Summary
これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。
Abstract
最近のがん研究の進歩は、がん転移の非常に複雑な性質を示しています。複数の遺伝子または遺伝子ネットワークは、癌の種類、組織、および個々の患者の特性に依存する癌転移カスケード遺伝子および遺伝子産物を差し見なして調節することに関与していることが分かってきた。これらは、遺伝的治療と個別化された医療アプローチのための潜在的に重要なターゲットを表しています。これらの遺伝的標的の同定には、迅速なスクリーニングプラットフォームの開発が不可欠である。
ひよこ絨毛管内膜(CAM)は、発達中の胚のガス交換を可能にする卵殻の下に位置する高血管化されたコラーゲンリッチ膜である。CAMの位置と血管化により、コラーゲン豊富なマトリックスと血管系との癌細胞相互作用の堅牢なヒト癌細胞異種移植およびリアルタイムイメージングを可能にする生体内ヒト癌転移モデルとして開発しました。
このモデルを用いて、癌転移の新しいドライバーまたはサプレッサーの同定のために定量的スクリーニングプラットフォームを設計した。我々は、完全なヒトゲノムshRNA遺伝子ライブラリーを有する頭頸部HEp3癌細胞のプールをトランスニューシーにし、その後、低密度で細胞をCAM血管系に注入した。細胞は増殖し、単一腫瘍細胞コロニーを形成した。CAM組織に侵入できなかった個々のコロニーは、コンパクトコロニー表現型として見え、細胞内に存在するトランスデューシングshRNAの同定のために切除された。個々のコロニーの画像は、その侵襲性について評価された。誤検出の割合を減らすには、複数の選択を行いました。目的の遺伝子を発現する個々の、単離された癌細胞クローンまたは新たに設計されたクローンは、原発性腫瘍形成アッセイまたは癌細胞血管系共同選択肢分析を行った。要約すると、我々は、イベントの動的かつ複雑なカスケードの非転移性標的同定およびインビタル分析を可能にする迅速なスクリーニングプラットフォームを提示する。
Introduction
転移は、癌患者死亡の主な原因である1、2、3。転移性癌細胞は、転移性カスケードの5つのステップを通して、癌の種類に依存する明確なシグナル伝達経路を利用する:局所浸潤、内空内、循環中の生存、外発性、および遠くの転移部位におけるコロニー拡張。この転移過程の現在の理解は、2つのボトルネックステップがあり、1つは原発性腫瘍からの癌細胞の指向性浸潤であり、第2は遠隔部位転移病変4、5、6の確立であることを示唆している。どちらのステップも、初期浸潤または遠隔転移性病変形成部位において、癌細胞がコラーゲンおよび脈管構造と積極的に相互作用することを要求する。したがって、転移性癌細胞は、細胞に付着し、コラーゲン線維を改造し、血管壁7に沿って方向に侵入することができる必要がある。がん細胞がこれらのステップを完了するのを阻止するために、転移防止治療標的を迅速に同定できるスクリーニングモデルが最も重要である。既存のin vitroスクリーニングモデルは、複雑な生きた組織環境を完全に模倣していません。マウス モデルはコストがかかり、時間がかかります。そのため、複雑な生体組織環境と標的の迅速な同定を提供する生体内スクリーニングプラットフォームが急務です。
過去10年の間に、鶏の胚は、ヒト癌転移8、9、10、11、12の堅牢で費用対効果の高いモデルとして確立された。このチック絨毛膜(CAM)組織は薄く半透明であり、原発性腫瘍および/または転移部位における細胞およびコロニー行動の生体内顕微鏡イメージングに理想的である。複数のヒト癌細胞株からの原発性腫瘍増殖は、CAM組織へのマイクロインジェクション後わずか数日のスパン内で開始および転移することができる。癌細胞は、静脈内、CAM内、またはコラーゲンオンプラントを含むいくつかの方法でCAM組織に投与することができ、この柔軟性は、研究者が癌進行の特定の段階、例えば転移性病変形成、原発性腫瘍または血管新生の侵入に焦点を当てることを可能にする。
ここでは、がん細胞が侵襲的転移性病変を確立する能力を測定するために使用できる定量的スクリーニングプラットフォームについて説明する。発現ライブラリーを用いて導入された癌細胞は、低密度でCAM血管系に静脈内に静脈内注入される。転移性コロニーは4〜5日間形成され、その後、得られたコロニーの浸潤能力と脈管系相互作用が評価される。侵入に失敗した個々のコロニーは、コロニーのコンパクトさと癌細胞血管接触の再注入および定量化によってCAMにおいて切除され、伝播され、その表現型が確認される。単一転移性コロニー変異型を担う発現ライブラリー構築物は、高スループットシーケンシングを介して単離コロニーゲノムDNAから同定される。同じプラットフォームは、遺伝子と観察された表現型との因果関係を検証したり、観察された表現型に関する詳細な機械学的研究を行うためにさらに使用され得る。
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Protocol
すべての実験は、アルバータ大学の制度的動物管理および使用委員会の規制とガイドラインに従って行われました。鳥類の胚は、多くの研究機関によって生きている動物であるとは考えられておらず、動物のプロトコルは必要ありません。しかし、鳥の胚は痛みを感じることができるので、可能な限り人道的に扱われなければならないというのは受け入れられた見解です。地元の動物研究当局は、適切な規制に従うことを確実にするために、研究作業を事前に取り出す必要があります。
1. 殻を使う卵培養
- 地元のプロバイダーから受精鶏卵を取得します。この実験はホワイトレグホーン鶏の品種を使用しています。しかし、他の品種も同様に使用することができます。
注:一部の胚が割れ目の間に損傷し、このプロトコルで使用できない場合は、必要以上に10%多くの卵を獲得することをお勧めします。 - 必要な数の卵を60%加湿したロッキングインキュベーターに移します。残りの卵は、生存率を失うことなく12°Cで最大2週間保存することができます。
- 加湿したロッキングインキュベーターで卵を4日間インキュベートします。
注:1日目は卵がロッキングインキュベーターに移される時です。 - 殻のない卵培養のために計量皿とプラスチック製の蓋を準備します。胚への効率的な空気アクセスを可能にするために、計量皿の各コーナーの1つをカットする(図1A)。
- フローフードの列に準備された計量料理を配置します。(図1B)。
- 別の計量皿では、卵のすす用70%エタノールを調製する。
- 卵を70%エタノールに簡単に浸し、電動ロータリーツールを使用して、卵の最大の緯度直径に平行に4つの2〜3mmカットを慎重に行います(図1C)。
- カットした卵を計量皿に移し、卵殻に亀裂が入るまで卵を皿底にそっと押し付けます(図1D)。
- 卵殻を半分引き離し、胚を計量皿に滑り込ませる。卵殻を捨て、計量皿を蓋で覆います。
- 胚を加湿非ロッキングインキュベーターに移す(図1E)。
注:胚を含む計量皿は、別々のプラスチック容器(12個の胚/容器)に入れられます。これは胚の生存率を増加させ、実験特異的な胚組織を可能にする。 - 胚をさらに6日間インキュベートする(生後10日まで)。死んだまたは汚染された胚を毎日チェックし、インキュベーターから取り除きます。
注意:胚は空中カビ胞子によって汚染される可能性があります。カビ汚染は、最初は胚CAM表面に白い斑点として現れる。汚染された胚をすぐに取り除き、汚染を防ぐために週単位で70%エタノールでインキュベーターを拭きます。私たちの経験では、汚染レベルは非常に低い〜1〜3%です。 - 10日目の朝に癌細胞注射のためにこれらの胚を使用する。
2. がん細胞の注射のための準備
注:転移性コロニー選択は、蛍光癌細胞によって確立された表現型に基づいており、緑色または赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質でタグ付けされた発現ライブラリまたはベクターに由来する( 図2Aの画面全体の流れを参照)。一過性蛍光タンパク質にトランスフェクトされた細胞や、がん細胞の増殖や不均一な染色によって生じるシグナルの急速な退色により、細胞透過性蛍光色素で標識された細胞を使用することは推奨されません。
- 培養癌細胞は注射時に60〜70%の合流度に。より高いレベルの合流性で癌細胞を使用すると、その生存率が低下し、転移性コロニー形成の効率が低くなります。マイコプラズマ汚染は鶏の胚の生存率の低下につながる可能性があるため、使用される癌細胞がマイコプラズマフリーであることを確認してください。
- 1x PBS pH 7.4で細胞を2回リンスする。残りのPBSを取り出し、0.5%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで2〜5分間培養し、すべての細胞が培養皿表面から持ち上げられるまでインキュベートします。
- 細胞懸濁液を室温で15 mL円錐形チューブおよび遠心分離機細胞に200 x g で5分間移動します。
- ステップ2.3のように再び細胞を遠心分離してPBSの10mLの細胞を再懸濁し、トリプシンおよび抗生物質などの他の培養培地成分を除去する。
注:がん細胞懸濁液中のトリプシンまたは細胞培養成分(抗生物質など)の存在は、鶏の胚の生存率を低下させる可能性があります。 - 慎重に上清を吸引し、氷冷PBSの1 mLで細胞を再懸濁します。
- ヘモサイトメーターまたは利用可能な他のセル計数装置を使用して細胞の数をカウントします。
注: このスクリーニングプロトコルでは、各転移性コロニーが単一のセルによって開始される必要があります。セルを数えるときは、細胞が完全にトリプシン化され、単一の細胞懸濁液として存在することを確認します(細胞の塊は存在しません)。 - 静脈内(IV)注射用濃縮細胞を0.5 x 10 6〜1.0 x 106細胞/mLに濃縮する。氷冷1x PBSを使用して、細胞濃縮物を希釈または再懸濁します。10個の胚ごとに約1mLの細胞懸濁液が必要になることを期待してください。
注:懸濁液中の必要な細胞懸濁液濃度は、主に実験者の経験のレベルによって決定されます。詳細については、次のセクションをご覧ください。
3. 転移性コロニー形成のための癌細胞の静脈内注射
注:このプロトコルに従って、100個もの胚を1日以内に注入することができます。転移性コロニーを単離するのに長い時間がかかる(ステップ5)がん細胞を注入し、したがって、初期実験を行って、すべてのステップを完了するのに必要な時間を推定することが推奨される。微分癌細胞蛍光標識を使用すると、動物の数と各実験に必要な時間を減らすことができます。例えば、コントロール細胞はRFP(赤蛍光タンパク質)で標識することができ、変異型腫瘍細胞はGFP(緑色蛍光タンパク質)で代替標識することができる。この場合、各実験には、胚間変動を補正する組み込みのコントロールがあります。
- 図2Bに示すように射出装置を組み立てる。まず注射器に針を取り付け、長さ3~5cmのチューブで注射針を伸ばします。
- 細かい鉗子(20-60 μL幅)を使用して、ホウケイ酸針の先端を切断します。
- 注射器に癌細胞懸濁液(50-200 μL)を入れ、ホウケイ酸針をチューブに挿入する(図2B)。
- ホウケイ酸針の細胞詰まりや気泡を点検します。各転移性コロニーが単一の細胞によって開始されるように、細胞を単一の細胞懸濁液として注入することが重要です。
注:がん細胞は、トリプシン化後1〜2時間以内にPBSで凝集する傾向があり、したがって、注射の直前に準備する必要があります。必要に応じて、細胞は、注射に使用される1mLシリンジ(ホウケイ酸針なし)を使用して定期的に再懸濁することができる。 - 毛細血管内で細胞の詰まりが観察された場合は、毛細血管を取り除き、細胞を再中断し、新しい毛細血管に置き換えます。任意の気泡を押し出すためにプランジャーを使用してください。細胞の詰まりや気泡が観察されない場合は、次のステップに進みます。
- カバー蓋を外し、ステレオスコープの下で胚を移します。CAM表面に注入される適切な静脈を特定する。静脈と動脈は、CAM組織内の複雑なネットワークを形成する(図2C)。静脈は、酸素豊富な血液を胚に運ぶため、明るい赤色によって区別される。
注:一般的な胚操作、癌細胞注射および転移性コロニー切除については、0.8xおよび1.5xの目標および視覚化のための10xの接眼器が装備されている蛍光のステレオ顕微鏡を使用する。あまり高度でない顕微鏡はまたユーザーの経験のレベルに応じて、これらのプロシージャのために正常に使用することができる。読者は、より詳細な推奨事項については、作成者に連絡することができます。 - 通常はホウケイ酸針先端の直径よりもわずかに広い(10-20%)、胚と計量皿の壁の中間に位置する細胞を注入するのに理想的な静脈を見つける。一般的に静脈分岐に隣接する点で注入する方が簡単です。
注:大きな静脈への注射は、より簡単に見えるかもしれませんが、過度の出血と減少した胚の生存率につながります。 - 針の先端を血管壁に押し付け、血流と同じ方向に穏やかな圧力をかける。必要に応じて、綿棒(他の手で保持)を使用して、注入される容器を固定または安定させます。
- 注射器プランジャーを軽く押し落とします。癌細胞懸濁液が血流に入ったときの血管の「クリアリング」を観察することによって、成功した注射を視覚化することができます。
- 必要な懸濁液量が静脈の血流に注入されるまで、2〜10 sの注射器プランジャーを押し続ける。一緒に単一の胚の注入は、ユーザーの経験レベルに応じて1〜10分を必要とするかもしれません。注射部位に過剰な出血や透明な液体の蓄積が現れた場合は、胚を捨てる。
注:胚を「過剰注入」するのは簡単です。留意すべき一般的な考慮事項は、転移性コロニーが4〜5日後に互いに接触してはならないということです。理想的には、末端CAM静脈毛細血管の5〜10%は、注射に成功した後に細胞を固定する必要があります(図2D、E)。ステップ2で述べたように、細胞濃度の範囲(0.5 x 10 6-1.0 x 106細胞/mL)を使用することができる。低濃度は、より長い注射時間を必要としますが、針の詰まりを減少させます.高濃度は、より短い注射時間を必要としますが、針の詰まりを増加させます.オペレータにとって最も快適なものを見つけるためにいくつかの濃度を試してみることをお勧めします。一般的に、より高濃度(1.0 x 106細胞/mL)は、注入時間を減少させることが好ましい。 - CAMから針を取り出し、綿棒で注射部位をそっと手を出して血液細胞または過剰な癌細胞を除去します。
- 計量皿の胚を蓋で覆い、注入された鶏の胚をインキュベーターに戻します。
- すべての胚が注入されるまで、次の胚で手順を繰り返します。
転移性コロニー成長時の胚維持
- 胚を視覚的に検査する。死んだものがある場合、または細菌やカビで汚染されている場合は、インキュベーターからそれらを取り除き、オートクレーブし、実験室の処分手順に従ってそれらを廃棄します。
注:胚は、転移性コロニー増殖のために1日おき(1日目、3日目、5日目の癌細胞注射後)検査することをお勧めします。注入された胚は、胚の損傷および/または死を引き起こす可能性があるため、不必要に移動しないでください。 - 細胞が過剰増殖(転移性コロニーが互いに重なり合う)またはCAM組織内の不均一な分布(CAM表面の小さなサブ領域に位置する転移性コロニー)を示す場合、その胚を実験から取り除く。実験から除去した直後に-20°C(または別の承認された方法)で凍結することによって廃棄した胚を安楽死させる。CAM組織内の生存可能な転移細胞の数は、最初(1〜2日目)減少し、次に増加します(日2〜5)。
注:いくつかの胚は、癌細胞を「拒絶」する可能性があります、すなわち、すべての癌細胞はCAM組織から消失する。これらの胚は実験から取り除くべきである。通常、がん細胞コロニーは、重量を量る皿を開かなくても蛍光ステレオ顕微鏡下で透明な蓋を通して見ることができる。 - 転移性コロニーの形状が均一に見えるようにします(注射後最初の1〜3日)。注射後4~5日目に侵襲性または非侵襲的な転移性コロニーを特定する(詳細はセクション5を参照)。
5. 転移性コロニーの分離
- 5日目の注射後にインキュベーターから胚を取り除き、胚のキャムに転移性コロニー分布がないか検査する。コンパクトな(または過度に侵襲的な)コロニーが存在する均一なコロニー分布を有する胚を同定する。
注:鶏の胚を培養するプロセスは無菌ではないので、すべてのスクリーニングステップは、将来の組織培養汚染を避けるために非常にクリーンな条件下で行われなければなりません。汚染は非常にまれであり、手袋とマスクを着用し、細胞注入およびコロニー分離手順の間にのみ無菌工具を使用することによって容易に回避することができる。周囲の実験室の温度への暴露を減らすと、汚染を防ぐために、胚を一つずつ検査することをお勧めします。 - 関心のある転移性コロニーを見つけます。コンパクトコロニーは、CAM組織内の限られた領域内に位置する癌細胞の大部分を有する1つとして記述することができる(細胞は「一緒に束ねた」ように見える)。侵襲性コロニーは、CAM組織に癌細胞が「散乱」するコロニーと言える(図3A、B)。
注:転移性コロニーの「コンパクト性」は、癌細胞浸潤の阻害、癌細胞増殖の阻害、またはその両方のいずれかによって説明することができる。すべてのシナリオに注意を払う必要があり、接触コロニーを分離する必要があります (図3A,B)。単純な蛍光体顕微鏡を使用して、コンパクトな、侵襲的な転移性コロニーの形型を区別することができます。 - 解剖顕微鏡の下で、対象の転移性コロニーを含むCAM組織を細かい鉗子を用いて上方に優しく引っ張る(図3C)。
- 手術用はさみを使用して、転移性コロニーを含むCAM組織を切断します。
- 転移性コロニーを含むCAM組織を空の無菌1.5mLチューブ(氷上)に移し、チューブ蓋を閉じます。
注:孤立したコロニーは、生存率を失うことなく、最大3時間氷上に保つことができます。 - 目的のすべてのコロニーが別々のチューブに収集されるまで切除手順を繰り返します。動物の苦しみを避けるために、1つの胚から2〜3コロニー以上を切除しないでください。コロニー切除直後に-20°C(または別の承認された方法)で凍結することによって胚を安楽死させる。
- 滅菌18ゲージ針を使用して、マイクロ遠心分離管内のCAM組織を穏やかにミンチします。コロニーごとに別々の針を使用してください。
- 1xコラゲターゼ溶液100μLを加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 周囲温度で5分間、細胞とCAM組織を300 x g でスピンダウンします。
- コラゲナーゼ溶液を吸引し、細胞の目的のラインに使用される完全な培地で細胞を再懸濁する。
注:通常、CAM組織はコラゲターゼ治療後に完全に解約されず、癌細胞は最初にCAM組織の断片内で増殖し、後で組織培養皿に移行するだけです。 - 周囲温度で5分間、細胞とCAM組織を300 x g で再び回転させます。
- 完全な培地と選択因子(もしも)の1mLの細胞およびCAM組織片を再懸濁し、その後、単一の12ウェル組織培養皿によく移す。
注:鶏CAM線維芽細胞は、クローン拡張を阻害する複数の通路のための組織培養中に持続する可能性があります。選択因子の存在下で転移性コロニーを拡大する能力(すなわち、癌細胞を蛍光性にレンダリングするために使用されたベクターが哺乳動物の抗生物質耐性遺伝子もコードする場合)は、クローン拡張を大幅にスピードアップし得る。抗生物質の適切な濃度が使用されていることを確認するために、スクリーニングの前に殺し曲線実験を行う必要があります。 - 次の1〜3週間は、癌細胞の増殖と汚染を毎日監視します。
- 細胞が合流率の70〜80%に達すると、より大きな体積培養皿に細胞を移す。
注:各クローンの少なくとも2つの極低温バイアルが凍結されるまで細胞を拡張することをお勧めします。大量の組織培養を維持することは、面倒で不必要な場合があります。 - 十分な癌細胞数に達するとすぐにシーケンシングまたは次の選択ラウンドに進みます。一般的に、1 x 106 の癌細胞は現代のハイスループットシーケンシング技術に十分である。
- クローン再注射に進み、コロニーの細胞血管接触の細胞コンパクト性または癌のイメージングおよび定量化に進む(図2A)。または、高スループットシーケンシングに進むか、コロニー選択を繰り返します。
注: 誤検知の数を減らすには、少なくとも 2 回の選択を行うことをお勧めします。2つのアプローチがうまく採用されました。1)各クローンを拡大し、コロニー表現型を確認するために個別に再注入する。2) 各 1:1 の比率ですべての展開されたクローンを混合し、混合物として再注入し、選択サイクルを繰り返します。
6. CAM血管系への蛍光タグ付きレクチンの注入。
- 注入する静脈を特定します。腫瘍細胞注射に使用したレクチンに対して同じ注射部位を使用する方が簡単です。
- 希蛍光レクチンストック溶液(5mg/mL)50-100x 1x PBSで、癌細胞注射に使用されるのと同じ注射装置にロードします。
注:血管の可視化のために注入する必要があるレクチンの量(通常は20-100 μL)は顕微鏡の感度に依存し、スクリーニング前に実験的に決定する必要があります。 - 腫瘍細胞注射と同じ技術を用いてレクチンを注入する(ステップ3.6.-3.10.参照)。
- レクチン注射後、胚をインキュベーターに入れて5分間回復する。胚をイメージングする直前に、一度に1つの胚のみを注入する。
手記。12日以上の胚は、一般的にレクチン注射からよく回復し、次の日に再びレクチンを再注入してシーケンシャルイメージングを行うことができます。若い胚はより敏感であり、血液凝固を示す可能性がある。
7. がん細胞血管接点の可視化
- 温度調節された顕微鏡のエンクロージャをイメージ投射の前におよそ6時間の37 °Cに設定しなさい。これにより、顕微鏡の温度が安定し、イメージング中のXYZドリフトを最小限に抑えることができます。
手記。この実験には、特殊な鶏胚イメージングチャンバ9、10、11、12、13を使用した。簡単な蛍光解剖顕微鏡は癌細胞の注入からクローン選択およびクローン再注入に始まるすべてのステップ、およびコロニーのコンパクトさの評価に使用することができる。細胞血管接点のイメージングと定量には、画像化チャンバーを備えた共焦点顕微鏡が必要です。最大1時間の加熱は必要なく、一般的に胚は生存する生存率に影響を与えなく、少なくとも2つの逐次イメージングセッションを生き残る。 - 必要な対物レンズ(20xまたは25倍の水浸し対物レンズが推奨)が設置されていることを確認します。
- 撮像チャンバーの蓋の下側に真空グリースの薄い層を適用して、カバースリップで安全なシールを作成します。
- 蓋を蓋にそっと置き、余分な真空グリースを拭き取ります。
- レクチン注入胚をインキュベーターから取り出し、必要に応じて計量皿のリムを切ります。
- 目的の転移コロニーが位置するCAMの領域に直接下げたカバースリップを持つイメージングチャンバーに胚を配置します。カバースリップがCAMに接触するまで、蓋をゆっくりと胚に下げます。ネジを締めて蓋を固定し、蓋が平準化され、カバースリップがCAMに下向きの圧力をかけないことを確認します。
- いくつかの(5-10)胚から対照群および実験群(10-20)から複数のランダムコロニーの画像を取得する。
手記。各フィールドからランダムな3Dスタック(1-5um Zステップ、50-100um範囲、25倍)を取得することをお勧めします。 - 可能であれば、顕微鏡取得ソフトウェアでフィールドステッチオプションを使用します。定量化に使用される画像は公開品質ではないため、可能であれば共振スキャンなどの高速取得モードを使用します。25xの目的および3 x 3のステッチを使用して5-10 μm Zステップ、100 μmの総範囲。1つの条件で少なくとも100個の細胞(〜20コロニー)を画像化する。
8. がん細胞の血管接点の定量化
- 必要なソフトウェアを使用して、3DファイルをZスタックとして開きます。
手記。がん細胞血管接触を定量化するためには、高解像度画像の取得と分析に特化したソフトウェアを使用する必要があります。3D 画像解析が可能なソフトウェア パッケージがいくつか用意されています。詳細は 資料表 をご覧ください。 - イメージの取得中に XY の動きが大きくなった場合は、ImageJ StackReg プラグイン (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg) を使用して Z スタックを位置合わせします。
- 目的のセルを見つけます。
- Xyz画像をZ方向にスクロールし、対象の細胞に対する癌細胞血管接触の最大長を含む光学セクションを特定する(図2E)。
- 「手動長さ測定機能」を用いて、がん細胞血管接触を測定します。
- 統計分析に使用するデータ・ソフトウェア・パッケージに測定値を入力します。
注意:がん細胞が血管に付着する能力は、癌細胞血管接触の長さ、または特定の癌細胞クローン(またはその両方)の血管構造に接触する細胞の割合として測定することができる。 - 次のセルに進みます。
- データを分析して、変異クローンと制御データセットを比較する統計的有意性を調べられます。
9. コロニーのコンパクト定量
- 手順 2 と同じ手法を使用して、展開されたクローンからセルを再注入します。
- 注射後5日間は、クローンごとに10〜50個のランダムな転移コロニーの画像を取得する。
注: 転移性コロニーのコンパクト化の定量化には、高品質の画像は必要ありません。単色、ステレオ顕微鏡(10倍倍)画像で十分です。画像の明るさ(コロニー内の細胞の大部分が見られるべきである)とコントラスト(1つまたは2つの細胞間の差)に注意を払う必要があります。 - コロニー画像をデジタル分離し(図2C、Dを参照)、スタンドアロンコロニーコンパクト化定量モジュールまたはブラインドスコアリング13を用いてコロニーのコンパクト化定量化に進む。
- 関心のある次のコロニーに進みます。
- 変異クローン(複数可)と制御(すなわちスクランブルshRNA)データセットを比較する統計的有意性についてデータを分析します。
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Representative Results
癌細胞注射は、毛細血管に宿っている細胞の大部分が単一であり、互いに有意な差(〜0.05〜0.1cm)に位置する場合に成功すると考えられるので、5〜6日間の潜伏期間の後にコロニーが重複しない(図3A)。癌細胞の蓄積が毛細血管のほとんどで見ることができるならば、注射は成功しなかった、これを示す胚は廃棄されるべきである(図2E)。かなりの数の注射された癌細胞は、注射の24時間以内に死に、いくつかの胚はすべての癌細胞を拒絶するように見える。がん細胞の生存率は、現地の卵供給業者によって異なります(すなわち、注入される細胞の量は異なる場合があります)、実験を進める前に最適な注射条件(がん細胞濃度対注入期間)を決定することを強くお勧めします。細胞濃度は、0.5 x 10 6~1.0 x 106細胞/mの範囲で推奨します。最適な細胞濃度と注射期間が達成されると、5日目の注射後の導入細胞は、CAM組織に散乱して現れる癌細胞によって決定されるように侵襲的に現れるコロニーの大部分を有する多種多様なコロニー表現型を産生すべきである(図3A)。注意は「コンパクト」に見え、CAM組織の一片で鉗子とはさみを切除することができるので、隣接するコロニーから十分に離れた位置にある転移性コロニーに支払われるべきである(図3C)。分離された陽性スクリーンヒット(すなわち、コンパクトコロニー)は、再注入時にコンパクトコロニー表現型を表示すべきである(図3B)。細胞生存率の低下(またはコロニー内の細胞増殖率)も同様に観察され得る。したがって、十分なコロニー数を得るために、正の画面ヒットの一部に対して、より高い細胞数を注入する必要がある可能性があります。癌細胞血管接触の測定のために注意は、血管壁の汚れ明るさ(蛍光レクチン;図3D、E)とレクチンの適切な量は、明るさ/コントラストの血管壁信号に注入する必要があります。顕微鏡-ソフトウェアのキャリブレーションが行われた後、定量化のステップで使用可能な任意の画像解析ソフトウェアを使用できます。
図1:鶏胚殻のない培養の概要(A)貝殻のない培養用に用意された蓋付きの計量皿。矢印はカットコーナーを指します。(B)フローフードに並べた計量料理。(C)電動ロータリーツールで卵殻を切る。(D) 卵を計量皿に割る。(E) 加湿インキュベーターで培養した胚。スケール バー =1 cm (A-D) または 5 cm (E) です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:がん細胞の注入と転移性コロニーの分離の概要(A)鶏胚スクリーニングプラットフォームのステップを概説するフローチャート。(B)立体蛍光顕微鏡ステージにがん細胞注射を設置。(C) CAM血管系への癌細胞の注入。(D)癌細胞注射の成功を示す画像(許容可能ながん細胞密度)を、注射直後に採取した。(E)癌細胞注射不良を示す画像は、過剰注入胚と見なされる。注意がん細胞は、毛細血管(白い矢印)に蓄積します。スケールバー= 1 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.スクリーニングプロトコルの異なるステップの代表結果。(A)異種(ライブラリー導入癌細胞株HEp3細胞)によって形成される転移性コロニー、注射後5日。赤い矢印は、切除されるべきコンパクトコロニー(潜在的な陽性ヒット)を示しています。(B)再注入後5日後に、単離されたスクリーンヒット(KIF3B)の1つによって形成された転移性コロニー。インセットは、破線の正方形から転移性コロニー画像をデジタルで切り取った。これは、C.I の定量に適した画質です。ヒット再注入の平均C.I.値(KIF3B)を示す。(C) CAM組織からの関心の転移性コロニーの単離。対照コロニーである(D)の代表的な光学切片、および(E)コロニーを過剰発現するKIF3B shRNAと、いずれも癌細胞血管接触測定を示す。CAM血管系は蛍光レクチン-649で標識されています。スケールバー =1 cm(A-C)または50 μm(D,E)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、遺伝または薬剤候補スクリーンなどの重要なアプリケーションに利用できる迅速な蛍光顕微鏡ベースの生体内スクリーニングプロトコルについて説明する。目的の遺伝的ライブラリーを用いて形質転換された癌細胞、または個々の発現構築物にトランスフェクトされた癌細胞は、このひよこCAMモデルを用いて目的の表現型に関して迅速にスクリーニングおよび定量することができる。変換プロトコルまたはトランスフェクションプロトコルはライブラリタイプによって大きく異なるため、この手順には含まれていません。表現型の関連する転移性コロニーは、CAMから切除され、拡張され、DNAが分離され、高スループットシーケンシングが目的の発現構築を同定する。一般に、各遺伝子ライブラリーにはプライマー配列とゲノムDNA精製の推奨方法が装備されています。最高の高スループットシーケンス結果を得るには、ローカル施設ガイドラインを使用することをお勧めします。
スクリーニング前に、ライブラリーおよび細胞株の感染の最適な多重度(M.O.I.)を決定することをお勧めします。理想的には、各細胞(したがって将来の転移性コロニー)は、必ずしも達成可能ではない我々の経験では、1つの遺伝子発現構造のみを含むべきである。ライブラリの製造元のプロトコルに従い、可能な限り 1 近く達成するために、幅広い M.O.I. (0.01-5) をテストすることをお勧めします。各転移性コロニー内に複数のライブラリ発現構築物が存在すると、コロニー表現型解析が著しく複雑になる可能性がある。また、ライブラリメーカーが提供する陰性制御を実験(すなわち蛍光タグ付けされたスクランブルshRNA発現ベクター)を使用することをお勧めします。
当社のスクリーニングプロトコルは、非侵襲的蛍光コロニーの選択に基づいています。実験で使用されるすべての細胞株が同様の蛍光強度を有することを保証することが重要である。細胞間の不均一な蛍光強度(および転移性コロニー)は、浸潤の代わりに細胞またはコロニーの明るさによる偏ったコロニー選択をもたらす可能性がある。
既存の方法と比較して、我々のプロトコルは、高度な画像化装置12、13、14を必要とせずに、このような速度、低コストおよび能力が、生体内の画面サイクルを完了する能力を提供する。さらに、スクリーニングサイクル全体を、細胞注入からシーケンシング段階まで3~6週間で完了させることができる。これらのステップは、ほとんどの研究者が利用できる基本的な蛍光ステレオ顕微鏡を使用して行うことができるので、癌細胞注射または転移性コロニー分離には高解像度顕微鏡は必要ありません。最後に、シェルレス胚培養は完全に自立しているため、複雑な研究動物住宅や摂食スケジュールは必要ありません。ほとんどの研究機関は、鶏の胚を生きた動物とは考えておらず、このモデルに関連するコストと文書化の負担を大幅に軽減します。
しかし、シェルレス胚モデルに関連するいくつかの制限があります。第一に、このモデルではすべてのがん細胞株が効率的に働くわけではありません。私たちの研究室では、HT1080(ヒト線維肉腫)、HEp3(頭頸部)、マウスb16黒色腫、4T1乳がん細胞株など、鶏CAM血管系に注入すると転移性コロニーを堅牢に形成するいくつかの癌細胞株を日常的に使用しています。乳癌(MDA468)、脳(U87およびU118)または卵巣(A2780s)のような異なる癌タイプを有する他の細胞株は、CAMに注入されると容易に転移性コロニーを形成し、したがって、このスクリーニングプロトコルにも12、14、15を用いることができる。しかし、私たちの経験では、LnCaPやPC3などの一般的に使用される癌細胞株は、このモデル(未発表の観察)ではうまく機能しません。もう一つの制限は、100〜200μmの画像化範囲を有する共焦点顕微鏡が、癌細胞血管接点の可視化のような高解像度イメージングに必要であり、この装置は多くの研究者にとって利用できないかもしれない。
全体として、このプロトコルは、癌転移抑制剤およびドライバーの発見に使用することができる迅速な生体内スクリーニングプラットフォームを記述する。このモデルの堅牢性と使いやすさが、多くの研究者にとって不可欠なスクリーニングモデルになると強く信じています。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、JDLとKSに#702849カナダ癌学会研究所グラントによって支援されました。ルイス博士は、アルバータがん財団が支援する前立腺癌研究のフランクとカーラ・ソジョンキー・チェアを務めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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