Summary
Nous décrivons un protocole pour reprogrammer les fibroblastes peau-dérivés humains en cellules neuronales induites d’ancêtre (iNPCs), et leur différentiation suivante dans les astrocytes induits (iAs). Cette méthode conduit à une génération rapide et reproductible d’iNPCs et d’iAs en grande quantité.
Abstract
La recherche sur les troubles neurologiques porte principalement sur l’impact des neurones sur les mécanismes de la maladie. La disponibilité limitée de modèles animaux a de graves répercussions sur l’étude des contributions spécifiques aux types de cellules à la maladie. De plus, les modèles animaux ne reflètent généralement pas la variabilité des mutations et des cours de la maladie observés chez les patients humains. Les méthodes de reprogrammation pour la génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont révolutionné la recherche spécifique au patient et créé des outils précieux pour étudier les mécanismes de la maladie. Cependant, la technologie iPSC présente des inconvénients tels que le temps, l’engagement du travail, la sélectivité clonale et la perte de marqueurs épigénétiques. Les modifications récentes de ces méthodes permettent une génération plus directe de lignées cellulaires ou de types de cellules spécifiques, en contournant l’isolement clonal ou un état de cellules souches pluripotentes. Nous avons développé une méthode de conversion directe rapide pour générer des cellules progénitrices neuronales induites (iNPCs) à partir de fibroblastes cutanés en utilisant des vecteurs rétroviraux en combinaison avec des milieux de névralisation. Les iNPCs peuvent être différenciés en neurones (iNs) oligodendrocytes (iOs) et astrocytes (iAs). La production d’iAs facilite le dépistage rapide des médicaments et des mécanismes de la maladie, car la différenciation par rapport aux iNPCs ne prend que 5 jours. De plus, les AI sont faciles à utiliser et sont générées en grand nombre dans des populations pures. Nous avons développé un test de co-culture hautement reproductible utilisant les neurones GFP+ de souris et les IA dérivées par le patient pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles pour de nombreux troubles neurologiques et neurodégénératifs. Il est important de savoir que les tests iA sont évolutifs au format 384 puits, ce qui facilite l’évaluation de plusieurs petites molécules dans une seule plaque. Cette approche permet l’évaluation thérapeutique simultanée de plusieurs lignées cellulaires patientes présentant un fond génétique diversifié. La production et le stockage faciles des AI et la capacité de cribler plusieurs composés dans un seul essai rendent cette méthodologie adaptable pour la médecine personnalisée.
Introduction
La compréhension des mécanismes sous-jacents de la maladie est essentielle pour les maladies neurologiques, car elle aide à l’élaboration de stratégies thérapeutiques potentielles. Alors que les modèles animaux ont historiquement été la référence en matière de recherche sur les maladies du système nerveux, la traduction directe des thérapies potentielles dans un cadre clinique montre souvent un succès limité1,2,3. Les raisons de l’absence de traduction sont le manque de variabilité du fond génétique et des mutations chez les souris, l’affichage incomplet des phénotypes de la maladie et la variation de la sensibilité aux médicaments ou du dosage chez les patients humains qui ne sont pas bien illustrés chez les souches de souris consanguines. En outre, pour de nombreux troubles neurologiques rares, aucun ou peu de modèles animaux sont disponibles. L’étude des mécanismes de la maladie directement dans les types de cellules humaines pertinents pourrait faciliter la recherche et améliorer l’application à la clinique. Pour les troubles du SNC, les cellules humaines primaires sont difficiles à récupérer et représentent une source très limitée, car les biopsies sont invasives ou ne peuvent être récupérées qu’après l’autopsie au stade final de la maladie. Au cours des 15 dernières années, le développement de la technologie de reprogrammation cellulaire a rapidement élargi la capacité de modéliser les maladies neurologiques et neurodégénératives humaines in vitro.
Les méthodes traditionnelles de reprogrammation cellulaire impliquent la reprogrammation de fibroblastes ou d’autres types de cellules en cellules souches pluripotentes induites (cspi) capables de se différencier en types cellulaires des trois couches germinales4. Takahashi et Yamanaka ont été les premiers à montrer que la ré-expression de quatre facteurs de transcription de cellules souches est suffisante pour rediriger les cellules somatiques vers devenir des cspi5. Les iPSC peuvent ensuite être différenciés en types de cellules spécifiques. Cependant, l’inconvénient de ce processus est qu’il est laborieux et long de générer et d’isoler des clones de cellules souches stables. Des mutations somatiques ou des aberrances spécifiques de la cellule mère sont également maintenues dans le clone de cellules souches et peuvent avoir un impact sur les résultats de l’étude6. En outre, de plus en plus de preuves suggèrent que le processus de reprogrammation aux cellules souches efface les changements épigénétiques précieux qui pourraient influencer les mécanismes de la maladie cellulaire4,7,8. Ces dernières années, les chercheurs se sont concentrés sur des méthodes de reprogrammation modifiées permettant une génération plus directe de différents types de cellules tout en contournant l’état des cellules souches pluripotentes9,10,11,12 (examiné en 13,14). Les premières percées ont révélé une reprogrammation combinatoire in vitro des fibroblastes en cardiomyocytes15,neurones16 et hépatocytes17 par expression ectopique de multiples facteurs de transcription spécifiques à la lignée ou microARN18. Cela a été suivi par des études reprogrammant directement les cellules pour modéliser les troubles neurologiques19,20. Comme mentionné ci-dessus, de tels protocoles de reprogrammation directe ou de conversion présentent des avantages potentiels par rapport aux protocoles iPSC classiques, notamment la vitesse et l’ablation de l’étape d’isolement clonal. De plus, les preuves suggèrent que ces protocoles permettent de maintenir une plus grande quantité d’informations épigénétiques liées à l’âge du patient et il en va probablement de même pour les marqueurs pertinents pour la maladie7,8.
À ce jour, la plupart des recherches in vitro sur les troubles neurologiques se sont concentrées principalement sur les neurones. Cependant, il est bien connu que d’autres types de cellules tels que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes jouent un rôle essentiel dans la pathologie de la maladie et la progression des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (HD), la sclérose en plaques (MS) et d’autres pathologies neurologiques telles que le syndrome de Rett (RTT), les troubles du sommeil, la dépendance, l’épilepsie, les troubles du stockage lysosomale, la dépression, la migraine et la douleur pathologique21,22,23,24,25,26. Les astrocytes sont le type de cellule le plus abondant dans le système nerveux central (SNC) et jusqu’à récemment, ils ont été largement négligés d’un point de vue pathologique7. Ils sont maintenant connus pour avoir un rôle critique en soutenant presque toutes les fonctions homéostatiques du CNS sain. De plus, il est évident qu’ils ont un impact pathologique important et sont très précieux pour comprendre le mécanisme de la maladie et évaluer les stratégies thérapeutiques19.
Dans la description actuelle, nous détaillons un protocole pour la conversion directe des fibroblastes humains de patients en cellules progénitrices neuronales induites (iNPCs) en utilisant des vecteurs rétroviraux exprimant les facteurs de reprogrammation yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 et c-Myc) et l’exposition ultérieure aux milieux de névralisation. Des études antérieures ont utilisé différentes combinaisons de facteurs transcriptionnels pour la reprogrammation directe vers les cellules neurales (examinées en 14), mais les facteurs utilisés dans le protocole décrit sont largement disponibles soit sous forme de plasmides pour la production interne de vecteurs viraux, soit sous forme de kits de reprogrammation virale prêts à l’emploi disponibles dans le commerce. Les iNPCs résultants peuvent être différenciés en neurones induits (iNs)27,oligodendrocytes (iOs)24 et astrocytes (iAS)19 pour étudier leur rôle dans les maladies neurologiques. Notre protocole n’implique pas la génération fastidieuse d’iPSCs que la plupart des protocoles disponibles utilisent pour la dérivation des astrocytes humains28. Environ 98% à 100% des iNPCs directement reprogrammés peuvent se différencier en astrocytes GFAP-positifs29 par rapport à seulement 2% en utilisant la méthode de conversion directe des fibroblastes en astrocytes30. Récemment, une étude transcriptomique comparative utilisant notre méthode de reprogrammation décrite a prouvé que les iNPCs reprogrammés des fibroblastes de distributeur peuvent retenir des dispositifs vieillissants au niveau transcriptional et fonctionnel semblable aux astrocytes post mortem d’âge assorti et aux astrocytes primaires29. Ainsi, ce protocole de conversion est un outil puissant pour étudier des mécanismes de la maladie et évaluer des approches thérapeutiques nouvelles pour des désordres neurodegenerative et neurologiques relatifs à l’âge.
Ici, nous décrivons le protocole utilisé pour générer des iNPCs et une différenciation supplémentaire en iAs, qui sont les plus adaptés pour les tests de criblage moléculaire à plus grande échelle. Les mécanismes de la maladie et les tests de dépistage des drogues avec les AI peuvent être effectués à l’aide de différentes méthodologies telles que des co-cultures avec des neurones ou des analyses métaboliques et biochimiques. L’avantage de ce système est la vitesse et la facilité d’entretien de ces lignées cellulaires par rapport aux cspi. De plus, les iNPCs peuvent être congelés en petites portions pour la différenciation des iAs, ce qui facilite le dépistage des drogues dans des conditions constantes sur de longues périodes de temps. Dans l’ensemble, la comparaison d’un plus grand nombre d’échantillons devient possible de cette façon, ce qui ouvre la porte à l’évaluation du potentiel thérapeutique des composés dans une population de patients plus grande et plus représentative.
Protocol
| média | Réactif | Montant à mélanger | Concentration finale (%) |
| Milieux de fibroblastes | DMEM, glucose élevé, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Sérum fœtal bovin | 50 mL | 10 | |
| Antibiotique-antimycotique | 5 mL | 1 | |
| Média de base | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotique-antimycotique | 5 mL | 1 | |
| Média de conversion | Média de base | 50 mL | 99.9 |
| FGF | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| FEM | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| héparine | 50 μL | 0,1 (5 μg/mL) | |
| Médias de cellules progénitrices neurales (NPC) | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotique-antimycotique | 5 mL | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| Milieux astrocytaires | DMEM, glucose élevé, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Sérum fœtal bovin | 50 mL | 10 | |
| Antibiotique-antimycotique | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| Le média doit être filtré après avoir mélangé tous les composants. Les supports de conversion (avec facteurs) doivent être préparés frais chaque semaine. | |||
Tableau 1. Recettes multimédias pour tous les types de cellules inclus dans le protocole. Les supports doivent être filtrés après avoir mélangé tous les composants avec un système de filtration sous vide stérile pour les gros volumes ou une seringue et des filtres de seringues de 0,2 um. Les supports de conversion (avec facteurs) doivent être préparés frais chaque semaine.
1. Conversion directe des fibroblastes humains adultes en cellules progénitrices neuronales
REMARQUE : Une chronologie schématique de ce protocole peut être consultée dans Meyer (2014)19.
- Utilisez des fibroblastes primaires de la peau humaine qui peuvent être obtenus à partir de banques de cellules ou de biopsiescutanées 31. Cellules de culture à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % deCO2. Cellules de passage pour au moins 1-2 passages après la décongélation avant utilisation dans l’expérience. Une fois que les cellules sont prêtes, enrobez un puits d’une plaque de 6 puits avec de la fibronectine humaine (1:200 diluée dans du PBS) à température ambiante pendant 15-20 min.
- Lorsque les cellules sont prêtes à être plaquées, retirez la fibronectine de la capsule et ajoutez immédiatement une solution cellulaire ou 2 mL de milieu fibroblastique(tableau 1)- ne laissez pas la capsule se dessécher avant d’ajouter du milieu. Selon la vitesse à laquelle les cellules se développent, plaque 150,000 (croissance rapide) - 200,000 (croissance lente) fibroblastes dans deux puits d’une plaque humaine fibronectine enduite de 6 puits chacun.
REMARQUE: Les cellules doivent être d’environ 70% confluentes pour la transduction virale afin de pouvoir les conserver dans la même plaque pendant plusieurs jours supplémentaires après la transduction. Il peut être bénéfique de semer à deux densités différentes afin d’avoir le choix le lendemain pour la conversion. - Le lendemain de l’ensemencement, vérifiez les fibroblastes au microscope et vérifiez la densité cellulaire (entre 70 et 85%) et même l’ensemencement dans tout le puits pour des résultats optimaux.
- Transduire un puits avec les quatre vecteurs rétroviraux (Oct3/4, Klf4, Sox2 et c-Myc) - utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 10 pour les fibroblastes à croissance rapide ou de 15 pour les fibroblastes à croissance lente (l’efficacité de transduction devrait dépasser 70% ou plus de cellules positives pour chaque vecteur). Ajouter du milieu de fibroblaste régulier au mélange viral à un volume total de 1 mL par puits et incuber pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % deCO2. Laissez le deuxième puits non traité et retournez les cellules à l’incubateur de culture tissulaire.
REMARQUE: Les vecteurs rétroviraux peuvent être achetés par un fournisseur ou fabriqués en interne, les protocoles sont disponibles en ligne32. - Le lendemain de la transduction, laver les cellules 1x avec du PBS et ajouter 1 mL de milieu de fibroblaste frais.
- Le lendemain, changez de moyen en moyen de conversion. Laver les cellules 1x avec pbs pour se débarrasser du milieu fibroblaste résiduel, puis ajouter 1 mL de milieu de conversion. Remplacez également le support du puits non traité par un support de conversion.
REMARQUE: Certains changements morphologiques peuvent être observés même en changeant le support sur les fibroblastes qui n’ont pas reçu de traitement vectoriel rétroviral, donc avoir un puits non traité (facultatif) sera utile pour déterminer les effets des vecteurs viraux. Les cellules devraient commencer à changer de morphologie 2-4 jours après le passage au milieu de conversion. - Observer les cellules au microscope et surveiller les changements de morphologie (Figure 1). Les milieux cellulaires doivent être remplacés quotidiennement tout au long du processus de conversion (1 à 2 mL de milieu de conversion, tableau 1)et pour la culture subséquente d’iNPC. Changer de milieu en enlevant soigneusement 70% du milieu du puits tout en s’assurant que les cellules restent couvertes dans les 30% restants du milieu.
REMARQUE: Les médias avec des facteurs de croissance doivent être consommés dans les 1 semaine suivant la préparation.- Continuer d’observer les cellules et de changer de milieu quotidiennement (1 à 2 mL de milieu de conversion).
- Certaines lignées cellulaires commencent à former des formations rondes surélevées lâches poussant dans des structures en forme de boule ou des sphères neuronales lâches(Figure supplémentaire 1 et 19,33). Veillez à ne pas détacher ces cellules. Si les billes se détachent, elles peuvent être collectées et replaquées dans un nouveau puits enrobé de fibronectine d’une plaque de 6 puits.
REMARQUE: Si elles sont développées sur leur propre, les cellules auront une diversité réduite par rapport à la plaque initiale et peuvent représenter une lignée cellulaire distinctement différente. Nous vous recommandons de combiner ces cellules avec le reste des cellules converties lors de la prochaine série de fractionnement.
- Après environ 5-6 jours dans les milieux de conversion (jusqu’à 12 jours pour les lignées cellulaires difficiles) ou lorsque les cellules deviennent très denses, faites-les passer 1:2 ou maximum 1:3.
REMARQUE: Il est très important de maintenir les cellules à une densité élevée tout au long du processus de conversion.
2. Procédure de conversion et de fractionnement iNPC
- Réchauffer la solution de détachement cellulaire (p. ex. Accutase) et recouvrir un nombre approprié de puits d’un 6 puits de fibronectine (1:200 dans du PBS, 1 mL de volume de revêtement) pendant 15 à 20 minutes à température ambiante. Le revêtement de fibronectine peut être plus long sans impact négatif, mais il faut veiller à ne pas raccourcir le temps de revêtement.
- Laver soigneusement les cellules avec du PBS sans détacher de cellules (utilisez la paroi du puits pour appliquer doucement du PBS sur les cellules). Retirez soigneusement le PBS avec des pipettes ou par aspiration.
- Ajouter 0,5 mL de solution de décollement cellulaire et incuber 2-3 min à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire. Vérifiez au microscope que la plupart des cellules se sont détachées. Si toutes les cellules se sont détacher, ajoutez 2 mL de supports de conversion frais et pipettez doucement de haut en bas 2-3 fois pour dissocier les touffes (si nécessaire).
- Recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et ajouter 3 mL supplémentaires de milieux pour diluer davantage la solution de détachement cellulaire. Lavez d’abord le puits avec le support supplémentaire pour vous assurer que toutes les cellules ont été collectées.
- Centrifuger pendant 4 min à 200 x g à température ambiante.
REMARQUE: Les cellules de conversion ou iNPCs sont extrêmement sensibles à la présence d’une solution de détachement cellulaire dans le support. Il est absolument nécessaire d’éliminer l’enzyme résiduelle par centrifugation et retrait du surnageant. - Retirer le surnageant des pastilles cellulaires et les ressusciter dans 1 mL de milieu frais. Pipetter doucement de haut en bas 2-3 fois pour résoudre les amas cellulaires. Retirez la fibronectine des 6 puits enduits et ajoutez immédiatement 1 mL de milieu frais à chaque puits (ne laissez pas la fibronectine sécher). Pour un rapport de fractionnement de 1:2, ajouter 0,5 mL de la suspension cellulaire dans un puits et l’autre 0,5 mL dans un deuxième puits.
- Cellules de culture à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire.
- Distribuez les cellules en secouant doucement le 6-puits dans la direction nord-sud-est-ouest (non circulaire) et mettez dans l’incubateur de culture de tissus.
- Observez les cellules au microscope le lendemain et changez de milieu (1-2 mL). Changez de média tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être fractionnées à nouveau.
REMARQUE: À ce stade, la prolifération cellulaire devrait commencer à s’accélérer, et les cellules devraient être prêtes pour une deuxième division dans les 2-3 jours (4 jours pour les lignes à croissance très lente).- Lors de cette nouvelle scission, ensemencez un puits de cellules dans un milieux de conversion et l’autre bien dans un milieux NPC ne contenant que du FGF à une concentration accrue sans EGF/héparine(tableau 1).
Remarque : Certaines lignes cellulaires atteignent un état stagnant dans le support de conversion après environ 10 jours et le passage au média NPC peut aider à la croissance cellulaire. En outre, les PNJ ont une forme plus spécifique et plus petite, lorsqu’ils sont cultivés dans des milieux NPC19. À ce stade, les iNPCs sont prêts pour la différenciation et l’utilisation ultérieure.
- Lors de cette nouvelle scission, ensemencez un puits de cellules dans un milieux de conversion et l’autre bien dans un milieux NPC ne contenant que du FGF à une concentration accrue sans EGF/héparine(tableau 1).
- Continuez à changer de support (1-2 mL) des iNPCs tous les jours.
- Développez les PNJ en plats de 10 cm en combinant deux ou trois puits confluents d’un 6 puits. Le volume du support pour les plats de 10 cm est généralement de 12 à 15 mL.
- Lors de la scission suivante, élargissez davantage ces cellules à trois ou quatre plats de 10 cm (12 à 15 mL de milieux) pour des générations de grands nombres de stocks cellulaires. Les plats de 10 cm sont généralement divisés à 1:3 ou 1:4 tous les 3-4 jours en fonction du taux de prolifération.
3. Génération d’astrocytes induits à partir de PNJ
- Pour fabriquer des astrocytes à partir d’iNPCs frais, ensemencez des iNPCs (dans des plaques enrobées de fibronectine de 10 cm) directement dans un milieu astrocytaire de 10 mL(tableau 1)de sorte qu’ils soient d’environ 10% de confluence le lendemain. Cellules de culture à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % deCO2.
NOTA : La densité d’ensemencement recommandée est habituellement de 50 μL de la remise en suspension cellulaire d’une parabole de 10 cm de PNJ, à condition qu’ils soient dilués à un volume final en fonction de leur rapport de fractionnement (p. ex. 3 mL pour une fente de 1:3, 4 mL pour une fente de 1:4, etc.). - Changer le milieu (milieu astrocytaire de 10 mL) des AI trois jours après le placage. Gardez les cellules différenciantes pendant 5-7 jours.
REMARQUE: Les iAs ne tolèrent pas bien plusieurs passages, il est donc préférable de faire des astrocytes frais chaque fois que vous divisez les PNJ. - Pour ensemencer à des fins d’expérimentation, diviser les astrocytes à l’aide de trypsine ou d’une solution de détachement cellulaire comme décrit aux étapes 2.1 à 2.7. Les densités d’ensemencement recommandées sont incluses dans le tableau 2.
| Type de plaque | Astrocytes par puits |
| 384 puits | 2500 |
| 96 puits | 10000 |
| 24 puits | 40000 |
| 6-puits | 150000 |
Tableau 2. Densité d’ensemencement recommandée d’AI par surface de plaque. Nombre typique d’AI ensemencés pour générer une monocouche sur les plaques de culture tissulaire les plus courantes.
4. Préparation et dégivrage des portions pour la différenciation des astrocytes des stocks de NPC congelés (alternative à l’étape 3)
REMARQUE: Comme alternative au maintien des iNPCs en culture, les astrocytes peuvent également être produits directement à partir d’un stock congelé. Pour ce faire, les iNPCs sont gelés en plus petites portions. Le tableau 3 montre les volumes de congélation et de décongélation suggérés pour les portions à décongeler dans une boîte de 10 cm contenant 10 mL de milieux astrocytaires.
| Taille de la portion | Suspension cellulaire (μL) | Milieux de congélation (μL) | Volume total (μL) | Dégivrages dans |
| 4x | 400 | 400 | 800 | Deux plats de 10 cm |
| 2x | 200 | 200 | 400 | Un plat de 10 cm |
Tableau 3. Instructions sur la façon de fraction iNPC pour générer des iAs. Proportion de la suspension iNPC et des milieux de congélation pour générer des portions. Notez que la concentration finale de DMSO est de 10% lorsque la suspension cellulaire est mélangée avec un média de congélation.
- Pour fabriquer des astrocytes à partir de stocks d’iNPC congelés, retirer une partie du flacon de stock du réservoir de stockage d’azote liquide et décongeler rapidement à 37 °C. Dès que les cellules sont décongelées, pipette solution cellulaire dans un tube de 15 mL contenant 5 mL d’astrocyte milieux.
- Centrifuger pendant 4 min à 200 x g et température ambiante. Retirer le surnageant et le ressusciter dans 1 mL de milieu astrocytaire frais.
- Ajouter 9 mL de milieu astrocytaire frais à un plat de 10 cm enrobé de fibronectine et ajouter 1 mL de solution cellulaire. Distribuer doucement les cellules en mouvement nord-sud-est-ouest. Cellules de culture à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % deCO2.
Representative Results
Ce protocole permet la génération rapide et facile d’iNPCs directement à partir de fibroblastes de peau humaine en utilisant des rétrovirus contenant les facteurs yamanaka. Cette méthode permet de contourner l’état des cellules souches et la nécessité d’une sélection clonale, évitant ainsi la variation clonale. Les étapes importantes à garder à l’esprit pendant que les cellules subissent le processus de conversion sont la densité d’ensemencement des fibroblastes, le pH du média et le maintien des cellules à une confluence optimale. Des exemples de changements optimaux de confluence et de morphologie de fractionnement au cours du processus de conversion peuvent être trouvés dans Figure 1.
Figure 1. Images représentatives du processus de conversion après l’ajout du mélange rétroviral de facteurs Yamanaka. Les fibroblastes ont été ensemencés et transduis vingt-quatre heures plus tard avec des facteurs Yamanaka. Deux jours après le virus (DPV), le média a été changé en support de conversion. Les cellules ont été cultivées dans des milieux de conversion jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à passer (13 DPV). Les cellules ont été ensemencées après le passage pour atteindre 80% de confluence le lendemain (14 DPV). Les passages suivants ont maintenu cette densité jusqu’à ce que les cellules progénitrices neuronales commencent à se diviser rapidement. La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Une fois le processus de conversion terminé, les PNJ montreront une expression fortement réduite ou aucune expression des marqueurs et de la morphologie des fibroblastes, et exprimeront des marqueurs cellulaires spécifiques au PNJ (Figure 2). De plus, ils peuvent également être utilisés pour générer différentes lignées cellulaires, telles que les iNs, les iOs et les iAs.
Figure 2. Les cellules qui subissent le processus de conversion expriment des marqueurs spécifiques à la cellule. Des fibroblastes patients (A), les cellules neuronales induites d’ancêtre (iNPCs (B) et les cellules induites d’astrocytes (iAs (C) ont été ensemencés sur des lamelles de verre dans un plat traité de culture de tissu de 24 puits. Des cellules immunostained pour : marqueurs spécifiques de cellules de fibroblaste (A), Vimentin (vert) et TE7 (rouge), marqueur spécifique de cellules d’iNPC (B), Nestin (rouge), et marqueur de cellules d’iAs (C) GFAP (violet) et marqueur d’iNPC Nestin (vert). La barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
D’après notre expérience, les AI en particulier sont très précieuses pour les tests de médicaments et de mécanismes de maladie car ils peuvent être générés dans des populations pures (98% ou plus de cellules positives GFAP29)en grand nombre reproductible. Les iAs peuvent être différenciés des iNPCs en prenant une petite partie aliquote de cellules pendant la division ou une partie iNPC précédemment congelée et en plaquant directement dans des milieux astrocytaires. Au cours de ce processus, il est important de maintenir la densité d’ensemencement initiale des iNPCs à faible(figure 3 et figure 4),car il a été démontré qu’une densité élevée entrave le processus de différenciation(figure 4)et d’accorder une attention supplémentaire au pH du milieu, car l’acidification peut activer même des astrocytes sains.
Figure 3. Images représentatives du processus de génération d’iAs à partir d’iNPCs. Les iNPCs sont ensemencés dans des milieux astrocytaires (tableau 1) à une faible densité d’ensemencement. Une bonne densité d’ensemencement est d’environ 10 % le premier jour suivant l’ensemencement (DPS) (à gauche); cependant, cette densité peut être ajustée en fonction du taux de croissance des cellules. La morphologie typique d’iAs peut être observée après 5 DPS (milieu). Dans certains cas, une morphologie aberrante des astrocytes peut être observée, avec de longues extensions épineuses. Ce changement est indicatif de l’activation des astrocytes et peut être secondaire à l’état de la maladie ou à des techniques de culture incorrectes (à droite). La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4. La densité d’ensemencement iNPC affecte l’efficacité de différenciation des iAs. Les lignées témoins d’iNPC ont été ensemencées à faible densité (A) et élevée (B) dans les milieux astrocytaires afin de démontrer les effets de la densité d’ensemencement sur la différenciation. 5 DPS, la ligne de basse densité a exprimé des marqueurs spécifiques aux astrocytes, tandis que la ligne de haute densité montre un mélange de marqueurs iNPC et iAs avec une morphologie marquée de type iNPC. La barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1. Chiffres supplémentaires du processus de conversion après l’ajout du mélange rétroviral de facteurs Yamanaka. Images du processus de conversion à 12 DPV (1 jour avant le passage) et 19 DPV (6 jours après le passage). Notez la différence de morphologie entre les cellules avant et après le passage, à 12 cellules DPV ont une morphologie de structure en forme de boule. Après un passage et plusieurs jours sur un support de conversion (tableau 1), les cellules commencent à afficher une morphologie de type PNJ. La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
En résumé, la conversion directe est une méthode rapide et facile pour générer des cellules progénitrices neuronales induites à partir de fibroblastes cutanés patients. Cette méthode est avantageuse en raison de sa vitesse ainsi que du grand nombre de cellules générées qui sont faciles à entretenir. De plus, de plus en plus de preuves suggèrent que les méthodes de reprogrammation directe éliminent moins de marques épigénétiques par rapport à la technologie classique de reprogrammation iPSC, laissant ainsi l’environnement de la maladie plus intact4,7,8. La différenciation des iNPCs en astrocytes est très simple et hautement reproductible même entre plusieurs laboratoires indépendants19,29,33. Les iNPCs peuvent être congelés en petites portions et décongelés directement à des fins de différenciation, ce qui aide à réduire la variation entre les expériences puisque les nombres de passages peuvent rester similaires. Les astrocytes jouent un rôle crucial dans la progression de la maladie dans de nombreuses maladies neurologiques et sont donc un type de cellule intéressant avec lequel travailler. Les astrocytes peuvent être utilisés pour des études mécanistes, des études métaboliques ou des tests de dépistage de drogues et sont généralement cultivés comme des monocouches. De plus, les astrocytes peuvent être combinés dans des systèmes de co-culture avec des neurones souris ou humains pour évaluer l’impact des astrocytes sur la survie neuronale et la morphologie, qui sont tous deux de bonnes lectures pour les tests de dépistage des drogues34.
Afin d’utiliser avec succès ce protocole, quelques points et limitations potentielles doivent être gardés à l’esprit. Les fibroblastes de la peau humaine, par exemple, varient considérablement dans leur taux de division cellulaire ainsi que dans leur réponse aux vecteurs viraux. Comme ce ne sont pas des lignées cellulaires normalisées, elles sont aussi variables que l’humanité elle-même, chaque lignée est différente. Comme pour de nombreuses méthodes de reprogrammation, il est plus facile de reprogrammer les fibroblastes qui ont un taux de division cellulaire modéré à rapide par rapport aux cellules qui se répliquent à peine. Le taux de réplication peut être impacté par la qualité de la biopsie cutanée et le traitement lui-même, par le nombre de passage des fibroblastes ainsi que par la manipulation. Lorsque vous travaillez avec des fibroblastes cutanés primaires, il est important de ne pas laisser les cellules devenir trop denses pour éviter l’induction de la sénescence. Si les fibroblastes ne poussent pas bien, il est préférable d’essayer un nouveau stock ou un passage inférieur, bien que dans certains cas, la maladie elle-même puisse également jouer un rôle. La division cellulaire peut parfois être améliorée en utilisant 15% ou 20% FBS dans le média des fibroblastes par rapport à la norme 10%.
La qualité des vecteurs viraux de reprogrammation est d’une grande importance pour le succès. Entre nos mains, les vecteurs rétroviraux étaient plus efficaces que les vecteurs lentiviraux ou d’autres virus non intégrateurs; cependant, cela pourrait dépendre de la qualité et de la pureté du vecteur viral. Les kits vectoriels rétroviraux commerciaux spécifient généralement la concentration de vecteur viral et souvent aussi une multiplicité d’infection pour une certaine lignée cellulaire. Il est important de garder à l’esprit que les fibroblastes primaires diffèrent de la lignée cellulaire utilisée par les entreprises pour déterminer l’absorption du vecteur viral. De plus, même lors de la commande du même kit commercial, la variation entre les lots est courante. De plus, l’absorption des vecteurs viraux varie également entre les lignées cellulaires de fibroblastes. Certaines lignées pourraient être plus sensibles et, par conséquent, les cellules transduites pourraient mourir, tandis que d’autres lignées cellulaires pourraient être plus résistantes à l’absorption virale. Ainsi, la détermination de l’efficacité de la transduction pour une lignée cellulaire donnée peut être importante, en particulier si la lignée cellulaire croît lentement ou si les tentatives de conversion précédentes ont échoué. Entre nos mains, la meilleure façon d’évaluer la quantité d’un vecteur rétroviral spécifique nécessaire à la conversion est d’effectuer une coloration immunofluorescente avec plusieurs dilutions du vecteur viral. Le nombre de cellules exprimant le transgène pour chaque vecteur peut alors être compté, dans le but d’une efficacité de transduction de 70% ou plus. D’après notre expérience, des protocoles d’entente similaires peuvent être utilisés pour la plupart des lignées cellulaires, mais le MOI peut être ajusté si nécessaire.
Pendant le processus de conversion, il est essentiel de ne pas diviser les cellules trop tôt. Le temps jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être divisées dépend de multiples facteurs, y compris la lignée cellulaire primaire et ses caractéristiques, la qualité du vecteur viral utilisé et la qualité du média. Il est important de noter que le taux de réussite de la conversion est beaucoup plus élevé lorsque les cellules sont maintenues à haute densité. Même si les cellules commencent à changer de morphologie, il est préférable de laisser les cellules dans le premier puits plus longtemps que de les diviser prématurément. Si la scission se produit trop tôt, la conversion peut s’arrêter dans sa progression et amener les cellules à se différencier à la forme et au comportement de type fibroblaste. En outre, les diluer trop tôt peut entraîner des corps cellulaires plus allongés par rapport aux corps cellulaires petits et compacts des PNJ observés précédemment. Ainsi, les premières scissions devraient toujours être conservatrices; il est préférable de garder les cellules trop denses avec une division 1:1 ou 1:2 par rapport à les diluer trop. On s’attend à une certaine mort cellulaire après la scission initiale. Il convient de noter que les cellules ont toujours l’air pires (plus plates) le premier jour après la division, ce qui est normal. Les meilleurs jugements sur la forme de la cellule doivent être faits 2-3 jours plus tard. Il est important de savoir que la qualité des facteurs de croissance et des composants des médias est également cruciale. Il est important de préparer de petites quantités de milieux contenant des facteurs de croissance afin que les milieux entièrement préparés ne soient utilisés que pendant 5 à 7 jours maximum. Ne conservez pas le support à température ambiante ou à 37 °C pendant de longues périodes. Utilisez rapidement et réfrigérez dès que le changement de support est effectué. De plus, maintenir le volume de média bas à 1 mL au lieu de 2 mL peut aider en particulier pour les lignées cellulaires qui sont plus résistantes à la conversion. Si les cellules consomment le support rapidement, ce qui peut être observé par un changement de couleur du média du rouge au jaune (taux d’acidification), ajustez le volume du média jusqu’à 2 mL. La consommation rapide de médias est un signe positif et souvent observée à des stades ultérieurs de la conversion parallèlement à une prolifération accrue.
Les PNJ sont également très sensibles à la présence d’accutase dans les milieux et il est très important de garder le temps d’incubation de l’accutase court. Nous recommandons une période d’incubation de 2-4 minutes, vérifier les cellules fréquemment au microscope pour voir quand ils se sont détachés. Il est essentiel de centrifuger les cellules après la division pour éliminer le mélange d’enzymes du support. Il est également important de garder le numéro de passage à l’esprit car les lignées cellulaires peuvent changer lors d’une culture prolongée conduisant à une modification des profils d’expression. Il est donc important de congeler de nombreux stocks de cellules aux premiers passages. Les cellules doivent être congelées dans 10% de DMSO et 90% de milieux NPC et stockées à long terme dans de l’azote liquide. En raison du manque de sérum dans ce milieu, il est essentiel d’assurer un gel lent à l’aide de chambres de congélation et une fois congelé pendant la nuit, transférer immédiatement à l’azote liquide. Tandis qu’aucune sélection clonale n’est exécutée dans ce protocole, il est possible que la culture et le passaging prolongés mènent à la sélection naturelle d’une population initiale de cellules avec le taux favorable de croissance et de survie. Par conséquent, il est important de garder à l’esprit le nombre de passages et la manipulation lors de l’exécution d’expériences. Nous préférons utiliser des passages inférieurs pour les expériences, si possible, nous ne dépassons pas les lignées cellulaires pendant plus de 20 fois. Étant donné que les PNJ se développent rapidement, un grand nombre de stocks peuvent être gelés à des passages inférieurs pour des expériences. Les lignées cellulaires présentant des taux de croissance particulièrement élevés sont plus à risque d’acidification des milieux. Ainsi, à mesure que les lignées cellulaires se développent à une vitesse différente, la quantité de milieux peut devoir être ajustée en fonction de la prolifération. Si les cellules sont continuellement laissées dans des milieux hautement acidifiés, cela peut influencer la santé des lignées cellulaires de contrôle et de maladie. Cela provoque même les astrocytes sains à devenir réactif, affectant leur utilisation dans la différenciation et les expériences ultérieures.
Pour la différenciation des astrocytes, il est important de maintenir les cellules à faible densité car une densité élevée empêchera les cellules de se différencier et elles continueront à proliférer à des taux plus élevés. Ainsi, la densité d’ensemencement doit être ajustée pour chaque lignée cellulaire en fonction de leur taux de prolifération. Nous vous recommandons d’essayer différentes densités d’ensemencement et d’effectuer des colorations / RT-PCR avec des marqueurs d’astrocyte pour assurer une différenciation appropriée. La qualité des AI peut être évaluée parallèlement aux contrôles sains à l’aide d’essais de co-culture avec des neurones. À condition que la pathologie de la maladie ne conduise pas à un phénotype réactif, les neurones doivent rester viables en contact avec les AI pendant plusieurs jours. La morphologie des astrocytes peut varier considérablement entre les lignées cellulaires individuelles et peut également être affectée par le phénotype de la maladie. D’ailleurs, dans les maladies où les astrocytes sont fortement impactés, ils pourraient montrer un phénotype réactif avec de grandes, allongées extensions.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous les patients et les bénévoles en bonne santé d’avoir fait don d’échantillons critiques aux études de recherche. De plus, nous remercions Rochelle Rodrigo pour l’assistance technique continue d’experts en culture tissulaire et Laura Ferraiuolo pour avoir confirmé indépendamment la technique dans son laboratoire en tant que collaboratrice. Ce travail a reçu un financement des National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 et RC2 NS69476-01 (à A.L.S.) et du Packard Center for ALS Research Grant P2ALS et de la Helping Link Foundation. K.M. a également reçu un financement du Fonds national suisse de la recherche scientifique ainsi que le Young Investigator Development Award de l’Association de la dystrophie musculaire, du Rett Syndrome Research Trust et des fondations Families of SCN2A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
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