너무 조밀해지지 않는 것이 중요합니다. 섬유아세포가 잘 자라지 않으면 새로운 재고나 더 낮은 통로를 시도하는 것이 가장 좋습니다. 세포 분열은 때때로 표준 10%에 비해 섬유아세포 매체에 있는 15% 또는 20% FBS를 사용하여 향상될 수 있습니다.
바이러스 벡터를 다시 프로그래밍하는 품질은 성공을 위해 매우 중요합니다. 우리의 손에, 레트로 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터 또는 다른 비 통합 바이러스에 비해 더 효율적이되었다; 그러나, 이것은 바이러스 벡터 품질 및 순도에 의존할 수 있습니다. 상용 레트로바이러스 벡터 키트는 일반적으로 바이러스 벡터 농도를 지정하고 종종 특정 세포주에 대한 감염의 복합성을 지정합니다. 1 차적인 섬유아세포가 바이러스 벡터 uptake를 결정하기 위하여 회사가 사용하는 세포주와 다르다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 또한 동일한 상용 키트를 주문할 때도 일괄 처리 간의 변형이 일반적입니다. 더욱이, 바이러스 벡터의 섭취는 또한 섬유아세포 세포주 사이에서 변화합니다. 몇몇 선은 더 민감할 수 있고 그러므로 변환된 세포는 바이러스성 uptake에 더 저항할 지도 모르다, 정지할 수 있었습니다. 따라서, 주어진 세포주에 대한 트랜스듀션 효율을 결정하는 것은 특히 세포주들이 천천히 성장하거나 이전의 변환 시도가 실패하는 경우에 중요할 수 있다. 우리의 손에, 변환에 필요한 특정 레트로 바이러스 벡터의 양을 평가하는 가장 좋은 방법은 바이러스 벡터의 여러 희석으로 면역 형광 염색을 수행하는 것입니다. 각 벡터에 대해 트랜스진을 발현하는 세포의 수는 70% 이상의 트랜스듀션 효율을 목표로 계산될 수 있다. 우리의 경험에서, 유사한 MOI는 대부분의 세포주에 사용될 수 있습니다 그러나 MOI는 필요한 경우에 조정될 수 있습니다.
변환 프로세스 동안 셀을 너무 일찍 분할하지 않는 것이 중요합니다. 세포가 분할될 준비가 될 때까지의 시간은 1 차 세포주 및 그 특성, 사용된 바이러스 벡터의 품질 및 미디어 품질을 포함한 여러 요인에 달려 있습니다. 중요한 것은, 세포가 고밀도로 유지될 때 변환의 성공률이 훨씬 높습니다. 세포가 형태학을 바꾸기 시작하더라도 세포를 조기에 분할하는 것보다 먼저 세포를 더 오래 두는 것이 좋습니다. 분할이 너무 일찍 발생하면 변환이 진행을 중단하고 세포를 섬유아세포와 같은 모양과 행동으로 다시 분화하도록 이끌 수 있습니다. 더욱이, 너무 일찍 희석하면 이전에 관찰된 NPC의 작고 컴팩트한 세포 체에 비해 더 길쭉한 세포 체가 발생할 수 있다. 따라서 첫 번째 분할은 항상 보수적이어야합니다. 너무 많이 희석에 비해 1:1 또는 1:2 분할과 함께 너무 조밀 한 세포를 유지하는 것이 좋습니다. 일부 세포 사멸은 초기 분할 후 예상된다. 참고로, 세포는 항상 더 나빠 보입니다 (아첨) 분할 후 첫날, 이는 정상입니다. 세포 모양에 대한 최선의 판단은 2-3 일 후에 이루어져야합니다. 중요한 것은 성장 요인과 미디어 구성 요소의 품질도 중요합니다. 완전히 준비된 미디어를 최대 5-7일 동안만 사용할 수 있도록 성장 요인을 포함하는 소량의 미디어를 준비하는 것이 중요합니다. 미디어를 실온 또는 37°C에서 장기간 보관하지 마십시오. 미디어 변경이 수행되는 즉시 신속하고 냉장 보관하십시오. 또한, 2mL 대신 1mL에서 미디어 의 양을 낮게 유지하는 것은 변환에 더 강한 세포주특히 도움이 될 수 있습니다. 세포가 빠르게 미디어를 소비하는 경우, 미디어 색의 변화에 의해 관찰될 수 있는 빨간색에서 노란색(산성화 속도)을, 최대 2mL까지 미디어의 부피를 조절한다. 급속한 미디어 소비는 긍정적인 신호이며 증식 증가와 함께 전환의 후기 단계에서 종종 관찰됩니다.
NPC는 또한 미디어에 accutase의 존재에 매우 민감하고 짧은 accutase 잠복기를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 우리는 2-4 분의 잠복기를 권장하고 현미경으로 세포를 자주 확인하여 분리 된 시기를 확인하십시오. 분리 후 세포를 원심분리하여 효소 믹스를 분리하여 매체로부터 제거하는 것이 필수적이다. 또한 세포주발성 프로파일의 변경으로 이어지는 확장된 배양 시 세포선이 변경될 수 있으므로 통로 번호를 염두에 두는 것도 중요합니다. 따라서, 초기 통로에 많은 세포 주식을 동결 하는 것이 중요 하다. 세포는 10% DMSO 및 90% NPC 매체로 동결되어야 하며 액체 질소에 장기적으로 저장되어야 합니다. 이 매체의 혈청 부족으로 인해 얼어 붙은 챔버를 사용하여 느린 동결을 보장하고 하룻밤 사이에 얼어 붙은 후 즉시 액체 질소로 옮기는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서 복제 선택이 수행되지 는 않지만, 확장 된 배양 및 패혈증이 유리한 성장과 생존율을 가진 초기 세포 집단의 자연 선택으로 이어질 수 있습니다. 따라서 실험을 수행할 때 통로 번호와 취급을 염두에 두는 것이 중요합니다. 우리는 실험을 위해 더 낮은 통로를 사용하는 것을 선호합니다, 가능하다면, 우리는 20 시간 이상 세포주를 통과하는 것을 초과하지 않습니다. NPC가 급속히 성장하기 때문에 실험을 위해 낮은 통로에서 많은 주식을 동결 할 수 있습니다. 특히 높은 성장률을 가진 세포선은 매체 산성화의 고위험에 있습니다. 따라서 세포주속도가 다르면 증식에 따라 미디어 양을 조정해야 할 수도 있습니다. 세포가 지속적으로 고산성 매체에 남아 있는 경우, 그것은 제어 및 질병 세포주 모두의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 건강한 성상세포조차도 반응성이 되는 원인이 되고, 추가 분화및 실험에 있는 그들의 사용에 영향을 미칩니다.
성상 세포 분화의 경우, 고밀도가 세포가 분화되는 것을 방지하고 더 높은 속도로 확산상태를 유지하므로 세포를 저밀도로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서, 시드 밀도는 그들의 증식속도에 따라 각 세포주에 대해 조정될 필요가 있다. 다양한 파종 밀도를 시도하고 적절한 분화를 보장하기 위해 성상세포 마커로 염색/RT-PCR을 수행하는 것이 좋습니다. IA 품질은 뉴런과 공동 배양 아세약을 사용하여 건강한 대조군과 함께 평가될 수 있습니다. 질병 병리학이 반응성 표현형으로 이어지지 않는 경우, 뉴런은 며칠 동안 iA와 접촉할 수 있어야 합니다. 천상체 형태는 개별 적인 세포주 사이에서 크게 변화할 수 있고 질병 표현형에 의해 또한 영향을 받을 수 있습니다. 더욱이, 성상 세포가 심하게 영향을 받는 질병에서는, 그(것)들은 크고 길쭉한 확장으로 반응성 표현형을 보여줄 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 연구 연구에 중요한 견본을 기증한 모든 환자와 건강한 자원봉사자에게 감사드립니다. 또한, 우리는 조직 문화에서 지속적인 전문가 기술 지원에 대한 로셸 로드리고와 독립적으로 협력자로 그녀의 실험실에서 기술을 확인 로라 페라이우올로 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 R01 NS64912-4 및 RC2 NS69476-01 (A.L.S.) 및 ALS 연구 보조금 P2ALS 및 도움 링크 재단을위한 패커드 센터에서 자금을 받았다. K.M. 또한 스위스 국립 과학 재단에서 자금을 지원 뿐만 아니라 근 이영양증 협회에서 젊은 조사자 개발 상, Rett 증후군 연구 신탁 및 SCN2A 재단의 가족.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
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