Summary
نحن نصف بروتوكولا لإعادة برمجة الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري إلى خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) ، وتمايزها اللاحق إلى خلايا أستراتية مستحثة (iAs). وتؤدي هذه الطريقة إلى توليد سريع وقابل للاستنساخ من الشخصيات غير الوطنية وأجهزة iAs بكميات كبيرة.
Abstract
تركز الأبحاث على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على تأثير الخلايا العصبية على آليات المرض. يؤثر التوافر المحدود للنماذج الحيوانية تأثيرا شديدا على دراسة مساهمات محددة لنوع الخلية في المرض. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج الحيوانية عادة لا تعكس التباين في الطفرات ودورات الأمراض التي ينظر إليها في المرضى البشر. أحدثت طرق إعادة البرمجة لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ثورة في أبحاث المريض المحددة وخلقت أدوات قيمة لدراسة آليات المرض. ومع ذلك ، فإن تقنية iPSC لها عيوب مثل الوقت والالتزام بالعمل والانتقائية اللاستنساخية وفقدان العلامات اللاجينية. تسمح التعديلات الأخيرة لهذه الطرق بتوليد أكثر مباشرة من أنساب الخلايا أو أنواع خلايا محددة ، متجاوزة العزلة اللاستنساخية أو حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لقد طورنا طريقة تحويل مباشرة سريعة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) من الخلايا الليفية الجلدية باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية في تركيبة مع وسائل الإعلام العصبية. يمكن تمييز ال INPCs إلى خلايا عصبية (iNs) أوليغودندروسيتوس (iOs) والخلايا الفلكية (iAs). ويسهل إنتاج اتفاقات مكافحة المخدرات إجراء اختبار سريع لآلية المخدرات والأمراض لأن التمايز عن الشخصيات غير الوطنية لا يستغرق سوى 5 أيام. وعلاوة على ذلك، من السهل العمل مع اتفاقات الاستثمار الدولية ويتم إنشاؤها في مجموعات سكانية نقية بأعداد كبيرة. قمنا بتطوير اختبار الثقافة المشتركة القابلة للاستنساخ للغاية باستخدام الخلايا العصبية GFP + الماوس و iAs المشتقة من المريض لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. الأهم من ذلك ، فإن مقايسات iA قابلة للتطوير إلى تنسيق 384 جيدا مما يسهل تقييم جزيئات صغيرة متعددة في لوحة واحدة. يسمح هذا النهج بإجراء تقييم علاجي متزامن لخطوط خلايا المريض المتعددة ذات الخلفية الوراثية المتنوعة. سهولة إنتاج وتخزين iAs والقدرة على فحص مركبات متعددة في مقايسة واحدة يجعل هذه المنهجية قابلة للتكيف مع الطب الشخصي.
Introduction
فهم آليات الأمراض الكامنة أمر بالغ الأهمية للأمراض العصبية لأنه يساعد في وضع استراتيجيات علاجية محتملة. في حين أن النماذج الحيوانية تاريخيا كانت المعيار الذهبي للبحث في أمراض الجهاز العصبي ، فإن الترجمة المباشرة للعلاجات المحتملة إلى بيئة سريرية غالبا ما تظهر نجاحا محدودا1و2و3. أسباب عدم وجود الترجمة هي عدم وجود تباين في الخلفية الوراثية والطفرات في الفئران ، والعرض غير الكامل للأنماط الظاهرية للمرض والاختلاف في حساسية الدواء أو التعاطي في المرضى البشريين التي لا يتم تصويرها بشكل جيد في سلالات الفئران الأصيلة. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للعديد من الاضطرابات العصبية النادرة، لا تتوفر نماذج حيوانية أو عدد قليل منها. دراسة آليات المرض مباشرة في أنواع الخلايا البشرية ذات الصلة يمكن أن تسهل البحث وتحسين الترجمة إلى العيادة. بالنسبة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي ، يصعب استرداد الخلايا البشرية الأولية وتمثل مصدرا محدودا جدا لأن الخزعات غازية أو لا يمكن استرجاعها إلا بعد الوفاة في المرحلة النهائية من المرض. في السنوات ال 15 الماضية ، وتطوير تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا وسعت بسرعة القدرة على نموذج الأمراض العصبية العصبية والعصبية البشرية في المختبر.
تتضمن الطرق التقليدية لإعادة برمجة الخلايا إعادة برمجة الخلايا الليفية أو أنواع الخلايا الأخرى إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) قادرة على التفريق بين أنواع الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث4. كان تاكاهاشي ويماناكا أول من أظهر أن إعادة التعبير عن أربعة عوامل لنسخ الخلايا الجذعية كافية لإعادة توجيه الخلايا الجسدية لتصبح iPSCs5. ويمكن بعد ذلك تمييز iPSCs إلى أنواع خلايا محددة. ومع ذلك ، فإن العيب في هذه العملية هو أنه من العمالة الكثيفة وتستغرق وقتا طويلا لتوليد وعزل استنساخ الخلايا الجذعية مستقرة. كما يتم الحفاظ على الطفرات الجسدية أو أبرانسات محددة من الخلية الأم في استنساخ الخلايا الجذعية ويمكن أن تؤثر على نتائجالدراسة 6. وبالإضافة إلى ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن عمليةإعادةبرمجة الخلايا الجذعية تمحو التغيرات اللاجينية القيمة التي يمكن أن تؤثر على آليات المرض الخلوي 4و7و8. في السنوات الأخيرة، ركز الباحثون على أساليب إعادة البرمجة المعدلة التي تسمح بتوليد أكثر مباشرة من أنواع الخلايا المختلفة مع تجاوز حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات9و10و11و12 (تمت مراجعتها في 13و14). كشفت الاختراقات الأولية في المختبر إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى خلايا القلب15، الخلايا العصبية16 وخلايا الكبد17 عن طريق التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ النسب محددة متعددة أو microRNAs18. وأعقب ذلك دراسات مباشرة إعادة برمجة الخلايا لنموذج الاضطرابات العصبية19,20. وكما ذكر أعلاه، فإن بروتوكولات إعادة البرمجة أو التحويل المباشرة هذه لها مزايا محتملة على بروتوكولات iPSC الكلاسيكية بما في ذلك السرعة واجتثاث خطوة العزلة اللاستنساخية. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أن هذه البروتوكولات تسمح بالحفاظ على كمية أكبر من المعلومات اللاجينية المتعلقة بعمر المريض ومن المرجح أن ينطبق الشيء نفسه على العلامات ذات الصلة بالمرض7،8.
حتى الآن، ركزت معظم البحوث في المختبر على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فمن المعروف جيدا أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الفلكية ، microglia وoligodendrocytes تلعب دورا حاسما في أمراض الأمراض وتطور الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض باركنسون (PD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، والتصلب المتعدد (MS) ، وأمراض عصبية أخرى مثل متلازمة ريت (RTT) ، واضطرابات النوم ، الإدمان والصرع واضطرابات التخزين الليسوسومية والاكتئاب والصداع النصفي والألم المرضي21،22،23،24،25،26. الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وحتى وقت قريب ، تم إهمالها على نطاق واسع من وجهة نظر مرضية7. ومن المعروف الآن أن لها دورا حاسما في دعم ما يقرب من جميع الوظائف الهوستاتيكية من الجهاز العصبي المركزي صحية. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن لها تأثيرا مرضيا مهما وقيمة جدا في فهم آلية المرض وتقييم الاستراتيجيات العلاجية19.
في الوصف الحالي ، نقوم بتفصيل بروتوكول للتحويل المباشر للخلايا الليفية للمريض البشري إلى خلايا سلف عصبية مستحثة (iNPCs) باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية التي تعبر عن عوامل إعادة برمجة Yamanaka (Klf4 ، Oct3 /4 ، Sox2 و c-Myc) والتعرض اللاحق لوسائل الإعلام العصبية. استخدمت الدراسات السابقة مجموعات مختلفة من العوامل النسخية لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا العصبية (تمت مراجعتها في 14)، ولكن العوامل المستخدمة في البروتوكول الموصوف متاحة على نطاق واسع إما كالبلازميدات في الإنتاج الداخلي للناقلات الفيروسية ، أو كما هي متاحة تجاريا جاهزة للذهاب مجموعات إعادة البرمجة الفيروسية. يمكن تمييز الخلايا العصبية الناتجة عن ذلك إلى خلايا عصبية مستحثة (iNs)27، oligodendrocytes (iOs)24 والخلايا الفلكية (iAS)19 لدراسة دورها في الأمراض العصبية. بروتوكولنا لا ينطوي على توليد تستغرق وقتا طويلا من iPSCs التي تستخدم معظم البروتوكولات المتاحة لاشتقاق الخلايا الفلكية البشرية28. ما يقرب من 98٪ إلى 100٪ من الشخصيات غير المبرمجة مباشرة يمكن أن تفرق إلى الخلايا الفلكية إيجابية GFAP29 بالمقارنة مع 2٪ فقط باستخدام طريقة التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا الفلكية30. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة نسخية مقارنة باستخدام طريقة إعادة البرمجة الموصوفة لدينا أن الشخصيات الطبيعية التي تمت برمجتها من الخلايا الليفية المانحة يمكن أن تحتفظ بميزات الشيخوخة على المستوى النسخي والوظيفي المشابه للعمر المطابق للخلايا الفلكية بعد الوفاة والخلايا الفلكية الأولية29. وبالتالي، فإن بروتوكول التحويل هذا هو أداة قوية للتحقيق في آليات المرض وتقييم النهج العلاجية الجديدة للاضطرابات العصبية والعصبية المرتبطة بالعمر.
هنا نصف البروتوكول المستخدمة لتوليد الشخصيات الوطنية والتمايز في اتفاقات الاستثمار الدولية ، والتي هي الأكثر ملاءمة على نطاق أوسع صغيرة الفحص الجزيئي المقايسات. يمكن القيام بآليات الأمراض واختبار الأدوية باستخدام iAs باستخدام منهجيات مختلفة مثل الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية أو التحليل الأيضي والكيميائي الحيوي. ميزة هذا النظام هو سرعة وسهولة صيانة هذه الخطوط الخلية بالمقارنة مع iPSCs. وعلاوة على ذلك، يمكن تجميد الشخصيات غير الوطنية في أجزاء صغيرة من أجل تمايز اتفاقات الاستثمار الدولية مما يسهل اختبار المخدرات في ظل ظروف ثابتة على مدى فترات طويلة من الزمن. وعموما، تصبح مقارنة أعداد العينات الأكبر ممكنة بهذه الطريقة التي تفتح الباب لتقييم الإمكانات العلاجية للمركبات في عدد أكبر وأكثر تمثيلا من المرضى.
Protocol
| وسائط | الكاشف | المبلغ الذي يجب مزجه | التركيز النهائي (٪) |
| وسائط الخلايا الليفية | DMEM, جلوكوز عالي, الغلوتاماكس | 500 مل | 89 |
| مصل الأبقار الجنينية | 50 مل | 10 | |
| مضاد حيوي مضاد للذهان | 5 مل | 1 | |
| الوسائط الأساسية | DMEM/F12 + جلوتاماكس | 500 مل | 97 |
| N-2 | 5 مل | 1 | |
| بي-27 | 5 مل | 1 | |
| مضاد حيوي مضاد للذهان | 5 مل | 1 | |
| وسائط التحويل | الوسائط الأساسية | 50 مل | 99.9 |
| FGF | 1 ميكرولتر | 0.02 (20 نانوغرام/مل) | |
| منتدى إدارة الإنترنت | 1 ميكرولتر | 0.02 (20 نانوغرام/مل) | |
| الهيبارين | 50 ميكرولتر | 0.1 (5 ميكروغرام/مل) | |
| العصبية سلف الخلية (NPC) وسائل الإعلام | DMEM/F12 + جلوتاماكس | 500 مل | 96.9 |
| N-2 | 5 مل | 1 | |
| بي-27 | 5 مل | 1 | |
| مضاد حيوي مضاد للذهان | 5 مل | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| وسائل الإعلام الفلكية | DMEM, جلوكوز عالي, الغلوتاماكس | 500 مل | 89 |
| مصل الأبقار الجنينية | 50 مل | 10 | |
| مضاد حيوي مضاد للذهان | 5 مل | 1 | |
| N-2 | 1 مل | 0.2 | |
| يجب تصفية الوسائط بعد خلط كافة المكونات. يجب إعداد وسائط التحويل (مع العوامل) طازجة كل أسبوع. | |||
الجدول 1 - الجداول وصفات الوسائط لجميع أنواع الخلايا المضمنة في البروتوكول. يجب تصفية الوسائط بعد خلط جميع المكونات إما بنظام ترشيح فراغ معقم للأحجام الكبيرة أو المحاقن ومرشحات المحاقن 0.2 um. يجب إعداد وسائط التحويل (مع العوامل) طازجة كل أسبوع.
1. التحويل المباشر للخلايا الليفية البشرية البالغة إلى خلايا السلف العصبية
ملاحظة: يمكن مراجعة جدول زمني تخطيطي لهذا البروتوكول في ماير (2014)19.
- استخدام الخلايا الليفية الجلد البشري الأولية التي يمكن الحصول عليها من بنوك الخلايا أو خزعات الجلد31. خلايا زراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون5٪. خلايا المرور لمدة 1-2 على الأقل مقاطع وظيفة ذوبان الجليد قبل استخدامها في التجربة. مرة واحدة في الخلايا جاهزة، معطف بئر من لوحة 6-جيدا مع فيبروكتين الإنسان (1:200 المخفف في برنامج تلفزيوني) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة.
- عندما تكون الخلايا جاهزة لتكون مطلية، وإزالة فيبروكتين من الطبق وإضافة فورا حل الخلية أو 2 مل من وسائل الإعلام الليفية (الجدول 1) - لا تدع الطبق تجف قبل إضافة وسائل الإعلام. اعتمادا على مدى سرعة نمو الخلايا، لوحة 150،000 (سريع النمو) - 200،000 (بطيئة النمو) الخلايا الليفية في بئرين من فيبروكتين الإنسان المغلفة 6-لوحة جيدا لكل منهما.
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا حوالي 70٪ التقاء لاتنتاج الفيروسية لتكون قادرة على الاحتفاظ بها في نفس اللوحة لعدة أيام أخرى بعد النقل. يمكن أن يكون من المفيد أن البذور في كثافتين مختلفتين من أجل الحصول على خيار في اليوم التالي للتحويل. - في اليوم التالي للبذر، تحقق من الخلايا الليفية تحت المجهر وتحقق من كثافة الخلية (بين 70-85٪) وحتى البذر في جميع أنحاء البئر للحصول على أفضل النتائج.
- تحويل بئر واحد مع جميع ناقلات الفيروسات الرجعية الأربعة (Oct3/4 ، Klf4 ، Sox2 و c-Myc) - استخدم تعدد العدوى (MOI) من 10 للنمو السريع أو 15 للخلايا الليفية البطيئة النمو (يجب أن تتجاوز كفاءة النقل 70٪ أو أكثر من الخلايا الإيجابية لكل ناقل). أضف مزيجا متوسطا إلى فيروسي منتظم إلى حجم إجمالي قدره 1 مل لكل بئر واحتضنه بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة CO2 بنسبة 5٪. ترك البئر الثاني دون علاج وإعادة الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
ملاحظة: يمكن شراء ناقلات ريتروفيرال من قبل بائع أو المحرز في المنزل، والبروتوكولات متوفرة على الانترنت32. - في اليوم التالي لاتحميل، وغسل الخلايا 1x مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من المتوسطة الليفية الطازجة.
- في اليوم التالي، تغيير متوسطة إلى متوسطة التحويل. غسل الخلايا 1x مع برنامج تلفزيوني للتخلص من المتوسطة الليفية المتبقية، ومن ثم إضافة 1 مل من متوسط التحويل. تغيير وسائل الإعلام من البئر غير المعالجة لتحويل وسائل الإعلام أيضا.
ملاحظة: يمكن ملاحظة بعض التغيرات المورفولوجية حتى عن طريق تغيير الوسائط على الخلايا الليفية التي لم تتلق علاج ناقلات الفيروسات الرجعية ، وبالتالي فإن وجود بئر غير معالج (اختياري) سيكون مفيدا عند تحديد آثار ناقلات الفيروس. يجب أن تبدأ الخلايا في تغيير مورفولوجيا 2-4 أيام بعد التحول إلى وسائط التحويل. - مراقبة الخلايا تحت المجهر ومشاهدة التغيرات في مورفولوجيا (الشكل 1). وينبغي استبدال وسائط الخلية يوميا طوال عملية التحويل (1-2 مل من وسائط التحويل، الجدول 1)وثقافة iNPC اللاحقة. تغيير المتوسطة عن طريق إزالة بعناية 70٪ من المتوسطة من البئر مع التأكد من أن الخلايا لا تزال مغطاة في 30٪ المتبقية من وسائل الإعلام.
ملاحظة: وسائل الإعلام مع عوامل النمو في ذلك يحتاج إلى أن تستهلك في غضون أسبوع واحد من التحضير.- استمر في مراقبة الخلايا وتغيير الوسائط يوميا (1-2 مل من وسائط التحويل).
- تبدأ بعض خطوط الخلية تشكيل تشكيلات مستديرة مرتفعة فضفاضة تنمو في الكرة مثل الهياكل أو المجالات العصبية فضفاضة (الشكل التكميلي 1 و 19،33). الحرص على عدم فصل هذه الخلايا. إذا كانت الكرات فصل، يمكن جمعها وإعادة مطلي في فيبروكتين جديدة مغلفة جيدا من لوحة 6-جيدا.
ملاحظة: إذا تم توسيعها من تلقاء نفسها، فإن الخلايا قد خفضت التنوع مقارنة بلوحة الأولية وقد تمثل خط خلية مختلفة بشكل واضح. نوصي الجمع بين هذه الخلايا مع بقية الخلايا المحولة في الجولة التالية من تقسيم.
- بعد حوالي 5-6 أيام في وسائط التحويل (حتى 12 يوما لخطوط الخلايا الصعبة) أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جدا ، مرورها 1:2 أو الحد الأقصى 1:3.
ملاحظة: من المهم جدا الاحتفاظ الخلايا في كثافة عالية خلال عملية التحويل.
2. تحويل و INPC تقسيم الإجراء
- الاحماء حل مفرزة الخلية (على سبيل المثال، Accutase) ومعطف عدد مناسب من الآبار من 6-جيدا مع فيبروكتين (1:200 في برنامج تلفزيوني، 1 مل من حجم الطلاء) لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن يكون طلاء فيبروكتين أطول دون تأثير سلبي ، ولكن يجب توخي الحذر لعدم تقصير وقت الطلاء.
- غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني دون فصل أي خلايا (استخدام جدار البئر لتطبيق برنامج تلفزيوني بلطف على الخلايا). إزالة برنامج تلفزيوني بعناية مع ماصة أو عن طريق الطموح.
- إضافة 0.5 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضان 2-3 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن معظم الخلايا قد انفصلت. إذا كانت جميع الخلايا قد حان قبالة، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام تحويل جديدة وماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات إلى كتل ينفصم (إذا لزم الأمر).
- جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وإضافة 3 مل إضافية من وسائل الإعلام لمزيد من التخفيف من محلول مفرزة الخلية. اغسل البئر باستخدام الوسائط الإضافية أولا لضمان جمع جميع الخلايا.
- جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 200 × ز في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تحويل الخلايا أو iNPCs حساسة للغاية لوجود حل مفرزة الخلية في الوسائط. من الضروري للغاية إزالة الإنزيم المتبقي عن طريق الطرد المركزي وسحب الناطور الفائق. - إزالة supernatant من بيليه الخلية وإعادة إنفاق الخلايا في 1 مل من المتوسطة الطازجة. ماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات لحل كتل الخلية. إزالة فيبروكتين من المغلفة 6-الآبار وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام الطازجة إلى كل بئر على الفور (لا تدع فيبروكتين الجافة). للحصول على نسبة انقسام 1:2، أضف 0.5 مل من تعليق الخلية في بئر واحد والآخر 0.5 مل في بئر ثاني.
- خلايا زراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.
- توزيع الخلايا عن طريق هز بلطف 6-جيدا في اتجاه الشمال والجنوب الشرقي والغرب (وليس دائرية) ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر في اليوم التالي وتغيير وسائل الإعلام (1-2 مل). تغيير الوسائط كل يوم حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام مرة أخرى.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يبدأ انتشار الخلية في التسارع، ويجب أن تكون الخلايا جاهزة لانقسام ثان في غضون 2-3 أيام (4 أيام للخطوط البطيئة النمو).- في هذا الانقسام الجديد، البذور بئر واحد من الخلايا في وسائل الإعلام التحويل والآخر جيدا في وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه تحتوي فقط FGF في زيادة التركيز دون EGF / الهيبارين (الجدول 1).
ملاحظة: تصل بعض خطوط الخلايا إلى حالة ركود في وسائط التحويل بعد حوالي 10 أيام وقد يساعد التبديل إلى وسائط NPC في نمو الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، NPCs لها شكل أكثر تحديدا وأصغر، عندما نمت في وسائل الإعلام المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني19. وفي هذه المرحلة، تكون الشخصيات غير الوطنية مستعدة للتمايز والاستخدام الإضافي.
- في هذا الانقسام الجديد، البذور بئر واحد من الخلايا في وسائل الإعلام التحويل والآخر جيدا في وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه تحتوي فقط FGF في زيادة التركيز دون EGF / الهيبارين (الجدول 1).
- استمر في تغيير الوسائط (1-2 مل) من الشخصيات غير الوطنية يوميا.
- توسيع الشخصيات إلى أطباق 10 سم من خلال الجمع بين اثنين أو ثلاثة آبار التقاء بئر 6-جيدا. حجم الوسائط لأطباق 10 سم عادة ما يكون 12-15 مل.
- في الانقسام التالي، قم بتوسيع هذه الخلايا إلى ثلاثة أو أربعة أطباق 10 سم (12-15 مل من الوسائط) لأجيال من أعداد كبيرة من مخزون الخلايا. عادة ما يتم تقسيم أطباق 10 سم في 1:3 أو 1:4 كل 3-4 أيام اعتمادا على معدل الانتشار.
3. توليد الخلايا الفلكية المستحثة من الشخصيات
- لجعل الخلايا الفلكية من الشخصيات الجديدة، البذور iNPCs (في 10 سم فيبروكتين لوحات المغلفة) مباشرة في 10 مل المتوسطة astrocyte (الجدول 1) بحيث تكون حوالي 10٪ التقاء في اليوم التالي. خلايا زراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون5٪.
ملاحظة: عادة ما تكون كثافة البذر الموصى بها 50 ميكرولتر من إعادة إنفاق الخلية لطبق 10 سم من الNPCs ، شريطة أن يتم تخفيفها إلى حجم نهائي استنادا إلى نسبة الانقسام (على سبيل المثال ، 3 مل لتقسيم 1:3 ، 4 مل لتقسيم 1:4 ، إلخ). - تغيير المتوسطة (10 مل وسائط الخلايا الفلكية) من iAs بعد ثلاثة أيام من الطلاء. الحفاظ على الخلايا التفريق لمدة 5-7 أيام.
ملاحظة: لا تتسامح iAs مع مقاطع متعددة بشكل جيد ، لذلك من الأفضل إجراء الخلايا الفلكية الطازجة في كل مرة تقوم فيها بتقسيم الشخصيات. - للبذور للتجريب، تقسيم الخلايا الفلكية باستخدام التريبسين أو حل مفرزة الخلية كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.7. يتم تضمين كثافات البذر الموصى بها في الجدول 2.
| نوع اللوحة | الخلايا الفلكية لكل بئر |
| 384 بئر | 2500 |
| 96-جيد | 10000 |
| 24-جيدا | 40000 |
| 6-جيد | 150000 |
الجدول 2 - الأرباح كثافة البذر الموصى بها من iAs لكل منطقة لوحة. عدد نموذجي من iAs المصنفة لتوليد monolayer على لوحات زراعة الأنسجة الأكثر شيوعا.
4. إعداد وتذويب أجزاء للتمايز الخلايا الفلكية من مخزونات المجلس الوطني للصحافه المجمدة (بديل للخطوة 3)
ملاحظة: كبديل للحفاظ على الشخصيات في الثقافة، يمكن أيضا إنتاج الخلايا الفلكية مباشرة من مخزون مجمد. ولذلك، يتم تجميد الشخصيات غير الوطنية في أجزاء أصغر. ويبين الجدول 3 وحدات التخزين المقترحة للتجميد والذوبان لأجزاء يتم إذابتها في طبق 10 سم يحتوي على 10 مل من وسائط الخلايا الفلكية.
| حجم الجزء | تعليق الخلية (ميكرولتر) | تجميد الوسائط (μL) | إجمالي الحجم (ميكرولتر) | يذوب في |
| 4x | 400 | 400 | 800 | طبقان 10 سم |
| 2x | 200 | 200 | 400 | طبق واحد 10 سم |
الجدول 3 - الأرباح تعليمات حول كيفية جزء iNPC لإنشاء iAs. نسبة تعليق iNPC وجمد الوسائط لتوليد أجزاء. لاحظ أن تركيز DMSO النهائي هو 10٪ عندما يتم خلط تعليق الخلية مع وسائل الإعلام تجميد.
- لجعل الخلايا الفلكية من مخزونات iNPC المجمدة، وإزالة قارورة مخزون جزء من خزان النيتروجين السائل وتذوب بسرعة في 37 درجة مئوية. بمجرد إذابة الجليد في الخلايا، محلول خلية ماصة في أنبوب 15 مل يحتوي على وسائط الخلايا الفلكية 5 مل.
- جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 200 × ز ودرجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant و resuspend في 1 مل من المتوسطة الفلكية الطازجة.
- إضافة 9 مل من المتوسطة الفلكية الطازجة إلى طبق فيبروكتين المغلفة 10 سم وإضافة 1 مل من محلول الخلية. توزيع الخلايا برفق في حركة الشمال والجنوب الشرقي والغرب. خلايا زراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون5٪.
Representative Results
يسمح هذا البروتوكول بالتوليد السريع والسهل للشخصيات غير المشلولة مباشرة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام الفيروسات الرجعية التي تحتوي على عوامل ياماناكا. تسمح هذه الطريقة بتجاوز حالة الخلايا الجذعية والحاجة إلى التحديد الكلوني ، وبالتالي تجنب الاختلاف اللاستنساخي. الخطوات الهامة التي يجب وضعها في الاعتبار أثناء خضوع الخلايا لعملية التحويل هي كثافة البذر في الخلايا الليفية ، درجة الحموضة في الوسائط والحفاظ على الخلايا في التقاء أمثل. يمكن العثور على أمثلة على التغيرات المثلى في التقاء التقسيم والمورفولوجيا أثناء عملية التحويل في الشكل 1.
الشكل 1. صور تمثيلية لعملية التحويل بعد إضافة المزيج الرجعي لعوامل ياماناكا. تم زرع الخلايا الليفية ونقلها بعد أربع وعشرين ساعة مع عوامل ياماناكا. بعد يومين من الفيروس (DPV)، تم تغيير الوسائط إلى وسائط التحويل. تم استزراع الخلايا في وسائط التحويل حتى كانت جاهزة للمرور (13 DPV). تم زرع الخلايا بعد مرور للوصول إلى التقاء 80٪ في اليوم التالي (14 DPV). حافظت الممرات اللاحقة على هذه الكثافة حتى تبدأ خلايا السلف العصبية في الانقسام بسرعة. مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد اكتمال عملية التحويل ، فإن NPCs تظهر تعبيرا مخفضا بقوة أو لا تعبير عن علامات الورم الليفي ومورفولوجيا ، والتعبير عن علامات الخلايا المحددة للمجلس الوطني للصحافه(الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها أيضا لتوليد خطوط خلايا مختلفة، مثل iNs و iOs و iAs.
الشكل 2. الخلايا التي تخضع لعملية التحويل تعبر عن علامات خاصة بالخلايا. تم بذر الخلايا الليفية المريض (A) ، والخلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs (B) والخلايا الفلكية المستحثة (iAs (C) على أغطية زجاجية في لوحة معالجة 24 زراعة أنسجة جيدة. كانت الخلايا ملطخة بالمناعة ل: علامات الخلايا المحددة للخلايا الليفية (A) ، Vimentin (الأخضر) و TE7 (أحمر) ، علامة الخلية المحددة iNPC (B) ، Nestin (أحمر) ، وعلامة الخلية iAs (C) GFAP (الأرجواني) وعلامة iNPC Nestin (خضراء). مقياس الشريط هو 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في تجربتنا، iAs على وجه الخصوص هي قيمة جدا لاختبار آلية المخدرات والمرض لأنها يمكن أن تتولد في مجموعات نقية (98٪ أو أكثر من الخلايا الإيجابية GFAP29) بأعداد كبيرة قابلة للاستنساخ. يمكن تمييز iAs عن iNPCs عن طريق أخذ aaliquot صغيرة من الخلايا أثناء تقسيم أو جزء iNPC المجمدة سابقا والطلاء مباشرة في وسائل الإعلام astrocyte. اعتبارات هامة خلال هذه العملية هي الحفاظ على الكثافة الأولية للبذر iNPCs منخفضة (الشكل 3 والشكل 4)، كما ثبت كثافة عالية لعرقلة عملية التمايز(الشكل 4)وإيلاء اهتمام إضافي لحاء وسائل الإعلام، كما يمكن للتحمض تنشيط حتى الخلايا الفلكية صحية.
الشكل 3. صور تمثيلية لعملية إنشاء iAs من الشخصيات الوطنية. يتم بذر الشخصيات في وسائط الخلايا الفلكية (الجدول 1) بكثافة بذر منخفضة. كثافة البذر الجيدة حوالي 10٪ في اليوم الأول بعد البذر (DPS) (يسار)؛ ومع ذلك، يمكن تعديل هذه الكثافة وفقا لمعدل نمو الخلايا. يمكن ملاحظة مورفولوجيا iAs النموذجية بعد 5 DPS (وسط). في بعض الحالات، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الخلايا الفلكية الشاذة، مع امتدادات طويلة وشائكة. هذا التغيير يدل على تنشيط الخلايا الفلكية ويمكن أن تكون ثانوية لحالة المرض أو تقنيات زراعة غير صحيحة (حق). مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تؤثر كثافة البذر iNPC على كفاءة تمييز iAs. تم زرع خطوط التحكم iNPC في كثافة منخفضة (A) و (B) عالية في وسائط Astrocyte لإظهار آثار كثافة البذر على التمايز. 5 DPS، أعرب خط منخفض الكثافة علامات محددة للخلايا الفلكية، في حين أن خط عالية الكثافة يظهر مزيجا من علامات iNPC و iAs مع مورفولوجيا تشبه iNPC ملحوظ. مقياس الشريط هو 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال أرقام إضافية لعملية التحويل بعد إضافة مزيج الرجعية من العوامل ياماناكا. صور لعملية التحويل في 12 DPV (1 قبل يوم من مرور) و 19 DPV (6 أيام بعد مرور). لاحظ الفرق في مورفولوجيا بين الخلايا قبل وبعد مرور، في 12 خلايا DPV لديها مورفولوجيا بنية تشبه الكرة. بعد مرور وعدة أيام على وسائل الإعلام التحويل (الجدول 1) تبدأ الخلايا عرض مورفولوجيا تشبه NPC. مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
باختصار ، التحويل المباشر هو طريقة سريعة وسهلة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة من الخلايا الليفية الجلدية المريضة. هذا الأسلوب مفيد بسبب سرعته وكذلك العدد الكبير من الخلايا التي تم إنشاؤها التي يسهل الحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن أساليب إعادة البرمجة المباشرة تزيل علامات أقل لا جينية مقارنة بتكنولوجيا إعادة برمجة iPSC الكلاسيكية، وبالتالي تتركبيئةالمرض أكثر سلامة 4و7و8. تمايز الشخصيات غير المعملية إلى الخلايا الفلكية مستقيم جدا إلى الأمام وقابل للاستنساخ للغاية حتى بين مختبرات مستقلة متعددة19،29،33. ويمكن تجميد الشخصيات غير المناقصة في أجزاء صغيرة وذوبانها مباشرة لأغراض التمايز، مما يساعد على تقليل التباين بين التجارب حيث يمكن الاحتفاظ بأرقام المرور متشابهة. تلعب الخلايا الفلكية دورا حاسما في تطور المرض في العديد من الأمراض العصبية ، وبالتالي فهي نوع من الخلايا المثيرة للاهتمام للعمل معها. يمكن استخدام الخلايا الفلكية للدراسات الميكانيكية أو الدراسات الأيضية أو فحوصات اختبار المخدرات وعادة ما تزرع كخلايا أحادية. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا الفلكية في نظم الثقافة المشتركة مع الماوس أو الخلايا العصبية البشرية لتقييم تأثير الخلايا الفلكية على بقاء الخلايا العصبية ومورفولوجيا، وكلاهما قراءات جيدة لاختبار المخدرات34.
من أجل استخدام هذا البروتوكول بنجاح، يجب أن يتم الأخذ بعين الاعتبار بعض النقاط والقيود المحتملة. الخلايا الليفية الجلد البشري على سبيل المثال تختلف اختلافا كبيرا في معدل انقسام الخلايا، فضلا عن الاستجابة لنواقل الفيروسية. وبما أن هذه ليست خطوط الخلايا الموحدة، فهي متغيرة مثل البشرية نفسها، كل سطر مختلف. أما بالنسبة للعديد من أساليب إعادة البرمجة، فمن الأسهل إعادة برمجة الخلايا الليفية التي لديها معدل انقسام الخلايا المعتدلة إلى السريعة مقابل الخلايا التي بالكاد تكرر. يمكن أن يتأثر معدل النسخ المتماثل بجودة خزعة الجلد ومعالجة نفسه ، من خلال عدد مرور الخلايا الليفية وكذلك المناولة. عند العمل مع الخلايا الليفية الجلدية الأولية، من المهم عدم السماح للخلايا الحصول على كثيفة جدا لتجنب تحريض الشيخوخة. إذا كانت الخلايا الليفية لا تنمو بشكل جيد ، فمن الأفضل تجربة مخزون جديد أو ممر أقل ، على الرغم من أنه في بعض الحالات ، يمكن أن يلعب المرض نفسه دورا أيضا. يمكن تحسين انقسام الخلايا في بعض الأحيان باستخدام 15٪ أو 20٪ FBS في وسائط الخلايا الليفية مقارنة ب 10٪ القياسية.
نوعية إعادة برمجة ناقلات الفيروسية ذات أهمية كبيرة للنجاح. في أيدينا، كانت ناقلات الفيروسات الرجعية أكثر كفاءة بالمقارنة مع ناقلات العدسية أو غيرها من الفيروسات غير المتكاملة؛ ومع ذلك ، يمكن أن يعتمد هذا على جودة النواقل الفيروسية والنقاء. مجموعات ناقلات الفيروسات الرجعية التجارية عادة تحديد تركيز ناقلات الفيروسية وغالبا ما أيضا تعدد العدوى لخط الخلية معينة. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الخلايا الليفية الأولية تختلف عن خط الخلية المستخدمة من قبل الشركات لتحديد امتصاص ناقلات الفيروسية. وعلاوة على ذلك، حتى عند طلب نفس المجموعة التجارية، والاختلاف بين دفعات أمر شائع. وعلاوة على ذلك، فإن امتصاص ناقلات الفيروسية يختلف أيضا بين خطوط الخلايا الليفية. يمكن أن تكون بعض الخطوط أكثر حساسية وبالتالي يمكن أن تموت الخلايا المنقولة ، في حين أن خطوط الخلايا الأخرى قد تكون أكثر مقاومة لامتصاص الفيروس. وبالتالي، يمكن تحديد كفاءة النقل لخط خلية معينة تكون مهمة خاصة إذا كان خط الخلية ينمو ببطء أو فشلت محاولات التحويل السابقة. في أيدينا ، فإن أفضل طريقة لتقييم مقدار ناقل فيروسي معين مطلوب للتحويل هي إجراء تلطيخ مناعي مع العديد من التخفيفات من الناقل الفيروسي. ويمكن بعد ذلك حساب عدد الخلايا التي تعبر عن المتحول لكل متجه، بهدف تحقيق كفاءة في النقل بنسبة 70 في المائة أو أكثر. في تجربتنا، يمكن استخدام MOIs مماثلة لمعظم خطوط الخلية ولكن يمكن تعديل وزارة الداخلية إذا لزم الأمر.
أثناء عملية التحويل، من الضروري عدم تقسيم الخلايا مبكرا جدا. يعتمد الوقت حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام على عوامل متعددة بما في ذلك خط الخلية الأساسي وخصائصه وجودة الناقل الفيروسي المستخدم وجودة الوسائط. الأهم من ذلك ، فإن معدل نجاح التحويل أعلى بكثير عندما يتم الاحتفاظ بالخلايا بكثافة عالية. حتى لو بدأت الخلايا في تغيير مورفولوجيا، فمن الأفضل ترك الخلايا في أول أطول بكثير من تقسيمها قبل الأوان. إذا حدث الانقسام في وقت مبكر جدا التحويل يمكن أن تتوقف في تقدمها وتؤدي الخلايا للتمييز مرة أخرى إلى شكل مثل الخلايا الليفية والسلوك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تمييعها في وقت مبكر جدا إلى أجسام خلايا أكثر استطالة مقارنة بأجسام الخلايا الصغيرة والمدمجة للشخصيات التي لوحظت سابقا. وبالتالي، ينبغي أن تكون الانقسامات الأولى محافظة دائما؛ وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة من الانقسامات، وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة فمن الأفضل للحفاظ على الخلايا كثيفة جدا مع انقسام 1:1 أو 1:2 مقارنة مع تمييع لهم أكثر من اللازم. ومن المتوقع حدوث بعض وفيات الخلايا بعد الانقسام الأولي. من الجدير بالذكر أن الخلايا تبدو دائما أسوأ (تملق) في اليوم الأول بعد تقسيم، وهو أمر طبيعي. وينبغي أن يكون أفضل الأحكام على شكل الخلية 2-3 أيام في وقت لاحق. والأهم من ذلك أن نوعية عوامل النمو ومكونات وسائط الإعلام أمر بالغ الأهمية أيضا. من المهم إعداد كميات صغيرة من الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو بحيث يتم استخدام الوسائط المعدة بالكامل فقط لمدة 5-7 أيام كحد أقصى. لا تبقي الوسائط في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. استخدمها بسرعة ثم قم بتبريدها بمجرد إجراء تغيير الوسائط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يساعد الحفاظ على مستوى صوت الوسائط منخفضا عند 1 مل بدلا من 2 مل خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا الأكثر مقاومة للتحويل. إذا كانت الخلايا تستهلك وسائل الإعلام بسرعة، والتي يمكن ملاحظتها عن طريق تغيير في شكل لون الوسائط الأحمر إلى الأصفر (معدل الحموضة)، وضبط حجم وسائل الإعلام إلى ما يصل إلى 2 مل. 10 - ويعتبر الاستهلاك السريع لوسائط الإعلام علامة إيجابية، وكثيرا ما يلاحظ في مراحل لاحقة من التحويل إلى جانب زيادة الانتشار.
كما أن الشخصيات غير المكتتة بالشخصيات حساسة جدا لوجود الأكوتاسي في وسائط الإعلام، ومن المهم جدا أن تبقي فترة حضانة الأكوتاسي قصيرة. نوصي بفترة حضانة مدتها 2-4 دقائق ، وفحص الخلايا بشكل متكرر تحت المجهر لمعرفة متى انفصلت. من الضروري طرد الخلايا بعد تقسيمها لإزالة مزيج الإنزيم من الوسائط. من المهم أيضا أن نأخذ رقم المرور في الاعتبار حيث يمكن أن تتغير خطوط الخلية عند الاستزراع الممتد مما يؤدي إلى تغيير ملامح التعبير. وبالتالي، من المهم تجميد العديد من مخزونات الخلايا في الممرات المبكرة. يجب تجميد الخلايا في 10٪ DMSO و 90٪ وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. بسبب عدم وجود مصل في هذه الوسائط من الأهمية بمكان ضمان تجميد بطيء باستخدام غرف التجميد وتجميد مرة واحدة بين عشية وضحاها، ونقل فورا إلى النيتروجين السائل. في حين لا يتم إجراء اختيار كلونال في هذا البروتوكول، فمن الممكن أن الاستزراع الموسع والتمريرة يؤدي إلى الانتقاء الطبيعي للسكان الخلية الأولية مع النمو مواتية ومعدل البقاء على قيد الحياة. لذلك ، من المهم أن نأخذ رقم المرور والمناولة في الاعتبار عند إجراء التجارب. نحن نفضل استخدام مقاطع أقل للتجارب ، إذا كان ذلك ممكنا ، لا نتجاوز تمرير خطوط الخلية لأكثر من 20 مرة. وبما أن المركبات غير الوطنية تنمو بسرعة، يمكن تجميد أعداد كبيرة من المخزونات في ممرات أدنى للتجارب. خطوط الخلايا ذات معدلات النمو المرتفعة بشكل خاص هي أكثر عرضة لتحمض وسائل الإعلام. وهكذا، ومع نمو خطوط الخلايا بسرعة مختلفة، قد تحتاج كمية الوسائط إلى تعديل استنادا إلى الانتشار. إذا تركت الخلايا باستمرار في وسائل الإعلام المحمضة للغاية، فإنه يمكن أن تؤثر على صحة كل من السيطرة وخطوط خلايا المرض. وهذا يؤدي حتى الخلايا الفلكية صحية لتصبح رد الفعل، مما يؤثر على استخدامها في مزيد من التمايز والتجارب.
بالنسبة لتمايز الخلايا الفلكية ، من المهم الحفاظ على الخلايا في كثافة منخفضة حيث أن الكثافة العالية ستمنع الخلايا من التفريق وستواصل الانتشار بمعدلات أعلى. وبالتالي، يجب تعديل كثافة البذر لكل خط خلية يعتمد على معدل انتشارها. نوصي بتجربة كثافات البذر المختلفة وتنفيذ البقع / RT-PCR مع علامات الخلايا الفلكية لضمان التمايز المناسب. يمكن تقييم جودة IAs جنبا إلى جنب مع الضوابط الصحية باستخدام المقايسات الثقافة المشتركة مع الخلايا العصبية. شريطة أن لا يؤدي مرض الأمراض إلى النمط الظاهري التفاعلي ، يجب أن تظل الخلايا العصبية قابلة للحياة في اتصال مع iAs لعدة أيام. يمكن أن يختلف مورفولوجيا الخلايا الفلكية بشكل كبير بين خطوط الخلايا الفردية ويمكن أن يتأثر بالنمط الظاهري للمرض أيضا. وعلاوة على ذلك، في الأمراض التي تتأثر فيها الخلايا الفلكية بشكل كبير، فإنها قد تظهر النمط الظاهري التفاعلي مع تمديدات كبيرة ممدود.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر جميع المرضى والمتطوعين الأصحاء على التبرع بعينات حرجة للدراسات البحثية. وعلاوة على ذلك، نشكر روشيل رودريغو على المساعدة التقنية المستمرة من الخبراء في زراعة الأنسجة ولورا فيرايولو لتأكيدها بشكل مستقل هذه التقنية في مختبرها كمتعاون. تلقى هذا العمل تمويلا من المعاهد الوطنية الأمريكية للمنح الصحية R01 NS644912-4 وRC2 NS69476-01 (إلى A.L.S.) ومركز باكارد لمنحة أبحاث ALS P2ALS ومؤسسة ربط المساعدة. كما تلقت .M تمويلا من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، فضلا عن جائزة تطوير المحققين الشباب من رابطة ضمور العضلات، وصندوق بحوث متلازمة ريت، وأسر مؤسسات SCN2A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
References
- Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
- Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
- Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).
- Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
- Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
- Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
- Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
- Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
- Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
- Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
- Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
- Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
- Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
- Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
- Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M.
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
- Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
- Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
- Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
- Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
- Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
- Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11 (2001).
- Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
- Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).
