Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver
Chapters
Summary March 26th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen skisserer en rutinemessig metode for bruk av seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftig 3D-bildeteknikk. Vellykket påføring av SBF-SEM hengsler på riktig fiksering og vevsfargingsteknikker, samt nøye vurdering av bildebehandlingsinnstillinger. Denne protokollen inneholder praktiske hensyn for hele denne prosessen.
Transcript
Seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi gir en enestående visning av tredimensjonale vev ultra strukturer, og kan svare på en rekke spørsmål tidligere umulig eller overmåte vanskelig å forfølge. Denne teknikken tillater rask og reproduserbar produksjon av tredimensjonale datasett med minimal vevslading og artefakter. Og viktigst av alt, det tillater automatisert fangst av tusenvis av bilder daglig.
Standard transmisjonselektronmikroskopi gir utmerket cellulær ultrastruktur. Disse bildene mangler imidlertid tredimensjonal kontekst, og kan være vanskelige å tolke. Seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskopi gir den tredimensjonale konteksten, slik at tolkningen av komplekse prosesser.
Selv om denne protokollen er pålitelig og reproduserbar, krever visse trinn presisjon og er kritisk viktige for suksessen til denne metoden. Denne videoen vil demonstrere disse kritiske trinnene i detalj. Etter å ha fikset prøver i 0,1 molar natriumkakrodylatbuffer, som inneholder 2,5% glutaraldehyd og to millimolar kalsiumklorid, bør prøver kuttes i blokker som ikke er større enn to millimeter kubert, og vaskes med 0,1 molar natriumkakroodylatbuffer som inneholder to millimolar kalsiumklorid.
Vevet blir deretter sekvensielt farget med osmium ferrocyanid, tiokarbohydrazid og osmium tetroxide. Etter osmium tetroksid inkubasjon, behandle vevet med 1% vandig uranylacetat ved fire grader Celsius over natten. Neste morgen oppløses 0,066 gram blynitrat i 10 milliliter 0,03 molar aspartinsyreoppløsning, og bruk et normalt kaliumhydroksid for å justere pH i Waltons bly aspartatløsning til 5,5.
Etter oppvarming av løsningen i ovnen, vask vevet fem ganger i tre minutter per vask i romtemperatur, dobbeltdestillert vann, før du overfører vevet til en 60 grader Celsius oppvarmet Waltons bly aspartatløsning i 30 minutter ved 60 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask vevet og dehydrer det i en stigende, iskald acetonserie, etterfulgt av en 10-minutters inkubasjon i romtemperaturaceton. Plasser deretter vevet i et 1:3-forhold mellom hardblandet harpiks i aceton i fire timer med infiltrasjon på en roterende plattform, etterfulgt av en åtte timers eller over natten infiltrasjon i et 1:1-forhold mellom harpiks og acetonoppløsning på en roterende plattform, deretter en infiltrasjon over natten i et 3: 1-forhold mellom harpiks og aceton på den roterende plattformen.
Neste morgen infiltrerer vevet i frisk 100% harpiks for en fire til åtte timer, en over natten og en fire timers infiltrasjon ved romtemperatur på en roterende plattform. Neste morgen, bruk en trepinne for å blande en liten mengde harpiks med karbonsvart pulver til harpiksen er mettet med pulveret, men er fortsatt flytende og ikke blir kornete. Boligen skal ligne tykk blekk, og kunne sakte dryppe uten synlige klumper Plasser vevsprøven i en silikongummiform, og ta et bilde for senere referanse av prøveretningen i harpiksblokken.
Når prøven er på plass, dekk vevet i karbonsvart mettet harpiks på spissen av silikonformen, med etiketten som indikerer eksperimentelle og vevsdetaljer i formen i motsatt ende av harpiksen. Plasser deretter formen i en 65 graders Celsius-ovn i en skråning i omtrent en time. Når karbonsvart infundert harpiks har tilstrekkelig herdet, fjern formen fra ovnen, og begynn med en tom brønn, fyll resten av formen med klar harpiks, pass på at etiketten forblir synlig.
Når prøven er dekket med klar harpiks, legg silikonformen tilbake i 65 grader Celsius-ovnen, ikke på en skråning, i 48 timer, og fjern deretter formen. For å klargjøre blokken for avbildning, plasser den harpiks-innebygde prøven på en mikrotom chuck med den koniske enden som stikker omtrent fem til seks millimeter ut av chucken. Lås prøven på plass med settskruen, og plasser prøven under en varmelampe.
Etter flere minutter plasserer du chucken i en stereomikroskopholder, og bruker et nytt, dobbeltkantet barberblad for å gjøre tynne seksjoner parallelle med blokkflaten til vevet er synlig, noe som vil være mindre reflekterende og granulært sammenlignet med delene av harpiksen som er blottet for vev. Fest en aluminiumsprøvepinne i festepinnen, og lag flere dype, kryssende riper i ansiktet på pinnen for å gi et større overflateareal for limet som brukes til å holde prøven på plass. Plasser prøven under en varmelampe, og skyv barberhøvelen en til to millimeter rett ned i harpiksblokken før du lager et sekund, vinkelrett kutt av lik dybde i blokken, for å trimme bort overflødig harpiks fra vevsprøven slik at blokken er omtrent tre millimeter i diameter med to til tre millimeter i høyden.
Etter denne første trimmingen, varm blokken under varmelampen igjen, og bruk et nytt, dobbeltkantet barberblad for å kutte av toppen av harpiksblokken omtrent en millimeter under den trimmede delen i et enkelt, glatt kutt. Plasser trimmepinneholderen, som inneholder den kuttede aluminiumspinnen, i stereomikroskopbeholderen, og påfør et tynt lag cyanoacrylatlim på pinneflaten slik at den helt dekker pinnen uten å danne en synlig menisk. Bruk tang til å trykke den trimmede vevsblokken på midten av prøvestiftflaten i flere sekunder, og la limet stilles inn i flere minutter.
Når limet har tørket grundig, finn vevet på den hevede delen av harpiksblokken, og bruk en dobbeltkantet barberhøvel for å trimme den hevede delen av harpiksen som inneholder vevsprøven til et område som ikke er større enn en kvadratmillimeter. Fjern sakte og forsiktig så mye overflødig harpiks som mulig, la blokken være litt lengre i en dimensjon, og bruk en endelig metallfil for å vinkle overflødig harpiks i området utenfor den hevede delen som inneholder vevsprøven ned mot kanten av pinnen. Fjern harpikspartikler og støv fra den forberedte prøven før du påfører et tynt lag med sølvmaling og gullsprut på hele prøveblokkoverflaten.
Etter belegg, trim overflødig sølvmaling fra blokkflatene, og plasser den monterte og trimmede blokken i den pæreformede enden av et skreddersydd overføringspipetterør med riktig etikett festet. Ved hjelp av SBF-SEM-avbildning er det identifisert et nettverk av elastinfrie mikrofibrilbunter i hornhinnen for voksne mus. Dette nettverket er organisert i forskjellige lag, med fibrene nært forbundet med keratocytter, selv ligger innenfor grunne invaginasjoner på keratocyttoverflaten.
Anvendelsen av denne protokollen har ført til oppdagelsen av en tidligere ukjent populasjon av sentrale hornhinnener som smelter sammen med basale epitelceller ved den stromale epitelgrensen. SBF-SEM-avbildning av den sentrale hornhinnen avslører tilstedeværelsen av limbal vaskulatur, nervebunter og tilhørende celler som kan segmenteres manuelt for 3D-rekonstruksjon. Noen fallgruver i denne bildebehandlingsprosedyren inkluderer bruk av en for lang pikselboetid, noe som kan føre til at etterfølgende bilder blir bølget og forvrengt, små utslipp av elektroner fra blokkflaten, noe som fører til raske kontrastendringer i linjer, kniv riper på blokkflaten på grunn av en skadet kniv eller ruskakkumulering på kanten av kniven. , artefakter fra en utvidet elektronstråle fokuserer på blokkflaten mens prøven fortsatt er i bildekammeret, feil vevsfiksering, noe som fører til separasjon av cellulære strukturer og bindevev, og bildehopping som følge av en stor mengde lading i vevs- eller harpiksblokken.
Når du kutter vevsblokken, er det viktig å ha en god forståelse av hvor vevet ligger i blokken, For ikke å ved et uhell trimme bort viktige prøveregioner. Hvis det ønskes bilder med høyere oppløsning av spesifikke cellulære strukturer eller interaksjoner, kan bildet stoppes, blokken fjernes fra mikroskopet, og seksjoner kuttes på en ultramikrotomi der de kan ses i et transmisjonselektronmikroskop Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi gir et helt unikt syn på biologisk vev. Ved hjelp av denne protokollen har vi raskt vært i stand til å skaffe kvalitetsdatasett, og for å utvide spekteret av vev vi kan utforske.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
