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Neuroscience

फाइब्रोब्लास्ट से न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स में भेदभाव से सीधे रूपांतरण का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए इन विट्रो मॉडलिंग

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/62016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2College of Medicine, The Ohio State University

Summary

हम प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (iNPCs) में मानव त्वचा से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट को फिर से प्रोग्राम करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और उनके बाद में प्रेरित एस्ट्रोसाइट्स (आईएएस) में भेदभाव। इस विधि से बड़ी मात्रा में आईएनपीसी और आईए का तेजी से और प्रजनन योग्य उत्पादन होता है।

Abstract

न्यूरोलॉजिकल विकारों पर अनुसंधान मुख्य रूप से रोग तंत्र पर न्यूरॉन्स के प्रभाव पर केंद्रित है। पशु मॉडलों की सीमित उपलब्धता गंभीर रूप से रोग के लिए सेल प्रकार विशिष्ट योगदान के अध्ययन को प्रभावित करती है। इसके अलावा, पशु मॉडल आमतौर पर मानव रोगियों में देखे गए उत्परिवर्तन और रोग पाठ्यक्रमों में परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) के उत्पादन के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग तरीकों रोगी विशिष्ट अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव किया है और रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण बनाया है । हालांकि, आईपीएससी प्रौद्योगिकी में समय, श्रम प्रतिबद्धता, क्लोनल चयनशीलता और एपिजेनेटिक मार्कर की हानि जैसे नुकसान हैं। इन तरीकों के हालिया संशोधनों से सेल वंश या विशिष्ट कोशिका प्रकारों की अधिक प्रत्यक्ष पीढ़ी की अनुमति होती है, क्लोनल अलगाव या एक pluripotent स्टेम सेल राज्य को दरकिनार करते हुए। हमने न्यूरलाइजिंग मीडिया के संयोजन में रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करते हुए त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (आईएनपीसी) को उत्पन्न करने के लिए एक तेजी से प्रत्यक्ष रूपांतरण विधि विकसित की है। iNPCs को न्यूरॉन्स (आईएनएस) ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (आईओएस) और एस्ट्रोसाइट्स (आईओएस) में विभेदित किया जा सकता है। आईएएस उत्पादन तेजी से दवा और रोग तंत्र परीक्षण की सुविधा के रूप में iNPCs से भेदभाव केवल 5 दिन लगते हैं । इसके अलावा, आईएएस के साथ काम करना आसान है और बड़ी संख्या में शुद्ध आबादी में उत्पन्न होता है। हमने कई न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए माउस जीएफपी + न्यूरॉन्स और रोगी व्युत्पन्न आईए का उपयोग करके एक अत्यधिक प्रजनन योग्य सह-संस्कृति परख विकसित की। महत्वपूर्ण बात, आईए परख ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप के लिए स्केलेबल है एक थाली में कई छोटे अणुओं के मूल्यांकन की सुविधा । यह दृष्टिकोण विविध आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ कई रोगी कोशिका लाइनों के एक साथ चिकित्सीय मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक परख में कई यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए आईए और क्षमता का आसान उत्पादन और भंडारण व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए अनुकूलनीय इस पद्धति को प्रस्तुत करता है।

Introduction

अंतर्निहित रोग तंत्र को समझना न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संभावित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायक होता है। जबकि पशु मॉडल ऐतिहासिक रूप से तंत्रिका तंत्र के रोगों पर शोध करने के लिए सोने का मानक रहा है, एक नैदानिक सेटिंग में संभावित चिकित्सा का सीधा अनुवाद अक्सर सीमित सफलता1,2,3दिखाता है। अनुवाद की कमी के कारण आनुवंशिक पृष्ठभूमि और चूहों में उत्परिवर्तन की परिवर्तनशीलता की कमी, रोग फेनोटाइप का अधूरा प्रदर्शन और दवा संवेदनशीलता में भिन्नता या मानव रोगियों में डोजिंग हैं जो इनस्ल माउस उपभेदों में अच्छी तरह से चित्र नहीं हैं। इसके अलावा, कई दुर्लभ न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए, कोई या कुछ पशु मॉडल उपलब्ध हैं। प्रासंगिक मानव कोशिका प्रकारों में सीधे रोग तंत्र का अध्ययन अनुसंधान की सुविधा और क्लिनिक के लिए अनुवाद में सुधार कर सकता है । सीएनएस विकारों के लिए, प्राथमिक मानव कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना मुश्किल है और एक बहुत ही सीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि बायोप्सी आक्रामक हैं या केवल रोग के अंतिम चरण में पोस्टमार्टम प्राप्त किया जा सकता है। पिछले 15 वर्षों में, सेलुलर रीप्रोग्रामिंग तकनीक के विकास ने तेजी से विट्रो में मानव न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को मॉडल करने की क्षमता का विस्तार किया है।

सेल रीप्रोग्रामिंग के पारंपरिक तरीकों में फाइब्रोब्लास्ट या अन्य सेल प्रकारों को प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) में शामिल किया गया है जो सभी तीन रोगाणु परतों से सेल प्रकारों में अंतर करने में सक्षम है4। ताकाहाशी और यामानाका सबसे पहले यह दर्शाते थे कि चार स्टेम सेल ट्रांसक्रिप्शन कारकों की पुनः अभिव्यक्ति आईपीएससी5 बननेके लिए दैहिक कोशिकाओं को रीडायरेक्ट करने के लिए पर्याप्त है । इसके बाद आईपीएससी को विशिष्ट सेल प्रकारों में और अधिक अंतरित किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया की कमी यह है कि यह श्रम गहन और स्थिर स्टेम सेल क्लोन उत्पन्न करने और अलग करने के लिए समय लेने वाली है। स्टेम सेल क्लोन में मदर सेल के दैहिक उत्परिवर्तन या विशिष्ट एबरेंसी भी बनाए रखे जाते हैं और अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं6. इसके अलावा, बढ़ते साक्ष्य ों से पता चलता है कि कोशिकाओं को रोकने के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग प्रक्रिया मूल्यवान एपिजेनेटिक परिवर्तनों को मिटाती है जो सेलुलर रोग तंत्र4,7,8को प्रभावित कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने संशोधित पुनर्प्रोग्रामिंग विधियों पर ध्यान केंद्रित किया, जिससे विभिन्न सेल प्रकारों की अधिक प्रत्यक्ष पीढ़ी की अनुमति दी गई, जबकि pluripotent स्टेम सेल राज्य9,10,11,12 (13, 14में समीक्षा) को दरकिनार करतेहुए। प्रारंभिक सफलताओं से पता चला है कि कार्डियोमायोसाइट्स15,न्यूरॉन्स16 और हेपेटोसाइट्स17 को फाइब्रोब्लास्ट के विट्रो स्ट्रेंथेरियल रीप्रोग्रामिंग में कई वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों या माइक्रोआरएनए18की एक्टोपिक अभिव्यक्ति द्वारा पता चला। इसके बाद19,20के दशक में न्यूरोलॉजिकल विकारों को मॉडल करने के लिए कोशिकाओं को सीधे रीप्रोग्रामिंग करने का अध्ययन किया गया । जैसा कि ऊपर बताया गया है, इस तरह के प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग या रूपांतरण प्रोटोकॉल में शास्त्रीय आईपीएससी प्रोटोकॉल पर संभावित फायदे हैं जिनमें गति और क्लोनल अलगाव कदम का एब्लेशन शामिल है। इसके अलावा, साक्ष्य ों से पता चलता है कि ये प्रोटोकॉल रोगी की आयु से संबंधित अधिक मात्रा में एपिजेनेटिक जानकारी बनाए रखने की अनुमति देते हैं और संभावना है कि रोग प्रासंगिक मार्कर7,8के लिए भी सही है ।

आज तक, न्यूरोलॉजिकल विकारों पर सबसे अधिक विट्रो अनुसंधान मुख्य रूप से न्यूरॉन्स पर केंद्रित किया गया है। हालांकि, यह सर्वविदित है कि एस्ट्रोसाइट्स जैसे अन्य सेल प्रकार, माइक्रोग्लिया और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स रोग विकृति और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग (एचडी), मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस), और अन्य न्यूरोलॉजिकल पैथोलॉजी जैसे रिटेट सिंड्रोम (आरटीटी), स्लीप डिसऑर्डर, एडिक्शन,, मिर्गी, lysosomal भंडारण विकार, अवसाद, माइग्रेन और रोग दर्द21,22,23, 24,25,26। एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार हैं और हाल ही में, उन्हें पैथोलॉजिकल दृष्टिकोण से मोटे तौर पर उपेक्षित किया गया है7। वे अब स्वस्थ सीएनएस के लगभग सभी homeostatic कार्यों का समर्थन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है । इसके अतिरिक्त, यह स्पष्ट है कि उनका एक महत्वपूर्ण रोग प्रभाव है और रोग तंत्र को समझने और चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने में बहुत मूल्यवान हैं19।

वर्तमान विवरण में, हम मानव रोगी फाइब्रोब्लास्ट को प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (आईएनपीसी) में सीधे रूपांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, जिसमें यामानाका रीप्रोग्रामिंग कारकों (Klf4, Oct3/4, Sox2 और सी-Myc) को व्यक्त करने वाले रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करके और बाद में तंत्रिकाकरण मीडिया के संपर्क में आता है। पिछले अध्ययनों ने तंत्रिका कोशिकाओं (14में समीक्षा) के लिए सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए ट्रांसक्रिप्शनल कारकों के विभिन्न संयोजनों का उपयोग किया है, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कारक मोटे तौर पर वायरल वैक्टर के घर उत्पादन के लिए प्लाज्मिड के रूप में उपलब्ध हैं, या वायरल पुनर्प्रोग्रामिंग किट जाने के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं। परिणामस्वरूप iNPCs को न्यूरोलॉजिकल रोगों में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएनएस)27,ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (आईओएस)24 और एस्ट्रोसाइट्स (आईओएस)19 में और अंतर किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में आईपीएससी की समय-लेने वाली पीढ़ी शामिल नहीं है जो सबसे अधिक उपलब्ध प्रोटोकॉल मानव एस्ट्रोसाइट्स28के व्युत्पन्न के लिए उपयोग करते हैं। लगभग 98% से 100% सीधे पुनर्प्रोग्राम किए गए iNPCs जीएफएपी-पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स29 में अंतर कर सकते हैं, जबकि फाइब्रोब्लास्ट से एस्ट्रोसाइट्स30तक प्रत्यक्ष रूपांतरण विधि का उपयोग करके केवल 2% की तुलना में। हाल ही में, हमारे वर्णित पुनर्प्रोग्रामिंग विधि का उपयोग करके एक तुलनात्मक प्रतिलिपि अध्ययन से पता चला है कि दाता फाइब्रोब्लास्ट से पुनर्प्रोग्राम किए गए iNPCs प्रतिलेखन और कार्यात्मक स्तर पर वृद्धावस्था सुविधाओं को बनाए रख सकते हैं जो आयु मिलान वाले पोस्टमॉर्टम एस्ट्रोसाइट्स और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स29के समान है। इस प्रकार, यह रूपांतरण प्रोटोकॉल रोग तंत्र की जांच करने और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

यहां हम iNPCs उत्पन्न करने और आईए में आगे भेदभाव करने के लिए उपयोग किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बड़े पैमाने पर छोटे आणविक स्क्रीनिंग परख के लिए सबसे उपयुक्त हैं। रोग तंत्र और आईओएस के साथ दवा परीक्षण न्यूरॉन्स या मेटाबोलिक और जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ सह संस्कृतियों के रूप में विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रणाली का लाभ आईपीएससी की तुलना में इन सेल लाइनों की गति और रखरखाव में आसानी है। इसके अलावा, आईए भेदभाव के लिए छोटे भागों में iNPCs जमे हुए किया जा सकता है जो समय की विस्तारित अवधि में निरंतर परिस्थितियों में दवा परीक्षण की सुविधा प्रदान करता है । कुल मिलाकर, बड़े नमूना संख्या की तुलना इस तरह संभव हो जाती है जो एक बड़े और अधिक प्रतिनिधि रोगी आबादी में यौगिकों की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए दरवाजा खोलता है।

Protocol

मीडिया अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) मिश्रण करने के लिए राशि अंतिम एकाग्रता (%)
फाइब्रोब्लास्ट मीडिया डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज, ग्लूटामैक्स 500 एमएल 89
भ्रूण गोजातीय सीरम 50 एमएल 10
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक 5 एमएल 1
बेस मीडिया DMEM/F12 + ग्लूटामैक्स 500 एमएल 97
एन-2 5 एमएल 1
बी-27 5 एमएल 1
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक 5 एमएल 1
रूपांतरण मीडिया बेस मीडिया 50 एमएल 99.9
एफजीएफ 1 माइक्रोल 0.02 (20 एनजी/एमएल)
ईजीएफ 1 माइक्रोल 0.02 (20 एनजी/एमएल)
हेपरिन 50 माइक्रोन 0.1 (5 μg/mL)
न्यूरल प्रोजेनिटर सेल (एनपीसी) मीडिया DMEM/F12 + ग्लूटामैक्स 500 एमएल 96.9
एन-2 5 एमएल 1
बी-27 5 एमएल 1
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक 5 एमएल 1
एफजीएफ 10 यूएल 0.002
एस्ट्रोसाइट मीडिया डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज, ग्लूटामैक्स 500 एमएल 89
भ्रूण गोजातीय सीरम 50 एमएल 10
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकॉटिक 5 एमएल 1
एन-2 1 एमएल 0.2
मीडिया को सभी घटकों को मिलाने के बाद फ़िल्टर किया जाना चाहिए। रूपांतरण मीडिया (कारकों के साथ) हर हफ्ते ताजा तैयार किया जाना चाहिए।

तालिका 1. प्रोटोकॉल में शामिल सभी सेल प्रकार के लिए मीडिया व्यंजनों। मीडिया को बड़ी मात्रा या सिरिंज और 0.2 उम सिरिंज फिल्टर के लिए बाँझ वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली के साथ सभी घटकों को मिलाने के बाद फ़िल्टर किया जाना चाहिए। रूपांतरण मीडिया (कारकों के साथ) हर हफ्ते ताजा तैयार किया जाना चाहिए।

1. न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं में वयस्क मानव फाइब्रोब्लास्ट का सीधा रूपांतरण

नोट: इस प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध समय रेखा मेयेर (२०१४)19में समीक्षा की जा सकती है ।

  1. प्राथमिक मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें जो सेल बैंकों या त्वचा बायोप्सी31से प्राप्त किए जा सकते हैं। 5% सीओ2 टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर सेल। प्रयोग में उपयोग करने से पहले कम से कम 1-2 मार्ग के लिए मार्ग कोशिकाएं विगलन पोस्ट करती हैं। एक बार कोशिकाओं के लिए तैयार कर रहे हैं, 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मानव फाइब्रोनेक्टिन (1:200 PBS में पतला) के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक अच्छी तरह से कोट ।
  2. जब कोशिकाएं चढ़ाए जाने के लिए तैयार हों, तो डिश से फाइब्रोनेक्टिन को हटा दें और तुरंत सेल सॉल्यूशन या फाइब्रोब्लास्ट मीडिया(टेबल 1)के 2 एमएल जोड़ें - मीडिया जोड़ने से पहले डिश को सूखने न दें। कोशिकाओं को कितनी तेजी से बढ़ने के आधार पर, प्लेट 150,000 (तेजी से बढ़ रही है) - 200,000 (धीमी गति से बढ़ रही) फाइब्रोब्लास्ट एक मानव फाइब्रोनेक्टिन के दो कुओं में लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट प्रत्येक।
    नोट: कोशिकाओं को वायरल ट्रांसडक्शन के लिए लगभग 70% कॉन्फ्ल्यूंट होना चाहिए ताकि उन्हें ट्रांसडक्शन के बाद कई और दिनों तक एक ही प्लेट में रखने में सक्षम हो सके। रूपांतरण के लिए अगले दिन एक विकल्प के लिए दो अलग-अलग घनत्व पर बीज करना फायदेमंद हो सकता है।
  3. सीडिंग के बाद के दिन, माइक्रोस्कोप के नीचे फाइब्रोब्लास्ट की जांच करें और सेल घनत्व (70-85%) के बीच सत्यापित करें और यहां तक कि इष्टतम परिणामों के लिए अच्छी तरह से बोने।
  4. सभी चार रेट्रोवायरल वैक्टर (Oct3/4, Klf4, Sox2 और सी-Myc) के साथ एक अच्छी तरह से ट्रांसड्यूस -संक्रमण की बहुलता (MOI) तेजी से बढ़ रही है या धीमी गति से बढ़ते फाइब्रोब्लास्ट के लिए 15 के लिए 10 का उपयोग करें (प्रत्येक वेक्टर के लिए अधिक सकारात्मक कोशिकाओं से अधिक होना चाहिए) । 5% सीओ2 टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 1 मिलीएल प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा में वायरल मिश्रण के लिए नियमित फाइब्रोब्लास्ट माध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। दूसरी अच्छी तरह से अनुपचारित छोड़ दें और कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस करें।
    नोट: रेट्रोवायरल वैक्टर एक विक्रेता द्वारा खरीदा जा सकता है या घर में बनाया, प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध है३२।
  5. ट्रांसडक्शन के बाद दिन, पीबीएस के साथ 1x कोशिकाओं को धोएं और ताजा फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  6. अगले दिन माध्यम बदलकर रूपांतरण माध्यम करें। अवशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के साथ 1x कोशिकाओं को धोएं, और फिर रूपांतरण माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। अनुपचारित अच्छी तरह से रूपांतरण मीडिया के लिए मीडिया के रूप में अच्छी तरह से बदलें ।
    नोट: फाइब्रोब्लास्ट पर मीडिया को बदलकर भी कुछ रूपात्मक परिवर्तन देखे जा सकते हैं जिन्हें रेट्रोवायरल वेक्टर उपचार प्राप्त नहीं हुआ था, इस प्रकार वायरल वैक्टर के प्रभाव का निर्धारण करते समय एक अनुपचारित अच्छी तरह से (वैकल्पिक) सहायक होगा। कोशिकाओं को रूपांतरण मीडिया पर स्विच करने के 2-4 दिन बाद आकृति विज्ञान बदलना शुरू कर देना चाहिए।
  7. माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें और आकृति विज्ञान(चित्रा 1)में परिवर्तन के लिए देखें। सेल मीडिया को रूपांतरण प्रक्रिया (रूपांतरण मीडिया के 1-2 एमसीएल, तालिका1) और बाद में आईएनपीसी संस्कृति के लिए दैनिक रूप से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करते हुए कि कोशिकाएं शेष 30% मीडिया में कवर रहें, ध्यान से 70% माध्यम को कुएं से हटाकर माध्यम बदलें।
    नोट: इसमें विकास कारकों के साथ मीडिया को तैयारी के 1 सप्ताह के भीतर भस्म करने की आवश्यकता है।
    1. कोशिकाओं का निरीक्षण करना जारी रखें और मीडिया को दैनिक (रूपांतरण मीडिया का 1-2 एमसीए) बदलें।
    2. कुछ सेल लाइनें गेंद जैसे संरचनाओं या ढीले न्यूरोनल क्षेत्रों(पूरक चित्र 1 और 19,33)में बढ़ती ढीली ऊंचा गोल संरचनाएं बनाने लगती हैं) । इन कोशिकाओं को अलग न करने का ध्यान रखें। यदि गेंदें अलग हो जाती हैं, तो उन्हें 6-अच्छी प्लेट के एक नए फाइब्रोनेक्टिन लेपित में एकत्र किया जा सकता है और फिर से चढ़ाया जा सकता है।
      नोट: यदि वे अपने दम पर विस्तार कर रहे हैं, कोशिकाओं प्रारंभिक थाली की तुलना में विविधता कम हो जाएगा और एक साफ़ अलग सेल लाइन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । हम बंटवारे के अगले दौर में परिवर्तित कोशिकाओं के बाकी के साथ इन कोशिकाओं के संयोजन की सलाह देते हैं ।
  8. रूपांतरण मीडिया में लगभग 5-6 दिनों के बाद (कठिन सेल लाइनों के लिए 12 दिनों तक) या जब कोशिकाएं बहुत घनी हो जाती हैं, तो उन्हें 1:2 या अधिकतम 1:3 मार्ग करें।
    नोट: रूपांतरण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर रखना बहुत महत्वपूर्ण है।

2. रूपांतरण और आईएनपीसी बंटवारे की प्रक्रिया

  1. कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए सेल टुकड़ी समाधान (जैसे, एक्यूटास) को गर्म करें और फाइब्रोनेक्टिन (पीबीएस में 1:200, कोटिंग वॉल्यूम के 1 एमएल) के साथ 6-वेल के कुओं की एक उपयुक्त संख्या कोट करें। फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग नकारात्मक प्रभाव के बिना लंबी हो सकती है, लेकिन कोटिंग समय को छोटा नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  2. किसी भी कोशिकाओं को अलग किए बिना पीबीएस के साथ कोशिकाओं को ध्यान से धोएं (कोशिकाओं पर धीरे-धीरे पीबीएस लागू करने के लिए अच्छी तरह से दीवार का उपयोग करें)। पीबीएस को पिपेट या आकांक्षा के साथ सावधानी से हटा दें।
  3. एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल टुकड़ी समाधान और 2-3 मिनट इनक्यूबेट के 0.5 मिलीएल जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करने के लिए सत्यापित करें कि ज्यादातर कोशिकाओं को अलग कर दिया है । यदि सभी कोशिकाएं बंद हो गई हैं, तो ताजा रूपांतरण मीडिया के 2 एमएल जोड़ें और झुरमुट (यदि आवश्यक हो) को अलग करने के लिए धीरे-धीरे 2-3 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  4. कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और सेल टुकड़ी समाधान को और पतला करने के लिए मीडिया के अतिरिक्त 3 एमएल जोड़ें। सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है सुनिश्चित करने के लिए पहले अतिरिक्त मीडिया के साथ अच्छी तरह से धो लें ।
  5. कमरे के तापमान पर 200 x ग्राम पर 4 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    नोट: कोशिकाओं या iNPCs परिवर्तित मीडिया में सेल टुकड़ी समाधान की उपस्थिति के प्रति बेहद संवेदनशील हैं । अपकेंद्री और सुपरनैंट की वापसी से अवशिष्ट एंजाइम को हटाना नितांत आवश्यक है।
  6. सेल पेलेट से सुपरनेट निकालें और ताजा माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। सेल झुरमुटों को हल करने के लिए धीरे-धीरे 2-3 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। लेपित 6-कुओं से फाइब्रोनेक्टिन निकालें और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल ताजा मीडिया जोड़ें (फाइब्रोनेक्टिन को सूखा न दें)। 1:2 के विभाजन अनुपात के लिए, एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 0.5 एमएल और दूसरे कुएं में अन्य 0.5 एमएल जोड़ें।
    1. एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं।
  7. उत्तर-दक्षिण-पूर्व-पश्चिम दिशा (गोलाकार नहीं) में 6-कुएं को धीरे-धीरे हिलाकर कोशिकाओं को वितरित करें और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में डाल दें।
  8. अगले दिन माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें और मीडिया (1-2 मिलील) बदलें। हर दिन मीडिया बदलें जब तक कोशिकाओं को फिर से विभाजित होने के लिए तैयार हैं ।
    नोट: इस बिंदु पर, सेल प्रसार में तेजी लाने के लिए शुरू कर देना चाहिए, और कोशिकाओं को 2-3 दिनों के भीतर एक दूसरे विभाजन के लिए तैयार होना चाहिए (बहुत धीमी गति से बढ़ती लाइनों के लिए 4 दिन) ।
    1. इस नए विभाजन पर, रूपांतरण मीडिया में कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से बीज और एनपीसी मीडिया मेंअन्य अच्छी तरह से EGF के बिना वृद्धि की एकाग्रता पर केवल FGF युक्त/
      नोट: कुछ सेल लाइनें लगभग 10 दिनों के बाद रूपांतरण मीडिया में स्थिर स्थिति तक पहुंचती हैं और एनपीसी मीडिया में स्विच करने से सेल विकास में मदद मिल सकती है। इसके अलावा, एनपीसी मीडिया19में उगाए जाने पर एनपीसी का आकार अधिक विशिष्ट, छोटा आकार होता है । इस बिंदु पर, iNPCs भेदभाव और आगे के उपयोग के लिए तैयार हैं।
  9. आईएनपीसी के मीडिया (1-2 एमएल) को रोजाना बदलते रहें।
    1. 6-कुएं के दो या तीन लवतान कुओं को मिलाकर 10 सेमी व्यंजनों में एनपीसी का विस्तार करें। 10 सेमी व्यंजन के लिए मीडिया की मात्रा आम तौर पर 12-15 एमएल है।
    2. अगले विभाजन पर, सेल स्टॉक की बड़ी संख्या की पीढ़ियों के लिए इन कोशिकाओं को तीन या चार 10 सेमी व्यंजन (मीडिया के 12-15 एमएल) तक विस्तारित करें। 10 सेमी व्यंजन आमतौर पर प्रसार दर के आधार पर हर 3-4 दिनों में 1:3 या 1:4 पर विभाजित होते हैं।

3. एनपीसी से प्रेरित एस्ट्रोसाइट्स पैदा करना

  1. ताजा iNPCs से एस्ट्रोसाइट्स बनाने के लिए, बीज iNPCs (10 सेमी फाइब्रोनेक्टिन कोटेड प्लेटों में) सीधे 10 मिलीएल एस्ट्रोसाइट माध्यम(तालिका 1)में ताकि वे अगले दिन लगभग 10% नरमी से हों। 5% सीओ2 टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर सेल।
    नोट: अनुशंसित सीडिंग घनत्व आमतौर पर एनपीसी के 10 सेमी डिश के सेल रीसस्स्पेशन का 50 माइक्रोन होता है, बशर्ते कि उन्हें अपने विभाजन अनुपात के आधार पर अंतिम मात्रा में पतला किया जाता है (उदाहरण के लिए, 1:3 विभाजन के लिए 3 एमएल, 1:4 विभाजन के लिए 4 एमएल, आदि)।
  2. चढ़ाना के तीन दिन बाद आईएएस का माध्यम (10 एमएल एस्ट्रोसाइट मीडिया) बदलें। कोशिकाओं को 5-7 दिनों तक अलग रखें।
    नोट: iAs कई मार्गों को अच्छी तरह से बर्दाश्त नहीं करते हैं, इसलिए एनपीसी को विभाजित करने के बाद हर बार ताजा एस्ट्रोसाइट्स बनाना बेहतर होता है।
  3. प्रयोग के लिए बीज के लिए, एस्ट्रोसाइट्स को ट्रिप्सिन या सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग करके विभाजित करें जैसा कि चरण 2.1-2.7 में वर्णित है। अनुशंसित सीडिंग घनत्व तालिका 2में शामिल हैं।
प्लेट टाइप एस्ट्रोसाइट्स प्रति अच्छी तरह से
384-कुआं 2500
96-कुआं 10000
24-कुआं 40000
6-अच्छी तरह से 150000

तालिका 2. प्लेट क्षेत्र के अनुसार आईएएस के अनुशंसित सीडिंग घनत्व। सबसे आम ऊतक संस्कृति प्लेटों पर एक मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए वरीयता प्राप्त आईएएस की विशिष्ट संख्या।

4. जमे हुए एनपीसी शेयरों से एस्ट्रोसाइट भेदभाव के लिए तैयारी और कुछ हिस्सों को डिफ्रॉस्टिंग करना (चरण 3 का विकल्प)

नोट: संस्कृति में iNPCs को बनाए रखने के लिए एक विकल्प के रूप में, एस्ट्रोसाइट्स भी सीधे एक जमे हुए स्टॉक से उत्पादित किया जा सकता है । ऐसा करने के लिए, iNPCs छोटे भागों में जमे हुए हैं । तालिका 3 से पता चलता है ठंड और पिघलने की मात्रा का सुझाव दिया भागों के लिए एक 10 सेमी खगोलसाइट मीडिया के 10 एमएल युक्त पकवान में defrosted हो ।

भाग का आकार सेल सस्पेंशन (μL) फ्रीजिंग मीडिया (μL) कुल मात्रा (μL) में Defrosts
4x 400 400 800 दो 10 सेमी व्यंजन
2x 200 200 400 एक 10 सेमी पकवान

तालिका 3. आईए उत्पन्न करने के लिए आईएनपीसी को कैसे भाग दिया जाए, इस पर निर्देश। भागों को उत्पन्न करने के लिए iNPC निलंबन और फ्रीजिंग मीडिया का अनुपात। ध्यान दें कि अंतिम DMSO एकाग्रता 10% है जब सेल निलंबन फ्रीजिंग मीडिया के साथ मिलाया जाता है ।

  1. जमे हुए आईएनपीसी स्टॉक से एस्ट्रोसाइट्स बनाने के लिए, तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से भाग स्टॉक शीशी को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से गल जाएं। जैसे ही कोशिकाओं को डिफ्रॉस्टेड किया जाता है, 15 एमएल ट्यूब में पिपेट सेल सॉल्यूशन जिसमें 5 एमएल एस्ट्रोसाइट मीडिया होता है।
  2. 200 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। फ्रेश एस्ट्रोसाइट मीडियम के 1 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड निकालें।
  3. एक फाइब्रोनेक्टिन कोटेड 10 सेमी डिश में ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम के 9 एमएल जोड़ें और सेल सॉल्यूशन के 1 एमएल जोड़ें। उत्तर-दक्षिण-पूर्व-पश्चिम गति में कोशिकाओं का धीरे-धीरे वितरण करें। 5% सीओ2 टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर सेल।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल सीधे मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से आईएनपीसी की तेजी से और आसान पीढ़ी को यामानाका कारकों वाले रेट्रोवायरस का उपयोग करके अनुमति देता है। यह विधि स्टेम सेल राज्य और क्लोनल चयन की आवश्यकता को दरकिनार करने की अनुमति देती है, जिससे क्लोनल भिन्नता से बचा जा सके। महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखने के लिए, जबकि कोशिकाओं रूपांतरण प्रक्रिया के दौर से गुजर रहे है फाइब्रोब्लास्ट सीडिंग घनत्व, मीडिया पीएच और एक इष्टतम उदारता पर कोशिकाओं को रखने के हैं । रूपांतरण प्रक्रिया के दौरान इष्टतम बंटवारे की उदारता और आकृति विज्ञान परिवर्तन के उदाहरण चित्र 1 में पाए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1। यामानाका कारकों के रेट्रोवायरल मिश्रण को जोड़ने के बाद रूपांतरण प्रक्रिया की प्रतिनिधि छवियां। फाइब्रोब्लास्ट को वरीयता दी गई और चौबीस घंटे बाद यामानाका कारकों के साथ स्थानांतरित कर दिया गया । दो दिन बाद वायरस (डीपीवी) मीडिया को बदलकर कन्वर्जन मीडिया कर दिया गया। कोशिकाओं रूपांतरण मीडिया में सुसंस्कृत थे जब तक वे पारित करने के लिए तैयार थे (13 DPV) । कोशिकाओं को अगले दिन (14 डीपीवी) 80% संगम तक पहुंचने के लिए पोस्ट पैसेज की वरीयता दी गई थी। बाद के मार्गों ने इस घनत्व को तब तक बनाए रखा जब तक कि न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाएं तेजी से विभाजित नहीं हो जातीं। स्केल बार 200 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रूपांतरण प्रक्रिया पूरी होने के बाद, एनपीसी दृढ़ता से कम अभिव्यक्ति या फाइब्रोब्लास्ट मार्कर और आकृति विज्ञान की कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखाएगा, और एनपीसी विशिष्ट सेल मार्कर(चित्रा 2) व्यक्त करेगा। इसके अलावा, इनका उपयोग विभिन्न सेल लाइनों जैसे आईएनएस, आईओएस और आईएएस को जेनरेट करने के लिए भी किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2। रूपांतरण प्रक्रिया से गुजरने वाली कोशिकाएं सेल-विशिष्ट मार्कर व्यक्त करती हैं। रोगी फाइब्रोब्लास्ट (ए), प्रेरित न्यूरोनल जनक कोशिकाएं (iNPCs (B) और प्रेरित एस्ट्रोसाइट्स (आईएएस (सी) कोशिकाओं को 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति उपचारित प्लेट में ग्लास कवरस्लिप पर वरीयता दी गई थी। कोशिकाओं के लिए इम्यूनो दाग थे: फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट सेल मार्कर (ए), विमेंटिन (हरा) और TE7 (लाल), iNPC विशिष्ट सेल मार्कर (बी), नेस्टिन (लाल), और आईएएस सेल मार्कर (सी) GFAP (बैंगनी) और iNPC मार्कर नेस्टिन (हरा) । स्केल बार 50 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमारे अनुभव में, विशेष रूप से आईएएस दवा और रोग तंत्र परीक्षण के लिए बहुत मूल्यवान हैं क्योंकि उन्हें शुद्ध आबादी (98% या उससे अधिक GFAP सकारात्मक कोशिकाओं29)में प्रजनन योग्य बड़ी संख्या में उत्पन्न किया जा सकता है। आईए को विभाजन के दौरान कोशिकाओं का एक छोटा सा एलिकोट लेकर या पहले से जमे हुए आईएनपीसी भाग और सीधे एस्ट्रोसाइट मीडिया में चढ़ाना द्वारा iNPCs से अलग किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण विचार iNPCs प्रारंभिक सीडिंग घनत्व कम(चित्रा 3 और चित्रा 4)को बनाए रख रहे हैं, क्योंकि एक उच्च घनत्व को भेदभाव प्रक्रिया(चित्रा 4)में बाधा डालने और मीडिया पीएच पर अतिरिक्त ध्यान देने के लिए दिखाया गया है, क्योंकि एसिडिफिकेशन भी स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स को सक्रिय कर सकता है।

Figure 3
चित्रा 3। आईएनपीसी से आईएएस जनरेशन प्रक्रिया की प्रतिनिधि छवियां। आईएनपीसी को एस्ट्रोसाइट मीडिया (तालिका 1) में कम सीडिंग घनत्व पर वरीयता प्राप्त है। पहले दिन पोस्ट सीडिंग (डीपीएस) (बाएं) पर एक अच्छा सीडिंग घनत्व लगभग 10% है; हालांकि, इस घनत्व को कोशिकाओं की वृद्धि दर के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। ठेठ आईएएस आकृति विज्ञान 5 डीपीएस (मध्य) के बाद देखा जा सकता है। कुछ मामलों में, लंबे, काँटेदार एक्सटेंशन के साथ, एबररेंट एस्ट्रोसाइट आकृतिविज्ञान देखा जा सकता है। यह परिवर्तन एस्ट्रोसाइट सक्रियण का संकेत है और रोग राज्य या गलत खेती तकनीकों (दाएं) के लिए माध्यमिक हो सकता है। स्केल बार 200 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4। आईएनपीसी सीडिंग घनत्व आईए भेदभाव दक्षता को प्रभावित करता है। नियंत्रण iNPC लाइनों कम (ए) और उच्च (बी) एस्ट्रोसाइट मीडिया में घनत्व पर वरीयता प्राप्त करने के लिए भेदभाव पर बोने घनत्व के प्रभाव को प्रदर्शित किया गया । 5 डीपीएस, कम घनत्व लाइन एस्ट्रोसाइट विशिष्ट मार्कर व्यक्त की है, जबकि उच्च घनत्व लाइन एक चिह्नित iNPC की तरह आकृति विज्ञान के साथ iNPC और iAs मार्कर का मिश्रण दिखाता है । स्केल बार 50 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1. यामानाका कारकों के रेट्रोवायरल मिश्रण को जोड़ने के बाद रूपांतरण प्रक्रिया के अतिरिक्त आंकड़े। 12 डीपीवी (पारित होने से 1 दिन पहले) और 19 डीपीवी (पारित होने के 6 दिन बाद) पर रूपांतरण प्रक्रिया की छवियां। मार्ग से पहले और बाद में कोशिकाओं के बीच आकृति विज्ञान पर अंतर ध्यान दें, 12 डीपीवी कोशिकाओं में गेंद जैसी संरचना आकृति विज्ञान होती है। एक मार्ग के बाद और रूपांतरण मीडिया (तालिका 1) कोशिकाओं पर कई दिनों के बाद एक एनपीसी की तरह आकृति विज्ञान प्रदर्शित शुरू करते हैं । स्केल बार 200 माइक्रोन है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

संक्षेप में, प्रत्यक्ष रूपांतरण रोगी त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक तेज और आसान तरीका है। इस विधि की गति के साथ-साथ उत्पन्न कोशिकाओं की बड़ी संख्या के कारण यह विधि लाभप्रद है जिसे बनाए रखना आसान है। इसके अलावा, बढ़ते साक्ष्य ों से पता चलता है कि सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग विधियां क्लासिक आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग तकनीक की तुलना में कम एपिजेनेटिक मार्क्स को हटा देती हैं, इसलिए रोग के वातावरण को अधिक बरकरार छोड़ जाता है4,7,8। एस्ट्रोसाइट्स के लिए आईएनपीसी का भेदभाव बहुत सीधे आगे है और कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं के बीच भी अत्यधिक पुन: उत्पन्न होता है19,29,33. iNPCs को छोटे हिस्सों में जमे हुए किया जा सकता है और सीधे भेदभाव उद्देश्यों के लिए गल सकता है, जो प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम करने में मदद करता है क्योंकि मार्ग संख्या को समान रखा जा सकता है। एस्ट्रोसाइट्स कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में रोग प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और इसलिए काम करने के लिए एक दिलचस्प सेल प्रकार हैं। एस्ट्रोसाइट्स का उपयोग मशीनी अध्ययन, मेटाबोलिक अध्ययन या दवा परीक्षण परख के लिए किया जा सकता है और आमतौर पर मोनोलेयर के रूप में उगाया जाता है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स को न्यूरोनल सर्वाइवल और आकृति विज्ञान पर एस्ट्रोसाइट्स के प्रभाव का आकलन करने के लिए माउस या मानव न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति प्रणालियों में जोड़ा जा सकता है, जिनमें से दोनों दवा परीक्षण34के लिए अच्छे रीडआउट हैं।

इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए कुछ बिंदुओं और संभावित सीमाओं को ध्यान में रखने की जरूरत है । उदाहरण के लिए मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट उनके सेल डिवीजन दर के साथ-साथ वायरल वैक्टर के जवाब में बहुत भिन्न होती है। चूंकि ये मानकीकृत सेल लाइनें नहीं हैं, वे मानव जाति के रूप में ही चर रहे हैं, प्रत्येक पंक्ति अलग है । कई रीप्रोग्रामिंग विधियों के लिए, फाइब्रोब्लास्ट को फिर से प्रोग्राम करना आसान है जिसमें मध्यम से तेज सेल डिवीजन दर बनाम कोशिकाएं हैं जो मुश्किल से नकल कर रही हैं। प्रतिकृति दर त्वचा बायोप्सी गुणवत्ता और प्रसंस्करण से प्रभावित हो सकती है, फाइब्रोब्लास्ट के मार्ग संख्या के साथ-साथ हैंडलिंग से। प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के साथ काम करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सेनेसेंस के प्रेरण से बचने के लिए बहुत घना न होने दें। यदि फाइब्रोब्लास्ट अच्छी तरह से विकसित नहीं होते हैं, तो एक नए स्टॉक या कम मार्ग की कोशिश करना सबसे अच्छा है, हालांकि कुछ मामलों में, रोग स्वयं भी एक भूमिका निभा सकता है। मानक 10% की तुलना में फाइब्रोब्लास्ट मीडिया में 15% या 20% एफबीएस का उपयोग करके सेल डिवीजन में कभी-कभी सुधार किया जा सकता है।

रिप्रोग्रामिंग वायरल वैक्टर की गुणवत्ता सफलता के लिए उच्च महत्व की है। हमारे हाथों में, रेट्रोवायरल वैक्टर लेंटीवायरल वैक्टर या अन्य गैर-एकीकृत वायरस की तुलना में अधिक कुशल थे; हालांकि, यह वायरल वेक्टर गुणवत्ता और शुद्धता पर निर्भर हो सकता है। वाणिज्यिक रेट्रोवायरल वेक्टर किट आमतौर पर वायरल वेक्टर एकाग्रता को निर्दिष्ट करते हैं और अक्सर एक निश्चित सेल लाइन के लिए संक्रमण की बहुलता भी देते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट वायरल वेक्टर तेज निर्धारित करने के लिए कंपनियों द्वारा उपयोग की जाने वाली सेल लाइन से भिन्न होते हैं। इसके अलावा, यहां तक कि जब एक ही वाणिज्यिक किट का आदेश, बैचों के बीच भिन्नता आम है । इसके अलावा, वायरल वैक्टर का तेज भी फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों के बीच भिन्न होता है। कुछ लाइनें अधिक संवेदनशील हो सकती हैं और इसलिए ट्रांसड्यूड कोशिकाएं मर सकती हैं, जबकि अन्य सेल लाइनें वायरल तेज के लिए अधिक प्रतिरोधी हो सकती हैं। इस प्रकार, किसी दिए गए सेल लाइन के लिए ट्रांसडक्शन दक्षता का निर्धारण करना महत्वपूर्ण हो सकता है, खासकर यदि सेल लाइन धीरे-धीरे बढ़ रही है या पिछले रूपांतरण प्रयास विफल हो गए हैं। हमारे हाथों में, रूपांतरण के लिए एक विशिष्ट रेट्रोवायरल वेक्टर की कितनी आवश्यकता है, इसका मूल्यांकन करने का सबसे अच्छा तरीका वायरल वेक्टर के कई कमजोर पड़ने के साथ एक इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला करना है। प्रत्येक वेक्टर के लिए ट्रांसजीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या को 70% या उससे अधिक की ट्रांसडक्शन दक्षता के उद्देश्य से गिना जा सकता है। हमारे अनुभव में, इसी तरह के MOIs सबसे सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन एमओआई यदि आवश्यक हो तो समायोजित किया जा सकता है ।

रूपांतरण प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं को बहुत जल्दी विभाजित नहीं करना महत्वपूर्ण है। समय जब तक कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए तैयार कर रहे है प्राथमिक सेल लाइन और उसकी विशेषताओं, वायरल वेक्टर की गुणवत्ता का इस्तेमाल किया और मीडिया की गुणवत्ता सहित कई कारकों पर निर्भर करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि जब कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर रखा जाता है तो रूपांतरण की सफलता दर बहुत अधिक होती है। यहां तक कि अगर कोशिकाएं आकृति विज्ञान को बदलने लगती हैं, तो कोशिकाओं को समय से पहले विभाजित करने से अधिक समय तक छोड़ देना बेहतर होता है। विभाजन बहुत जल्दी होता है रूपांतरण अपनी प्रगति में रोक सकता है और कोशिकाओं को फाइब्रोब्लास्ट की तरह आकार और व्यवहार में वापस अंतर करने के लिए नेतृत्व । इसके अलावा, उन्हें बहुत जल्दी कमजोर करने से एनपीसी के छोटे और कॉम्पैक्ट सेल निकायों की तुलना में अधिक विस्तारित सेल निकाय हो सकते हैं। इस प्रकार, पहले विभाजन हमेशा रूढ़िवादी होना चाहिए; कोशिकाओं को बहुत अधिक पतला करने की तुलना में 1:1 या 1:2 विभाजन के साथ बहुत घने रखना बेहतर है। प्रारंभिक विभाजन के बाद कुछ सेल मृत्यु की उम्मीद है। ध्यान दें, कोशिकाएं विभाजन के बाद पहले दिन हमेशा बदतर (चापलूसी) दिखती हैं, जो सामान्य है। सेल आकार पर सबसे अच्छा निर्णय 2-3 दिन बाद किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात यह है कि विकास कारकों और मीडिया घटकों की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है । विकास कारकों वाले मीडिया की छोटी मात्रा तैयार करना महत्वपूर्ण है ताकि पूरी तरह से तैयार मीडिया का उपयोग केवल 5-7 दिनों के लिए अधिकतम किया जा सके । समय की विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया मत रखो। मीडिया में बदलाव होते ही जल्दी से इस्तेमाल करें और फ्रिज में रखें। इसके अलावा, 2 एमएल के बजाय 1 एमएल पर मीडिया की मात्रा कम रखने से विशेष रूप से सेल लाइनों के लिए मदद मिल सकती है जो परिवर्तित करने के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं। यदि कोशिकाएं मीडिया का तेजी से उपभोग करती हैं, जिसे मीडिया रंग में परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है लाल से पीले (एसिडिफिकेशन रेट) तक, मीडिया की मात्रा को 2 मिलील तक समायोजित करें। रैपिड मीडिया की खपत एक सकारात्मक संकेत है और अक्सर प्रसार में वृद्धि के साथ रूपांतरण के बाद के चरणों में मनाया जाता है।

एनपीसी मीडिया में एक्पुटेज की मौजूदगी को लेकर भी काफी संवेदनशील होते हैं और एक्पुटेस को इनक्यूबेशन समय कम रखना बहुत जरूरी है। हम 2-4 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि की सलाह देते हैं, माइक्रोस्कोप के नीचे अक्सर कोशिकाओं की जांच करते हैं ताकि यह देखा जा सके कि वे अलग होते हैं। मीडिया से एंजाइम मिश्रण को हटाने के लिए विभाजन के बाद कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करना आवश्यक है। यह भी मन में पारित होने की संख्या रखने के रूप में सेल लाइनों विस्तारित संस्कृति अभिव्यक्ति प्रोफाइल के परिवर्तन के लिए अग्रणी पर बदल सकते है महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, शुरुआती मार्ग पर कई सेल स्टॉक को फ्रीज करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को 10% DMSO और ९०% एनपीसी मीडिया में जमे हुए और तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक संग्रहीत किया जाना चाहिए । इस मीडिया में सीरम की कमी के कारण यह ठंड कक्षों का उपयोग कर एक धीमी गति से फ्रीज सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक बार रात भर जमे हुए, तुरंत तरल नाइट्रोजन के लिए हस्तांतरण । हालांकि इस प्रोटोकॉल में कोई क्लोनल चयन नहीं किया जाता है, यह संभव है कि विस्तारित खेती और पासिंग अनुकूल विकास और जीवित रहने की दर के साथ प्रारंभिक कोशिका आबादी के प्राकृतिक चयन की ओर जाता है। इसलिए, प्रयोग करते समय मार्ग संख्या और हैंडलिंग को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। हम प्रयोगों के लिए कम मार्ग का उपयोग करना पसंद करते हैं, यदि संभव हो, तो हम 20 से अधिक बार सेल लाइनों को पास करने से अधिक नहीं हैं। चूंकि एनपीसी तेजी से बढ़ते हैं, इसलिए प्रयोगों के लिए कम मार्ग पर बड़ी संख्या में स्टॉक जमे हुए हो सकते हैं । विशेष रूप से उच्च विकास दर वाली सेल लाइनों में मीडिया एसिडिफिकेशन का खतरा अधिक है । इस प्रकार, जैसे-जैसे सेल लाइनें अलग-अलग गति के साथ बढ़ती हैं, प्रसार के आधार पर मीडिया की मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि कोशिकाओं को लगातार अत्यधिक अम्लीय मीडिया में छोड़ दिया जाता है, तो यह नियंत्रण और रोग कोशिका रेखाओं दोनों के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है। यह भी स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स प्रतिक्रियाशील बनने के लिए कारण बनता है, आगे भेदभाव और प्रयोगों में उनके उपयोग को प्रभावित ।

एस्ट्रोसाइट भेदभाव के लिए, कोशिकाओं को कम घनत्व पर रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च घनत्व कोशिकाओं को अंतर करने से रोकेगा और वे उच्च दरों पर प्रसार करते रहेंगे। इस प्रकार, प्रत्येक सेल लाइन के लिए उनकी प्रसार दर पर निर्भर सीडिंग घनत्व को समायोजित करने की आवश्यकता है। हम विभिन्न सीडिंग घनत्व की कोशिश करने की सलाह देते हैं और उचित भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए एस्ट्रोसाइट मार्कर के साथ धुंधला/आरटी-पीसीआर करते हैं। आईओएस गुणवत्ता का आकलन न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति परख का उपयोग करके स्वस्थ नियंत्रणों के साथ किया जा सकता है। बशर्ते रोग विकृति प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप का कारण न बन जाए, न्यूरॉन्स को कई दिनों तक आईए के संपर्क में रहना चाहिए। एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान व्यक्तिगत सेल लाइनों के बीच बहुत भिन्न हो सकता है और रोग फेनोटाइप से भी प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, बीमारियों में जहां एस्ट्रोसाइट्स पर भारी प्रभाव पड़ता है, वे बड़े, लम्बी एक्सटेंशन के साथ एक प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप दिखा सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अनुसंधान अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण नमूने दान करने के लिए सभी रोगियों और स्वस्थ स्वयंसेवकों का शुक्रिया अदा करते हैं । इसके अलावा, हम एक सहयोगी के रूप में अपनी प्रयोगशाला में तकनीक की पुष्टि करने के लिए स्वतंत्र रूप से ऊतक संस्कृति और लौरा Ferraiuolo में निरंतर विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए रोशेल रोड्रिगो का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को अमेरिका के स्वास्थ्य अनुदान R01 NS644912-4 और RC2 NS69476-01 (A.L.S.) और ALS अनुसंधान अनुदान P2ALS और मदद लिंक फाउंडेशन के लिए पैकार्ड केंद्र से धन प्राप्त किया । K.M स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन के साथ-साथ मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन, रिट सिंड्रोम रिसर्च ट्रस्ट और SCN2A फाउंडेशन के परिवारों से युवा अन्वेषक विकास पुरस्कार से भी धन प्राप्त किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic Corning 430167 Tissue culture
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene USA Scientific 1475-1611 Used for lifting and centrifuge cells
50mL Conical Centrifuge Tubes USA Scientific 1500-1811 Media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062 Antibiotic with antifungal activity for media preparation
B-27  Supplement (50X), serum free Invitrogen 17504044 For NPC and base media
Cryogenic vials  1.2ML Corning CLS430658-500EA For freezing cell stocks
DMEM, high glucose, GlutaMAX  Supplement, pyruvate Gibco 10569010 For fibroblast and Astrocyte media
DMEM/F-12, GlutaMAX  supplement Gibco 10565042 For NPC and base media
DMSO Sigma D2438-50ML For freezing cell stocks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190136 Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit ALSTEM RF101 Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.
Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000-036 Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher 14-955-461 Filter media (50mL)
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149-10KU Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore Sigma FC010-10MG Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.
Isopropanol (technical grade) Fisher Scientific S25372A For freezing cell stocks
Mr. Frosty Thermo Fisher 5100-0001 For freezing cell stocks
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 For Astrocyte, NPC and base media
Recombinant Human EGF Preprotech AF-100-15 Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
Recombinant Human FGF-basic Preprotech 100-18B Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System Millipore Sigma S2GPU05RE Media filtration
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid Fisher 08-772-1B Tissue culture
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Invitrogen 25300062 Lifting of Fibroblasts and Astrocytes
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile Millipore Sigma 80-2502 Filter media (50mL)

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न्यूरोसाइंस अंक 172 इन विट्रो मॉडलिंग डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग रूपांतरण फाइब्रोब्लास्ट न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाएं प्रेरित एस्ट्रोसाइट्स
फाइब्रोब्लास्ट से न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स में भेदभाव से सीधे रूपांतरण का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए इन विट्रो मॉडलिंग
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Dennys, C. N., Sierra-Delgado, J.… More

Dennys, C. N., Sierra-Delgado, J. A., Ray, S. S., Hartlaub, A. M., Roussel, F. S., Rodriguez, Y., Meyer, K. In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes. J. Vis. Exp. (172), e62016, doi:10.3791/62016 (2021).

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