Summary
我们描述了一个将人类皮肤衍生的成纤维细胞重新编程为诱导神经元祖先细胞（iNPC）的协议，以及它们随后分化成诱导的星形细胞（iAs）的协议。这种方法可快速、可重复地大量生成 iNC 和 iAs。
Abstract
神经系统疾病的研究主要侧重于神经元对疾病机制的影响。动物模型的有限可用性严重影响了细胞类型对疾病特定贡献的研究。此外，动物模型通常不能反映人类患者的突变和疾病过程的变异性。诱导多能干细胞（iPSC）的再编程方法彻底改变了患者的特定研究，为研究疾病机制创造了宝贵的工具。然而，iPSC技术有缺点，如时间，劳动承诺，克隆选择性和表观遗传标记的损失。最近对这些方法的修改允许更直接地生成细胞系或特定细胞类型，绕过克隆隔离或多能干细胞状态。我们开发了一种快速直接转换方法，利用逆转录病毒载体与神经介质相结合，从皮肤成纤维细胞中产生诱导神经元祖细胞（iNPC）。iNPC可以区分成神经元（iNs）寡头细胞（iOs）和星形细胞（iAs）。iAs 生产有助于快速药物和疾病机制测试，因为与 iNC 的区分只需 5 天。此外，iAs 易于处理，并且大量在纯人群中生成。我们开发了一种高度可重复的共培养检测方法，使用小鼠 GFP® 神经元和患者衍生的 iAs 来评估许多神经和神经退行性疾病的潜在治疗策略。重要的是，iA 检测可扩展至 384 井格式，便于对一个板中的多个小分子进行评估。这种方法允许同时对具有不同遗传背景的多个患者细胞系进行治疗性评估。易于生产和储存 iAs，并能够在一次检测中筛选多种化合物，使这种方法适合个性化医学。
Introduction
了解潜在的疾病机制对神经系统疾病至关重要，因为它有助于制定潜在的治疗策略。虽然动物模型历来是研究神经系统疾病的黄金标准，但将潜在疗法直接转化为临床环境往往显示出有限的成功1、2、3。缺乏翻译的原因是小鼠遗传背景和突变缺乏变异性，疾病表型显示不完整，药物敏感性变化或人类患者的服用在近亲繁殖小鼠菌株中表现不佳。此外，对于许多罕见的神经系统疾病，没有或很少的动物模型可用。直接研究相关人类细胞类型的疾病机制可以促进研究，并改善对临床的翻译。对于CNS疾病，原发性人类细胞很难检索，并且代表非常有限的来源，因为活检是侵入性的，或者只能在疾病的末期进行验尸。在过去的15年里，细胞重新编程技术的发展迅速扩展了在体外模拟人类神经和神经退行性疾病的能力。
传统的细胞重新编程方法包括将成纤维细胞或其他细胞类型重新编程成诱导多能干细胞（iPSC），能够从所有三个细菌层4中区分成细胞类型。高桥和山中是第一个表明，四个干细胞转录因子的再表达足以重定向体细胞成为iPSC5。然后，iPSC 可以进一步区分为特定的细胞类型。然而，这个过程的缺点是，产生和分离稳定的干细胞克隆是劳动密集型的，耗时。干细胞克隆中还保留着体细胞突变或母细胞的特定异常，并可能影响研究结果。此外，越来越多的证据表明，干细胞的重新编程过程会抹去可能影响细胞疾病机制的有价值的表观遗传变化。近年来，研究人员专注于修改的重新编程方法，允许更直接地生成不同的细胞类型，同时绕过多能干细胞状态9，10，11，12（审查在13，14）。 初步突破揭示在体外组合重新编程成纤维细胞到心肌细胞15，神经元16和肝细胞17通过异位表达的多个血统特定转录因子或微RNA18。随后进行了直接重新编程细胞以模拟神经紊乱19，20的研究。如上所述，这种直接重新编程或转换协议比经典的 iPSC 协议具有潜在的优势，包括速度和克隆隔离步骤的消融。此外，有证据表明，这些协议允许保持更多的表观遗传信息与病人的年龄，并可能同样适用于疾病相关标记7，8。
迄今为止，大多数关于神经系统疾病的体外研究主要集中在神经元上。然而，众所周知，其他细胞类型，如星形细胞， 微胶质和寡头细胞在疾病病理学和神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症）、肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、帕金森病 （PD）、亨廷顿舞蹈症 （HD）、多发性硬化症 （MS） 和其他神经病理学（如雷特综合征 （RTT）、睡眠障碍、成瘾、 癫痫，溶酶体储存障碍，抑郁症，偏头痛和病理疼痛21，22，23，24，25，26。天体细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，直到最近，它们从病理学角度被广泛忽视。众所周知，它们现在在支持健康 CNS 的几乎所有家居功能方面起着至关重要的作用。此外，很明显，它们具有重要的病理影响，在了解疾病机制和评估治疗策略方面非常有价值。
在目前的描述中，我们详细说明了人类患者成纤维细胞直接转化为诱导神经元祖细胞（iNPC）的协议，使用逆转录病毒载体表达山中再编程因子（Klf4，10月3/4，Sox2和c-Myc），以及随后接触神经化介质。先前的研究已经使用不同的转录因子组合直接重新编程到神经细胞（在14审查），但所述协议中使用的因素广泛可用，无论是作为质粒在内部生产的病毒载体，或作为商业上可用准备去病毒重新编程套件。由此产生的iNPC可以进一步区分成诱导神经元（iNs）27，寡头细胞（iOs）24和星形细胞（iAS）19，以研究它们在神经系统疾病中的作用。我们的协议不涉及耗时的iPSC生成，大多数可用的协议用于人类星形细胞28的衍生。大约98%至100%的直接重新编程的iNPC可以区分成GFAP阳性星形细胞29，而只有2%使用直接转换方法从成纤维细胞到星形细胞30。最近，一项使用我们描述的再编程方法进行的比较转录研究表明，从供体成纤维细胞重新编程的iNPC可以在转录和功能水平上保留与死后天体细胞和原生星细胞29相匹配的年龄特征。因此，这种转化协议是研究疾病机制和评估与年龄相关的神经退行性疾病和神经紊乱的新疗法的有力工具。
在这里，我们描述了用于生成 iNPC 和进一步区分为 iAs 的协议，这是最适合更大规模小分子筛选检测的。疾病机制和药物测试与iAs可以使用不同的方法，如与神经元共同培养或代谢和生化分析。与 iPSC 相比，该系统的优点是这些细胞系的维护速度和易于维护。此外，iNPC 可以冷冻在小部分 iAs 分化，从而在长期不变条件下进行药物测试。总体而言，通过这种方式，对较大的样本数量进行比较是可能的，这为评估更大、更具代表性的患者群体中化合物的治疗潜力打开了大门。
Protocol
| 媒体 | 试剂 | 混合量 | 最终浓度（%） |
| 纤维细胞介质 | DMEM，高葡萄糖，麸质MAX | 500毫升 | 89 |
| 胎儿牛血清 | 50升 | 10 | |
| 抗生素抗菌剂 | 5升 | 1 | |
| 基础媒体 | 德梅姆/F12 » 格鲁塔马克斯 | 500毫升 | 97 |
| N-2 | 5升 | 1 | |
| B-27 | 5升 | 1 | |
| 抗生素抗菌剂 | 5升 | 1 | |
| 转换介质 | 基础媒体 | 50升 | 99.9 |
| FGF | 1μL | 0.02 （20 ng/mL） | |
| 埃格夫 | 1μL | 0.02 （20 ng/mL） | |
| 肝素 | 50 微升 | 0.1 （5 微克/升） | |
| 神经祖细胞 （NPC） 介质 | 德梅姆/F12 » 格鲁塔马克斯 | 500毫升 | 96.9 |
| N-2 | 5升 | 1 | |
| B-27 | 5升 | 1 | |
| 抗生素抗菌剂 | 5升 | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| 天体细胞介质 | DMEM，高葡萄糖，麸质MAX | 500毫升 | 89 |
| 胎儿牛血清 | 50升 | 10 | |
| 抗生素抗菌剂 | 5升 | 1 | |
| N-2 | 1升 | 0.2 | |
| 混合所有组件后，必须过滤媒体。转换介质（具有因素）必须每周准备新鲜。 | |||
表1。协议中包含的所有单元格类型的媒体配方。 将所有组件与无菌真空过滤系统混合以进行大容量或注射器和 0.2 um 注射器过滤器混合后，应过滤介质。转换介质（具有因素）必须每周准备新鲜。
1. 将成人成纤维细胞直接转化为神经元祖细胞
注：此协议的示意图时间表可在迈耶 （2014）19 中查看。
- 使用主要的人类皮肤成纤维细胞，可以从细胞库或皮肤活检31获得。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 °C 的培养细胞。在实验中使用之前，至少1-2个通道的通道细胞在解冻后。细胞准备好后，在室温下用人体纤维素（PBS稀释1：200）涂上6井板，时间为15-20分钟。
- 当细胞准备镀时，从盘子中取出纤维素，并立即添加细胞溶液或2mL成纤维细胞介质（表1）- 在添加介质之前不要让盘子干涸。根据细胞生长的速度，在两口井中各涂有6个细胞板的板150，000（快速生长） - 200，000（缓慢生长）成纤维细胞。
注意：细胞应是病毒转导的70%左右的汇流体，以便在转导后能够将它们放在同一个盘子中几天。它可以有利于种子在两个不同的密度，以便有一个选择的第二天转换。 - 播种后的第二天，检查显微镜下的成纤维细胞，并验证细胞密度（70-85%）甚至在整个井中播种以获得最佳效果。
- 与所有四个逆转录病毒载体（10月3/4，Klf4，Sox2和c-Myc）一口井 - 使用多种感染（MOI）为10的快速生长或15缓慢生长成纤维细胞（转导效率应超过70%或以上的正细胞为每个载体）。将常规成纤维细胞介质添加到病毒混合物中，每口井的总体积为 1 mL，并在 5% CO2 组织培养孵化器中以 37 °C 的温度在一夜之间孵化。将第二个井未经处理，并将细胞返回组织培养孵化器。
注：逆转录病毒载体可以由供应商购买或内部制作，协议可在线32。 - 转导后的第二天，用 PBS 清洗细胞 1 倍，并添加 1 mL 的新鲜成纤维细胞介质。
- 第二天，将介质更改为转换介质。用 PBS 清洗细胞 1 倍，以摆脱残余成纤维细胞介质，然后添加 1 mL 的转换介质。将未经处理的介质也更改为转换介质。
注意：即使通过改变未接受逆转录病毒载体治疗的成纤维细胞上的介质，也可以观察到一些形态变化，因此，在确定病毒载体的影响时，有未经治疗的井（可选）会很有帮助。细胞应在切换到转换介质后 2-4 天开始改变形态。 - 观察显微镜下的细胞，观察形态的变化（图1）。细胞介质应在整个转换过程中每天更换（转换介质的 1-2 mL， 表 1）以及随后的 iNPC 文化。通过小心地从井中去除 70% 的介质来改变介质，同时确保细胞在剩余的 30% 介质中保持覆盖。
注：具有生长因子的媒体需要在准备后1周内消耗。- 继续观察细胞并每天更换介质（转换介质的 1-2 mL）。
- 一些细胞系开始形成松散的升高圆形成，在球体中生长，如结构或松散的神经元球体（补充图1和19，33）。 小心不要分离这些细胞。如果球分离，它们可以收集和重新镀在一个新的纤维素涂层井的6井板。
注意：如果它们自己膨胀，细胞的多样性将比初始板减少，并且可能代表一个明显不同的细胞系。我们建议在下一轮分裂时将这些细胞与其他转换的细胞组合在一起。
- 在转换介质中大约 5-6 天后（对于困难的细胞系最多 12 天），或当细胞变得非常密集时，通过它们 1：2 或最大 1：3。
注意：在整个转换过程中保持细胞的高密度非常重要。
2. 转换和 iNPC 拆分程序
- 加热细胞分离溶液（如 Accutase），在室温下涂抹适当数量的 6 井与纤维素（PBS 中 1：200，涂层体积 1 mL）的 6 井，时间为 15-20 分钟。纤维素涂层可以更长，没有负面影响，但应小心不要缩短涂层时间。
- 使用PBS小心地清洗细胞，而不会分离任何细胞（使用井壁轻轻地将PBS涂抹在细胞上）。小心地用移液器或吸入器取出 PBS。
- 加入 0.5 mL 的细胞分离溶液，在 37 °C 的组织培养孵化器中孵化 2-3 分钟。在显微镜下检查，以验证大多数细胞是否已经分离。如果所有细胞都脱落，添加 2 mL 的新鲜转换介质，并轻轻地上下吹笛 2-3 次，以分离团块（如果需要）。
- 将细胞收集在 15 mL 管中，并添加额外的 3 mL 介质，以进一步稀释细胞分离溶液。首先用额外的介质清洗油井，以确保所有细胞都已收集完好。
- 离心机在室温下在200 x g下4分钟。
注意：转换细胞或 iNPC 对介质中细胞分离解决方案的存在极为敏感。绝对有必要通过离心和提取超自然药物来去除残留酶。 - 从细胞颗粒中取出超纳特，用1mL的新鲜介质重新注入细胞。轻轻上下吹笛2-3次，以解决细胞团。从涂层的6口井中取出纤维素，并立即向每口井添加1毫升的新鲜介质（不要让纤维素干燥）。对于 1：2 的分割比，在一口井中加入 0.5 mL 的细胞悬浮，在第二口井中添加 0.5 mL。
- 组织培养孵化器中37°C的培养细胞。
- 通过在南北-东西方向（不是圆形）轻轻摇动6井来分配细胞，并放入组织培养孵化器中。
- 第二天观察显微镜下的细胞，并改变介质（1-2 mL）。每天更换介质，直到细胞准备再次分裂。
注意：此时，细胞增殖应开始加速，细胞应在2-3天内准备好第二次分裂（非常缓慢的生长线为4天）。- 在这种新的分裂中，在转化介质中播种一口细胞，在NPC介质中播种另一口细胞，其中只有FGF在不含EGF/肝素的情况下浓度增加（表1）。
注意：一些细胞系在大约10天后在转换介质中达到停滞状态，切换到NPC介质可能有助于细胞生长。此外，NPC有一个更具体，更小的形状，当成长在人大媒体19。此时，iNPC 已准备好进行区分和进一步使用。
- 在这种新的分裂中，在转化介质中播种一口细胞，在NPC介质中播种另一口细胞，其中只有FGF在不含EGF/肝素的情况下浓度增加（表1）。
- 每天不断更换iNPC的媒体（1-2 mL）。
- 将两三口6井的汇合井组合在一起，将NPC扩展为10厘米的菜肴。10 厘米菜肴的介质体积通常为 12-15 mL。
- 在下一次分裂时，进一步扩大这些细胞到三到四个10厘米的菜（12-15 mL的介质），为几代人大量的细胞库存。10 厘米的菜肴通常每 3-4 天以 1：3 或 1：4 的速率拆分，具体取决于增殖率。
3. 从NPC生成诱导星形细胞
- 要从新鲜的 iNPC 中制造星形细胞，种子 iNPC（在 10 厘米纤维素涂层板中）直接在 10 mL 星形细胞介质（表 1）中，以便它们在第二天达到 10% 左右的汇合。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 °C 的培养细胞。
注：建议的播种密度通常是 10 厘米盘 NPC 细胞悬念的 50 μL，前提是它们根据拆分比稀释为最终体积（例如，1：3 分裂的 3 mL，1：4 分裂的 4 mL 等）。 - 电镀三天后更换 iAs 的介质（10 mL 星体介质）。保持细胞分化5-7天。
注意：iAs不能很好地容忍多个段落，因此每次拆分NPC时最好制作新鲜的星形细胞。 - 要播种进行实验，请使用步骤 2.1-2.7 中描述的尝试蛋白或细胞分离溶液分割星形细胞。推荐的播种密度包含在 表 2 中。
| 板类型 | 每井天文细胞 |
| 384 井 | 2500 |
| 96 井 | 10000 |
| 24 井 | 40000 |
| 6 井 | 150000 |
表2。建议每个板面积的 iAs 的播种密度。 在最常见的组织培养板上播种以生成单层的典型 iAs 的典型数量。
4. 准备和解冻与冷冻 NPC 股票的天体细胞分化部分（第 3 步的替代方案）
注：作为在文化中保持 iNPC 的替代方案，星形细胞也可以直接从冷冻库存中产生。为此，iNPC 被冻结在较小的部分。 表3 显示建议冻结和解冻体积，将部分解冻成含有10mL天体细胞介质的10厘米的盘子。
| 份量大小 | 细胞悬架（μL） | 冷冻介质（μL） | 总容量 （μL） | 解冻进入 |
| 4x | 400 | 400 | 800 | 两道10厘米的菜 |
| 2倍 | 200 | 200 | 400 | 一道10厘米的菜 |
表3。关于如何分份 iNPC 以生成 iAs 的说明。 iNPC 暂停和冻结介质以生成部分的比例。请注意，当细胞悬浮与冷冻介质混合时，最终 DMSO 浓度为 10%。
- 要从冷冻的 iNPC 库存中制造星形细胞，请从液氮储存罐中取出部分小瓶，并在 37 °C 时快速解冻。 细胞解冻后，在含有5mL星体介质的15mL管中立即溶液。
- 离心机在200 x g和室温下4分钟。去除超自然物，在1mL的新鲜星体介质中再喷出。
- 将 9 mL 的新鲜星体介质添加到涂有 10 厘米盘的纤维素中，并添加 1 mL 的细胞溶液。在南北-东南-西北运动中轻轻分配细胞。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 °C 的培养细胞。
Representative Results
该协议允许使用含有山中因子的逆转录病毒，直接从人的皮肤成纤维细胞中快速、轻松地生成 iNPC。这种方法允许绕过干细胞状态和克隆选择的需要，从而避免克隆变异。细胞在进行转化过程中需要记住的重要步骤是成纤维细胞播种密度、介质 pH 值以及保持细胞的最佳组合。在 转换过程中，可以找到最佳分裂共和和形态变化的例子。
图1。添加山中因素的逆转录病毒组合后转换过程的代表性图像。 24小时后，在山中因素的推动下，纤维细胞被播种并转产。两天后病毒（DPV），媒体被改为转换媒体。细胞在转换介质中培养，直到它们准备好通过（13 DPV）。细胞在通过后播种，第二天达到80%的汇合（14 DPV）。随后的通道保持这种密度，直到神经元祖细胞开始迅速分裂。比例栏是 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
转换过程完成后，NPC将显示强烈的表达或没有成纤维细胞标记和形态的表达，并表达NPC特定的细胞标记（图2）。此外，它们还可用于生成不同的细胞系，如 iN、iO 和 iAs。
图2。经历转换过程的细胞表示细胞特异性标记。 患者成纤维细胞 （A）、诱导神经元祖细胞 （iNPC （B） 和诱导天体细胞 （iAs （C） 细胞在 24 个良好组织培养处理板的玻璃盖上播种。细胞被免疫染色：成纤维细胞特定细胞标记 （A）、维门汀（绿色）和 TE7（红色）、iNPC 特定细胞标记 （B）、内斯汀（红色）和 iAs 细胞标记 （C） GFAP（紫色）和 iNPC 标记内斯汀（绿色）。比例栏是 50μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
根据我们的经验，iAs尤其对药物和疾病机制测试非常有价值，因为它们可以在可重复大量时在纯种群（98%或更多GFAP阳性细胞29）中产生。iAs 可以通过在分裂过程中或之前冻结的 iNPC 部分时使用少量细胞，并在星体细胞介质中直接电镀来与 iNPC 区别开来。在这个过程中，重要的考虑因素是保持iNPC最初的播种密度低（图3 和 图4），因为高密度已被证明阻碍分化过程（图4），并更加注意介质pH，因为酸化可以激活甚至健康的星形细胞。
图3。来自 iNC 的 iAs 生成过程的代表性图像。 iNPC 以较低的播种密度在天体细胞介质 （表 1） 中播种。良好的播种密度约为播种后第一天（DPS）的10%（左）：但是，这种密度可以根据细胞的生长速度进行调整。典型的 iAs 形态可以在 5 DPS （中间） 后观察到。在某些情况下，可以观察到异常的星形形，并具有长而尖的延伸。此更改表示星形细胞激活，可能继发于疾病状态或不正确的培养技术（右图）。比例栏是 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图4。iNPC 播种密度影响 iAs 分化效率。 控制 iNPC 线在天体细胞介质中以低 （A） 和高 （B） 密度播种，以显示播种密度对分化的影响。5 DPS，低密度线表示星形细胞特异性标记，而高密度线显示具有标记的 iNPC 和 iAs 标记的混合物，具有标记的 iNPC 样形态。比例栏是 50μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
补充图1。添加山中因素的逆转录病毒组合后转换过程的其他数字。 12 DPV（通过前 1 天）和 19 DPV（通过后 6 天）的转换过程图像。请注意，在通过前后细胞之间的形态差异，在12个DPV细胞有一个球状结构形态。经过一段和几天的转换介质（表1）细胞开始显示一个NPC样形态。比例栏是 200μm.请点击这里下载此文件。
Discussion
总之，直接转化是一种快速而简单的方法，从患者皮肤成纤维细胞中产生诱导神经元祖细胞。这种方法是有利的，因为它的速度以及大量的细胞生成，易于维护。此外，越来越多的证据表明，与经典的iPSC重新编程技术相比，直接重新编程方法去除的表观遗传标记较少，因此使疾病环境更加完整4，7，8。iNPC与星形细胞的分化是非常直接的，即使在多个独立实验室19、29、33之间也具有高度的可重复性。iNPC 可以冷冻在小部分，并直接解冻用于分化目的，这有助于减少实验之间的变化，因为通道数可以保持相似。在许多神经系统疾病中，天体细胞在疾病进展中起着至关重要的作用，因此是一种有趣的细胞类型。天体细胞可用于机械学研究、代谢研究或药物测试检测，通常以单层方式生长。此外，星形细胞可以与小鼠或人类神经元在共同培养系统中结合，以评估星形细胞对神经元生存和形态的影响，这两者都是药物测试34的良好读数。
为了成功使用此协议，需要牢记一些要点和潜在的局限性。例如，人类皮肤成纤维细胞在细胞分裂率和对病毒载体的反应上差异很大。由于这些不是标准化的细胞系，它们和人类本身一样是可变的，因此每一条线都是不同的。至于许多重新编程方法，与几乎没有复制的细胞相比，重新编程成纤维细胞更容易具有中度到快速的细胞分裂率。复制率可能受到皮肤活检质量和处理本身、成纤维细胞通过次数和处理的影响。当与原发性皮肤成纤维细胞一起工作时，重要的是不要让细胞变得过于密集，以避免诱导衰老。如果成纤维细胞生长不好，最好尝试新股或低通道，虽然在某些情况下，疾病本身也可以发挥作用。细胞分裂有时可以通过在成纤维细胞介质中使用 15% 或 20% FBS 来改进，而标准为 10%。
重新编程病毒载体的质量对于成功非常重要。在我们手中，逆转录病毒媒介比扁桃体向量或其他非整合病毒效率更高：然而，这可能取决于病毒载体的质量和纯度。商用逆转录病毒载体套件通常指定病毒载体浓度，并且通常也是特定细胞系的多种感染。重要的是要记住，原纤维细胞不同于公司用于确定病毒载体吸收的细胞系。此外，即使在订购相同的商业套件时，批次之间的变化也是常见的。此外，病毒载体的吸收也因成纤维细胞系而异。有些线可能更敏感，因此被转化的细胞可能会死亡，而其他细胞系可能更耐病毒吸收。因此，确定给定细胞系的转导效率可能很重要，尤其是在细胞系增长缓慢或之前的转换尝试失败时。在我们手中，评估转化需要多少特定的逆转录病毒载体的最佳方法是进行免疫荧光染色与病毒载体的几个稀释。然后可以计算表达每个向量的转基因细胞的数量，以达到70%或更高的转导效率。根据我们的经验，类似的MOI可用于大多数细胞系，但如有必要，可以调整 MOI。
在转换过程中，不要过早分裂细胞至关重要。细胞准备分裂的时间取决于多种因素，包括主细胞系及其特征、使用的病毒载体的质量和介质质量。重要的是，当细胞保持高密度时，转化的成功率要高得多。即使细胞开始改变形态，最好把细胞留在第一口井里，而不是过早分裂它们。如果分裂发生得太早，转化可以停止其进展，并导致细胞分化回成纤维细胞般的形状和行为。此外，与之前观察到的NPC的小型和紧凑细胞体相比，过早稀释它们会导致细胞体更拉长。因此，第一次分裂应始终保守：与过多稀释细胞相比，最好以1：1或1：2的分裂来保持细胞过密集。初步分裂后，预计会有一些细胞死亡。值得注意的是，细胞在分裂后的第一天总是看起来更糟（更平坦），这是正常的。对细胞形状的最佳判断应在2-3天后做出。重要的是，增长因素和媒体组件的质量也至关重要。重要的是要准备少量含有生长因子的媒体，以便充分准备的媒体最多只能使用5-7天。长时间不要将介质保持在室温或 37°C。快速使用，并在执行媒体更改后立即冷藏。此外，将介质的体积保持在 1 mL 而不是 2 mL，尤其对更耐转换的细胞系有帮助。如果细胞快速消耗介质，可以通过介质颜色变化从红色到黄色（酸化率）来观察，则将介质的体积调整到高达 2 mL。媒体的快速消费是一个积极的迹象，在转换的后期，随着扩散的增加，经常会观察到这一点。
NPC 对媒体中是否存在鼓掌也非常敏感，保持累积潜伏时间短非常重要。我们建议潜伏期为2-4分钟，经常在显微镜下检查细胞，看看它们何时分离。分离后离心细胞以从介质中去除酶混合物至关重要。记住通道编号也很重要，因为细胞系在扩展培养后可能会发生变化，导致表达特征的改变。因此，在早期通道冻结许多细胞库存是很重要的。细胞应冷冻在10%DMSO和90%NPC介质中，并长期储存在液氮中。由于这种介质中缺乏血清，使用冷冻室确保缓慢冷冻至关重要，一旦冷冻过夜，立即转移到液氮中。虽然本协议中没有进行克隆选择，但延长培养和传递可能会导致具有良好生长和存活率的初始细胞种群的自然选择。因此，在进行实验时必须牢记通过次数和处理。我们更喜欢使用较低的通道进行实验，如果可能的话，我们不会超过通过细胞系超过20次。由于NPC增长迅速，大量的库存可以冻结在较低的通道进行实验。生长率特别高的细胞系存在更高的介质酸化风险。因此，随着细胞系以不同的速度增长，媒体的数量可能需要根据增殖进行调整。如果细胞持续留在高度酸化的介质中，它会影响控制细胞和疾病细胞系的健康。这导致甚至健康的星形细胞变得被动，影响它们在进一步分化和实验中的使用。
对于星形细胞分化，保持细胞的低密度很重要，因为高密度会阻止细胞分化，并且它们会以更高的速度继续增殖。因此，种子密度需要根据每个细胞系的增殖率进行调整。我们建议尝试不同的播种密度，并使用星形细胞标记进行染色/RT-PCR，以确保适当的分化。使用与神经元共同培养的检测，在健康控制的同时评估 IAs 质量。如果疾病病理学不会导致反应性表型，神经元在与 iAs 接触数天时应保持可行。天体细胞形态在单个细胞系之间可能有很大的差异，并且可能受到疾病表型的影响。此外，在天体细胞受到严重影响的疾病中，它们可能表现出具有较大拉长扩展的活性表型。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢所有患者和健康志愿者将关键样本捐赠给研究。此外，我们感谢罗谢尔·罗德里戈在组织培养方面的持续专家技术援助，以及劳拉·费雷奥洛作为合作者在她的实验室中独立确认了这一技术。这项工作得到了美国国家卫生研究院赠款 R01 NS644912-4 和 RC2 NS69476-01（到 A.L.S.）和帕卡德 ALS 研究补助金 P2ALS 和帮助链接基金会的资助。K.M还获得了瑞士国家科学基金会的资助，以及肌肉萎缩协会、雷特综合症研究信托基金和SCN2A基金会家庭颁发的青年调查员发展奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
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