Summary
Vi beskriver en protokol til at omprogrammere humane hud-afledte fibroblaster i induceret Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), og deres efterfølgende differentiering i induceret Astrocytes (iAs). Denne metode fører til hurtig og reproducerbar generering af iNPC'er og iAs i store mængder.
Abstract
Forskning i neurologiske lidelser fokuserer primært på neuronernes indvirkning på sygdomsmekanismerne. Begrænset tilgængelighed af dyremodeller har alvorlige konsekvenser for undersøgelsen af celletypespecifikke bidrag til sygdom. Desuden afspejler dyremodeller normalt ikke variation i mutationer og sygdomskurser, der ses hos mennesker. Omprogrammeringsmetoder til generering af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) har revolutioneret patientspecifik forskning og skabt værdifulde værktøjer til at studere sygdomsmekanismer. Men iPSC-teknologi har ulemper såsom tid, arbejdsengagement, klonisk selektivitet og tab af epigenetiske markører. Nylige ændringer af disse metoder tillader mere direkte generering af celleafstamler eller specifikke celletyper, uden om kloningsisolering eller en pluripotent stamcelletilstand. Vi har udviklet en hurtig direkte konverteringsmetode til at generere inducerede Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) fra hudfibroblaster, der bruger retrovirale vektorer i kombination med neuraliserende medier. INPC'erne kan differentieres til neuroner (iNs) oligodendrocytter (iOs) og astrocytter (iAs). iAs produktion letter hurtig medicin og sygdom mekanisme test som differentiering fra iNPC'er tager kun 5 dage. Desuden er iAs nemme at arbejde med og genereres i rene populationer i stort antal. Vi udviklede en meget reproducerbar co-kulturanalyse ved hjælp af mus GFP + neuroner og patient afledte iAs at evaluere potentielle terapeutiske strategier for mange neurologiske og neurodegenerative lidelser. Det er vigtigt, at iA-assays er skalerbare til 384-brønd-format, der letter evalueringen af flere små molekyler i en plade. Denne tilgang giver mulighed for samtidig terapeutisk evaluering af flere patientcellelinjer med forskellig genetisk baggrund. Nem produktion og opbevaring af iAs og kapacitet til at screene flere forbindelser i en analyse gør denne metode tilpasningsdygtige til personlig medicin.
Introduction
Forståelse underliggende sygdomsmekanismer er afgørende for neurologiske sygdomme, da det hjælpemidler i udviklingen af potentielle terapeutiske strategier. Mens dyremodeller historisk set har været guldstandarden for forskning i sygdomme i nervesystemet, viser den direkte oversættelse af potentielle terapier til en klinisk indstilling ofte begrænset succes1,2,3. Årsagerne til den manglende oversættelse er manglende variation i genetisk baggrund og mutationer hos mus, ufuldstændig visning af sygdomsfænomentyper og variation i lægemiddelfølsomhed eller dosering hos humane patienter, der ikke er afbilledet godt i indavlede musestammer. Desuden er der for mange sjældne neurologiske lidelser ingen eller få dyremodeller tilgængelige. Undersøgelse af sygdomsmekanismer direkte i relevante menneskelige celletyper kan lette forskning og forbedre oversættelsen til klinikken. For CNS lidelser, primære menneskelige celler er vanskelige at hente og repræsenterer en meget begrænset kilde som biopsier er invasive eller kan kun hentes post mortem i slutningen af sygdommen. I de sidste 15 år har udviklingen af cellulær omprogrammeringsteknologi hurtigt udvidet evnen til at modellere menneskelige neurologiske og neurodegenerative sygdomme in vitro.
Traditionelle metoder til celleomprogrammering omfatter omprogrammering af fibroblaster eller andre celletyper til inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er), der kan differentieres til celletyper fra alle tre kimlag4. Takahashi og Yamanaka var de første til at vise, at re-udtryk for fire stamcelle transskription faktorer er tilstrækkelig til at omdirigere somatiske celler til at blive iPSCs5. iPSC'er kan derefter differentieres yderligere til specifikke celletyper. Ulempen ved denne proces er imidlertid, at det er arbejdskrævende og tidskrævende at generere og isolere stabile stamcellekloner. Somatiske mutationer eller specifikke aberrancies af modercellen opretholdes også i stamcelleklonen og kan påvirke resultaterne af undersøgelsen6. Derudover tyder stigende beviser på, at omprogrammeringsprocessen til stamceller sletter værdifulde epigenetiske ændringer, der kan påvirke cellulære sygdomsmekanismer4,7,8. I de senere år har forskere fokuseret på modificerede omprogrammeringsmetoder, der tillader en mere direkte generation af forskellige celletyper, mens de omgår den pluripotente stamcelletilstand9,10,11,12 (gennemgået i 13,14). Indledende gennembrud afsløret in vitro kombinatorisk omprogrammering af fibroblaster til kardiomyocytter15, neuroner16 og hepatocytter17 ved ektopisk udtryk for flere afstamningsspecifikke transskriptionsfaktorer eller microRNAs18. Dette blev efterfulgt af undersøgelser direkte omprogrammering af celler til model neurologiske lidelser19,20. Som nævnt ovenfor har sådanne direkte omprogrammerings- eller konverteringsprotokoller potentielle fordele i forhold til klassiske iPSC-protokoller, herunder hastighed og ablation af klonisoleringstrinnet. Desuden tyder på, at disse protokoller gør det muligt at opretholde en større mængde epigenetisk information relateret til patientens alder og sandsynligvis det samme gælder for sygdomsrelevante markører7,8.
Til dato har de fleste in vitro forskning om neurologiske lidelser været fokuseret primært på neuroner. Det er imidlertid velkendt, at andre celletyper såsom astrocytter, mikroglia og oligodendrocytter spiller en afgørende rolle i sygdomspatologi og progression af neurodegenerative lidelser som Alzheimers sygdom (AD), Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons Sygdom (HS), multipel sklerose (MS) og andre neurologiske patologier som Rett syndrom (RTT), søvnforstyrrelser, afhængighed, epilepsi, lysosomale opbevaringsforstyrrelser, depression, migræne og patologisk smerte21,22,23,24,25,26. Astrocytter er den mest rigelige celletype i centralnervesystemet (CNS), og indtil for nylig er de stort set blevet forsømt fra et patologisk synspunkt7. De er nu kendt for at have en afgørende rolle i at støtte næsten alle homeostatic funktioner i den sunde CNS. Derudover er det tydeligt, at de har en vigtig patologisk virkning og er meget værdifulde i forståelsen af sygdomsmekanismen og evaluering af terapeutiske strategier19.
I den aktuelle beskrivelse beskriver vi en protokol for direkte konvertering af humane patientfibroblaster til inducerede Neuronal Progenitor Cells (iNPC'er) ved hjælp af retrovirale vektorer, der udtrykker Yamanaka-omprogrammeringsfaktorerne (Klf4, Oct3/4, Sox2 og c-Myc) og efterfølgende eksponering for neuraliserende medier. Tidligere undersøgelser har brugt forskellige kombinationer af transskriptionelle faktorer til direkte omprogrammering til neurale celler (gennemgået i 14), men de faktorer, der anvendes i den beskrevne protokol er bredt tilgængelige enten som plasmider til i hus produktion af virale vektorer, eller som kommercielt tilgængelige klar til at gå viral omprogrammering kits. De resulterende iNPC'er kan yderligere differentieres til inducerede neuroner (iNs)27, oligodendrocytter (iOs)24 og astrocytter (iAS)19 for at studere deres rolle i neurologiske sygdomme. Vores protokol involverer ikke tidskrævende generering af iPSC'er, som de fleste tilgængelige protokoller bruger til afledning af menneskelige astrocytter28. Ca. 98% til 100% af direkte omprogrammerede iNPC'er kan differentieres til GFAP-positive astrocytter29 sammenlignet med kun 2% ved hjælp af direkte konverteringsmetode fra fibroblaster til astrocytter30. For nylig har en sammenlignende transskriptionsundersøgelse ved hjælp af vores beskrevne omprogrammeringsmetode vist, at iNPC'er, der er omprogrammeret fra donorfibroblaster, kan bevare aldringsfunktioner på transskriptions- og funktionsniveau svarende til aldersmatchede postmortem astrocytter og primære astrocytter29. Således er denne konverteringsprotokol et kraftfuldt værktøj til at undersøge sygdomsmekanismer og evaluere nye terapeutiske tilgange til aldersrelaterede neurodegenerative og neurologiske lidelser.
Her beskriver vi den anvendte protokol til at generere iNPC'er og yderligere differentiering i iAs, som er de mest velegnede til større skala små molekylære screening assays. Sygdomsmekanismer og lægemiddeltest med iAs kan udføres ved hjælp af forskellige metoder såsom co-kulturer med neuroner eller metabolisk og biokemisk analyse. Fordelen ved dette system er hastigheden og letheden af vedligeholdelsen af disse cellelinjer sammenlignet med iPSC'er. Desuden kan iNPC'er fryses i små portioner til iAs differentiering, hvilket letter test af lægemidler under konstante forhold over længere tid. Samlet set bliver sammenligning af større stikprøver mulig på denne måde, som åbner døren for at evaluere terapeutisk potentiale af forbindelser i en større og mere repræsentativ patientpopulation.
Protocol
| medie | Reagens | Beløb, der skal blandes | Endelig koncentration (%) |
| Fibroblast medier | DMEM, høj glukose, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Føtalt kvægserum | 50 mL | 10 | |
| Antibiotisk-antimycotisk | 5 mL | 1 | |
| Basismedier | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotisk-antimycotisk | 5 mL | 1 | |
| Konverteringsmedier | Basismedier | 50 mL | 99.9 |
| Kvindelig kønslemlæstelse | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| Globaliseringsfonden | 1 μL | 0,02 (20 ng/mL) | |
| Heparin | 50 μL | 0,1 (5 μg/mL) | |
| Neurale stamcellecellemedier (NPC) | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| Antibiotisk-antimycotisk | 5 mL | 1 | |
| Kvindelig kønslemlæstelse | 10 uL | 0.002 | |
| Astrocyt Media | DMEM, høj glukose, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| Føtalt kvægserum | 50 mL | 10 | |
| Antibiotisk-antimycotisk | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| Mediet skal filtreres efter blanding af alle komponenter. Konvertering medier (med faktorer) skal udarbejdes frisk hver uge. | |||
Tabel 1. Medieopskrifter for alle celletyper, der er inkluderet i protokollen. Medier skal filtreres efter blanding af alle komponenter med enten et sterilt vakuumfiltreringssystem til store mængder eller sprøjte og 0,2 um sprøjtefiltre. Konvertering medier (med faktorer) skal udarbejdes frisk hver uge.
1. Direkte konvertering af voksne humane fibroblaster til neuronale stamceller
BEMÆRK: En skematisk tidslinje for denne protokol kan gennemgås i Meyer (2014)19.
- Brug primære menneskelige hud fibroblaster, der kan fås fra celle banker eller hud biopsier31. Dyrkningsceller ved 37 °C i en 5% CO2 vævskultur inkubator. Passageceller i mindst 1-2 passager efter optøning før brug i forsøget. Når cellerne er klar, pels en brønd af en 6-brønds plade med human fibronectin (1:200 fortyndet i PBS) ved stuetemperatur i 15-20 min.
- Når cellerne er klar til at blive belagt, skal du fjerne fibronectin fra skålen og straks tilføje celleopløsning eller 2 ml fibroblastmedie (tabel 1) - lad ikke skålen tørre ud, før der tilsættes medier. Afhængigt af hvor hurtigt cellerne vokser, plade 150.000 (hurtigt voksende) - 200.000 (langsomt voksende) fibroblaster i to brønde af en menneskelig fibronectin belagt 6-godt plade hver.
BEMÆRK: Cellerne skal være omkring 70% sammensatte for viral transduktion for at kunne holde dem i samme plade i flere dage efter transduktion. Det kan være gavnligt for frø ved to forskellige tætheder for at have et valg næste dag til konvertering. - Dagen efter såning skal du kontrollere fibroblasterne under mikroskopet og kontrollere celletætheden (mellem 70-85%) og endda såning i hele brønden for optimale resultater.
- Transduce en godt med alle fire retrovirale vektorer (Oct3 / 4, Klf4, Sox2 og c-Myc) - brug en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10 for hurtigt voksende eller 15 for langsomt voksende fibroblaster (transduktion effektivitet bør overstige 70% eller flere positive celler for hver vektor). Der tilsættes regelmæssigt fibroblast medium til viral blanding til et samlet volumen på 1 mL pr. brønd og inkubat natten over ved 37 °C i en 5% CO2 vævskulturinkubator. Lad den anden godt ubehandlet og returnere celler til vævskultur inkubator.
BEMÆRK: Retrovirale vektorer kan købes af en leverandør eller laves internt, protokoller er tilgængelige online32. - Dagen efter transduktion vaskes celler 1x med PBS og tilsættes 1 mL frisk fibroblast medium.
- Den næste dag skal du skifte mellem- til konverteringsmedie. Vask celler 1x med PBS for at slippe af med det resterende fibroblast medium, og tilsæt derefter 1 mL konverteringsmedium. Skift også mediet for det ubehandlede til konverteringsmedier.
BEMÆRK: Nogle morfologiske ændringer kan observeres selv ved at ændre medierne på fibroblaster, der ikke fik retroviral vektorbehandling, og dermed have en ubehandlet brønd (valgfrit) vil være nyttigt, når virkningerne af de virale vektorer bestemmes. Celler skal begynde at ændre morfologi 2-4 dage efter skift til konverteringsmedier. - Overhold celler under mikroskopet, og hold øje med ændringer i morfologi (Figur 1). Cellemedier bør udskiftes dagligt under hele konverteringsprocessen (1-2 mL konverteringsmedier, tabel 1)og til efterfølgende iNPC-kultur. Skift medium ved omhyggeligt at fjerne 70% af medium fra brønden og samtidig sikre, at cellerne forbliver dækket i de resterende 30% af medierne.
BEMÆRK: Medier med vækstfaktorer i det skal indtages inden for 1 uge efter forberedelsen.- Fortsæt med at observere celler og skifte medie dagligt (1-2 mL konverteringsmedier).
- Nogle cellelinjer begynder at danne løse forhøjede runde formationer, der vokser i kuglelignende strukturer eller løse neuronale kugler(Supplerende figur 1 og 19,33). Pas på ikke at løsne disse celler. Hvis kuglerne løsner sig, kan de opsamles og re-belagt i en ny fibronectin belagt godt af en 6-brønds plade.
BEMÆRK: Hvis de udvides på egen hånd, vil cellerne have reduceret mangfoldighed i forhold til den oprindelige plade og kan repræsentere en klart anderledes cellelinje. Vi anbefaler, at du kombinerer disse celler med resten af de konverterede celler ved næste opdelingsrunde.
- Efter ca. 5-6 dage i konverteringsmedier (op til 12 dage for vanskelige cellelinjer), eller når cellerne bliver meget tætte, skal du sende dem 1:2 eller maksimum 1:3.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at holde cellerne i en høj tæthed under hele konverteringsprocessen.
2. Procedure for omregning og opdeling af iNPC
- Varm celleløsningen (f.eks. Accutase) op, og beklæd et passende antal brønde i en 6-brønd med fibronectin (1:200 i PBS, 1 ml belægningsvolumen) i 15-20 minutter ved stuetemperatur. Fibronectinbelægning kan være længere uden negativ påvirkning, men man skal passe på ikke at forkorte belægningstiden.
- Vask celler omhyggeligt med PBS uden at løsne celler (brug brøndens væg til at påføre PBS forsigtigt på cellerne). Fjern forsigtigt PBS med pipetter eller ved aspiration.
- Der tilsættes 0,5 ml celleløsning og inkuberes 2-3 min ved 37 °C i en vævskulturinkubator. Kontroller under mikroskopet for at kontrollere, at de fleste celler er løsrevet. Hvis alle celler er kommet ud, tilsæt 2 mL frisk konvertering medier og forsigtigt pipette op og ned 2-3 gange for at adskille klumper (hvis det kræves).
- Cellerne opsamles i et 15 ml rør, og der tilsættes yderligere 3 ml medier for yderligere at fortynde celleløsningen. Vask brønden med de ekstra medier først for at sikre, at alle celler er blevet indsamlet.
- Centrifuge i 4 min ved 200 x g ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Konvertering af celler eller iNPC'er er ekstremt følsomme over for tilstedeværelsen af celleløsningsopløsning i mediet. Det er absolut nødvendigt at fjerne restenzymet ved centrifugering og tilbagetrækning af supernatant. - Supernatant fjernes fra cellepillen, og cellerne opsuspenseres i 1 mL frisk medium. Rør forsigtigt op og ned 2-3 gange for at løse celleklumper. Fjern fibronectin fra belagt 6-brønde og tilsæt 1 mL frisk medier til hver brønd med det samme (lad ikke fibronectin tørre). For et splitforhold på 1:2 tilsættes 0,5 mL af celleaffjedringen i den ene brønd og den anden 0,5 mL i en anden brønd.
- Dyrkningsceller ved 37 °C i en vævskulturinkubator.
- Fordel cellerne ved forsigtigt at ryste 6-brønden i nord-syd-øst-vest retning (ikke cirkulær) og sat i vævskultur inkubator.
- Overhold cellerne under mikroskopet næste dag og skift medie (1-2 mL). Skift medie hver dag, indtil cellerne er klar til at blive delt igen.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal cellespredningen begynde at accelerere, og cellerne skal være klar til en anden opdeling inden for 2-3 dage (4 dage for meget langsomt voksende linjer).- Ved denne nye opdeling frø en brønd af celler i konvertering medier og den anden godt i NPC medier, der kun indeholder FGF ved øget koncentration uden EGF / heparin (Tabel 1).
BEMÆRK: Nogle cellelinjer når en stagnerende tilstand i konverteringsmedier efter ca. 10 dage, og skift til NPC-medier kan hjælpe med cellevækst. Derudover har NPC'er en mere specifik, mindre form, når de dyrkes i NPC-medier19. På dette tidspunkt er iNPC'erne klar til differentiering og videre brug.
- Ved denne nye opdeling frø en brønd af celler i konvertering medier og den anden godt i NPC medier, der kun indeholder FGF ved øget koncentration uden EGF / heparin (Tabel 1).
- Fortsæt med at skifte medie (1-2 mL) af iNPC'erne dagligt.
- Udvid NPC'ere i 10 cm retter ved at kombinere to eller tre sammenflydende brønde af en 6-brønd. Medievolumenet til 10 cm retter er typisk 12-15 mL.
- Ved den næste opdeling udvides disse celler yderligere til tre eller fire 10 cm retter (12-15 mL medier) i generationer af et stort antal cellelagre. 10 cm retter deles normalt ved 1:3 eller 1:4 hver 3-4 dage afhængigt af spredningshastigheden.
3. Generering af inducerede astrocytter fra NPC'ere
- For at fremstille astrocytter af friske IPC'er, frø iNPC'er (i 10 cm fibronectin coatede plader) direkte i 10 mL astrocyt medium (Tabel 1), således at de er omkring 10% sammenløb den følgende dag. Dyrkningsceller ved 37 °C i en 5% CO2 vævskultur inkubator.
BEMÆRK: Den anbefalede såningstæthed er normalt 50 μL af cellerepensionen af en 10 cm skål NPC'er, forudsat at de fortyndes til et endeligt volumen baseret på deres splitforhold (f.eks. 3 mL for en 1:3 split, 4 mL for en 1:4 split osv.). - Skift medium (10 mL astrocyte medier) af iAs tre dage efter plating. Hold cellerne differentierende i 5-7 dage.
BEMÆRK: IAs tolererer ikke flere passager godt, derfor er det bedre at lave friske astrocytter, hver gang du opdeler NPC'erne. - Til frø til forsøg skal astrocytterne opdeles ved hjælp af trypsin- eller celleafmonteringsopløsning som beskrevet i trin 2.1-2.7. De anbefalede såningstætheder er medtaget i tabel 2.
| Pladetype | Astrocytter per brønd |
| 384-brønd | 2500 |
| 96-brønd | 10000 |
| 24-brønd | 40000 |
| 6-brønd | 150000 |
Tabel 2. Anbefalet såningstæthed af iAs pr. pladeareal. Typisk antal iAs seedet til at generere en monolayer på de mest almindelige vævskultur plader.
4. Forberedelse og optøning af portioner til astrocytdifferentiering fra frosne NPC-lagre (alternativ til trin 3)
BEMÆRK: Som et alternativ til at opretholde iNPC'er i kultur kan astrocytter også fremstilles direkte fra en frossen bestand. For at gøre dette fryses iNPC'erne i mindre portioner. Tabel 3 viser de foreslåede fryse- og optøningsvolumener for portioner, der skal optøs til en skål på 10 cm, der indeholder 10 mL Astrocyte-medier.
| Portionsstørrelse | Celleophæng (μL) | Frysende medier (μL) | Samlet volumen (μL) | Afrimning til |
| 4x | 400 | 400 | 800 | To 10 cm retter |
| 2x | 200 | 200 | 400 | En 10 cm skål |
Tabel 3 . Instruktioner om, hvordan du portion iNPC at generere iAs. Andel af iNPC suspension og frysning medier til at generere portioner. Bemærk, at den endelige DMSO-koncentration er 10%, når celleaffjedringen blandes med frysemedier.
- For at fremstille astrocytter fra frosne iNPC-lagre skal portionslagerglas fjernes fra flydende nitrogentank og tøs hurtigt ved 37 °C. Så snart cellerne er optøet, pipette celleopløsning i en 15 ml rør, der indeholder 5 ml astrocyt medier.
- Centrifuge i 4 min ved 200 x g og stuetemperatur. Supernatanten fjernes og genbruges i 1 mL frisk astrocyt medium.
- Tilsæt 9 ml frisk astrocyt medium til en fibronectin belagt 10 cm skål og tilsæt 1 ml celleopløsning. Forsigtigt distribuere celler i nord-syd-øst-vest bevægelse. Dyrkningsceller ved 37 °C i en 5% CO2 vævskultur inkubator.
Representative Results
Denne protokol giver mulighed for hurtig og nem generering af iNPC'er direkte fra menneskelige hudfibroblaster ved hjælp af retrovirus, der indeholder Yamanaka-faktorerne. Denne metode gør det muligt at omgå stamcelletilstanden og behovet for klonvalg og derved undgå klonvariation. Vigtige skridt til at huske på, mens cellerne gennemgår konverteringsprocessen er fibroblast såning tæthed, medier pH og holde cellerne på en optimal sammenløb. Eksempler på optimale ændringer i opdelingskonfluens og morfologi under konverteringsprocessen findes i figur 1.
Figur 1. Repræsentative billeder af konverteringsprocessen efter tilføjelse af retroviral blanding af Yamanaka-faktorer. Fibroblaster blev seedet og transduceret 24 timer senere med Yamanaka faktorer. To dage efter virus (DPV), medier blev ændret til konvertering medier. Celler blev dyrket i konvertering medier, indtil de var klar til passage (13 DPV). Celler blev seedet post passage for at nå 80% sammenløb den følgende dag (14 DPV). Efterfølgende passager opretholdt denne tæthed, indtil neuronale stamceller begynder hurtigt at dividere. Skalalinjen er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Når konverteringsprocessen er fuldført, viser NPC'erne stærkt reducerede udtryk eller intet udtryk for fibroblastmarkører og morfologi og udtrykker NPC-specifikke cellemærker (Figur 2). Desuden kan de også bruges til at generere forskellige cellelinjer, som iNs, iOs og iAs.
Figur 2. Celler, der gennemgår konverteringsprocessen, udtrykker cellespecifikke mærker. Patient fibroblaster (A), inducerede Neuronal Progenitor Cells (iNPC'er (B) og inducerede Astrocytes (iAs (C) celler blev seedet på glasovertræk i en 24 godt vævskultur behandlet plade. Cellerne blev immunostained for: fibroblast specifikke cellemarkører (A), Vimentin (grøn) og TE7 (rød), iNPC specifik cellemarkør (B), Nestin (rød) og iAs cellemarkør (C) GFAP (lilla) og iNPC markør Nestin (grøn). Skalalinjen er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det er vores erfaring, iAs især er meget værdifulde for narkotika og sygdom mekanisme test, da de kan genereres i rene populationer (98% eller mere GFAP positive celler29) på reproducerbare store antal. iAs kan skelnes fra iNPC'er ved at tage en lille aliquot af celler under opdeling eller en tidligere frossen iNPC del og direkte plating i astrocyt medier. Vigtige overvejelser i denne proces er at opretholde iNPC'ernes oprindelige såningstæthed lav (figur 3 og figur 4), da en høj densitet har vist sig at hindre differentieringsprocessen (figur 4) og være ekstra opmærksom på mediernes pH, da forsuring kan aktivere selv sunde astrocytter.
Figur 3. Repræsentative billeder af iAs-oprettelsesprocessen fra iNPC'er. iNPC'er er seedet i Astrocyte medier (Tabel 1) ved en lav såning tæthed. En god såning tæthed er omkring 10% på den første dag efter såning (DPS) (venstre); Denne tæthed kan dog justeres i henhold til cellernes vækstrate. Typisk iAs morfologi kan observeres efter 5 DPS (midten). I nogle tilfælde kan afvigende astrocytmorfologi observeres med lange, strittende udvidelser. Denne ændring er tegn på astrocytaktivering og kan være sekundær i forhold til sygdomstilstand eller forkerte dyrkningsteknikker (til højre). Skalalinjen er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. iNPC såning tæthed påvirker iAs differentiering effektivitet. Kontrol iNPC linjer blev seedet ved lav (A) og høj (B) tæthed i Astrocyte medier til at påvise virkningerne af såning tæthed på differentiering. 5 DPS, linjen med lav densitet udtrykt astrocyt-specifikke markører, mens linjen med høj densitet viser en blanding af iNPC- og iAs-markører med en markeret iNPC-lignende morfologi. Skalalinjen er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Yderligere tal for konverteringsprocessen efter tilføjelse af retroviral blanding af Yamanaka-faktorer. Billeder af konverteringsprocessen ved 12 DPV (1 dag før passage) og 19 DPV (6 dage efter passage). Bemærk forskellen på morfologi mellem celler før og efter passage, på 12 DPV celler har en bold-lignende struktur morfologi. Efter en passage og flere dage på konverteringsmedier (tabel 1) begynder celler at vise en NPC-lignende morfologi. Skalalinjen er 200 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Sammenfattende er den direkte konvertering en hurtig og nem metode til at generere inducerede neuronale stamceller fra patientens hudfibroblaster. Denne metode er fordelagtig på grund af dens hastighed såvel som det store antal genererede celler, der er lette at vedligeholde. Desuden tyder stigende beviser på, at direkte omprogrammeringsmetoder fjerner mindre epigenetiske mærker sammenlignet med klassisk iPSC-omprogrammeringsteknologi, hvilket efterlader sygdomsmiljøet mere intakt4,7,8. Differentieringen af iNPC'er til astrocytter er meget ligetil og meget reproducerbar selv mellem flere uafhængigelaboratorier 19,29,33. INPC'er kan fryses i små portioner og optøs direkte til differentieringsformål, hvilket hjælper med at reducere variationen mellem eksperimenter, da passagenumre kan holdes ens. Astrocytter spiller en afgørende rolle i sygdomsprogression i mange neurologiske sygdomme og er derfor en interessant celletype at arbejde med. Astrocytterne kan bruges til mekanistiske undersøgelser, metaboliske undersøgelser eller lægemiddeltestanalyser og dyrkes normalt som monolag. Desuden kan astrocytter kombineres i co-kultursystemer med mus eller menneskelige neuroner for at vurdere astrocytters indvirkning på neuronal overlevelse og morfologi, som begge er gode udlæsninger til lægemiddeltest34.
For at kunne bruge denne protokol skal man huske på nogle få punkter og potentielle begrænsninger. Den menneskelige hud fibroblaster for eksempel varierer meget i deres celledeling sats samt reaktion på virale vektorer. Da disse ikke er standardiserede cellelinjer, er de lige så variable som menneskeheden selv, hver linje er forskellig. Som for mange omprogrammering metoder, er det lettere at omprogrammere fibroblaster, der har en moderat til hurtig celledeling sats versus celler, der er knap replikere. Replikationshastigheden kan påvirkes af hudens biopsikvalitet og selve behandlingen, af passagenummeret på fibroblasterne samt håndtering. Når du arbejder med primære hud fibroblaster, er det vigtigt ikke at lade cellerne få for tæt til at undgå induktion af senescens. Hvis fibroblasterne ikke vokser godt, er det bedst at prøve en ny bestand eller en lavere passage, selvom sygdommen i nogle tilfælde også kan spille en rolle. Celledeling kan undertiden forbedres ved at bruge 15% eller 20% FBS i fibroblast medier i forhold til standard 10%.
Kvaliteten af de omprogrammerende virale vektorer er af stor betydning for succes. I vores hænder var retrovirale vektorer mere effektive sammenlignet med lentivirale vektorer eller andre ikke-integrerende vira; Dette kan dog afhænge af den virale vektorkvalitet og renhed. Kommercielle retrovirale vektor kits normalt angive viral vektor koncentration og ofte også en mangfoldighed af infektion for en bestemt celle linje. Det er vigtigt at huske på, at primære fibroblaster adskiller sig fra den cellelinje, der bruges af virksomhederne til at bestemme viral vektoroptagelse. Selv ved bestilling af det samme kommercielle sæt er variation mellem partier desuden almindelig. Desuden varierer optagelsen af virale vektorer også mellem fibroblastcellelinjer. Nogle linjer kan være mere følsomme, og derfor transducerede celler kunne dø, mens andre cellelinjer kan være mere modstandsdygtige over for viral optagelse. Det kan således være vigtigt at bestemme transduktionseffektiviteten for en given cellelinje, især hvis cellelinjen vokser langsomt, eller tidligere konverteringsforsøg mislykkedes. I vores hænder er den bedste måde at vurdere, hvor meget af en bestemt retroviral vektor der er nødvendig for konvertering, at udføre en immunfluorescerende farvning med flere fortyndinger af den virale vektor. Antallet af celler, der udtrykker transgenet for hver vektor, kan derefter tælles med henblik på en transduktionseffektivitet på 70% eller højere. Det er vores erfaring, at lignende MOI'er kan bruges til de fleste cellelinjer, men MOI kan justeres om nødvendigt.
Under konverteringsprocessen er det vigtigt ikke at opdele cellerne for tidligt. Tiden indtil cellerne er klar til at blive opdelt afhænger af flere faktorer, herunder den primære cellelinje og dens egenskaber, kvaliteten af den anvendte virale vektor og mediekvaliteten. Det er vigtigt, at succesraten for konverteringen er meget højere, når cellerne holdes ved høj tæthed. Selv hvis cellerne begynder at ændre morfologi, er det bedre at forlade cellerne i den første godt længere end at opdele dem for tidligt. Hvis opdelingen sker for tidligt konverteringen kan standse i sin udvikling og føre cellerne til at differentiere tilbage til fibroblast-lignende form og adfærd. Desuden kan fortynding af dem for tidligt resultere i mere aflange cellelegemer sammenlignet med de små og kompakte cellelegemer i NPC'erne, der er observeret tidligere. Således bør de første opdelinger altid være konservative; det er bedre at holde cellerne for tætte med en 1:1 eller 1:2 split i forhold til fortynding dem for meget. Nogle celledød forventes efter den første split. Bemærk, at cellerne altid ser værre (fladere) den første dag efter opdeling, hvilket er normalt. Bedste domme på celleform bør foretages 2-3 dage senere. Det er vigtigt, at kvaliteten af vækstfaktorerne og mediekomponenterne også er afgørende. Det er vigtigt at forberede små mængder medier, der indeholder vækstfaktorer, så de fuldt forberedte medier kun vil blive brugt i maksimalt 5-7 dage. Mediet må ikke opbevares ved stuetemperatur eller 37°C i længere tid ad gangen. Brug hurtigt og opbevares i køleskab, så snart medieskiftet er udført. Derudover kan det hjælpe at holde medievolumen lavt ved 1 mL i stedet for 2 mL, især for cellelinjer, der er mere modstandsdygtige over for konvertering. Hvis cellerne forbruger mediet hurtigt, hvilket kan observeres ved en ændring i mediefarveformen rød til gul (forsuringshastighed), skal du justere medievolumenet til op til 2 mL. Hurtigt medieforbrug er et positivt tegn og ses ofte på senere stadier af konverteringen sammen med øget spredning.
NPC'ere er også meget følsomme over for tilstedeværelsen af accutase i medierne, og det er meget vigtigt at holde den accutase inkubationstid kort. Vi anbefaler en inkubationsperiode på 2-4 minutter, kontroller celler ofte under mikroskopet for at se, hvornår de er løsrevet. Det er vigtigt at centrifuge cellerne efter opdeling for at fjerne enzymblandingen fra mediet. Det er også vigtigt at holde passagenummeret i tankerne, da cellelinjer kan ændre sig ved udvidet dyrkning, der fører til ændring af udtryksprofiler. Således er det vigtigt at fryse mange cellelagre ved tidlige passager. Celler bør fryses i 10% DMSO og 90% NPC medier og opbevares på lang sigt i flydende nitrogen. På grund af manglen på serum i dette medie er det afgørende at sikre en langsom fryse ved hjælp af frysekamre og når det er frosset natten over, straks overføre til flydende nitrogen. Mens der ikke udføres klonvalg i denne protokol, er det muligt, at udvidet dyrkning og passaging fører til naturlig udvælgelse af en indledende cellepopulation med gunstig vækst og overlevelsesrate. Derfor er det vigtigt at holde passagenummer og håndtering for øje, når man udfører eksperimenter. Vi foretrækker at bruge lavere passager til eksperimenter, hvis det er muligt, vi ikke overstiger passaging cellelinjerne i mere end 20 gange. Da NPC'erne vokser hurtigt, kan et stort antal bestande fryses i lavere passager for eksperimenter. Cellelinjer med særligt høje vækstrater har større risiko for medieforsuring. Efterhånden som cellelinjerne vokser med forskellig hastighed, kan det derfor være nødvendigt at justere mængden af medier baseret på spredning. Hvis cellerne kontinuerligt efterlades i stærkt forsurede medier, kan det påvirke sundheden for både kontrol- og sygdomscellelinjer. Dette får selv sunde astrocytter til at blive reaktive, hvilket påvirker deres anvendelse i yderligere differentiering og eksperimenter.
For astrocyt differentiering, er det vigtigt at holde cellerne ved lav densitet som høj densitet vil forhindre cellerne i at differentiere, og de vil holde formere sig ved højere hastigheder. Således skal såningstætheden justeres for hver cellelinje, der er afhængig af deres spredningshastighed. Vi anbefaler at prøve forskellige såningstætheder og udføre pletter / RT-PCR med astrocytmarkører for at sikre korrekt differentiering. IAs kvalitet kan vurderes sammen med sunde kontroller ved hjælp af co-kultur assays med neuroner. Forudsat at sygdomspatologi ikke fører til en reaktiv fænotype, bør neuroner forblive levedygtige i kontakt med iAs i flere dage. Astrocyt morfologi kan variere meget mellem de enkelte cellelinjer og kan blive påvirket af sygdommen fænotype så godt. Desuden kan de i sygdomme, hvor astrocytter er stærkt påvirket, vise en reaktiv fænotype med store, aflange udvidelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle patienter og raske frivillige for at donere kritiske prøver til forskningsundersøgelser. Desuden takker vi Rochelle Rodrigo for løbende ekspert teknisk bistand i vævskultur og Laura Ferraiuolo for uafhængigt at bekræfte teknikken i hendes laboratorium som samarbejdspartner. Dette arbejde modtog støtte fra US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 og RC2 NS69476-01 (til A.L.S.) og Packard Center for ALS Research Grant P2ALS og Helping Link Foundation. K.M. modtog også støtte fra Swiss National Science Foundation samt Young Investigator Development Award fra Muskelsvindforeningen, Rett Syndrome Research Trust og familierne til SCN2A-fonde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
References
- Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
- Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
- Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).
- Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
- Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
- Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
- Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
- Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
- Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
- Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
- Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
- Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
- Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
- Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
- Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M.
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
- Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
- Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
- Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
- Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
- Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
- Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11 (2001).
- Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
- Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).
