Summary
这是一种有效的方法来筛选抑制剂或癌症转移的驱动因素。细胞，用表达库转导，被注射到鸡胆碱膜血管，形成转移菌落。已降低或增加侵入性的菌落被切除、扩大、重新注入以确认其表型，最后使用高吞吐量测序进行分析。
Abstract
癌症研究的最新进展说明了癌症转移的高度复杂性。发现多个基因或基因网络参与不同程度地调节癌症转移级联基因和基因产物，取决于癌症类型、组织和单个患者特征。这些是基因治疗和个性化医学方法的潜在重要目标。开发快速筛选平台对于确定这些遗传目标至关重要。
小鸡胆碱膜（CAM）是一种高度血管化、富含胶原蛋白的膜，位于蛋壳下，允许在发育中的胚胎中进行气体交换。由于CAM的位置和血管化，我们开发它作为一个活体人类癌症转移模型，允许强大的人类癌细胞异种化和实时成像癌细胞与胶原蛋白丰富的基质和血管的相互作用。
利用这种模型，设计了一个定量筛查平台，用于识别癌症转移的新驱动因素或抑制剂。我们用完整的人类基因组shRNA基因库转导了一池头部和颈部HEp3癌细胞，然后以低密度将细胞注入CAM血管。细胞增殖并形成单肿瘤细胞群落。无法侵入CAM组织的个体菌落被视为紧凑的菌落表型，并被切除，以识别细胞中存在的转导shRNA。对个别殖民地的入侵性进行了评估。进行了多轮选择，以降低误报率。个体、分离的癌细胞克隆或表达感兴趣基因的新设计的克隆受到原发性肿瘤形成检测或癌细胞血管共选分析。总之，我们提出了一个快速筛选平台，允许对动态和复杂的事件级联进行反转移目标识别和活性分析。
Introduction
转移是癌症患者死亡的主要原因1，2，3。转移性癌细胞利用不同的信号通路，取决于癌症的类型，在整个转移级联的五个步骤：局部入侵，内化，在循环中生存，奢侈和殖民地扩张在遥远的转移点。目前对这一转移过程的理解表明，有两个瓶颈步骤，一个是原发性肿瘤对癌细胞的定向侵入，二是建立远地点转移病变4、5、6。这两个步骤都需要癌细胞在初始入侵或遥远转移性病变形成的部位与胶原蛋白和血管积极相互作用。因此，转移性癌细胞必须能够附着在细胞上，重塑胶原纤维，并沿着血管壁定向侵入7。筛选模型，可以迅速识别抗金属治疗目标，以阻止癌细胞完成这些步骤是最重要的。现有的体外筛查模型并不能完全模拟复杂的活组织环境。鼠标型号既昂贵又耗时。因此，迫切需要提供复杂的活组织环境和快速识别目标的活体筛查平台。
在过去十年中，鸡胚胎已被确定为人类癌症转移8、9、10、11、12的强大且具有成本效益的模型。小鸡胆管素膜（CAM）组织是薄和半透明的，这使得它非常适合细胞和细胞群落行为在原发性肿瘤和/或转移位点12的活性显微成像。从多个人类癌细胞系的原发性肿瘤生长可以在微注射到CAM组织后几天内启动和转移。癌细胞可以通过多种方式管理到CAM组织，包括静脉注射、内膜或作为植物上的胶原蛋白，这种灵活性使研究人员能够专注于癌症进展的特定阶段，例如转移性病变形成、从原发性肿瘤中侵入或血管生成。
在这里，我们描述了一个定量筛选平台，可用于测量癌细胞建立侵入性转移性病变的能力。用表达库转导的癌细胞以低密度静脉注射到CAM血管中。转移菌落形成4-5天，然后评估由此产生的殖民地的入侵能力和血管相互作用。未入侵的个体菌落被切除、传播，其表型通过重新注射和量化菌落紧凑度和癌细胞血管接触在CAM中得到确认。负责单转移性群落突变表型的表达库结构通过高通量测序从分离的群落基因组DNA中识别出来。同一平台可进一步用于验证基因与观察到表型之间的因果关系，或对观察到的表型进行深入的机械研究。
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Protocol
所有实验都是根据艾伯塔大学机构动物护理和使用委员会的条例和准则进行的。许多研究机构不认为鸟类胚胎是活的动物，也不需要动物协议。然而，这是一个公认的观点，即鸟类胚胎会感到疼痛，因此必须尽可能人道地对待。在开始任何研究工作之前，必须联系当地动物研究机构，以确保遵守适当的法规。
1. 无壳蛋培养
- 从当地供应商处获取受精鸡蛋。本实验采用白腿角鸡品种：然而，其他品种也可以使用。
注：建议在裂开过程中某些胚胎受损且无法在本协议中使用的情况下，获得比所需卵子多 10% 的卵子。 - 将所需的鸡蛋数量转移到 60% 的加湿摇动孵化器中。其余的鸡蛋可以在12°C下储存长达两周，而不会丧失生存能力。
- 在潮湿的摇摇孵化器中孵化卵子四天。
注：第 1 天是鸡蛋转移到摇动孵化器时。 - 为无壳蛋培养品准备称重盘和塑料盖。切开每个称重盘的一个角落，以便高效空气进入胚胎（图1A）。
- 将准备好的称重盘排成一排，放在流动罩中。（图1B）。
- 在单独的称重盘中，准备 70% 乙醇用于鸡蛋冲洗。
- 将鸡蛋短暂浸入70%乙醇中，然后使用电动旋转工具小心地将四个2-3毫米的切口与鸡蛋最大的纬度直径平行（图1C）。
- 将切好的鸡蛋转移到称重盘中，轻轻将鸡蛋压在盘底，直到蛋壳形成裂纹（图1D）。
- 将蛋壳拉开一半，让胚胎滑入称重盘中。丢弃蛋壳，盖上盖子盖住称重盘。
- 将胚胎移植到加湿的非摇动孵化器（图1E）。
注：称量含有胚胎的盘子被放置在单独的塑料容器（12个胚胎/容器）中。这增加了胚胎的生存能力，并允许实验特定的胚胎组织。 - 再孵育胚胎6天（直到10天大）。每天检查是否有死胚胎或受污染的胚胎，并将它们从孵化器中取出。
注：胚胎可能受到空气中的霉菌孢子的污染。霉菌污染最初表现为胚胎CAM表面的白色斑点。立即取出受污染的胚胎，每周用70%乙醇擦拭孵化器，以防止污染。根据我们的经验，污染水平非常低+1-3%。 - 在第10天早上用这些胚胎注射癌细胞。
2. 注射癌细胞的准备
注：转移菌落选择基于荧光癌细胞建立的表型，源自表达库或带有荧光蛋白（如绿色或红色荧光蛋白）标记的载体（见 图2A中的整个屏幕流量）。不建议使用暂时受荧光蛋白瞬息万变的细胞，或使用细胞渗透荧光染料标记的细胞，因为癌细胞增殖和不均匀染色导致信号迅速褪色。
- 培养癌细胞到60-70%的汇流在注射时。在更高水平的汇流中使用癌细胞会降低其生存能力，导致转移性菌落形成效率低下。确保使用的癌细胞没有支原体，因为支原体污染可能导致鸡胚胎存活率降低。
- 用 1x PBS pH 7.4 冲洗细胞两次。取出剩余的PBS，然后加入0.5%的Trypsin-EDTA，在37°C孵育2-5分钟，直到所有细胞从培养皿表面升高。
- 将电池悬架在室温下在 200 x g 下传输到 15 mL 圆锥管和离心机电池中，持续 5 分钟。
- 将PBS10 mL中的细胞重新用于和离心细胞，就像第2.3步一样，以去除试丁香和其他培养介质成分，如抗生素。
注：在癌细胞悬浮物中存在试丁类药物或细胞培养成分（如抗生素）可能导致鸡胚胎存活率降低。 - 小心地用 1 mL 的冰冷 PBS 吸气超高分子和再悬浮细胞。
- 使用血细胞计或任何其他可用的细胞计数设备计算细胞数量。
注：此筛选协议要求每个转移菌落由单个细胞启动。计算细胞时，确保细胞完全尝试，并作为单个细胞悬浮存在（不存在细胞团）。 - 对于静脉注射 （IV） 注射浓缩细胞到 0.5 x 106 到 1.0 x 106 细胞/mL。使用冰冷 1x PBS 稀释和/或重新悬念细胞浓缩物。预计每10个胚胎需要大约1兆L的细胞悬浮。
注：悬浮中必要的细胞悬浮浓度主要取决于实验者的经验水平。有关详细信息，请参阅下一节。
3. 静脉注射癌细胞，形成转移性菌落
注：按照这个协议，一天内可以注射多达一百个胚胎。分离转移菌落（第5步）然后注射癌细胞通常需要更长的时间，因此，建议进行初步实验，估计完成所有步骤所需的时间。使用微分癌细胞荧光标签有助于减少动物数量和每次实验所需的时间。例如，控制细胞可以标有RFP（红色荧光蛋白），而突变肿瘤细胞可以单独标记为GFP（绿色荧光蛋白）。在这种情况下，每个实验都有一个内置的控制，用于纠正胚胎间的变异性。
- 组装注射装置，如 图2B所示。首先将针头安装到注射器上，然后用3-5厘米长的管子将注射器针伸出。
- 使用细钳（+20-60 μL 宽）将玻色硅酸盐针头折断。
- 将注射器与癌细胞悬浮（50-200 μL）一起加载，并将玻色硅酸盐针插入管中（图2B）。
- 检查胸硅酸盐针，检查细胞堵塞和气泡。将细胞作为单个细胞悬浮物注入，以确保每个转移性细胞群是由单个细胞启动的，这一点至关重要。
注：癌细胞在试用后1-2小时内聚集在PBS中，因此应在注射前立即准备。如有必要，可以使用用于注射的 1 mL 注射器（无需骨硅酸盐针）定期重新使用细胞。 - 如果在毛细内观察到细胞堵塞，取出毛细圈，重新暂停细胞，代之以新的毛细子。使用柱塞推出任何气泡。如果没有细胞堵塞或气泡被观察到继续到下一步。
- 取下盖盖，在立体镜下转移胚胎。确定要注射在 CAM 表面的适当静脉。静脉和动脉形成CAM组织内错综复杂的网络（图2C）。静脉以鲜红的颜色区分，因为它们将富含氧气的血液输送到胚胎中。
注：对于一般胚胎操作、癌细胞注射和转移性细胞群切除，请使用荧光立体显微镜，配备 0.8 倍和 1.5 倍目标以及 10 倍目镜进行可视化。根据用户的体验水平，较不先进的显微镜也可以成功用于这些程序。读者可以联系作者，了解更详细的建议。 - 找到注射细胞的理想静脉，通常只比胸腺素针尖的直径稍宽（10-20%），位于胚胎和称重盘壁之间的中间。它通常更容易注射在紧邻静脉分叉的点。
注：注射到更大的静脉可能看起来更容易，但会导致过度出血和减少胚胎存活率。 - 将针尖压在血管壁上，在与血流相同的方向施加温和的压力。如有必要，使用棉签（另手持有）帮助锚定或稳定正在注入的容器。
- 轻轻压低注射器柱塞。当癌细胞悬浮进入血液时，通过观察血管的"清除"，可以想象成功的注射。
- 继续压低注射器柱塞2-10s，直到所需的悬浮体被注射到静脉的血液中。根据用户的体验水平，注射单个胚胎可能需要 1-10 分钟。如果注射部位出现过度出血或液体积聚，丢弃胚胎。
注：很容易"过度注射"胚胎。应记住的一般考虑是，转移殖民地不应在4-5天的生长期后相互接触。理想情况下，+5-10% 的终端 CAM 静脉毛细血管应有细胞固定在它们后，成功注射 （图 2D，E）.如第 2 步所述，可以使用一系列细胞浓度（0.5 x 106 - 1.0 x 106 细胞/mL）。较低的浓度需要更长的注射时间，但会减少针头堵塞。更高的浓度需要更短的注射时间，但会增加针头堵塞。建议尝试几个浓度，以找到一个最舒适的操作员。一般来说，更高的浓度（1.0 x 106 细胞/mL）更倾向于减少注射时间。 - 从CAM中取出针头，用棉签轻轻涂抹注射部位，以去除任何血液或多余的癌细胞。
- 用盖子盖住称重盘中的胚胎，将注射的鸡胚胎放回孵化器中。
- 重复与下一个胚胎的程序，直到所有胚胎被注射。
4. 转移性菌落生长期间的胚胎维持
- 目视检查胚胎。如果有任何死亡，和/或被细菌或霉菌污染，从孵化器中取出它们，然后按照实验室处理程序进行高压灭菌和丢弃。
注：建议每隔一天检查胚胎（第1天、第3天、第5天癌细胞注射后），以促进转移性细胞群生长。避免不必要地移动注射的胚胎，因为它可能会导致胚胎损伤和/或死亡。 - 如果细胞显示过度生长（转移菌落相互重叠）或CAM组织内分布不均匀（位于CAM表面小亚区域的转移菌落）将胚胎从实验中取出。在从实验中取出后立即将废弃胚胎冷冻在-20°C（或其他经批准的方法）下，对废弃胚胎实施安乐死。CAM 组织内可行转移细胞的数量最初会减少（第 1-2 天），然后会增加（第 2-5 天）。
注意：有些胚胎可能会"拒绝"癌细胞，即所有的癌细胞都会从CAM组织中消失。这些胚胎应该从实验中取出。通常，癌细胞菌落可以通过荧光立体显微镜下的透明盖子看到，而无需打开称重盘。 - 确保转移菌落在形状上看起来均匀（注射后的前 1-3 天）。在注射后的第 4-5 天识别侵入性或非侵入性转移菌落（有关详细信息，请参阅第 5 节）。
5. 分离转移性殖民地
- 在第5天注射后从孵化器中取出胚胎，并检查胚胎CAM的转移性细胞群分布。识别具有均匀的菌落分布的胚胎，其中存在紧凑（或过度侵入性）的菌落。
注：培育鸡胚胎的过程并非无菌，因此，所有筛选步骤必须在高度清洁的条件下进行，以避免未来的组织培养污染。污染非常罕见，通过戴手套和口罩，在细胞注射和菌落隔离过程中只使用无菌工具，很容易避免。建议逐一检查胚胎，以减少胚胎接触环境实验室温度，防止污染。 - 定位感兴趣的转移殖民地。紧凑型菌落可被描述为大多数癌细胞位于CAM组织有限区域内的菌落（细胞看起来"聚集在一起"）。侵入性菌落可描述为癌细胞"散射"在CAM组织中的殖民地（图3A，B）。
注：转移性菌落的"紧凑性"可以解释为抑制癌细胞入侵，抑制癌细胞增殖，或者两者兼有。应注意所有情况，联系殖民地应隔离（图3A，B）。一个简单的荧光立体显微镜可用于区分紧凑型和侵入性转移性群体表型。 - 在解剖显微镜下，使用细钳（图3C）轻轻拉动含有转移性利益群落的CAM组织。
- 使用手术剪刀切断包含转移菌落的 CAM 组织。
- 将包含转移菌落的 CAM 组织转移到空的无菌 1.5 mL 管（冰上），并关闭管盖。
注：孤立的殖民地可以在冰上保存长达3小时，而不会丧失生存能力。 - 重复切除程序，直到所有感兴趣的菌落被收集到单独的管子中。为了避免动物的痛苦，不要从一个胚胎中切除超过2-3个菌落。在细胞群切除后立即将胚胎冷冻在-20°C（或其他经批准的方法）下，对胚胎实施安乐死。
- 使用无菌 18 量表针轻轻切碎微中心管中的 CAM 组织。为每个殖民地使用单独的针头。
- 加入 100 μL 的 1x 拼贴纳塞溶液，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 在环境温度下以 300 x g 的速度旋转细胞和 CAM 组织 5 分钟。
- 在用于细胞兴趣线的完整介质中激发拼贴酶溶液和重新悬念细胞。
注：通常CAM组织在拼贴治疗后不会完全分离，癌细胞会首先在CAM组织片中扩散，然后迁移到组织培养皿中。 - 在环境温度下，在 300 x g 下再次旋转细胞和 CAM 组织 5 分钟。
- 在 1 mL 的完整介质加上选择因子（如果有的话）中重新使用细胞和 CAM 组织片段，然后转移到单个 12 井组织培养皿中。
注意：鸡凸轮成纤维细胞可能持续组织培养的多个通道抑制克隆扩张。在选择因子的存在下扩展转移菌落的能力（即，如果用于使癌细胞荧光的载体也编码哺乳动物抗生素耐药基因）可以大大加快克隆扩张。在筛查之前应进行杀伤曲线实验，以确保使用适当浓度的抗生素。 - 在接下来的1-3周内，每天监测癌细胞的生长和污染。
- 当细胞达到70-80%的汇流转移细胞到更大的体积培养皿。
注意：建议扩大细胞，直到每个克隆的至少两个低温小瓶可以冷冻。保持大量的组织培养可能是费力和不必要的。 - 一旦达到足够的癌细胞数量，就开始测序或下一轮选择。一般来说，1 x 106 的癌细胞足以用于现代高通量测序技术。
- 进行克隆再注射、成像和量化菌落紧凑性或癌细胞血管接触（图2A）。或者继续进行高吞吐量测序或重复殖民地选择。
注意：建议至少两轮选择，以减少误报的数量。成功地采用了两种方法。1） 扩展每个克隆并单独重新喷射以确认菌落表型。2） 以 1：1 的比例混合所有扩展的克隆，重新注射为混合物并重复选择周期。
6. 将荧光标记的叶片注射到CAM血管中。
- 识别要注射的静脉。使用用于肿瘤细胞注射的lectin的同一注射部位比较容易。
- 稀释荧光莱汀库存溶液 （5 毫克/兆升） 50-100x 与 1x PBS，并加载到相同的注射设备，用于癌细胞注射。
注：血管可视化需要注射的莱克汀量（通常为20-100微升）取决于显微镜的灵敏度，应在筛查前进行实验确定。 - 使用与肿瘤细胞注射相同的技术注射莱汀（参见步骤 3.6.-3.10.）。
- 注射后，将胚胎放入孵化器中恢复5分钟。一次只注射一个胚胎，在胚胎成像之前立即注射。
注意。12天或以上的胚胎通常从莱汀注射中恢复良好，第二天可以再次用莱汀重新注射，进行连续成像。年轻的胚胎更敏感，并可能显示血液凝固。
7. 癌细胞血管接触的可视化
- 在成像前约 6 小时将温度调节的显微镜外壳设置为 37 °C。这将稳定显微镜温度，并有助于在成像过程中最大限度地减少 XYZ 漂移。
注意。这个实验使用了专门的鸡胚胎成像室9、10、11、12、13。 从癌细胞注射到克隆选择和克隆再注射，以及对菌落紧凑度的评估，都可以使用简单的荧光解剖显微镜。配备显像室的共聚焦显微镜对于癌细胞血管接触的成像和量化是必要的。长达1小时无需加热，一般胚胎至少存活两次连续成像，不会对其生存能力造成影响。 - 确保安装必要的客观透镜（建议安装 20 倍或 25 倍水浸入客观透镜）。
- 将一层薄薄的真空润滑脂涂抹在成像室盖的下侧，以创建带盖唇的安全密封。
- 轻轻地将盖唇放入盖子中，擦去多余的真空润滑脂。
- 将注射的胚胎从孵化器中取出，如有必要，切开称重盘的边缘。
- 将胚胎放置在成像室中，将盖片直接降低到感兴趣的转移菌落所在的 CAM 区域。慢慢地将盖子降低到胚胎上，直到盖唇接触CAM。拧紧螺丝以固定盖子，确保盖子平放，并确保盖唇不会对 CAM 施加任何向下压力。
- 从多个（5-10）胚胎中获取多个随机菌落（10-20）的图像。
注意。建议从每个字段获取随机 3D 堆栈（1-5um Z 步;50-100um 范围;25 倍）。 - 如有，请在显微镜采集软件中使用现场缝合选项。由于用于量化的图像不会是出版物质量，因此如果可用，请使用快速采集模式，如共振扫描。使用 25 倍目标和 3 x 3 拼接，5-10 μm Z 步，100 μm 总范围。每个情况至少映照 100 个细胞（+20 个菌落）。
8. 癌细胞血管接触的量化
- 使用必要的软件将 3D 文件作为 Z 堆栈打开。
注意。必须使用专门的软件来获取和分析高分辨率图像，以量化癌细胞血管接触。提供几套能够进行 3D 图像分析的软件包。有关详细信息，请参阅 材料表 。 - 如果在图像采集过程中发生了重大 XY 运动，请使用 ImageJ StackReg 插件（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg）对齐 Z 堆栈。
- 找到感兴趣的单元格。
- 滚动浏览 Z 方向的 XYZ 图像，确定包含癌细胞血管接触最大长度的光学部分，以获得感兴趣的细胞（图 2E）。
- 使用"手动长度测量功能"测量癌细胞血管接触。
- 将测量输入用于统计分析的数据软件包中。
注：癌细胞附着在血管上的能力可以测量为癌细胞血管接触的长度或与特定癌细胞克隆（或两者兼有）的血管接触细胞的百分比。 - 继续到下一个感兴趣的单元格。
- 分析数据，以获得比较突变克隆（s）和控制数据集的统计意义。
9. 殖民地紧凑性量化
- 使用与第 2 步相同的技术从扩展的克隆中重新注射细胞。
- 注射后五天获取每个克隆10-50个随机转移菌落的图像。
注：转移性聚落紧凑量化不需要高质量的图像。单色立体显微镜（10 倍放大）图像足够。应注意图像的亮度（应看到群落内的大部分细胞）和对比（一个或两个细胞之间的差异）。 - 数字隔离殖民地图像（见图2C，D），并继续使用独立的殖民地紧凑量化模块或盲分13殖民地紧凑量化。
- 前往下一个感兴趣的殖民地。
- 分析数据，以获得比较突变克隆（s）和控制（即争抢 shRNA）数据集的统计意义数据。
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Representative Results
如果大多数位于毛细血管中的细胞是单细胞，并且位于彼此显著的差异（+0.05-0.1 厘米），因此菌落在5-6天的潜伏期后不会重叠（图3A），则癌细胞注射被认为是成功的。注射没有成功，如果在大多数毛细血管中可以看到癌细胞的积累，显示这一点的胚胎应该被丢弃（图2E）。大量注射的癌细胞在注射后24小时内会灭亡，使一些胚胎似乎拒绝所有的癌细胞。癌细胞的存活率会因当地卵子供应者而异（即注射的细胞数量可能有所不同），我们强烈建议在进行实验之前确定最佳注射条件（癌细胞浓度与注射持续时间）。我们建议细胞浓度在 0.5 x 106 到 1.0 x 106 细胞/m 之间。当达到最佳细胞浓度和注射持续时间时，注射后第5天转导细胞应产生多种菌落表型，大多数菌落出现侵入性，由分散在CAM组织中的癌细胞决定（图3A）。应注意那些看起来"紧凑"的转移性菌落，它们离邻近的殖民地足够远，可以在一块CAM组织中用钳子和剪刀切除它们（图3C）。孤立的正屏幕命中（即紧凑的菌落）应在重新注射时显示紧凑的菌落表型（图3B）。也可以观察到细胞存活率（或细胞增殖率）的下降。因此，可能需要为一些正屏幕点击注入更高的细胞数，以获得足够的群落数。在测量癌细胞血管接触时，应注意血管壁污渍亮度（荧光叶黄素： 图3D，E）和适量的莱克汀应注射明亮的/对比血管壁信号。在显微镜软件校准完成后，任何可用的图像分析软件都可以在量化步骤中使用。
图1：鸡胚胎无壳培养概述。（A）为无壳培养准备的带盖子的称重盘。箭头指向切角。（B） 称量盘子排列在流动罩的行中。（C） 用电动旋转工具切割蛋壳。（D） 将鸡蛋裂成称量盘。（E） 在加湿孵化器中培养的胚胎。比例尺条 +1 厘米（A-D）或 5 厘米（E）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：癌细胞注射和转移性细胞群分离的轮廓。 （A） 流图概述鸡胚胎筛选平台步骤。（B） 在立体荧光显微镜阶段设置的癌细胞注射。（C） 将癌细胞注射到CAM血管中。（D） 显示成功注射癌细胞（可接受的癌细胞密度）的图像，注射后立即拍摄。（E） 显示癌细胞注射不良的图像，被视为过度注射的胚胎。注意癌细胞在血液毛细血管中积聚（白箭）。缩放条 = 1 厘米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。筛选协议不同步骤的代表结果。（A） 异质形成的转移菌落（库转导癌细胞系HEp3细胞），注射后5天。红色箭头显示应切除的紧凑菌落（潜在正击）。（B） 注射后5天，由一个孤立的屏幕命中（KIF3B）形成的转移菌落。插图以数字方式从虚张声势的正方形中剪切出转移性殖民地图像。这是 C.I 量化的可接受图像质量。显示命中再注射的平均 C.I. 值（KIF3B）。（C） 从CAM组织中分离出感兴趣的转移性群落。（D ）控制菌落的代表光学部分， 和（E） KIF3B shRNA 过度表达的菌落， 都显示癌细胞血管接触测量.CAM血管被标记为荧光叶素-649。比例尺条 +1 厘米（A-C）或 50 μm（D、E）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了基于快速荧光显微镜的活性筛选方案，可用于重要的应用，如基因或药物候选屏幕。使用这种鹰凸轮模型快速筛选和量化使用感兴趣的表型的癌细胞，这些癌细胞已被遗传感兴趣的基因库转导或与单个表达结构发生感染。由于转导或转染协议因库类型而异，因此未包含在此程序中。表型相关的转移菌落从 CAM 中切除，扩展和 DNA 分离，用于高通量测序，以确定兴趣的表达结构。一般来说，每个基因库都配备了引物序列和推荐的基因组DNA纯化方法。我们建议使用本地设施指南获得最佳的高吞吐量测序结果。
建议在筛查前确定库和细胞系感染的最佳倍数 （M.O.I.）。理想情况下，每个细胞（因此未来转移性聚落）应该只包含一个基因表达结构，然而在我们的经验中，并不总是可以实现的。我们建议遵循图书馆制造商的协议，并测试广泛的 M.O.I. （0.01-5）， 以实现尽可能接近 1。每个转移群落内存在多个库表达结构可能会显著使群落表型分析复杂化。我们还建议使用库制造商在您的实验中提供负控制（即争抢 shRNA 表达荧光标记的矢量）。
我们的筛选方案基于非侵入性荧光菌落的选择;确保实验中使用的所有细胞系具有类似的荧光强度至关重要。细胞（和转移菌落）之间的荧光强度不均匀可能导致由于细胞或群落亮度而不是侵入性而导致有偏见的群落选择。
与现有方法相比，我们的协议提供了几个独特的优势，如速度，低成本和能力，以完成内部屏幕周期，而无需先进的成像设备12，13，14。此外，整个筛选周期可以完成，从细胞注射到测序阶段需要 3 到 6 周的时间。癌细胞注射或转移性菌落分离不需要高分辨率显微镜，因为这些步骤可以使用大多数研究人员可用的基本荧光立体显微镜进行。最后，由于无壳胚胎培育完全自我维持，因此不需要复杂的研究动物住房或喂养计划。大多数研究机构并不认为鸡胚胎是活体动物，这大大降低了与这种模式相关的成本和文件负担。
然而，与无壳胚胎模型相关的一些限制。首先，并非所有的癌细胞系都有效工作在这个模型中。在我们的实验室中，我们经常使用几种癌细胞系，如HT1080（人类纤维瘤）、HEp3（头部和颈部）和小鼠b16黑色素瘤和4T1乳腺癌细胞系，当注射到鸡CAM血管中时，这些细胞系会有力地形成转移性菌落。其他细胞系与不同的癌症类型，如乳腺癌（MDA468），大脑（U87和U118）或卵巢（A2780s）很容易形成转移菌落时，注射到CAM，因此可用于这个筛选协议，以及12，14，15。然而，根据我们的经验，常用的癌细胞系，如LnCaP和PC3，在这个模型（未发表的观察）中表现不佳。另一个限制是，高分辨率成像需要具有 100 到 200 μm 成像范围的共聚焦显微镜，例如癌细胞血管接触的可视化，这种设备可能无法为许多研究人员使用。
总之，此协议描述了一个快速的活性筛查平台，可用于发现癌症转移抑制剂和驱动因素。我们坚信，该模型的坚固性和易用性将使它成为许多研究人员必不可少的筛选模型。
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Disclosures
没什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大癌症协会研究所的资助，该研究所向JDL和KS#702849。刘易斯博士在艾伯塔省癌症基金会的支持下担任前列腺癌研究的弗兰克和卡拉·索琼基主席。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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