Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.
La investigación sobre los trastornos neurológicos se centra principalmente en el impacto de las neuronas en los mecanismos de la enfermedad. La disponibilidad limitada de modelos animales afecta gravemente el estudio de las contribuciones específicas del tipo celular a la enfermedad. Por otra parte, los modelos animales no reflejan generalmente variabilidad en mutaciones y cursos de la enfermedad considerados en pacientes humanos. Los métodos de reprogramación para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) han revolucionado la investigación específica del paciente y han creado herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, la tecnología iPSC tiene desventajas como el tiempo, el compromiso laboral, la selectividad clonal y la pérdida de marcadores epigenéticos. Las modificaciones recientes de estos métodos permiten una generación más directa de linajes celulares o tipos específicos de células, evitando el aislamiento clonal o un estado de células madre pluripotentes. Hemos desarrollado un método de conversión directa rápida para generar células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) de fibroblastos de la piel que utilizan vectores retrovirales en combinación con medios neuralizantes. Los iNPCs se pueden diferenciar en neuronas (iNs) oligodendrocitos (iOs) y astrocitos (iAs). La producción de iAs facilita las pruebas rápidas del mecanismo de la droga y de la enfermedad pues la diferenciación de iNPCs toma solamente 5 días. Además, los iAs son fáciles de trabajar y se generan en poblaciones puras en grandes cantidades. Desarrollamos un ensayo de co-cultivo altamente reproducible utilizando neuronas GFP + de ratón e iAs derivados del paciente para evaluar posibles estrategias terapéuticas para numerosos trastornos neurológicos y neurodegenerativos. Es importante destacar que los ensayos iA son escalables al formato de 384 pozos, lo que facilita la evaluación de múltiples moléculas pequeñas en una placa. Este acercamiento permite la evaluación terapéutica simultánea de variedades de células pacientes múltiples con el fondo genético diverso. La fácil producción y almacenamiento de iAs y la capacidad de examinar múltiples compuestos en un solo ensayo hacen que esta metodología sea adaptable para la medicina personalizada.
La comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad es crítica para las enfermedades neurológicas, ya que ayuda en el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas. Mientras que los modelos animales han sido históricamente el patrón oro para la investigación de enfermedades del sistema nervioso, la traducción directa de terapias potenciales en un entorno clínico a menudo muestra un éxito limitado1,2,3. Las razones de la falta de traducción son la falta de variabilidad de los antecedentes genéticos y las mutaciones en ratones, la visualización incompleta de fenotipos de enfermedades y la variación en la sensibilidad o la dosificación de fármacos en pacientes humanos que no se muestran bien en cepas de ratón consanguíneo. Además, para muchos desordenes neurológicos raros, ningunos o pocos modelos animales están disponibles. El estudio de los mecanismos de la enfermedad directamente en los tipos de células humanas relevantes podría facilitar la investigación y mejorar la traducción a la clínica. Para los trastornos del SNC, las células humanas primarias son difíciles de recuperar y representan una fuente muy limitada, ya que las biopsias son invasivas o solo se pueden recuperar post mortem en la etapa final de la enfermedad. En los últimos 15 años, el desarrollo de la tecnología de reprogramación celular ha ampliado rápidamente la capacidad de modelar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas humanas in vitro.
Los métodos tradicionales de reprogramación celular implican la reprogramación de fibroblastos u otros tipos de células en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales4. Takahashi y Yamanaka fueron los primeros en demostrar que la reexpresión de cuatro factores de transcripción de células madre es suficiente para redirigir las células somáticas para convertirse en iPSCs5. Los iPSC se pueden entonces diferenciar más lejos en tipos específicos de la célula. Sin embargo, el inconveniente de este proceso es que requiere mucho trabajo y mucho tiempo generar y aislar clones estables de células madre. Las mutaciones somáticas o aberraciones específicas de la célula madre también se mantienen en el clon de células madre y pueden afectar los resultados del estudio6. Además, cada vez hay más evidencia que sugiere que el proceso de reprogramación a células madre borra valiosos cambios epigenéticos que podrían influir en los mecanismos de la enfermedad celular4,7,8. En los últimos años, los investigadores se centraron en métodos de reprogramación modificados que permiten una generación más directa de diferentes tipos de células mientras se pasa por alto el estado de las células madre pluripotentes9,10,11, 12 (revisado en 13,14). Los avances iniciales revelaron la reprogramación combinatoria in vitro de fibroblastos a cardiomiocitos15,neuronas16 y hepatocitos17 por expresión ectópica de múltiples factores de transcripción específicos del linaje o microRNAs18. Esto fue seguido por estudios que reprogramaron directamente las células para modelar trastornos neurológicos19,20. Como se mencionó anteriormente, tales protocolos de reprogramación o conversión directa tienen ventajas potenciales sobre los protocolos iPSC clásicos, incluida la velocidad y la ablación del paso de aislamiento clonal. Por otra parte, la evidencia sugiere que estos protocolos permiten mantener una mayor cantidad de información epigenética relacionada con la edad del paciente y probablemente lo mismo ocurre con los marcadores relevantes de la enfermedad7,8.
Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones in vitro sobre trastornos neurológicos se han centrado principalmente en las neuronas. Sin embargo, es bien sabido que otros tipos de células como los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos juegan un papel crítico en la patología de la enfermedad y la progresión de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), la esclerosis múltiple (EM) y otras patologías neurológicas como el síndrome de Rett (RTT), trastornos del sueño, adicción, epilepsia, trastornos de almacenamiento lisosomal, depresión, migraña y dolor patológico21,22,23,24,25,26. Los astrocitos son el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) y hasta hace poco, han sido ampliamente descuidados desde un punto de vista patológico7. Ahora se saben para tener un papel crítico en la apoyación de casi todas las funciones homeostáticas del CNS sano. Adicionalmente, es evidente que tienen un impacto patológico importante y son muy valiosos para comprender el mecanismo de la enfermedad y evaluar las estrategias terapéuticas19.
En la descripción actual, detallamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos pacientes humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) utilizando vectores retrovirales que expresan los factores de reprogramación de Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc) y la posterior exposición a medios neuralizantes. Estudios anteriores han utilizado diferentes combinaciones de factores transcripcionales para la reprogramación directa a las células neuronales (revisado en 14), pero los factores utilizados en el protocolo descrito están ampliamente disponibles, ya sea como plásmidos para la producción interna de vectores virales, o como disponibles comercialmente listos para ir kits de reprogramación viral. Los iNPCs resultantes se pueden diferenciar aún más en neuronas inducidas (iNs)27,oligodendrocitos (iOs)24 y astrocitos (iAS)19 para estudiar su papel en enfermedades neurológicas. Nuestro protocolo no implica la generación lenta de iPSCs que la mayoría de los protocolos disponibles utilizan para la derivación de astrocitos humanos28. Aproximadamente del 98% al 100% de los iNPCs reprogramados directamente pueden diferenciarse en astrocitos positivos para GFAP29 en comparación con solo el 2% utilizando el método de conversión directa de fibroblastos a astrocitos30. Recientemente, un estudio transcriptómico comparativo utilizando nuestro método de reprogramación descrito ha demostrado que los iNPCs reprogramados a partir de fibroblastos donantes pueden retener características de envejecimiento a nivel transcripcional y funcional similares a los astrocitos post mortem de edad comparable y los astrocitos primarios29. Así, este protocolo de la conversión es una herramienta potente para investigar mecanismos de la enfermedad y para evaluar los acercamientos terapéuticos nuevos para los desordenes neurodegenerative y neurológicos relativos a la edad.
Aquí describimos el protocolo utilizado para generar iNPCs y una mayor diferenciación en iAs, que son los más adecuados para ensayos de cribado molecular pequeños a mayor escala. Los mecanismos de la enfermedad y las pruebas de fármacos con iAs se pueden realizar utilizando diferentes metodologías como los co-cultivos con neuronas o el análisis metabólico y bioquímico. La ventaja de este sistema es la velocidad y facilidad de mantenimiento de estas líneas celulares en comparación con las iPSC. Además, los iNPCs se pueden congelar en pequeñas porciones para la diferenciación de iAs, lo que facilita las pruebas de drogas en condiciones constantes durante períodos prolongados de tiempo. En general, la comparación de números de muestra más grandes se hace posible de esta manera, lo que abre la puerta para evaluar el potencial terapéutico de los compuestos en una población de pacientes más grande y representativa.
En resumen, la conversión directa es un método rápido y fácil para generar células progenitoras neuronales inducidas a partir de fibroblastos cutáneos de pacientes. Este método es ventajoso debido a su velocidad, así como la gran cantidad de celdas generadas que son fáciles de mantener. Además, la creciente evidencia sugiere que los métodos de reprogramación directa eliminan menos marcas epigenéticas en comparación con la tecnología clásica de reprogramación iPSC, por lo que el entorno de la enfermedad está más intacto4,7,8. La diferenciación de iNPCs a astrocitos es muy sencilla y altamente reproducible incluso entre múltiples laboratorios independientes19,29,33. Los iNPCs pueden congelarse en pequeñas porciones y descongelarse directamente para fines de diferenciación, lo que ayuda a reducir la variación entre los experimentos, ya que los números de paso se pueden mantener similares. Los astrocitos juegan un papel crucial en la progresión de la enfermedad en muchas enfermedades neurológicas y, por lo tanto, son un tipo de célula interesante para trabajar. Los astrocitos se pueden utilizar para estudios mecanicistas, estudios metabólicos o ensayos de pruebas de drogas y generalmente se cultivan como monocapas. Además, los astrocitos se pueden combinar en sistemas de co-cultivo con neuronas de ratón o humanas para evaluar el impacto de los astrocitos en la supervivencia neuronal y la morfología, los cuales son buenas lecturas para las pruebas de drogas34.
Para utilizar con éxito este protocolo, algunos puntos y limitaciones potenciales necesitan ser mantenidos en mente. Los fibroblastos de la piel humana, por ejemplo, varían mucho en su tasa de división celular, así como en la respuesta a los vectores virales. Dado que estas no son líneas celulares estandarizadas, son tan variables como la propia humanidad, cada línea es diferente. En cuanto a muchos métodos de reprogramación, es más fácil reprogramar fibroblastos que tienen una tasa de división celular moderada a rápida en comparación con las células que apenas se replican. La tasa de replicación puede verse afectada por la calidad de la biopsia de piel y el procesamiento en sí, por el número de paso de los fibroblastos, así como la manipulación. Cuando se trabaja con fibroblastos primarios de la piel, es importante no dejar que las células se vuelven demasiado densas para evitar la inducción de la senescencia. Si los fibroblastos no crecen bien, lo mejor es probar una nueva cepa o un pasaje más bajo, aunque en algunos casos, la enfermedad en sí también podría desempeñar un papel. La división celular a veces se puede mejorar mediante el uso de 15% o 20% FBS en los medios de fibroblastos en comparación con el 10% estándar.
La calidad de los vectores virales de reprogramación es de gran importancia para el éxito. En nuestras manos, los vectores retrovirales fueron más eficientes en comparación con los vectores lentivirales u otros virus no integradores; sin embargo, esto podría depender de la calidad y pureza del vector viral. Los kits retrovirales comerciales del vector especifican generalmente la concentración viral del vector y a menudo también una multiplicidad de infección para cierta variedades de células. Es importante tener en cuenta que los fibroblastos primarios difieren de la línea celular utilizada por las empresas para determinar la absorción de vectores virales. Además, incluso cuando se pide el mismo kit comercial, la variación entre lotes es común. Por otra parte, la absorción de vectores virales también varía entre las variedades de células del fibroblasto. Algunas líneas podrían ser más sensibles y, por lo tanto, las células transducidas podrían morir, mientras que otras líneas celulares podrían ser más resistentes a la absorción viral. Por lo tanto, determinar la eficiencia de transducción para una línea celular dada puede ser importante, especialmente si la línea celular está creciendo lentamente o los intentos de conversión anteriores fallaron. En nuestras manos, la mejor manera de evaluar cuánto de un vector retroviral específico se necesita para la conversión es realizar una tinción inmunofluorescente con varias diluciones del vector viral. El número de células que expresan el transgén para cada vector puede entonces ser contado, con el objetivo de una eficiencia de transducción del 70% o superior. En nuestra experiencia, mois similares se pueden utilizar para la mayoría de las variedades de células sin embargo el MOI se puede ajustar si es necesario.
Durante el proceso de conversión, es fundamental no dividir las celdas demasiado pronto. El tiempo hasta que las células estén listas para ser divididas depende de múltiples factores, incluyendo la línea celular primaria y sus características, la calidad del vector viral utilizado y la calidad de los medios. Es importante destacar que la tasa de éxito de la conversión es mucho mayor cuando las células se mantienen en alta densidad. Incluso si las células comienzan a cambiar de morfología, es mejor dejar las células en el primer pozo más tiempo que dividirlas prematuramente. Si la división ocurre demasiado pronto, la conversión puede detenerse en su progreso y llevar a las células a diferenciarse de nuevo a la forma y el comportamiento similares a los fibroblastos. Además, diluirlos demasiado pronto puede resultar en cuerpos celulares más alargados en comparación con los cuerpos celulares pequeños y compactos de los NPCs observados previamente. Por lo tanto, las primeras divisiones siempre deben ser conservadoras; es mejor mantener las células demasiado densas con una división de 1:1 o 1:2 en comparación con diluirlas demasiado. Se espera cierta muerte celular después de la división inicial. Cabe destacar que las celdas siempre se ven peor (más planas) el primer día después de la división, lo cual es normal. Los mejores juicios sobre la forma de la célula deben hacerse 2-3 días más tarde. Es importante destacar que la calidad de los factores de crecimiento y los componentes de los medios también es crucial. Es importante preparar pequeñas cantidades de medios que contengan factores de crecimiento para que los medios completamente preparados solo se utilicen durante un máximo de 5-7 días. No mantenga los medios a temperatura ambiente o 37°C durante períodos prolongados de tiempo. Use rápidamente y refrigere tan pronto como se realice el cambio de medio. Además, mantener el volumen de medios bajo en 1 mL en lugar de 2 mL puede ayudar especialmente para las líneas celulares que son más resistentes a la conversión. Si las células consumen el medio rápidamente, que se puede observar por un cambio en la forma de color del medio de rojo a amarillo (tasa de acidificación), ajuste el volumen del medio hasta 2 mL. El rápido consumo de medios de comunicación es una señal positiva y a menudo se observa en etapas posteriores de la conversión junto con una mayor proliferación.
Los NPCs también son muy sensibles a la presencia de accutase en los medios de comunicación y es muy importante mantener el tiempo de incubación de accutase corto. Recomendamos un período de incubación de 2-4 minutos, revisar las células con frecuencia bajo el microscopio para ver cuándo se han desprendido. Es esencial centrifugar las células después de la división para eliminar la mezcla de enzimas del medio. También es importante tener en cuenta el número de pasaje, ya que las líneas celulares pueden cambiar al cultivarse durante un cultivo prolongado que conduce a la alteración de los perfiles de expresión. Por lo tanto, es importante congelar muchas poblaciones de células en los primeros pasajes. Las células deben congelarse en medios 10% DMSO y 90% NPC y almacenarse a largo plazo en nitrógeno líquido. Debido a la falta de suero en este medio, es fundamental garantizar una congelación lenta utilizando cámaras de congelación y una vez congelado durante la noche, transferir inmediatamente al nitrógeno líquido. Mientras que no se realiza ninguna selección clónica en este protocolo, es posible que el cultivo y el passaging extendidos llevan a la selección natural de una población inicial de la célula con tasa favorable del crecimiento y de la supervivencia. Por lo tanto, es importante tener en cuenta el número de pasaje y el manejo al realizar experimentos. Preferimos usar pasajes más bajos para experimentos, si es posible, no superamos el paso de las líneas celulares por más de 20 veces. Dado que los NPC crecen rápidamente, un gran número de poblaciones pueden congelarse en pasajes más bajos para experimentos. Las líneas celulares con tasas de crecimiento particularmente altas tienen un mayor riesgo de acidificación de los medios. Por lo tanto, a medida que las líneas celulares crecen con diferente velocidad, la cantidad de medios podría necesitar ser ajustada en función de la proliferación. Si las células se dejan continuamente en medios altamente acidificados, puede influir en la salud de las líneas celulares de control y enfermedad. Esto hace que incluso los astrocitos sanos se vuelvan reactivos, afectando su uso en una mayor diferenciación y experimentos.
Para la diferenciación de astrocitos, es importante mantener las células en baja densidad, ya que la alta densidad evitará que las células se diferenciven y seguirán proliferando a tasas más altas. Por lo tanto, la densidad de siembra debe ajustarse para cada línea celular dependiente de su tasa de proliferación. Recomendamos probar diferentes densidades de siembra y realizar tinciones/RT-PCR con marcadores de astrocitos para asegurar una diferenciación adecuada. La calidad de los IOS se puede evaluar junto con controles saludables mediante ensayos de co-cultivo con neuronas. Siempre que la patología de la enfermedad no conduzca a un fenotipo reactivo, las neuronas deben permanecer viables en contacto con iAs durante varios días. La morfología de los astrocitos puede variar mucho entre las líneas celulares individuales y también puede verse afectada por el fenotipo de la enfermedad. Además, en enfermedades donde los astrocitos se ven fuertemente afectados, podrían mostrar un fenotipo reactivo con extensiones grandes y alargadas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos los pacientes y voluntarios sanos por donar muestras críticas a estudios de investigación. Además, agradecemos a Rochelle Rodrigo por su continua asistencia técnica experta en cultivo de tejidos y a Laura Ferraiuolo por confirmar de forma independiente la técnica en su laboratorio como colaboradora. Este trabajo recibió fondos de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos Subvenciones R01 NS644912-4 y RC2 NS69476-01 (a A.L.S.) y packard Centro para la ALS Research Grant P2ALS y la Fundación Helping Link. K.M. también recibió fondos de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias, así como el Premio al Desarrollo de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Distrofia Muscular, the Rett Syndrome Research Trust y las familias de las fundaciones SCN2A.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |