Summary
Vi beskriver en protokoll for å omprogrammere humane hudavledede fibroblaster til induserte nevronale stamceller (iNPCer), og deres påfølgende differensiering til induserte Astrocytter (iAer). Denne metoden fører til rask og reproduserbar generering av iNPCer og iAer i store mengder.
Abstract
Forskning på nevrologiske lidelser fokuserer primært på effekten av nevroner på sykdomsmekanismer. Begrenset tilgjengelighet av dyremodeller påvirker studien av celletypespesifikke bidrag til sykdom alvorlig. Videre reflekterer dyremodeller vanligvis ikke variasjon i mutasjoner og sykdomsforløp sett hos menneskelige pasienter. Omprogrammeringsmetoder for generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har revolusjonert pasientspesifikk forskning og skapt verdifulle verktøy for å studere sykdomsmekanismer. Imidlertid har iPSC-teknologi ulemper som tid, arbeidsforpliktelse, klonisk selektivitet og tap av epigenetiske markører. Nylige modifikasjoner av disse metodene tillater mer direkte generering av celleavstanser eller bestemte celletyper, omgå klonisolasjon eller en pluripotent stamcelletilstand. Vi har utviklet en rask direkte konverteringsmetode for å generere induserte neuronale stamceller (iNPCer) fra hudfibroblaster som bruker retrovirale vektorer i kombinasjon med nevraliserende medier. INPCene kan differensieres til nevroner (iNs) oligodendrocytter (iOs) og astrocytter (iAer). iAs produksjon letter rask testing av legemiddel- og sykdomsmekanismer, da differensiering fra iNPCer bare tar 5 dager. Dessuten er iAer enkle å jobbe med og genereres i rene populasjoner i stort antall. Vi utviklet en svært reproduserbar co-kulturanalyse ved hjelp av mus GFP + nevroner og pasientavledede iAer for å evaluere potensielle terapeutiske strategier for mange nevrologiske og nevrodegenerative lidelser. Det er viktig at iA-analysene er skalerbare til 384-brønnsformat som letter evalueringen av flere små molekyler i en plate. Denne tilnærmingen tillater samtidig terapeutisk evaluering av flere pasientcellelinjer med forskjellig genetisk bakgrunn. Enkel produksjon og lagring av iAer og kapasitet til å screene flere forbindelser i en analyse gjør denne metoden tilpasningsdyktig for personlig medisin.
Introduction
Forståelse av underliggende sykdomsmekanismer er avgjørende for nevrologiske sykdommer da det hjelper i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier. Mens dyremodeller historisk har vært gullstandarden for å forske på sykdommer i nervesystemet, viser den direkte oversettelsen av potensielle terapier til en klinisk setting ofte begrenset suksess1,2,3. Årsaker til mangel på oversettelse er mangel på variasjon i genetisk bakgrunn og mutasjoner hos mus, ufullstendig visning av sykdomsfenotyper og variasjon i legemiddelfølsomhet eller dosering hos menneskelige pasienter som ikke er avbildet godt i innavlede musestammer. Videre, for mange sjeldne nevrologiske lidelser, er det ingen eller få dyremodeller tilgjengelig. Å studere sykdomsmekanismer direkte i relevante menneskelige celletyper kan legge til rette for forskning og forbedre oversettelsen til klinikken. For CNS-lidelser er primære menneskelige celler vanskelig å hente og representere en svært begrenset kilde da biopsier er invasive eller bare kan hentes etter mortem på slutten av sykdommen. I løpet av de siste 15 årene har utviklingen av cellulær omprogrammeringsteknologi raskt utvidet evnen til å modellere menneskelige nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer in vitro.
Tradisjonelle metoder for celleprogrammering innebærer omprogrammering av fibroblaster eller andre celletyper til induserte pluripotente stamceller (iPSCer) som er i stand til å differensiere til celletyper fra alle trebakterielagene 4. Takahashi og Yamanaka var de første som viste at re-uttrykk for fire stamcelletranskripsjonsfaktorer er tilstrekkelig til å omdirigere somatiske celler til å bli iPSCer5. iPSCer kan deretter differensieres ytterligere til bestemte celletyper. Ulempen med denne prosessen er imidlertid at det er arbeidskrevende og tidkrevende å generere og isolere stabile stamcellekloner. Somatiske mutasjoner eller spesifikke avvik i morscellen opprettholdes også i stamcelleklonen og kan påvirke resultatene av studien6. I tillegg tyder økende bevis på at omprogrammeringsprosessen til stamceller sletter verdifulle epigenetiske endringer som kan påvirke cellulære sykdomsmekanismer4,7,8. I de senere år fokuserte forskere på modifiserte omprogrammeringsmetoder som tillater en mer direkte generasjon av forskjellige celletyper mens de omgår den pluripotente stamcelletilstanden9,10,11,12 (gjennomgått i 13,14). Innledende gjennombrudd avslørte in vitro kombinatorisk reprogrammering av fibroblaster til kardiomyocytter15, nevroner16 og hepatocytter17 ved ektopisk uttrykk for flere avstamningsspesifikke transkripsjonsfaktorer eller microRNAer18. Dette ble etterfulgt av studier som direkte omprogrammerte celler for å modellere nevrologiske lidelser19,20. Som nevnt ovenfor har slike direkte omprogrammerings- eller konverteringsprotokoller potensielle fordeler i forhold til klassiske iPSC-protokoller, inkludert hastighet og ablasjon av klonisk isolasjonstrinn. Videre tyder bevis på at disse protokollene tillater å opprettholde en større mengde epigenetisk informasjon relatert til pasientens alder og sannsynligvis det samme gjelder for sykdomsrelevante markører7,8.
Til dags dato har de fleste in vitro-forskning på nevrologiske lidelser primært vært fokusert på nevroner. Det er imidlertid velkjent at andre celletyper som astrocytter, mikroglia og oligodendrocytter spiller en kritisk rolle i sykdomspatologi og progresjon av nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS), multippel sklerose (MS) og andre nevrologiske patologier som Rett syndrom (RTT), søvnforstyrrelser, avhengighet, epilepsi, lysosomale lagringsforstyrrelser, depresjon, migrene og patologisk smerte21,22,23,24,25,26. Astrocytter er den mest tallrike celletypen i sentralnervesystemet (CNS) og inntil nylig har de blitt bredt neglisjert fra et patologisk synspunkt7. De er nå kjent for å ha en kritisk rolle i å støtte nesten alle homeostatiske funksjoner i det sunne CNS. I tillegg er det tydelig at de har en viktig patologisk innvirkning og er svært verdifulle i å forstå sykdomsmekanisme og evaluere terapeutiske strategier19.
I den nåværende beskrivelsen beskriver vi en protokoll for direkte konvertering av menneskelige pasientfibroblaster til induserte Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) ved hjelp av retrovirale vektorer som uttrykker Yamanaka-omprogrammeringsfaktorene (Klf4, Oct3/4, Sox2 og c-Myc) og påfølgende eksponering for nevraliserende medier. Tidligere studier har brukt forskjellige kombinasjoner av transkripsjonelle faktorer for direkte omprogrammering til nevrale celler (gjennomgått i 14), men faktorene som brukes i den beskrevne protokollen er bredt tilgjengelige enten som plasmider for i husproduksjon av virale vektorer, eller som kommersielt tilgjengelige klare til å gå virale omprogrammeringssett. De resulterende iNPCene kan differensieres ytterligere til induserte nevroner (iNs)27, oligodendrocytter (iOs)24 og astrocytter (iAS)19 for å studere sin rolle i nevrologiske sykdommer. Vår protokoll innebærer ikke tidkrevende generering av iPSCer som de fleste tilgjengelige protokoller bruker for avledning av menneskelige astrocytter28. Omtrent 98% til 100% av direkte omprogrammerte iNPCer kan skille seg ut i GFAP-positive astrocytter29 sammenlignet med bare 2% ved hjelp av direkte konverteringsmetode fra fibroblaster til astrocytter30. Nylig har en komparativ transkripsjonsstudie ved hjelp av vår beskrevne omprogrammeringsmetode vist at iNPCer omprogrammert fra donorfibroblaster kan beholde aldringsfunksjoner på transkripsjonelt og funksjonelt nivå som ligner alderstilpassede postmortem astrocytter og primære astrocytter29. Dermed er denne konverteringsprotokollen et kraftig verktøy for å undersøke sykdomsmekanismer og evaluere nye terapeutiske tilnærminger for aldersrelaterte nevrodegenerative og nevrologiske lidelser.
Her beskriver vi protokollen som brukes til å generere iNPCer og ytterligere differensiering i iAer, som er de mest egnede for små molekylære screeninganalyser i større skala. Sykdomsmekanismer og legemiddeltesting med iAer kan gjøres ved hjelp av forskjellige metoder som samkulturer med nevroner eller metabolsk og biokjemisk analyse. Fordelen med dette systemet er hastigheten og enkelheten ved vedlikehold av disse cellelinjene sammenlignet med iPSCer. Videre kan iNPCer fryses i små porsjoner for iAs differensiering som letter narkotikatesting under konstante forhold over lengre perioder. Samlet sett blir sammenligning av større utvalgstall mulig på denne måten som åpner døren for å evaluere terapeutisk potensial for forbindelser i en større og mer representativ pasientpopulasjon.
Protocol
| media | Reagent | Beløp som skal blandes | Endelig konsentrasjon (%) |
| Fibroblast-medier | DMEM, høy glukose, GlutaMAX | 500 ml | 89 |
| Fetal Bovine Serum | 50 ml | 10 | |
| Antibiotika-antimykotisk | 5 ml | 1 | |
| Basismedier | DMEM/F12 + Glutamax | 500 ml | 97 |
| N-2 | 5 ml | 1 | |
| B-27 | 5 ml | 1 | |
| Antibiotika-antimykotisk | 5 ml | 1 | |
| Konverteringsmedier | Basismedier | 50 ml | 99.9 |
| FGF | 1 μL | 0,02 (20 ng/ml) | |
| EGF | 1 μL | 0,02 (20 ng/ml) | |
| Heparin | 50 μL | 0,1 (5 μg/ml) | |
| Nevrale stamcellemedier (NPC) | DMEM/F12 + Glutamax | 500 ml | 96.9 |
| N-2 | 5 ml | 1 | |
| B-27 | 5 ml | 1 | |
| Antibiotika-antimykotisk | 5 ml | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| Astrocyttmedier | DMEM, høy glukose, GlutaMAX | 500 ml | 89 |
| Fetal Bovine Serum | 50 ml | 10 | |
| Antibiotika-antimykotisk | 5 ml | 1 | |
| N-2 | 1 ml | 0.2 | |
| Mediet må filtreres etter blanding av alle komponenter. Konverteringsmedier (med faktorer) må tilberedes fersk hver uke. | |||
Tabell 1. Medieoppskrifter for alle celletyper som er inkludert i protokollen. Media bør filtreres etter blanding av alle komponenter med enten et sterilt vakuumfiltreringssystem for store volumer eller sprøyte- og 0,2 um sprøytefiltre. Konverteringsmedier (med faktorer) må tilberedes fersk hver uke.
1. Direkte konvertering av voksne menneskelige fibroblaster til nevronale stamceller
MERK: En skjematisk tidslinje for denne protokollen kan gjennomgås i Meyer (2014)19.
- Bruk primære menneskelige hudfibroblaster som kan fås fra cellebanker eller hudbiopsier31. Kulturceller ved 37 °C i en 5 % CO 2-vevskulturinkubator. Passasjeceller i minst 1-2 passasjer etter opptining før bruk i eksperimentet. Når cellene er klare, belegge en brønn på en 6-brønns plate med menneskelig fibronektin (1:200 fortynnet i PBS) ved romtemperatur i 15-20 min.
- Når cellene er klare til å bli belagt, fjern fibronectin fra parabolen og tilsett umiddelbart celleoppløsning eller 2 ml fibroblastmedier (tabell 1) - ikke la parabolen tørke ut før du legger til medier. Avhengig av hvor raskt cellene vokser, plate 150.000 (raskt voksende) - 200.000 (langsomt voksende) fibroblaster i to brønner av en menneskelig fibronectin belagt 6-brønns plate hver.
MERK: Cellene skal være rundt 70% sammenfallende for viral transduksjon for å kunne holde dem i samme plate i flere dager etter transduksjon. Det kan være gunstig å frø på to forskjellige tettheter for å ha et valg neste dag for konvertering. - Dagen etter sådd, kontroller fibroblaster under mikroskopet og kontroller celletettheten (mellom 70-85%) og til og med sådd gjennom brønnen for optimale resultater.
- Transduser en brønn med alle fire retrovirale vektorer (Oct3/4, Klf4, Sox2 og c-Myc) - bruk et mangfold av infeksjon (MOI) på 10 for rask vekst eller 15 for langsomt voksende fibroblaster (transduksjonseffektivitet bør overstige 70% eller mer positive celler for hver vektor). Tilsett vanlig fibroblast medium til viral blanding til et totalt volum på 1 ml per brønn og inkuber over natten ved 37 °C i en 5 % CO 2-vevskulturinkubator. La den andre brønnen være ubehandlet og returner celler til vevskulturinkubator.
MERK: Retrovirale vektorer kan kjøpes av en leverandør eller gjøres internt, protokoller er tilgjengelige online32. - Dagen etter transduksjon, vask cellene 1x med PBS og tilsett 1 ml fersk fibroblastmedium.
- Neste dag endrer du middels til konverteringsmedium. Vask cellene 1x med PBS for å kvitte seg med gjenværende fibroblastmedium, og tilsett deretter 1 ml konverteringsmedium. Endre også mediet til det ubehandlede til konverteringsmediet.
MERK: Noen morfologiske endringer kan observeres selv ved å endre media på fibroblaster som ikke fikk retroviral vektorbehandling, og dermed ha en ubehandlet brønn (valgfritt) vil være nyttig når du bestemmer effekten av virale vektorer. Celler bør begynne å endre morfologi 2-4 dager etter bytte til konverteringsmedier. - Observer celler under mikroskopet og se etter endringer i morfologi (Figur 1). Cellemedier bør erstattes daglig gjennom hele konverteringsprosessen (1-2 ml konverteringsmedier, tabell 1) og for etterfølgende iNPC-kultur. Bytt medium ved å forsiktig fjerne 70% av mediet fra brønnen samtidig som du sørger for at cellene forblir dekket i de resterende 30% av mediene.
MERK: Medier med vekstfaktorer i den må konsumeres innen 1 uke etter forberedelse.- Fortsett å observere celler og endre media daglig (1-2 ml konverteringsmedier).
- Noen cellelinjer begynner å danne løse, forhøyede runde formasjoner som vokser i ball som strukturer eller løse nevronkuler (Supplerende figur 1 og 19,33). Pass på at du ikke løsner disse cellene. Hvis ballene løsner, kan de samles og re-belagt i en ny fibronectin belagt brønn av en 6-brønns plate.
MERK: Hvis de utvides på egen hånd, vil cellene ha redusert mangfold sammenlignet med startplaten og kan representere en tydelig annen cellelinje. Vi anbefaler at du kombinerer disse cellene med resten av de konverterte cellene ved neste runde med deling.
- Etter ca 5-6 dager i konverteringsmedier (opptil 12 dager for vanskelige cellelinjer) eller når cellene blir svært tette, passerer du dem 1:2 eller maksimum 1:3.
MERK: Det er veldig viktig å holde cellene i høy tetthet gjennom hele konverteringsprosessen.
2. Konvertering og iNPC splitting prosedyre
- Varm opp celleavløsningsløsningen (f.eks. accutase) og belegge et passende antall brønner i en 6-brønn med fibronektin (1:200 i PBS, 1 ml beleggvolum) i 15-20 min ved romtemperatur. Fibronectinbelegg kan være lengre uten negativ innvirkning, men det bør tas hensyn til ikke å forkorte beleggtiden.
- Vask cellene forsiktig med PBS uten å løsne noen celler (bruk veggen av brønnen til å påføre PBS forsiktig på cellene). Fjern FORSIKTIG PBS med pipetter eller ved aspirasjon.
- Tilsett 0,5 ml celleavløsningsløsning og inkuber 2-3 min ved 37 °C i en vevskulturinkubator. Kontroller under mikroskopet for å kontrollere at de fleste celler er koblet fra. Hvis alle cellene har løsnet, tilsett 2 ml ferske konverteringsmedier og pipette forsiktig opp og ned 2-3 ganger for å fjerne klumper (om nødvendig).
- Samle cellene i et 15 ml rør og tilsett ytterligere 3 ml medier for å fortynne celleavløsningsløsningen ytterligere. Vask brønnen med de ekstra mediene først for å sikre at alle cellene er samlet inn.
- Sentrifuge i 4 min ved 200 x g ved romtemperatur.
MERK: Konvertering av celler eller iNPCer er ekstremt følsomme for tilstedeværelsen av celleavløsningsløsning i mediet. Det er absolutt nødvendig å fjerne restenzymet ved sentrifugering og tilbaketrekking av supernatant. - Fjern supernatant fra cellepellet og resuspend cellene i 1 ml friskt medium. Rør forsiktig opp og ned 2-3 ganger for å løse celleklumper. Fjern fibronektin fra belagte 6-brønner og tilsett 1 ml ferske medier til hver brønn umiddelbart (ikke la fibronectin tørke). For et delt forhold på 1: 2, legg til 0,5 ml celleoppheng i en brønn og den andre 0,5 ml i en annen brønn.
- Kulturceller ved 37 °C i en vevskulturinkubator.
- Fordel cellene ved forsiktig å riste 6-brønnen i nord-sør-øst-vest retning (ikke sirkulær) og sett inn vevskulturinkubator.
- Vær oppmerksom på cellene under mikroskopet neste dag og bytt medium (1-2 ml). Endre medier hver dag til cellene er klare til å deles på nytt.
MERK: På dette tidspunktet bør celleproliferasjonen begynne å akselerere, og cellene skal være klare for en ny splitt innen 2-3 dager (4 dager for svært langsomme voksende linjer).- Ved denne nye splitten frø en brønn av celler i konverteringsmedier og den andre brønnen i NPC-medier som bare inneholder FGF ved økt konsentrasjon uten EGF / heparin (Tabell 1).
MERK: Noen cellelinjer når en stillestående tilstand i konverteringsmedier etter omtrent 10 dager, og bytte til NPC-medier kan hjelpe med cellevekst. I tillegg har NPCer en mer spesifikk, mindre form når de vokser i NPC media19. På dette tidspunktet er iNPCene klare for differensiering og videre bruk.
- Ved denne nye splitten frø en brønn av celler i konverteringsmedier og den andre brønnen i NPC-medier som bare inneholder FGF ved økt konsentrasjon uten EGF / heparin (Tabell 1).
- Fortsett å endre medier (1-2 ml) av iNPCene daglig.
- Utvid NPC-er til 10 cm retter ved å kombinere to eller tre konfluente brønner i en 6-brønn. Medievolumet for 10 cm retter er vanligvis 12-15 ml.
- Ved neste splitt utvider du disse cellene ytterligere til tre eller fire 10 cm retter (12-15 ml medier) for generasjoner av et stort antall cellelagre. 10 cm retter deles vanligvis på 1:3 eller 1:4 hver 3-4 dager, avhengig av spredningshastighet.
3. Generere induserte astrocytter fra NPCer
- For å lage astrocytter fra ferske iNPCer, frø iNPCs (i 10 cm fibronectin belagte plater) direkte i 10 ml astrocytt medium (Tabell 1) slik at de er rundt 10% samløp neste dag. Kulturceller ved 37 °C i en 5 % CO 2-vevskulturinkubator.
MERK: Den anbefalte såddtettheten er vanligvis 50 μL av celleresuspensering av en 10 cm tallerken med NPCer, forutsatt at de fortynnes til et endelig volum basert på deres delingsforhold (f.eks. 3 ml for en 1:3 splitt, 4 ml for en 1:4 splitt, etc.). - Bytt medium (10 ml astrocyttmedie) av iAene tre dager etter plating. Hold cellene differensierer i 5-7 dager.
MERK: iA tolererer ikke flere passeringer godt, derfor er det bedre å lage friske astrocytter hver gang du deler NPC-ene. - For å frø for eksperimentering, del astrocyttene ved hjelp av trypsin eller celleavløsningsløsning som beskrevet i trinn 2.1-2.7. Anbefalte såingstettheter er inkludert i tabell 2.
| Plate Type | Astrocytter per brønn |
| 384-brønn | 2500 |
| 96-brønns | 10000 |
| 24-brønns | 40000 |
| 6-brønns | 150000 |
Tabell 2. Anbefalt såingstetthet for iA per plateområde. Typisk antall iAs frø for å generere en monolayer på de vanligste vev kultur plater.
4. Klargjøring og avriming av deler for astrocyttdifferensiering fra frosne NPC-aksjer (alternativ til trinn 3)
MERK: Som et alternativ til å opprettholde iNPCer i kulturen, kan astrocytter også produseres direkte fra et frossent lager. For å gjøre dette fryses iNPCene i mindre porsjoner. Tabell 3 viser foreslåtte fryse- og opptiningsvolumer for porsjoner som skal tines i en 10 cm tallerken som inneholder 10 ml Astrocyte-medier.
| Størrelse på del | Celle suspensjon (μL) | Frysemedier (μL) | Totalt volum (μL) | Tines inn i |
| 4x | 400 | 400 | 800 | To 10 cm retter |
| 2x | 200 | 200 | 400 | En 10 cm tallerken |
Tabell 3. Instruksjoner om hvordan du deler iNPC for å generere iAer. Andel iNPC-fjærings- og frysemedier for å generere deler. Vær oppmerksom på at den endelige DMSO-konsentrasjonen er 10% når cellefjæring blandes med frysemedier.
- For å lage astrocytter fra frosne iNPC-lagre, fjern porsjonslagerhetteglass fra flytende nitrogenlagringstank og tin raskt ved 37 °C. Så snart cellene er tinet, pipettecelleløsning i et 15 ml rør som inneholder 5 ml astrocyttmedier.
- Sentrifuge i 4 min ved 200 x g og romtemperatur. Fjern supernatanten og resuspend i 1 ml friskt astrocyttmedium.
- Tilsett 9 ml fersk astrocyttmedium til en fibronektinbelagt 10 cm tallerken og tilsett 1 ml celleoppløsning. Fordel celler forsiktig i nord-sørøst-vest bevegelse. Kulturceller ved 37 °C i en 5 % CO 2-vevskulturinkubator.
Representative Results
Denne protokollen tillater rask og enkel generering av iNPCer direkte fra humane hudfibroblaster ved hjelp av retrovirus som inneholder Yamanaka-faktorene. Denne metoden gjør det mulig å omgå stamcelletilstanden og behovet for klonal seleksjon, og dermed unngå klonvariasjon. Viktige trinn å huske på mens cellene gjennomgår konverteringsprosessen er fibroblast såddtetthet, media pH og holde cellene på en optimal samløp. Du finner eksempler på optimale endringer i delingssamleferd og morfologi under konverteringsprosessen i figur 1.
Figur 1. Representative bilder av konverteringsprosessen etter å ha lagt til den retrovirale blandingen av Yamanaka-faktorer. Fibroblaster ble sådd og transdusert tjuefire timer senere med Yamanaka-faktorer. To dager etter virus (DPV), ble medier endret til konverteringsmedier. Celler ble dyrket i konverteringsmedier til de var klare til å passere (13 DPV). Celler ble sådd etter passasje for å nå 80% samløp neste dag (14 DPV). Etterfølgende passasjer opprettholdt denne tettheten til nevronale stamceller begynner å dele seg raskt. Skalalinjen er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når konverteringsprosessen er fullført, vil NPCene vise sterkt redusert uttrykk eller ingen uttrykk for fibroblastermarkører og morfologi, og uttrykke NPC-spesifikke cellemarkører (figur 2). Videre kan de også brukes til å generere forskjellige cellelinjer, som iNs, iOs og iAs.
Figur 2. Celler som gjennomgår konverteringsprosessen, uttrykker cellespesifikke markører. Pasientfibroblaster (A), induserte nevronale stamceller (iNPCer (B) og induserte Astrocytter (iAs (C) celler ble sådd på glassdeksler i en 24 brønnvevskulturbehandlet plate. Celler ble immunostert for: fibroblastspesifikke cellemarkører (A), Vimentin (grønn) og TE7 (rød), iNPC-spesifikk cellemarkør (B), Nestin (rød) og iAs cellemarkør (C) GFAP (lilla) og iNPC-markør Nestin (grønn). Skalalinjen er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter vår erfaring er spesielt iAer svært verdifulle for testing av narkotika- og sykdomsmekanismer, da de kan genereres i rene populasjoner (98% eller mer GFAP positive celler29) ved reproduserbare store tall. iAer kan skilles fra iNPCer ved å ta en liten aliquot av celler under splitting eller en tidligere frossen iNPC-del og direkte plating i astrocyttmedier. Viktige hensyn i denne prosessen er å opprettholde iNPCs første såddtetthet lav (Figur 3 og Figur 4), da en høy tetthet har vist seg å hindre differensieringsprosessen (figur 4) og være ekstra oppmerksom på medie pH, da forsuring kan aktivere selv sunne astrocytter.
Figur 3. Representative bilder av iAs generasjonsprosess fra iNPCer. iNPCer er sådd i Astrocyte media (tabell 1) ved lav såing tetthet. En god såddtetthet er ca 10% på den første dagen etter sådd (DPS) (venstre); Denne tettheten kan imidlertid justeres i henhold til vekstraten til celler. Typisk iAs morfologi kan observeres etter 5 DPS (midten). I noen tilfeller kan avvikende astrocyttmorfologi observeres, med lange, spiky utvidelser. Denne endringen indikerer astrocyttaktivering og kan være sekundært til sykdomstilstand eller feil dyrkingsteknikker (høyre). Skalalinjen er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. iNPC-såddtetthet påvirker iAs differensieringseffektivitet. Kontroll iNPC-linjer ble sådd ved lav (A) og høy (B) tetthet i Astrocyte media for å demonstrere effekter av såddtetthet på differensiering. 5 DPS, den lave tetthetslinjen uttrykte astrocyttspesifikke markører, mens linjen med høy tetthet viser en blanding av iNPC- og iAs-markører med en merket iNPC-lignende morfologi. Skalalinjen er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1. Ytterligere tall for konverteringsprosessen etter å ha lagt til den retrovirale blandingen av Yamanaka-faktorer. Bilder av konverteringsprosessen ved 12 DPV (1 dag før passering) og 19 DPV (6 dager etter passering). Legg merke til forskjellen på morfologi mellom celler før og etter passasje, ved 12 DPV-celler har en balllignende strukturmorfologi. Etter en passasje og flere dager på konverteringsmedier (tabell 1) begynner celler å vise en NPC-lignende morfologi. Skalalinjen er 200 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Oppsummert er den direkte konverteringen en rask og enkel metode for å generere induserte nevronale stamceller fra pasienthudfibroblaster. Denne metoden er fordelaktig på grunn av hastigheten så vel som det store antallet celler som genereres som er enkle å vedlikeholde. Videre tyder økende bevis på at direkte omprogrammeringsmetoder fjerner mindre epigenetiske merker sammenlignet med klassisk iPSC-omprogrammeringsteknologi, og dermed etterlater sykdomsmiljøet mer intakt4,7,8. Differensiering av iNPCer til astrocytter er veldig rett frem og svært reproduserbar selv mellom flere uavhengige laboratorier19,29,33. iNPCer kan fryses i små porsjoner og tines direkte for differensieringsformål, noe som bidrar til å redusere variasjon mellom eksperimenter siden passasjenumre kan holdes like. Astrocytter spiller en avgjørende rolle i sykdomsprogresjon i mange nevrologiske sykdommer og er derfor en interessant celletype å jobbe med. Astrocyttene kan brukes til mekanistiske studier, metabolske studier eller legemiddeltestingsanalyser og dyrkes vanligvis som monolayers. Videre kan astrocytter kombineres i samkultursystemer med mus eller menneskelige nevroner for å vurdere virkningen av astrocytter på nevronal overlevelse og morfologi, som begge er gode avlesninger for legemiddeltesting34.
For å kunne bruke denne protokollen, må noen få punkter og potensielle begrensninger huskes. De menneskelige hudfibroblaster for eksempel varierer sterkt i celledelingshastigheten samt responsen på virale vektorer. Siden disse ikke er standardiserte cellelinjer, er de like variable som menneskeheten selv, hver linje er forskjellig. Når det gjelder mange omprogrammeringsmetoder, er det lettere å omprogrammere fibroblaster som har en moderat til rask celledelingshastighet kontra celler som knapt replikerer. Replikeringshastigheten kan påvirkes av hudens biopsikvalitet og selve behandlingen, ved passeringsnummeret til fibroblaster samt håndtering. Når du arbeider med primære hudfibroblaster, er det viktig å ikke la cellene bli for tette for å unngå induksjon av senescence. Hvis fibroblaster ikke vokser godt, er det best å prøve en ny bestand eller en lavere passasje, men i noen tilfeller kan sykdommen selv også spille en rolle. Celledeling kan noen ganger forbedres ved å bruke 15% eller 20% FBS i fibroblastmediet sammenlignet med standard 10%.
Kvaliteten på omprogrammering av virale vektorer er av høy betydning for suksess. I våre hender var retrovirale vektorer mer effektive sammenlignet med lentivirale vektorer eller andre ikke-integrerte virus; Dette kan imidlertid være avhengig av viral vektorkvalitet og renhet. Kommersielle retrovirale vektorsett spesifiserer vanligvis viral vektorkonsentrasjon og ofte også et mangfold av infeksjon for en bestemt cellelinje. Det er viktig å huske på at primære fibroblaster er forskjellig fra cellelinjen som brukes av selskapene til å bestemme viral vektoropptak. Videre, selv når du bestiller det samme kommersielle settet, er variasjon mellom partier vanlig. Videre varierer opptaket av virale vektorer også mellom fibroblastcellelinjer. Noen linjer kan være mer følsomme og derfor kan transinduserte celler dø, mens andre cellelinjer kan være mer motstandsdyktige mot viralt opptak. Dermed kan det være viktig å bestemme transduksjonseffektivitet for en gitt cellelinje, spesielt hvis cellelinjen vokser sakte eller tidligere konverteringsforsøk mislyktes. I våre hender er den beste måten å evaluere hvor mye av en bestemt retroviral vektor som trengs for konvertering, å utføre en immunfluorescerende farging med flere fortynninger av virusvektoren. Antall celler som uttrykker transgene for hver vektor kan deretter telles, med sikte på en transduksjonseffektivitet på 70% eller høyere. Etter vår erfaring kan lignende MOIer brukes til de fleste cellelinjer, men MOI kan justeres om nødvendig.
Under konverteringsprosessen er det viktig å ikke dele cellene for tidlig. Tiden til cellene er klare til å deles, avhenger av flere faktorer, inkludert primærcellelinjen og dens egenskaper, kvaliteten på den virale vektoren som brukes og mediekvaliteten. Det er viktig at suksessraten for konverteringen er mye høyere når cellene holdes med høy tetthet. Selv om cellene begynner å endre morfologi, er det bedre å forlate cellene i den første brønnen lenger enn å dele dem for tidlig. Hvis delingen oppstår for tidlig, kan konverteringen stoppe i fremdriften og føre til at cellene skiller seg tilbake til fibroblastlignende form og oppførsel. Videre kan fortynning av dem for tidlig føre til mer langstrakte cellelegemer sammenlignet med de små og kompakte cellelegemene til NPCene som ble observert tidligere. Dermed bør de første splittelsene alltid være konservative; det er bedre å holde cellene for tette med en 1: 1 eller 1: 2 splitt sammenlignet med å fortynne dem for mye. Noe celledød forventes etter den første splitten. Vær oppmerksom på at cellene alltid ser verre ut (flatere) den første dagen etter splitting, noe som er normalt. Beste vurderinger på celleform bør gjøres 2-3 dager senere. Det er viktig at kvaliteten på vekstfaktorene og mediekomponentene også er avgjørende. Det er viktig å forberede små mengder medier som inneholder vekstfaktorer, slik at de fullt forberedte mediene bare vil bli brukt i maksimalt 5-7 dager. Ikke hold mediet ved romtemperatur eller 37 °C over lengre tid. Bruk raskt og kjøl så snart medieskiftet er utført. I tillegg kan det å holde medievolumet lavt på 1 ml i stedet for 2 ml hjelpe spesielt for cellelinjer som er mer motstandsdyktige mot konvertering. Hvis cellene bruker mediet raskt, noe som kan observeres ved en endring i mediefargeform rød til gul (forsuringshastighet), juster volumet av mediet til opptil 2 ml. Raskt medieforbruk er et positivt tegn og observeres ofte på senere stadier av konvertering sammen med økt spredning.
NPCer er også svært følsomme for tilstedeværelsen av accutase i media, og det er svært viktig å holde accutase inkubasjonstiden kort. Vi anbefaler en inkubasjonsperiode på 2-4 minutter, sjekk celler ofte under mikroskopet for å se når de har løsnet. Det er viktig å sentrifugere cellene etter splitting for å fjerne enzymblandingen fra mediet. Det er også viktig å huske på passasjenummeret, da cellelinjer kan endres ved utvidet dyrking som fører til endring av uttrykksprofiler. Dermed er det viktig å fryse mange cellelagre ved tidlige passasjer. Celler bør fryses i 10% DMSO og 90% NPC-medier og lagres på lang sikt i flytende nitrogen. På grunn av mangel på serum i dette mediet er det viktig å sikre en langsom frysing ved hjelp av frysekamre og når det er frosset over natten, overføres umiddelbart til flytende nitrogen. Selv om det ikke utføres klonisk seleksjon i denne protokollen, er det mulig at utvidet dyrking og passivisering fører til naturlig utvalg av en innledende cellepopulasjon med gunstig vekst og overlevelsesrate. Derfor er det viktig å huske på passasjenummer og håndtering når du utfører eksperimenter. Vi foretrekker å bruke lavere passasjer for eksperimenter, hvis mulig, overskrider vi ikke å passere cellelinjene i mer enn 20 ganger. Siden NPC-ene vokser raskt, kan et stort antall aksjer fryses ved lavere passasjer for eksperimenter. Cellelinjer med særlig høy vekstrate har høyere risiko for medieforsuring. Etter hvert som cellelinjer vokser med forskjellig hastighet, kan det derfor hende at mediemengden må justeres basert på spredning. Hvis cellene kontinuerlig blir igjen i svært sure medier, kan det påvirke helsen til både kontroll- og sykdomscellelinjer. Dette fører til at selv sunne astrocytter blir reaktive, noe som påvirker bruken i ytterligere differensiering og eksperimenter.
For astrocyttdifferensiering er det viktig å holde cellene i lav tetthet, da høy tetthet vil forhindre at cellene differensierer, og de vil fortsette å spre seg med høyere hastigheter. Dermed må såddtetthet justeres for hver cellelinje avhengig av spredningshastigheten. Vi anbefaler at du prøver forskjellige såddtettheter og utfører flekker / RT-PCR med astrocyttmarkører for å sikre riktig differensiering. IAs kvalitet kan vurderes sammen med sunne kontroller ved hjelp av samkulturanalyser med nevroner. Forutsatt sykdomspatologi fører ikke til en reaktiv fenotype, nevroner bør forbli levedyktige i kontakt med iAer i flere dager. Astrocyttmorfologi kan variere sterkt mellom individuelle cellelinjer og kan også påvirkes av sykdomsfenotypen. Videre, i sykdommer der astrocytter er sterkt påvirket, kan de vise en reaktiv fenotype med store, langstrakte forlengelser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle pasienter og friske frivillige for å donere kritiske prøver til forskningsstudier. Videre takker vi Rochelle Rodrigo for kontinuerlig ekspert teknisk assistanse i vevskultur og Laura Ferraiuolo for uavhengig bekreftelse av teknikken i laboratoriet hennes som samarbeidspartner. Dette arbeidet fikk støtte fra US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 og RC2 NS69476-01 (til A.L.S.) og Packard Center for ALS Research Grant P2ALS og Helping Link Foundation. K.M. mottok også støtte fra Swiss National Science Foundation samt Young Investigator Development Award fra Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust og Families of SCN2A foundations.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
References
- Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
- Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
- Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).
- Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
- Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
- Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
- Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
- Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
- Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
- Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
- Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
- Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
- Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
- Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
- Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M.
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
- Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
- Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
- Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
- Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
- Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
- Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11 (2001).
- Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
- Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).
