Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen skisserer en rutinemessig metode for bruk av seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftig 3D-bildeteknikk. Vellykket påføring av SBF-SEM hengsler på riktig fiksering og vevsfargingsteknikker, samt nøye vurdering av bildebehandlingsinnstillinger. Denne protokollen inneholder praktiske hensyn for hele denne prosessen.

Abstract

Seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) gjør det mulig å samle hundrevis til tusenvis av serieregistrerte ultrastrukturelle bilder, og tilbyr en enestående tredimensjonal visning av vevsmikroanatomi. Mens SBF-SEM har sett en eksponentiell økning i bruk de siste årene, er tekniske aspekter som riktig vevsforberedelse og avbildningsparametere avgjørende for suksessen til denne bildemodaliteten. Dette bildesystemet drar nytte av enhetens automatiserte natur, slik at man kan forlate mikroskopet uten tilsyn under bildebehandlingsprosessen, med den automatiserte samlingen av hundrevis av bilder mulig på en enkelt dag. Men uten passende vev forberedelse cellulær ultrastruktur kan endres på en slik måte at feil eller villedende konklusjoner kan trekkes. I tillegg genereres bilder ved å skanne blokksiden av en harpiks-innebygd biologisk prøve, og dette gir ofte utfordringer og hensyn som må tas. Opphopning av elektroner i blokken under avbildning, kjent som "vevslading", kan føre til tap av kontrast og manglende evne til å sette pris på cellulær struktur. Videre, mens økende elektronstråleintensitet / spenning eller synkende stråleskanningshastighet kan øke bildeoppløsningen, kan dette også ha den uheldige bivirkningen av å skade harpiksblokken og forvrenge etterfølgende bilder i bildeserien. Her presenterer vi en rutinemessig protokoll for fremstilling av biologiske vevsprøver som bevarer cellulær ultrastruktur og reduserer vevslading. Vi tar også hensyn til bildebehandling for rask anskaffelse av seriebilder av høy kvalitet med minimal skade på vevsblokken.

Introduction

Seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) ble først beskrevet av Leighton i 1981 hvor han formet et skanningselektronmikroskop forsterket med en innebygd mikrotom som kunne kutte og bilde tynne deler av vev innebygd i harpiks. Dessverre begrenset tekniske begrensninger bruken til ledende prøver, da ikke-ledende prøver som biologisk vev akkumulerte uakseptable ladenivåer (elektronoppbygging i vevsprøven)1. Mens belegg blokk-ansikt mellom kutt med fordampet karbon redusert vev lading, dette sterkt økt bildebehandling oppkjøpstid og bildelagring forble et problem som datateknologi på den tiden var utilstrekkelig til å administrere de store filstørrelsene som er opprettet av enheten. Denne metodikken ble revidert av Denk og Horstmann i 2004 ved hjelp av en SBF-SEM utstyrt med et variabelt trykkkammer2. Dette tillot innføring av vanndamp til bildekammeret som reduserer lading i prøven, noe som gjør avbildning av ikke-ledende prøver levedyktig, om enn med tap av bildeoppløsning. Ytterligere forbedringer i vevsforberedelse og avbildningsmetoder tillater nå avbildning ved hjelp av høyt vakuum, og SBF-SEM-avbildning er ikke lenger avhengig av vanndamp for å spre lading3,4,5,6,7,8,9. Mens SBF-SEM har sett en eksponentiell økning i bruk de siste årene, er tekniske aspekter som riktig vevsforberedelse og avbildningsparametere avgjørende for suksessen til denne bildemodaliteten.

SBF-SEM tillater automatisert innsamling av tusenvis av serieregistrerte elektronmikroskopibilder, med planaroppløsning så liten som 3-5 nm10,11. Vev, impregnert med tungmetaller og innebygd i harpiks, er plassert i et skanningselektronmikroskop (SEM) som inneholder en ultramikrotomi utstyrt med en diamantkniv. En flat overflate er kuttet med diamantkniven, kniven trekkes tilbake, og overflaten av blokken skannes i et rastermønster med en elektronstråle for å skape et bilde av vev ultrastruktur. Blokken heves deretter en bestemt mengde (f.eks. 100 nm) i z-aksen, kjent som et "z-trinn", og en ny overflate kuttes før prosessen gjentas. På denne måten produseres en 3-dimensjonal (3D) blokk med bilder når vevet kuttes bort. Dette bildesystemet drar ytterligere nytte av enhetens automatiserte natur, slik at man kan forlate mikroskopet uten tilsyn under bildebehandlingsprosessen, med den automatiserte samlingen av hundrevis av bilder mulig på en enkelt dag.

Mens SBF-SEM-avbildning primært bruker backscattered elektroner for å danne et bilde av blokkflaten, genereres sekundære elektroner under bildebehandlingsprosessen12. Sekundære elektroner kan akkumuleres, sammen med backscattered og primærstråleelektroner som ikke unnslipper blokken, og produserer "vevslading", noe som kan føre til et lokalisert elektrostatisk felt ved blokkflaten. Denne elektronakkumuleringen kan forvrenge bildet eller føre til at elektroner kastes ut av blokken og bidrar til signalet som samles inn av backscatter-detektoren, og reduserer signal-til-støy-forholdet13. Mens nivået av vevslading kan reduseres ved å redusere elektronstrålespenningen eller intensiteten, eller redusere strålebotiden, resulterer dette i et redusert signal-til-støy-forhold14. Når en elektronstråle med lavere spenning eller intensitet brukes, eller strålen bare har lov til å bo innenfor hvert pikselrom i en kortere periode, blir mindre backscattered elektroner kastet ut av vevet og fanget av elektrondetektoren, noe som resulterer i et svakere signal. Denk og Horstmann håndterte dette problemet ved å introdusere vanndamp i kammeret, og dermed redusere ladningen i kammeret og på blokkflaten på bekostning av bildeoppløsning. Med et kammertrykk på 10-100 Pa er en del av elektronstrålen spredt og bidrar til bildestøy og tap av oppløsning, men dette produserer også ioner i prøvekammeret som nøytraliserer ladningen i prøveblokken2. Nyere metoder for nøytralisering av ladningen i prøveblokken bruker brenngassinjeksjon av nitrogen over blokkflaten under avbildning, eller introduserer negativ spenning til SBF-SEM-trinnet for å redusere sondestråle-lading energi og øke signalet samlet inn6,7,15. I stedet for å introdusere stadiumskjevhet, kammertrykk eller lokalisert nitrogeninjeksjon for å redusere ladningsoppbyggingen på blokkoverflaten, er det også mulig å øke reduktiviteten til harpiksen ved å introdusere karbon til harpiksblandingen, noe som gir mer aggressive bildebehandlingsinnstillinger16. Følgende generelle protokoll er en tilpasning av Deerinck et al. protokollen publisert i 2010 og dekker modifikasjoner på vevsforberedelse og avbildningsmetoder vi fant nyttige for å minimere vevslading samtidig som vi opprettholder høyoppløselig bildeoppkjøp3,17,18,19. Mens den tidligere nevnte protokollen fokuserte på vevsbehandling og tungmetallimpregnering, gir denne protokollen innsikt i bildebehandlings-, dataanalyse- og rekonstruksjonsarbeidsflyten som er knyttet til SBF-SEM-studier. I vårt laboratorium har denne protokollen blitt vellykket og reprodusert påført et bredt utvalg av vev, inkludert hornhinne og fremre segmentstrukturer, øyelokk, lacrimal og hardere kjertel, netthinne og optisk nerve, hjerte, lunge og luftvei, nyre, lever, cremaster muskel, og cerebral cortex / medulla, og i en rekke arter, inkludert mus, rotte, kanin, marsvin, fisk, monolayer og stratifiserte cellekulturer, gris, ikke-menneskelig primat, samt menneskelig20,21,22,23. Selv om små endringer kan være verdt for spesifikke vev og applikasjoner, har denne generelle protokollen vist seg å være svært reproduserbar og nyttig i sammenheng med vårt kjerneavbildningsanlegg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr ble håndtert i henhold til retningslinjene beskrevet i Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research og University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av institusjonene der de ble håndtert: Mus, rotte, kanin, marsvin og ikke-menneskelige primatprosedyrer ble godkjent av University of Houston Animal Care and Use Committee, sebrafiskprosedyrer ble godkjent av DePauw University Animal Care and Use Committee, og grisprosedyrer ble godkjent av Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Alt humant vev ble håndtert i samsvar med Helsinkideklarasjonen om forskning på humant vev og passende institusjonell gjennomgangsstyregodkjenning ble innhentet.

1. Vevsbehandling

  1. Forbered en lagerløsning på 0,4 M natriumkakroktylatbuffer ved å blande natriumkakroktylatpulver i ddH2O. Bland bufferen grundig og pH juster oppløsningen til 7,3. Denne bufferen brukes til å lage fikseringsmiddel (sammensetning beskrevet nedenfor i trinn 1.3), vaskebuffer, samt osmium- og kaliumferrocyanidløsninger.
    MERK: Perfusjonsfiksering er ofte den beste metoden for fiksering for SBF-SEM-studier, da fiksering skjer raskt og i hele kroppen. Hvis perfusjonsfiksering ikke er mulig i studiedesignet, går du til trinn 1.3.
  2. Utfør perfusjonsfiksering med riktig fysiologisk trykk for dyremodellen24,25,26. Dette gjøres via transkardial sekvensiell perfusjon med heparinisert saltvann etterfulgt av fiksering, hver plassert i en bestemt høyde (f.eks. 100 cm) over organismen (egnet til det fysiologiske trykket i det vaskulære systemet i dyremodellen), med fiksering som strømmer inn i venstre ventrikel, og går ut av et snitt laget i høyre atrium. Vev av interesse vil bli blek som blod er erstattet med fixative, hvis hele eller en del av vevet ikke blanche da vev kan ikke være hensiktsmessig løst og ultrastruktur kan ikke bevares.
  3. Bruk et barberblad eller en skarp skalpell til å trimme vevsprøver i blokker som ikke er større enn 2 mm x 2 mm x 2 mm. Hvis trinn 1.2 ble hoppet over, gjør du dette raskt slik at vevet kan være nedsenking fikset så raskt som mulig.
    1. Alternativt kan dissekere vev under fixative og overføre til fersk fiksering for å fullføre nedsenkningsprosessen. Den endelige sammensetningen av fikseringsmiddelet består av 0,1 M natriumkakroocylatbuffer som inneholder 2,5% glutaraldehyd og 2 mM kalsiumklorid. La fiksering fortsette i minst 2 timer ved romtemperatur og maksimalt over natten ved 4 °C. Hvis det er mulig, bruk en vippe-/vippeplate for å forsiktig omrøre prøver under festing.
    2. Alternativt, hvis en inverter mikrobølgeovn er tilgjengelig, fikse vev i nevnte fixative under vakuum på 150 watt i 4 sykluser på 1 minutt på, 1 minutt av. Mikrobølgefiksering er den foretrukne metoden for trinn 1.3, da den raskt fikser vev og bevarer vev ultrastruktur27.
      MERK: Vev må aldri tørkes i denne protokollen, det må utvises forsiktighet for å overføre vev raskt fra en løsning til den neste.
  4. Vask fast vev 5x i 3 minutter hver (15 minutter totalt) ved romtemperatur i 0,1 M natriumkakroktylatbuffer som inneholder 2 mM kalsiumklorid.
  5. Gjør følgende osmium ferrocyanidoppløsning frisk, helst under de forrige vasketrinnene. Kombiner en 4% osmium tetroksidoppløsning (fremstilt i ddH2O) med et likt volum på 3% kaliumferrocyanid i 0,2 M kaktokylatbuffer med 4 mM kalsiumklorid. Etter det forrige vasketrinnet, plasser vevet i denne løsningen i 1 time på is i mørket og i avtrekkshetten.
    MERK: Osmium tetroxide er et gult krystallinsk stoff som kommer i en ampule. For å lage osmiumetroksidoppløsningen, åpne ampullen, tilsett ddH2O og soniker i 3-4 timer i mørket til krystallene er helt oppløst. Osmium tetroxide løsning er en klar gul løsning, hvis løsningen er svart osmium er redusert og bør ikke lenger brukes.
  6. Mens vevet inkuberer i osmium ferrocyanidoppløsningen, begynner du å forberede tiokarbohydrazidoppløsningen (TCH). Forbered denne løsningen frisk og ha den lett tilgjengelig på slutten av 1 time osmium ferrocyanide fikseringsperiode. Kombiner 0,1 g tiokarbohydrazid med 10 ml ddH2O og legg denne oppløsningen i en 60 °C ovn i 1 time. For å sikre at løsningen er oppløst, virvler du forsiktig hvert 10. Før bruk, filtrer denne løsningen gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.
  7. Før du inkuberer i TCH, vask vevet med romtemperatur ddH2O 5x i 3 minutter hver (totalt 15 minutter).
  8. Plasser vevet i den filtrerte TCH-oppløsningen i totalt 20 minutter ved romtemperatur (Figur 1A-C).
  9. Etter inkubasjon i TCH, vask vevet 5x i 3 minutter hver (15 minutter totalt) i romtemperatur ddH2O.
  10. Plasser vev i ddH2O som inneholder 2% osmium tetroxide (ikke osmium redusert med kalium ferrocyanid) i 30 minutter ved romtemperatur. Dette bør gjøres i avtrekkshetten og i mørket, da osmium kan reduseres med lys (f.eks. under aluminiumsfolie) (Figur 1D-F).
  11. Etter osmium tetroksid inkubasjon, vask vev 5x i 3 minutter hver (15 minutter totalt) i romtemperatur ddH2O.
  12. Legg vev i 1% vandig uranylacetat (uranylacetatpulver blandet i ddH2O) over natten i kjøleskap ved 4 °C.
  13. Rett før du fjerner vev fra kjøleskapet, lag fersk Waltons bly aspartatløsning. Begynn med å oppløse 0,066 g blynitrat i 10 ml 0,03 M aspartinsyreoppløsning (0,04 g aspartiginsyre i 10 ml destillert vann) og juster pH til 5,5 med 1 N KOH (0,5611 g i 10 ml destillert vann).
    FORSIKTIG: Et bunnfall kan dannes ved justering av pH. Dette er ikke akseptabelt.
    1. Bruk en rørestang, legg sakte til 1 N KOH-dråpevis mens du overvåker pH. Forvarm den ferdige klare bly aspartatoppløsningen i en 60 °C ovn i 30 minutter. Hvis det dannes et bunnfall, kan ikke løsningen brukes, og en annen løsning må utarbeides.
  14. Fjern vevet fra kjøleskapet og vask 5x i 3 minutter hver (15 minutter totalt) i romtemperatur ddH2O.
  15. Etter vask, plasser vevet i den oppvarmede Waltons bly aspartatoppløsning i 30 minutter mens du opprettholder temperaturen ved 60 °C.
  16. Etter inkubasjon i Waltons bly aspartat, vask vevet 5x i 3 minutter hver (15 minutter totalt) i romtemperatur ddH2O (Figur 1G-I).
  17. Dehydrer vevet gjennom en iskald acetonserie (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% og 100% aceton (i ddH2O der det er aktuelt) slik at 10 minutter for hvert trinn i serien.
  18. Etter den iskalde dehydreringsserien plasserer du vev i romtemperaturokton i 10 minutter.
    1. I løpet av denne tiden, formulere Embed 812 ACM harpiks. Bruk den "harde blanding" oppskriften, da den er mer motstandsdyktig mot bjelkeskader. Bland harpiksen grundig, og legg vevet i Embed 812:aceton (1:3 mix) i 4 timer, etterfulgt av Embed 812:aceton (1:1 mix) i 8 timer eller over natten, og til slutt Bygg inn 812:aceton (3:1 mix) over natten. Utfør disse harpiksininfiltrasjonstrinnene ved romtemperatur.
  19. Neste dag legger du vevet i 100% Embed 812 i 4-8 timer, deretter i fersk 100% Embed 812 over natten, og til slutt i friske 100% Embed 812 i 4 timer. Utfør disse harpiksininfiltrasjonstrinnene ved romtemperatur.
    1. Like før du legger inn, legg en liten mengde harpiks i en blandebeholder og bland sakte (en trepinne kan brukes til omrøring) i karbonsvart pulver til harpiksen er mettet med pulveret, men er fortsatt flytende og ikke blir kornete. Det skal ligne tykk blekk og kunne sakte dryppe fra trepinnen uten synlige klumper.
  20. Orienter vevsprøvene i en silikongummiform og ta et bilde slik at prøveretningen i harpiksblokken registreres og kan refereres til. Dekk prøvene i karbonsvart mettet harpiks på spissen av silikonformen og legg formen i en ovn i ~ 1 time ved 65 °C.
    1. Plasser formen i en skråning for å inneholde harpiksen på spissen av formen der den dekker vevsprøven. Plasser en etikett med en prøveidentifikator for eksperiment/vev i formen i motsatt ende av harpiksen (figur 2A).
  21. Fjern silikonformen fra ovnen og fyll resten av formen med klar harpiks (ingen karbon svart) og sørg for at etiketten forblir synlig. Herd harpiksen infundert med karbon svart nok til ikke å blande lett med klar harpiks.
    1. Forbered en ekstra brønn i formen som ikke inneholder vev. Begynn med den ekstra brønnen, fyll resten av formen med klar harpiks.
    2. Hvis den karbonsvarte infunderte harpiksen begynner å blø inn i den klare harpiksen, plasserer du silikonformen tilbake i ovnen i ekstra tid (f.eks. 15 minutter).
    3. Når alle vevsprøvene er toppet med klar harpiks, legg silikonformen tilbake i ovnen (flat, ingen helling) ved 65 °C i 48 timer for å fullføre herdeprosessen.

2. Blokk forberedelse

MERK: Metoden vil avhenge av hvordan prøven er orientert i blokken og hvordan seksjoneringen skal skje. Imidlertid finner den vanligste vevsorienteringen vevet sentrert i spissen av harpiksblokken, vinkelrett på den lange enden av harpiksblokken.

  1. I de fleste tilfeller må du først trimme enden av blokken for å finne vevet ved å plassere prøveblokken i mikrotomchucken med den koniske enden som stikker opp ca. 5-6 mm ut av chucken. Lås den på plass med settskruen og plasser den under en varmelampe.
  2. Etter flere minutter vil blokken være formbar og lett å trimme. Plasser chucken i stereomikroskopholderen og bruk et nytt dobbeltkantet barberblad for å gjøre tynne seksjoner parallelle med blokkflaten til vevet er synlig. Dette er best sett ved å vinke lys over blokkflaten, vevsprøven vil være mindre reflekterende og granulær sammenlignet med de delene av harpiksen som er blottet for vev. Se bildet tatt av vevsprøver før innføring av karbonsvart mettet harpiks for en ide om hvordan og hvor vevet ligger.
  3. Sett en prøvepinneholder til side for trimmingsformål. Denne pinneholderen plasseres aldri i SEM-kammeret og kan derfor håndteres uten hansker, dette vil bli referert til som trimmepinneholderen. Enhver prøveholder som skal plasseres i bildekammeret, må aldri berøres uten hansker. Dette unngår å introdusere fett og olje i mikroskopkammeret.
  4. Plasser en prøvepinne i aluminium i festepinnen og stram skruen litt med forsiden (den flate overflaten) på pinnen som holdes 3-4 mm over pinneholderen.
  5. Lag flere dype, kryssende riper i ansiktet av pinnen for å gi et større overflateareal for limet som brukes til å holde prøven på plass. Hvis en aluminiumspinne brukes, anbefales en liten flathodeskrutrekker i stål for dette trinnet (Figur 2B).
  6. Plasser chucken som inneholder vevsprøven tilbake under varmelampen til harpiksen blir myk og formbar, og plasser den deretter i chuckbeholderen under stereomikroskopet.
  7. Bruk et dobbeltkantet barberblad for å trimme bort overflødig harpiks fra den delen av harpiksblokken som inneholder vevsprøven. Til syvende og sist vil størrelsen på vevsblokken festet til pinnen være ca. 3 mm i diameter og 2-3 mm i høyden.
    1. Skyv forsiktig barberhøvelen rett ned i harpiksblokken omtrent 1-2 mm, og skyv deretter barberhøvelen forsiktig horisontalt inn i harpiksblokken på en dybde som tilsvarer forrige kutt. Gjør dette sakte og med stor forsiktighet, da det er mulig å skade eller kutte bort den delen av blokken som inneholder vevsprøven. Når de to kuttene møtes, vil overflødig harpiks skille seg fra blokken. Fortsett å fjerne harpiks til bare et hevet område på 3 mm x 3 mm gjenstår.
  8. Etter denne første trimmingen plasserer du blokken (fortsatt i chucken) under varmelampen i flere minutter.
  9. Når harpiksen blir myk og formbar, plasser blokken tilbake under stereomikroskopet. Bruk et nytt dobbeltkantet barberblad, klipp av toppen av harpiksblokken, omtrent 1 mm under den trimmede delen, med et enkelt glatt kutt. En flat overflate er å foretrekke, da dette vil bli limt til prøvepinnen. Vær forsiktig så du ikke lar prøven gå tapt, da dette trinnet krever en viss kraft som kan overføres til den fjernede delen av blokken og føre til at den flyr bort. Legg kuttet og trimmet prøven til side.
  10. Plasser festepinneholderen som inneholder den kuttede aluminiumspinnen, i beholderen for stereomikroskopet. Påfør et tynt lag cyanoacrylat lim på pinneflaten slik at den helt dekker pinnen uten å danne en synlig menisk. Plukk opp den trimmede delen av vevsblokken med tang og legg den på pinneflaten. Sentrer vevsprøven på prøvepinnen. Trykk den ned og hold den i flere sekunder. La limet stilles inn i flere minutter.
  11. Når limet er helt tørt, plasserer du trimmepinneholderen tilbake under stereomikroskopet. Bruk en fin fil, arkiver overflødig harpiks slik at ingen harpiks overhenger pinnen. Harpiksformen skal ligne det sirkulære pinnehodet.
  12. Finn vevet på den hevede delen av harpiksblokken din, skrå belysning er nyttig for dette. Ved hjelp av en dobbeltkantet barberhøvel må den hevede delen av harpiksen som inneholder vevsprøven trimmes til et område som ikke er større enn 1 mm2. Hvis det er mulig, kan blokkflaten trimmes enda mindre, dette vil redusere stress på diamantkniven og forbedre levetiden.
    1. Fjern så mye overflødig harpiks som mulig, slik at blokken blir litt lengre i en dimensjon. Dette gjøres sakte og med forsiktighet, da det er mulig for harpiksen som inneholder vevsprøven å bryte bort hvis for mye kraft påføres. Mens en barberhøvel anbefales, kan en fin metallfil brukes til dette trinnet.
  13. Med en fin metallfilvinkel overflødig harpiks, i området utenfor den hevede delen som inneholder vevsprøven, ned mot kanten av pinnen (Figur 2C).
  14. Fjern harpikspartikler og støv fra den forberedte prøven før du påfører sølvmaling etterfulgt av gullsprut. Bland sølv med aceton slik at det er en lett spredbar væske, som ligner neglelakk (men ikke så tynn at den drypper av applikatoren) og påfør en tynn frakk på hele prøveblokkoverflaten. Aceton fordampes raskt, så det kan være nødvendig å legge til ekstra aceton når sølvmalingen begynner å tykkere.
    1. La sølvmalingen tørke over natten før den lastes inn i mikroskopet.
      MERK: Dette sølvlaget må være tynt for å unngå å utvide blokkflaten utover 1 mm x 1 mm, og selv om sølvmalingen aldri har skadet diamantkniven, anbefales det fortsatt mindre blokkflater for å bevare diamantknivens levetid. Acetonen blandet inn med sølvet må fordampe helt før gull-sputtering eller lasting av prøven i mikroskopet for å unngå å introdusere acetondamp i bildekammeret.
    2. Etter påføring av sølvmaling, påfør et tynt lag gull på prøveblokken. Ved hjelp av en standard vakuumsputteringsenhet utstyrt med et standard gullfoliemål, vil et kammertrykk på 200 milliTorr (Argon-gass) og 40 milliampere som kjører i 2 minutter resultere i et 20 nm tykt gullbelegg.
  15. Etter belegg, plasser den monterte og trimmede blokken i et rør med riktig eksperimentetikett festet. Lag tilpassede rør ved hjelp av engangsoverføringspipetter.
    1. Klipp overføringspipetten like under pæren, og la en kort del av overføringspipetterøret være festet under den pæreformede enden. Forkort den rørformede delen som ble kuttet bort, og kutt pipettespissen tilbake nok slik at aluminiumsprøvepinnen kan skyves tett inn i den.
    2. Plasser enden som inneholder aluminiumsprøvepinnen i den pæreformede enden av den modifiserte overføringspipetten.
  16. Før du laster en forberedt vevsblokk, må du forsiktig trimme bort overflødig sølvmaling fra overflaten av blokkflaten.

3. SEM-innstillinger for avbildning av blokkflaten

MERK: Bildeinnstillingene som følger, ble produsert på enheten som brukes av forfatterne, som er oppført i tabellen over materialer som følger med. Selv om denne enheten er i stand til variabel trykkavbildning, ble de beste resultatene fanget opp under høyt vakuum.

  1. Oppholdstid: Bruk 12 μs/px under seriell seksjonering. Når et interesseområde er identifisert, kan et bilde med høyere oppløsning anskaffes ved 32 μs/px.
  2. Vakuuminnstillinger: Bruk et pistoltrykk på 9e-008 Pa, et kolonnetrykk på 1,1e-004 Pa, og et kammertrykk på 9,5e-002 Pa.
  3. Tid for innspilling: Med innstillingene ovenfor kan du ta en bildestakk på 2048 x 2048 piksler med en hastighet på 50 sekunder per bilde. Bilder med høyere oppløsning av interesseområder kan tas med 4096 x 4096 piksler på i underkant av 9 minutter per bilde.
  4. Tykkelse på inndeling: Bruk 100-200 nm. Mindre er mulig, men kan kreve lavere strålespenning, intensitet eller oppholdstid.
  5. Høy spenning (HV): Bruk 7-12 kV. Mens du øker spenningen reduserer spotstørrelsen og øker oppløsningen, introduserer den mer mulighet for stråleskade. Høyere kV øker strålegjennomtrengningen som resulterer i tap av detaljer. Senking av kV forringer imidlertid signal-til-støy-forholdet (Figur 3)14.
  6. Stråleintensitet (BI): Forfatterens SBF-SEM-enhet tilbyr en stråleintensitetsskala fra 1-20. På denne skalaen gir verdier på 5-7 kvalitetsbilder uten overdreven lading og stråleskade. Jo høyere BI er, jo større oppløsning er det imidlertid større sjanse for lading og stråleskade14.
  7. Spotstørrelse og bildeforstørrelse: Bestem spotstørrelsen etter stråleintensitet og spenningsnivå. Ideelt sett bør spotstørrelsen ikke være større enn pikselstørrelsen som brukes. Pikselstørrelsen bestemmes ved å dele synsfeltet (FOV) på antall piksler. En FOV på 25 μm med en bildestørrelse på 2048 x 2048 piksler vil for eksempel gi 12,2 nm per piksel. Derfor bør spotstørrelsen ikke være større enn 12,2 nm. Figur 4 viser hvordan HV, BI og spotstørrelse er relatert.
  8. Arbeidsavstand (WD) - Med blokk ansiktsbilder er arbeidsavstanden ikke justerbar. Det er rett og slett en fokusfaktor. Det vil være nesten identisk for alle blokker som er avbildet. Selv om arbeidsavstanden ikke kan justeres, spiller den en kritisk rolle i oppløsningen til bildet som er tatt. Etter hvert som arbeidsavstanden reduseres, øker oppløsningsgrensen for bilder som er tatt. I noen tilfeller kan det være mulig å redusere arbeidsavstanden ved å gjøre endringer i bildekammeret, men disse modifikasjonene må gjøres etter brukerens skjønn. For å redusere arbeidsavstanden og øke bildeoppløsningen løsnet vi mikrotomskruene på dørbraketten og omplasserte mikrotomet slik at det hvilte ~ 2 mm nærmere stråledetektoren etter å ha festet skruene igjen.
  9. Oppløsning - Bruk innstillingene ovenfor, x &y oppløsning så høy som 3,8 nm er mulig. Det er viktig å merke seg at oppløsningen er begrenset av strålepunktstørrelse samt pikseloppløsningen til bildeopptakene (f.eks. et 20 μm synsfelt tatt i et bilde på 2048 x 2048 piksler har en pikseloppløsning på 9,8 nm, selv om en spotstørrelse på 3,8 nm ble brukt). Bildeoppløsningen i z-planet er avhengig av seksjoneringstykkelse, vi finner at 100-200 nm fungerer bra med denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus Hornhinnen
Denne protokollen har blitt brukt mye på musen hornhinnen. Ved hjelp av SBF-SEM-avbildning ble det vist seg at et nettverk av elastinfrie mikrofibrilbunter (EFMB-er) var til stede i den voksne mushinnen. Det ble tidligere antatt at dette nettverket bare var til stede under embryonal og tidlig postnatal utvikling. SBF-SEM avslørte et omfattende EFMB-nettverk i hele hornhinnen, med individuelle fibre funnet å være 100-200 nm i diameter når de måles i tverrsnitt. Det ble også funnet at dette EFMB-nettverket ble organisert i forskjellige lag, med fibre nært forbundet med keratocytter, selv ligger innenfor grunne invaginasjoner på keratocyttoverflaten (Figur 5). Oppdagelsen av EFMB-fibre i den voksne hornhinnen førte til immunogold-merking overføring elektronmikroskopi (TEM), fluorescens og konfektstudier for å forstå arten av dette nettverket23.

Videre anvendelse av denne protokollen førte til oppdagelsen av en tidligere ukjent populasjon av sentrale hornhinnener som smelter sammen med basale epitelceller ved den stromale epitelgrensen (Figur 6). Tidligere ble det antatt at alle nerver som samhandler med epitelet ved denne grensen trengte inn i hornhinnen epitel og ramified produsere subbasal og epitelial plexi. I denne studien gjennomgikk ~ 45% av sentrale nerver som samhandler med basal epitelet cellecellefusjon i stedet for enkel penetrasjon. Ved hjelp av stereologiske metoder anvendt på SBF-SEM-datasett, var det mulig å vise at denne nye nervepopulasjonen hadde et overflate-til-volum-forhold omtrent halvparten av gjennomtrengende nerver, i samsvar med deres "hovne" utseende (Nerve Fusion - 3,32±0,25, Nerve Penetration - 1,39±0,14, p ≤ 0,05). 3D-rekonstruksjoner av gjennomtrengende og fusjonerende nervebunter og deres mitokondrier ble opprettet, og fremhevet mangelen på mitokondrier i smeltede deler av nervebuntene. Oppdagelsen av nevronal epitelcellefusjon ved hjelp av SBF-SEM førte til fluorescensstudier som bekreftet membrankontinuitet mellom de to smeltede cellene21.

Den sentrale hornhinnen er et avaskulært vev, og som sådan er den perifere limbalvaskulaturen spesielt viktig for hornhinnens generelle helse. Cellecellerelasjonene og ultrastrukturen i dette området er komplekse. Evnen til å sette pris på disse cellecelleinteraksjonene og ultrastrukturelle forbindelsene har imidlertid vært begrenset i fluorescens- og enkeltseksjons TEM-studier. Derfor ble en SBF-SEM-bildestakk som inneholder vaskulatur i lemmer, nervebunter og tilhørende celler, segmentert manuelt for 3D-rekonstruksjon (figur 7). I dette bildet kan den nære sammenhengen mellom vaskulære endotelkryss og en overliggende pericytt, de enkelte granulatene til en perivascular mastcelle, kjernen og forkant av en nøytrofil som kryper langs den ytre overflaten av blodkarveggen, samt en passerende nervebunt ses.

Samlet viser denne kroppen av arbeid evnen til denne protokollen til å produsere høykvalitets 3D-elektronmikroskopidatasett i vev rik på ekstracellulær matrise og epitel, samt vaskulatur og tilknyttede celler.

Høyere orden Primate Retina - Nerve Plexus og Vaskulært Nettverk
Retinal nervefiberlaget (RNFL) av høyere orden primater inneholder og avhenger av et omfattende vaskulært nettverk. Ofte innebærer sykdommer i netthinnen endringer i begge parametrene til retinal nervefiberlaget så vel som vaskulaturen som finnes i den. Å forstå forholdet mellom RNFL og dets vaskulære nettverk i sunt, ikke-patologisk vev er det første skrittet for å forstå eventuelle endringer som kan oppstå som følge av sykdom. For å bedre forstå dette forholdet ble SBF-SEM-protokollen brukt på normal primat netthinne i høyere rekkefølge, og rekonstruksjonen av det vaskulære nettverket ble utført og volumetriske data hentet fra denne rekonstruksjonen (Figur 8). Denne 4,642,307 μm3-regionen i RNFL inneholdt en vaskulær seng 1.207x10-4 μL i volum, som utgjør 2,6% av det totale volumet av RNFL. Dette arbeidet demonstrerer denne protokollens evne til å produsere høykvalitets 3D-elektronmikroskopidatasett i tett nevrologisk vev.

Sebrafisk og giant danio hjerte - strikket muskel og utvikle vaskulatur
Både sebrafisken og den gigantiske danioen er viktige modeller for hjerteutvikling og regenerering. Historisk sett anses sebrafiskhjertet å bestå av to anatomisk distinkte myokardsegmenter som fungerer sammen til støtte for sebrafiskens fysiologiske krav. Grensesnittet mellom disse to ventrikulære lagene ble imidlertid ikke godt forstått. Ved hjelp av denne protokollen ble det oppdaget et tidligere ukjent koblingsområde som består av et tynt ark med fibroblaster. Det ble funnet at åpninger i dette arket tillot to separate myokardsegmenter å komme i kontakt og danne komplekse adhesjonskryss, inkludert desmosomer og fascia-tilhengere22.

Denne protokollen har blitt brukt i videre arbeid med å undersøke det vaskulære nettverket til det utviklende gigantiske danio-hjertet (figur 9). Denne metoden gjør det mulig for 3D-verdsettelsen av det utviklende hjerte-myocyttnettverket og dets forhold til å utvikle mikrovaskular. Samlet viser dette arbeidet denne protokollens evne til å produsere høykvalitets 3D-elektronmikroskopidatasett i muskel og svært vaskulært vev.

Bildeinnstillinger, lading og oppløsning
Mens passende fiksering og tungmetallfarging er nødvendig for kvalitetsSBF-SEM-avbildning, er like viktig bruk av ledende harpiks og riktige bildeinnstillinger for spørsmålene som blir adressert. I denne protokollen brukes bruk av karbon svart for å øke ledningsevnen til prøveblokken og gi en kanal til monteringspinnen for klaring av sekundære elektroner fra blokkflaten. Dette har vist seg effektivt i bekjempelse av vevslading som ofte forringer bildekvaliteten i vev som ikke er tilberedt med karbon svart16. I tillegg gir sølvmaling og gull sputtering påført blokken en dissipasjonsvei for elektronoppbygging. Noen enheter tillater tilsetning av en fokal ladekompensator, noe som reduserer ladingen ved å påføre en puff av nitrogen over blokkflaten, men vi har hatt lignende suksess med bruk av karbon svart og påføring av sølvmaling og gull sputtering til blokken15. Mangel på prøveledningsevne kan føre til elektronoppbygging synlig som vevslading (Figur 1), samt utslipp som er synlige som brå bildeforskyvning og fordreining som dramatisk reduserer bildekvaliteten (Figur 10B &F). Bruken av karbonsvart gjør det mulig å avbilde under høyvakuum og bruk av bildeinnstillinger som resulterer i høyt signal-til-støy-forhold og forbedret bildeoppløsning. En slik innstilling som fører til forbedret bildekvalitet er pikselbohetstid. SBF-SEM-avbildningsprosessen innebærer rasterskanning av en elektronstråle over prøveoverflaten for å generere backscattered elektroner som mikroskopdetektoren kan samle og tolke som signal. Hvor lenge denne strålen kan bo innenfor området for hvert bildepunkt, fører til at en mer nøyaktig pikselverdi tilordnes hver pikselplassering (Figur 3A og B)2. Det er imidlertid en balanse mellom økt signal-til-støy, oppløsning og skade som håndteres til blokk-ansiktet. Strålen bestråler effektivt blokk-ansiktet med høyenergielektroner som kan bryte ned og myke harpiks, noe som resulterer i bildeforringelse og skjærekomplikasjoner (figur 10)28. Jo tynnere z-oppløsningen kreves, jo vanskeligere blir det å opprettholde høyoppløselig bildebehandling. Vi bruker vanligvis z-trinn på 100-200 nm, men z-trinns størrelser på 25-50 nm er rapportert5,29,30,31. Med z-trinn av denne størrelsen kan nedbrudd og mykgjøring av harpiks på grunn av stråleskade føre til enten kompresjon av harpiksen som får kniven til å gå glipp av et kutt eller kutte blokkflaten, men med "skravling" der kniven hopper over overflaten av blokken og skaper krusninger og bånd13. Selv om små z-trinn er et attraktivt prospekt, er det viktig å huske på det spesifikke forskningsspørsmålet når du velger et passende z-trinn. Overprøvetaking kan føre til betydelige datalagringshensyn samt en økning i tiden som kreves for å produsere 3D-rekonstruksjoner.

Vevsfiksering og farging
Før tungmetallinkubasjon må vev festes i glutaraldehyd. Selv om vi anbefaler mikrobølgefiksering under vakuum for bevaring av vev ultrastruktur27, hvis en mikrobølgeovn i laboratorieklasse ikke er tilgjengelig, kan en kommersiell inverter mikrobølgeovn med variabel wattstyrke erstattes32,33,34,35. Hvis dette gjøres, bør det utvises ekstra forsiktighet for å sikre at vevsforvrengning ikke oppstår. Feil vevsfiksering kan resultere i endret vevsmorfologi som det fremgår av figur 10E. Denne protokollen, som de fleste moderne SBF-SEM fargingsprotokoller, har blitt tilpasset fra fargingsprosedyren skissert av Deerinck i 201017, basert på osmium-thiocarbohydrazide-osmium flekker opprettet av Willingham og Rutherford i 198436. Tungmetallene som brukes i denne protokollen gir kontrast til de cellulære strukturene i en vevsprøve (figur 1). Den første osmiuminkubasjonen skjer med redusert osmium som binder seg til C = C-bindinger i umettede fettstoffer som fører til membran- og lipidfarging37,38. Osmium reduseres med kaliumferrocyanid, som hjelper til med farging av mettede lipider og virker også for å stabilisere fosfolipider39,40. Thiocarbohydrazide blir deretter lagt til som et mordent som binder seg til osmium fra den første inkubasjonen, som fungerer som en bro som ytterligere osmium er bundet på et senere tidspunkt i protokollen41. Uranylacetat, som er et uransalt, er et effektivt kontrastmiddel for lipider, nukleinsyrer og proteiner, mens blysitrat forbedrer kontrasten mellom proteiner og glykogener. De varierende affinitetene til disse midlene for cellulære komponenter forbedrer ytterligere den generelle kontrasten i vev utover osmiuminkubasjonene42.

Bilde av blokkfjeet
Figur 11, figur 12, figur 13 illustrerer de kombinerte effektene av spenning, pikselbohetstid og stråleintensitet. Konvensjonell praksis antyder at en kombinasjon av lavspenning, kort oppholdstid og lav stråleintensitet er nødvendig for optimal avbildning og forhindre stråleskader på prøveblokken. I motsetning til disse innstillingene illustrerer figur 11, figur 12, figur 13 at høyere spenninger (f.eks. 7 kV), lengre oppholdstider (32 μs/px) og høyere stråleintensiteter (innstilling 6 i vårt tilfelle) kan gi overlegen bildekvalitet i forhold til konvensjonelle innstillinger.

SBF-SEM tillater innsamling av serielle elektronmikroskopibilder som kan samles inn som et 3D-datasett bestående av voxels. Selv om dette er en utrolig kraftig bruk av SBF-SEM, tillater denne metoden også rask og repeterbar avbildning av sjeldne biologiske hendelser eller celler. Bildeanskaffelse ved hjelp av SBF-SEM kan overvåkes for sjeldne hendelser, og bildebehandling stanses midlertidig for å samle bilder med høyere forstørrelse/oppløsning av disse hendelsene. Videre kan blokken fjernes fra mikroskopkammeret og blokk-face seksjonert for overføring elektronmikroskopi (TEM) avbildning. På denne måten kan store datasett av sjeldne hendelser samles inn ved hjelp av SBF-SEM, samt verdsatt på angstromskalaen ved hjelp av TEM.

Figure 1
Figur 1: SBF-SEM- og TEM-sammenligninger ved ulike trinn i protokollen. Denne protokollen inneholder flere trinn der prøvevev er farget med tungmetaller. Dette påvirker ikke bare vevskontrast og verdsettelse av cellulære strukturer og organeller, men også nivåene av lading som oppstår når vevet er avbildet. Denne illustrasjonen inneholder tre forskjellige visninger av forberedt vev: en lav forstørrelsesvisning (A, D &G), en høy forstørrelsesvisning (B, E &H) og en TEM-sammenligning av tilberedt mushinnen (C, F &I). Det kan bemerkes at høyere forstørrelsesbilder kan føre til økt vevslading, da elektronstrålen er konsentrert i en mindre region av vev. Den øverste raden (A-C) er en representativ prøve fra vev behandlet gjennom ferdigstillelse av trinn 1,8, og har blitt impregnert med kaliumferrocyanid, osmium tetroksid og tiokarbohydrazid. Pilene i de to første kolonnene viser det epitelial-stromale grensesnittet som et referansepunkt. Legg merke til det lave kontrastnivået i forhold til de to nederste radene, samt de økte nivåene av vevslading. Prøven i den midterste raden (D-F) ble behandlet gjennom fullføringen av trinn 1.10 og drar nytte av et ekstra osmium-tetroksidtrinn, og er synlig mer kontrastert enn prøven i den øverste raden. Mens cellulære strukturer er merkbare, er lading fortsatt til stede. Prøven i den nederste raden (G-I) drar nytte av hele fargingsprotokollen og har minimal vevslading. TEM-avbildning avslører vevskontrastnivåer som er gitt av tungmetallene som er tilstede ved hvert trinn (høyre kolonne): organeller i hornhinnen endotel (*) er mer kontrasterte og tydelige etter hvert som vevsbehandlingen fortsetter gjennom protokollen. I tillegg blir stromale kollagen- og fibrillindetaljer mer synlige (pilspiss) etter hvert som protokollen er fullført. Panel A, D &G skala bar = 50 μm. Panel B, E & H skala bar = 10 μm. Panel C, F & I skala bar = 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk for innebygd vevsblokk, prøvestift og endelig forberedelse. (A) Vevet skal plasseres i en kjent orientering helt på spissen av harpiksformen og den øvre tredjedelen av formen fylt med karbonsvart mettet harpiks. Regionen av formen lengst fra vevet skal forbli klar slik at eksperimentetiketten tydelig kan ses. (B) Prøvestiftoverflaten skal ripes for å produsere et rutenettmønster, dette gir et større kontaktområde for cyanoacrylatlimet å herdes mellom den forberedte prøveblokken og pinnen. (C) Karbonsvart mettet harpiks skal utgjøre et bredt kontaktområde med prøvepinnehodet, men regionen som kuttes av diamantkniven, bør ikke være større enn 1x1 mm. Det er god praksis å avsmalne blokken mot spissen. Dette minimerer skjærekrefter på diamantkniven, og ved å ha en bredere base er blokken mer motstandsdyktig mot å skille seg fra pinnen under seksjonering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av innstillinger for bildeopptak. ( A&B) Paneler A og B sammenligner bildekvalitet og oppløsning som en funksjon av pikselbohetstid. Panel A ble opprettet ved hjelp av en 32 μs / piksel oppholdstid ved 4 kV og lider av et redusert signal til støyforhold som det fremgår av det "kornete" utseendet til det forstørrede innsettet. Panel B ble opprettet ved hjelp av en 100 μs / pixel dwell tid ved 4 kV. Økning av pikselboetiden øker signal-til-støy-forholdet og avslører et økt nivå av cellulære detaljer, men økt pikselbohetstid har potensial til å føre til vevslading og / eller varmeoppbygging som myker blokken og introduserer skjæregjenstander (skravling) når du seksjonerer. Panel C og D sammenligner bilder tatt under identiske eksponeringsforhold, men med to forskjellige stråle kV-verdier. Vev i disse panelene ble impregnert med gullfargede nanogoldpartikler for å gjøre forskjeller i strålegjennomtrengningsdybder tydeligere. Panel C ble tatt opp ved 9 kV mens panel D ble tatt opp ved 21 kV. Økt kV har fordelen av økt kontrast (D), men detaljer går tapt som følge av å samle elektroner fra en større vevsdybde (C). Som et resultat av prøvetaking av et større tverrsnitt er større antall immunogoldpartikler som er spesifikke for GAP 43 synlige, mens ikke-spesifikk merking forblir det samme, noe som resulterer i et økt signal-til-støy-forhold. Panel A &B skala bar = 2 μm. Panel C &D skala bar = 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Stråleintensitet, kV og spotstørrelse. (A) Ved kontakt med vevsprøven gir elektronstrålen (lyseblå) et dråpeformet interaksjonsvolum, hvorfra ulike former for energi produseres fra samspillet mellom stråleelektroner og vevsprøven. Dråpeformen er en funksjon av vevstetthet og tungmetallfarging sammen med stråleenergi, og vippevinkelen til elektronstrålen43. Mens røntgenstråler, naverelektroner og tertiære elektroner produseres under SBF-SEM-avbildning, er den primære bekymringen med backscattered (mørkeblå) og sekundære (grønne) elektroner13. Bildet produsert med SBF-SEM-avbildning produseres ved å samle backscattered elektroner. Disse elektronene stammer fra elastiske interaksjoner mellom strålen og prøven, og signalet som samles inn er svært avhengig av atomnummeret av atomer samhandlet med - derav behovet for tungmetallfarging44. Sekundære elektroner stammer fra uelastiske interaksjoner mellom strålen og prøven og påvisning av signalet er svært avhengig av overflateretning. Fordi blokkflaten er flat i SBF-SEM, bidrar ikke sekundære elektroner meningsfullt til signalet som samles inn13. Faktisk kan sekundær elektronakkumulering på overflaten av blokken være en viktig kilde til lading og har en skadelig effekt på bildekvalitet2. (B) Dette diagrammet viser forholdet mellom stråleintensitet, stråle kV og spotstørrelse. Spotstørrelsen er den romlige oppløsningen til strålen, og bestemmer oppløsningsgrensen for bildene som produseres. Senking av kV øker spotstørrelsen, men reduserer også bildedybden, noe som gir bedre forståelse av detaljer. Dette har også effekten av å redusere det påvisbare signalet. Økende stråleintensitet gir en innledende forbedring på spotstørrelse og signaldeteksjon, men øker raskt nivåene av vevslading. Til syvende og sist er stråleintensiteten og kV-verdiene som velges utvalgsavhengige og best bestemt empirisk i forhold til det vitenskapelige spørsmålet som stilles. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Elastinfritt mikrofibrilbuntnettverk i muskarushinnen. 3D-rekonstruksjon av mikrofibriler (hvit) nært forbundet med keratocytter (gul, oransje &grønn) i hornhinnen stroma. Mikrofibrilene kan ses ved siden av, og i noen tilfeller innenfor grunne spor i, hornhinnen keratocytter (piler) (A). Dette nettverket av elastinfrie mikrofibriler er organisert i forskjellige lag i hornhinnen stroma (B). Skalastang = 2 μm. Bildeblokken rekonstruert er 45x45 μm i x &y-aksen, og 30 μm i z-aksen med voxel en oppløsning på 22x22x100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Rekonstruksjon av hornhinnens nerver som passerer gjennom basal lamina ved den stromale epitelgrensen. 3D-rekonstruksjon av en gjennomtrengende nerve (lilla) når den passerer gjennom basal lamina (grønn). Denne nerven kan ses for å bifurcate før penetrasjon. Etter å ha penetrert inn i epitelet, gjennomgikk begge nervegrenene konsekvenser. Mitokondrier (gul) er synlige i de stromale og epiteliale delene av nervebunten. Skalastang = 2,5 μm. Bildeblokken rekonstruert er 25x25 μm i x &y-aksen, og 14 μm i z-aksen med en voxeloppløsning på 12x12x100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Limbal vaskulatur og tilhørende celler i perifer mus hornhinnen. Et enkelt bilde (A) fra en 3D-bildeblokk (B) kan ses gjennom hvilket et kar, nervebunt og tilknyttede celler beveger seg. Panel C viser et rekonstruert kar (rødt) med en tilknyttet pericyte (grå) viklet rundt det som dekker endotelcellekryssene. En nervebunt (blå) bifurcates i nærheten av dette fartøyet som det reiser gjennom vevet. En nøytrofil (gul) kan ses parallelt med fartøyets lange akse, med sin polymorfiske kjerne synlig i cellekroppen og den etterfølgende uropoden synlig som et fremspring mot høyre for bildet. En mastcelle (magenta) er synlig på undersiden av fartøyet. Panel D isolerer denne mastcellen, hvor granulatene (grønne) lettere kan ses over kjernen (lilla) i cellen. Panel E fremhever de cellulære strukturene som er lagt på de cellulære rekonstruksjonene, med endotelkjerner betegnet i blått, og tilhengermikropartikler som er synlige i fartøyets lumen (oransje). Piler viser cellecellekantlinjer mellom endotelceller, som ytterligere kan ses på som hevede rygger som strekker seg langs cellene på lyssiden av fartøyet. Panel En skalalinje = 2 μm. Bildeblokken som brukes til å rekonstruere disse cellene er 30x30 μm i x & y-aksen, og 42,5 μm i z-aksen med en voxeloppløsning på 14,6x14,6x100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Rekonstruert vaskulært nettverk av det ikke-menneskelige primat retinal nervefiberlaget. (A) Et 200x200 μm SBF-SEM bilde av primat netthinnen tatt ved 8192x8192 px. Stedet som er samplet er ~ 500 mikron fra den dårligere temporale felgmarginen til et sunt øye uten patologi. Bildeserien rekonstruert i paneler C &D ble tatt på 2048x2048 px, med bildebehandling satt på pause slik at regioner av interessert kunne avbildes på 8192x8192 px. Panel B er det innlagte området i panel A, hentet direkte fra det opprinnelige bildet. Legg merke til det store antallet axoner og deres mitokondrier. (C) Orthoslice seksjon gjennom en 200x200x200 μm vev volum av en kontroll øye dårligere temporal nerve fiber lag, med vaskulatur segmentert. (D) Z-projeksjon av nervefiberlagets vaskulatur. Denne serien illustrerer oppløsningen som er mulig i et stort felt ved hjelp av denne metodikken. Panel En skalastang = 20 μm. Panel B skalastang = 2 μm. Bildeseriens voxel-oppløsning er 97,6 x 97,6 x 500 nm. Område med rente pikseloppløsning er 24.4x24.4 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Segmentering og 3D-volumgjengivelse av kar i den gigantiske danioen (Devario malabaricus) kompakt hjerte. (A) Todimensjonal mikrograf i en bildestabel, som viser profilen til et sentralt venetall (pil) og en endotelkjerne (pilspiss), med omkringliggende hjertegeocytter rik på mitokondrier og godt organiserte sarkomer (*). (B) Todimensjonal mikrograf av bildestakken med et kapillærstørrelsesfartøy (pil). (C) Biorthogonale projeksjoner av mikrografstakken som viser kapillæren i panel B projisert gjennom ett ortogonalt stykke. (D) 3D-gjengivelse av segmenterte endotelceller som fôrer det rekonstruerte fartøyet. Illustrert i grønne, røde, blå og lilla er fire separate endotelceller; endotelcellen avbildet i blått kan ses i tverrsnitt i panel B (pil), mens endotelcellene som er avbildet i rødt (pil) og grønt (pilspiss) ses i tverrsnitt i panel A. Paneler A &B skalalinje = 2 μm. Bildeblokken rekonstruert er 30x30 μm i x &y-aksen, og 16 μm i z-aksen med en voxel-oppløsning på 14,6x14,6x100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Bildekomplikasjoner og gjenstander. (A) Den bølgete og forvrengte karakteren til dette bildet er et resultat av bildebehandling ved hjelp av en pikselbohetstid som er for lang. Dette varmer harpiksblokken, slik at blokken vender mot myk og gummiaktig, noe som resulterer i et forvrengt bilde ved kutting. (B) Dette bildet inneholder en rekke gjenstander. Stjernen indikerer en bølget forvrengning forårsaket av tidligere avbildning ved en høyere forstørrelse og ligner på panel A, og konsentrerer strålen på et mindre område med lengre pikselboetid har myknet harpiksen i dette interesseområdet. Selv om det høyere forstørrelsesbildet som ble samlet inn, var fritt for gjenstander, kan dette føre til en påfølgende serie med bilder der eksemplet som ligger til grunn for interesseområdet, ser fordreid ut. Dette panelet illustrerer også spørsmålet om opphopning av rusk på blokkflaten (pilen) under bildebehandling, også betegnet med pilen i panel E. Hvis dette blir et vedvarende bildeproblem, vil det være nødvendig å bryte vakuumet, åpne kammeret og blåse bort rusk akkumulert på diamantkniven og rundt prøven. Små utslipp av elektroner fra blokkflaten kan føre til raske kontrastendringer og linjer betegnet med den hvite pilspissen. (C) Dette bildet illustrerer kniv riper på blokkflaten. Dette kan oppstå på grunn av en skadet kniv, eller ruskakkumulering på kanten av kniven. (D) Gjenstanden merket (pil) er et resultat av elektronstrålen fokusert på (uten seksjonering) blokkflaten i en lengre periode med prøven fortsatt i bildekammeret. (E) Feil fiksering av vev kan føre til separasjon av cellulære strukturer og bindevev (*). (F) Hvis det oppstår en stor mengde lading i vevs- eller harpiksblokken, kan det oppstå etterfølgende akkumulering og utflod som fører til at bildet "hopper over" som det er sett på dette bildet. Legg merke til forvrengningen av vevet i bildet ved disse hoppepunktene (pilene). Panel En skalastang = 1 μm. Panel B skalastang = 2 μm. Panel C skalastang = 5 μm. Panel D skala bar = 2 μm. Panel E skala bar = 25 um. Panel F skala bar = 50 um. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Bildevev ved 3 kV ved bruk av ulike pikselbotider og stråleintensiteter. Alle bildene samlet seg ved hjelp av en 3 kV-stråle, stråleintensiteten er på en enhetsspesifikk skala fra 1 til 20. Feltet som er avbildet er av de vaskulære lumen som inneholder hvite og røde blodlegemer. På denne lave kV er det vanskelig å sette pris på mobildetaljer. Å øke pikselens oppholdstid hadde liten effekt. Øke stråleintensiteten til 6 forbedret bildekontrast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: Bildevev ved 7 kV ved bruk av ulike pikselbotider og stråleintensiteter. Alle bilder ble samlet inn ved hjelp av en 7 kV-stråle, stråleintensiteten er på en enhetsspesifikk skala fra 1 til 20. Feltet som er avbildet er av de vaskulære lumen som inneholder hvite og røde blodlegemer. Ved 7 kV bidro økende stråleintensitet og pikselboetid til bildebehandling av høyere kvalitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Bildevev ved 12 kV ved bruk av ulike pikselbotider og stråleintensiteter. Alle bilder ble samlet inn ved hjelp av en 12 kV stråle, stråleintensitet er på en enhetsspesifikk skala fra 1 til 20. Feltet som er avbildet er av de vaskulære lumen som inneholder hvite og røde blodlegemer. Ved 12 kV optimaliseres bildebehandlingen ved å justere pikselbohetstid og stråleintensitet. Ladingen reduseres/mangler ved kortere pikselboetider, mens mobildetaljer og bildekontrast er best med lengre pikselbohetstid og høyere stråleintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hensikten med dette metodepapiret er å fremheve vevsforberedelses- og bildemetodikken som har gjort det mulig for laboratoriet vårt å fange opp høyoppløselige serielle elektronmikroskopibilder på en pålitelig måte, og å påpeke kritiske trinn som fører til dette resultatet, samt potensielle fallgruver som kan oppstå når du utfører SBF-SEM-avbildning. Suksess ved hjelp av denne protokollen krever riktig fiksering av vev, impregnering av tungmetaller i prøven, modifikasjoner av innebyggingsharpiksen for å redusere lading, samt en forståelse av mikroskop- og bildeinnstillingene som brukes til å samle bilder. Maksimal, "kvalitet inn, kvalitet ut" er et passende aksiom for SBF-SEM-avbildning. Siden målet med SBF-SEM ofte er verdsettelse eller kvantifisering av ultrastrukturelle detaljer, må det utvises ekstra forsiktighet til fikseringsstrategien for å sikre at vevsforvrengning ikke oppstår. Hvis vev blir forvrengt på noe tidspunkt i utarbeidelsen av prøver (dvs. gjennomgår hevelse, krymping eller forstyrrelse av cellulær morfologi), vil vevsrekonstruksjon og kvantisering ikke gi nøyaktige data. Videre kan bruk av feil bildebehandlingsinnstillinger føre til tap av data som ikke kan gjenerobres, da SBF-SEM-avbildning er en destruktiv prosess. I tillegg må det utvises forsiktighet ved lasting av en vevsprøve, da den delikate diamantkniven kan bli skadet av forkorting eller feil prøvepreparering. Dette kan føre til sjetonger eller brudd i kniven, noe som kan etterlate synlige ripemerker i bilder (Figur 10C). Diamantkniven kan også bli skadet av forkalkede strukturer, harde granulater eller ved et uhell innebygd glass (f.eks. fra reagensampuller).

Mens flertallet av SBF-SEM litteratur til dags dato bruker stråleakselerasjonsspenninger i området 1 til 3 kV sammen med pikselbo ganger nærmere 1-5 μs / px (Figur 11)45,46,47,48,49, bruker den gjeldende protokollen akselerasjonsspenninger på 7-12 kV og en pikselboetid på 12 μs/px for seriell avbildning og 32 μs/px for bildeområder av interesse (Figur 12 og 13). Disse innstillingene, kombinert med en skivetykkelse på 100-200 nm, gir mulighet for høy kvalitet og høyoppløselig avbildning av et bredt spekter av biologisk vev. Økt akselerasjonsspenning gir økt kontrast, oppløsning og signal-til-støy-forhold. Økt oppholdstid øker oppløsningen og signal-til-støy-forholdet ytterligere, mens økt skivetykkelse fører til redusert lading på blokkoverflaten under seksjonering og bekjemper stråleindusert skade i etterfølgende bilder14. Selv om denne avbildningsmetoden kan avvike fra konvensjonen, snakker bildene og datasettene som produseres, for seg selv. Hvis vi måtte spekulere på årsaken til denne suksessen, er det mulig at det er et resultat av vår unike kombinasjon av høye kV-verdier, lengre pikselbotider og blokkforberedelse. Økende bildebehandling kV resulterer i økt interaksjonsvolum mellom elektronstrålen og prøven. Dette interaksjonsvolumet er både dypere og bredere, noe som resulterer i en teoretisk økning i antall elektroner som oppdages som stammer fra dypere i prøveblokken, eller fra et bredere tverrsnitt av vev når spotstørrelsen tåre øker i diameter. Siden SBF-SEM er interessert i overflatedetaljene til blokken, resulterer dette i en teoretisk reduksjon i signal-til-støy-forholdet. Økningen i kV skyver imidlertid også elektroner dypere inn i prøven der det er mindre sannsynlig at de unnslipper blokken og bidrar til elektronene som samles inn av detektoren. Med den ekstra fordelen av et økt signal via lengre pikselbotider og høyere stråleintensitet, er det mulig at denne bildemetoden resulterer i en større økning i signal fra prøveoverflaten i forhold til støy som stammer fra interaksjonsvolumet. I tillegg bidrar den økte prøveledningsevnen som introduseres med karbonsvart, samt sølv- og gullbelegg til å forbedre ladningsoppbyggingen som nå skjer dypere inne i blokken og videre fra blokkflaten. faktisk Figur 11, Figur 12, Figur 13 viser at etter hvert som kV økes, begynner prøveladingen å avta ettersom den potensielt skyves dypere inn i blokken. Prøver som er avbildet med lav forstørrelse, kan fanges opp med tilstrekkelig kontrast ved hjelp av de konvensjonelle innstillingene, men disse bildene mangler ofte detaljer ved nøye inspeksjon. Dataene våre viser tydelig at når du bruker relativt høy forstørrelse der målet er mobildetaljer, kan det å øke de konvensjonelle innstillingene gi eksepsjonelle resultater. 2020-artikkelen av P. Goggin, et al gir en nyttig tabell som skisserer effekten av å endre bildeinnstillinger på endelig bildekvalitet, og er en nyttig referanse for å konsultere om optimalisering av protokollen for nytt vev blir nødvendig14. Den 100-200 nm stykke tykkelse anbefalt i denne protokollen har den ekstra fordelen av å tillate innsamling av store SBF-SEM datasett med en rask hastighet. Mens du samler bilder ved 12μs / px for eksempel, krever bildebehandling gjennom en 100 μm dybde ved 2048x2048 px ~ 14 timer mens du seksjonerer på 100nm / seksjon, men ville kreve ~ 56 timer hvis seksjonert på 25nm / seksjon. Selv om x,y-oppløsningen forblir uendret som følge av seksjonstykkelse, og ikke tar hensyn til den ekstra muligheten til å bilde ved hjelp av høyere kV-verdier og pikselbotider som følger med større seksjoner, er det viktig å merke seg at oppløsningen langs z-aksen lider. Tap av z-oppløsning er en viktig vurdering og bør vurderes når man bestemmer hvordan vev skal orienteres i harpiksblokken og i forhold til bildeplanet, og har potensial til å utelukke studiet av mindre celleegenskaper eller interaksjoner (f.eks. synaptiske invaginasjoner eller intracellulære egenskaper på skalaen av titalls nanometer). Men i tillegg til rask bildetid har denne protokollen ytterligere ekstra fordeler ved at den raskt produserer ideelle datasett for stereologisk analyse samt studiet av sjeldne biologiske hendelser eller celler. Større seksjonstykkelse kan også hjelpe i manuell 3D-rekonstruksjon, da en 100 μm-region som er seksjonert på 100 nm / seksjon, vil kreve manuell segmentering av 1000 bilder, mens samme region som er seksjonert på 25 nm / seksjon vil kreve manuell segmentering av 4000 bilder.

SBF-SEM har fordelen av å generere store datasett på relativt kort tid. Mens dataanalyse kan utføres ved hjelp av kvantitative metoder som stereologi, som vil bli diskutert nedenfor, kan det ofte være informativt å lage 3D-rekonstruksjoner via bildesegmentering. En bildestakk opprettet ved hjelp av SBF-SEM kan betraktes som en samling voxels, mens segmentering er prosessen med å tilordne disse voxels til brukerdefinerte objekter og dermed skape 3D-representasjoner av vevsstrukturer. Disse rekonstruksjonene gir ofte et hittil usett perspektiv på vevs ultrastruktur og cellecelleinteraksjon (Figur 5, Figur 6, Figur 7, Figur 8, Figur 9). Videre, når rekonstruksjoner er opprettet, er det mulig å bruke data som ligger i rekonstruksjonene for å trekke ut et vell av informasjon fra segmentert vev. Parametere som spenner fra overflateareal, volum, lengde og avstand, samt vinkeldata, er alle lett tilgjengelige når en rekonstruksjon er opprettet50,51. Selv om dette kan være utrolig nyttig, spesielt når det er parret med videoer og bilder hentet fra rekonstruerte datasett, er tiden som kreves for manuell segmentering en viktig vurdering når du prøver å ekstrapolere data fra SBF-SEM-datasett. Det er for tiden en rekke både gratis og innkjøpbare programvare tilgjengelig for manuell og semi-manuell segmentering av SBF-SEM bildestakker. Et gratis alternativ for rekonstruksjon programvare er bildebehandlingspakken Fiji for ImageJ, en åpen kildekode bildebehandlingsprogram, som inneholder en segmentering editor plugin som tillater manuell segmentering52,53. I tillegg tilbyr programvaren Reconstruct et alternativt gratis segmenteringsalternativ54 (Figur 8). Selv om det er potensielt dyrt, inneholder kjøpbare alternativer ofte mer robuste funksjonssett, for eksempel halvautomatiske segmenteringsprosesser eller film- og bildeopprettingspakker. Et slikt alternativ ble brukt til å lage rekonstruksjonene som finnes i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 9 (Detaljer tilgjengelig i materialfortegnelse). I tillegg er verktøy tilgjengelige for oppretting, analyse og gjengivelse av kontrastbaserte 3D-rekonstruksjoner ved hjelp av virtuell virkelighet med potensial til å øke hastigheten på gjenoppbyggingsprosessen20,55. Selv om det ikke alltid er tilgjengelig for alle programmer, er en rekke programvareverktøy tilgjengelige for dataassistert manuell segmentering som har potensial til å redusere tiden det tar å segmentere56,57,58. Uavhengig av programvaren som brukes, betydelig forethought og en forståelse av spørsmålet som blir besvart, eller gapet i kunnskap som skal fylles, ved seriell rekonstruksjon bør gå foran segmentering, da prosessen er arbeidskrevende og tidkrevende.

Produksjonen av 3D-rekonstruksjoner kommer med egne hensyn. Med større datasett kan behandlingskraft være en begrensende faktor, og optimalisering av bruken av systemressurser kan være avgjørende for å opprettholde en produktiv arbeidsflyt og fremskynde rekonstruksjons- og gjengivelsesprosessen. Når du gjengir en 3D-rekonstruksjon, konverterer de fleste programvare segmenterte bildestakker til en overflate som består av sammenkoblede trekanter. Hvis et rekonstruksjonsprosjekt er stort eller intrikat, kan gjengivelsen av disse trekantene kreve mye datakraft. Mens du arbeider med en 3D-rekonstruksjon, kan det være nyttig å begrense antall trekanter rekonstruksjonsprogramvaren kan bruke til å konvertere de segmenterte bildene til rekonstruerte overflater. Dette kan være nyttig for å overvåke fremdriften til en 3D-rekonstruksjon under segmenteringsprosessen. Når segmenteringen er fullført, kan trekantgrensen fjernes før bilder eller videoer av rekonstruksjoner gjengis. Alternativt, og hvis rekonstruksjonsprogramvaren tillater det, har vi funnet suksess med å overvåke fremdriften til en rekonstruksjon ved hjelp av volumgjengivelse i stedet for overflategenerering. Volumgjengivelse, selv om den ikke er like egnet for bilder eller videoer som er ment for publisering eller presentasjon, krever langt mindre prosessorkraft, og kan derfor være nyttig for å gi en jevn opplevelse når du rekonstruerer og forbereder bilder og videoer av rekonstruksjoner. I tillegg er det lurt å segmentere et SBF-SEM-datasett manuelt for å definere hvert objekt som skal rekonstrueres med sin egen unike identifikator. Hvis et felt med epitelceller for eksempel rekonstrueres, i stedet for å tilordne alle epitelceller til en voxelgruppe med tittelen "epitel", bør hver epitelcelle tildeles sin egen moniker (dvs. epi1, epi2, epi3, etc.). Dette gir større frihet når rekonstruksjonen er fullført, da hver celle enten kan inkluderes eller utelukkes fra den endelige gjengivelsen, tildeles forskjellige farger eller transparenter, eller fjernes eller introduseres individuelt hvis en video produseres. Dette gjør det også mulig å hente beregninger som overflateareal eller volum fra hvert rekonstruerte objekt i stedet for objektgruppen som helhet.

Et annet utrolig kraftig verktøy for å trekke ut kvantitative data fra SBF-SEM-bildestakker er praksisen med stereologi. Stereologi utnytter de iboende matematiske relasjonene mellom tredimensjonale objekter og deres todimensjonale representasjoner (dvs. elektronmikrografer). SBF-SEM-datasett er ideelle for bruk av stereologi, da denne metoden for å trekke ut 3D-informasjon fra store datasett er betydelig mindre tids- og arbeidskrevende sammenlignet med segmentert rekonstruksjon. Stereology består vanligvis av å bruke geometriske rutenett på tilfeldige, jevnt samplede bilder og har blitt brukt mye de siste 50 årene for å produsere nøyaktige og objektive estimater av celle / organelle nummer, lengde, overflateareal og volum21,59,60,61,62,63. Mens 3D-rekonstruksjoner kan være imponerende og gi et nytt perspektiv på biologisk vev, er det ofte raskere, mer nøyaktig, reproduserbart og bidrar til store prøvestørrelser for å bruke en stereologisk tilnærming til datautvinning. Mens det er mange artikler som diskuterer praktisk anvendelse av stereology64,65,66, gir en rekke lærebøker nyttige, dyptgående oversikter over metodikken, samt gir en rekke stereologiske rutenett som kan brukes på studiet av vev ultrastruktur67,68,69.

SBF-SEM er en kraftig bildemetode som muliggjør tredimensjonal forståelse av vev ultrastruktur. Mens evnen til å lage 3D-datasett med SEM-oppløsning setter tidligere ubesvarte spørsmål innen rekkevidde, er riktig vevsforberedelse og forståelse av SBF-SEM-avbildning avgjørende for suksessen til studier som bruker denne mikroskopimetoden. Det er vårt håp at anvendelsen av denne protokollen til fremtidige studier vil føre til større og større innsikt i de biologiske mysteriene som omgir oss, og fortsette å presse oss videre inn i grensene for menneskelig kunnskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown og Margaret Gondo for deres utmerkede tekniske assistanse. Denne forskningen ble delvis støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 og P30 EY007551 (National Eye Institute), delvis av Lion's Foundation for Sight, og delvis av NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

Biologi utgave 169 seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi SBF-SEM 3D-EM 3D-rekonstruksjon vevsforberedelse prøveforberedelse serielle seksjoner ultrastruktur høyoppløselig volumetrisk bildebehandling biologisk stort volum
Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter