Summary
Il s’agit d’une méthode efficace pour dépister les suppresseurs ou les facteurs de métastases cancéreuses. Les cellules, transduites avec une bibliothèque d’expressions, sont injectées dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque du poulet pour former des colonies métastatiques. Les colonies ayant un caractère invasif diminué ou accru sont excisées, élargies, réinjectées pour confirmer leur phénotype et, enfin, analysées à l’aide d’un séquençage à haut débit.
Abstract
Les progrès récents de la recherche sur le cancer ont illustré la nature très complexe des métastases cancéreuses. Il a été constaté que plusieurs gènes ou réseaux de gènes sont impliqués dans la régulation différentielle des gènes en cascade métastatique du cancer et des produits géniques en fonction du type de cancer, des tissus et des caractéristiques individuelles du patient. Ceux-ci représentent des cibles potentiellement importantes pour les thérapies génétiques et les approches de médecine personnalisée. Le développement de plateformes de dépistage rapide est essentiel pour l’identification de ces cibles génétiques.
La membrane chorioallantoïque du poussin (CAM) est une membrane riche en collagène hautement vascularisée située sous la coquille de l’œuf qui permet l’échange de gaz dans l’embryon en développement. En raison de l’emplacement et de la vascularisation du CAM, nous l’avons développé en tant que modèle de métastase cancéreuse humaine intravitale qui permet une xénogreffe robuste des cellules cancéreuses humaines et une imagerie en temps réel des interactions des cellules cancéreuses avec la matrice riche en collagène et le système vasculaire.
À l’aide de ce modèle, une plateforme de dépistage quantitatif a été conçue pour l’identification de nouveaux facteurs ou suppresseurs de métastases cancéreuses. Nous avons transduit un pool de cellules cancéreuses HEp3 de la tête et du cou avec une bibliothèque complète de gènes shRNA du génome humain, puis injecté les cellules, à faible densité, dans le système vasculaire CAM. Les cellules ont proliféré et formé des colonies de cellules monotumorales. Les colonies individuelles qui étaient incapables d’envahir le tissu CAM étaient visibles comme un phénotype de colonie compact et excisées pour l’identification de l’ARNh transducté présent dans les cellules. Les images de colonies individuelles ont été évaluées pour leur caractère envahissant. Plusieurs séries de sélections ont été effectuées pour réduire le taux de faux positifs. Des clones individuels de cellules cancéreuses isolées ou des clones nouvellement modifiés qui expriment des gènes d’intérêt ont été soumis à un test de formation tumorale primaire ou à une analyse de cooptation vasculaire des cellules cancéreuses. En résumé, nous présentons une plateforme de dépistage rapide qui permet l’identification de cibles anti-métastatiques et l’analyse intravitale d’une cascade dynamique et complexe d’événements.
Introduction
Les métastases sont la principale cause de décès des patients atteints de cancer1,2,3. Les cellules cancéreuses métastatiques utilisent des voies de signalisation distinctes, en fonction du type de cancer, tout au long des cinq étapes de la cascade métastatique: invasion locale, intravasation, survie dans la circulation, extravasation et expansion des colonies sur des sites métastatiques éloignés. La compréhension actuelle de ce processus métastatique suggère qu’il existe deux étapes de goulot d’étranglement, l’une est l’invasion directionnelle de la cellule cancéreuse à partir de la tumeur primaire, et la seconde est l’établissement de la lésion métastatique du site distant4,5,6. Les deux étapes nécessitent que les cellules cancéreuses interagissent activement avec le collagène et le système vasculaire aux sites d’invasion initiale ou de formation de lésions métastatiques à distance. Par conséquent, les cellules cancéreuses métastatiques doivent pouvoir s’attacher aux cellules, remodeler les fibres de collagène et envahir directionnellement le long des parois vasculaires7. Les modèles de dépistage qui peuvent identifier rapidement des cibles thérapeutiques anti-extatiques pour empêcher les cellules cancéreuses de compléter ces étapes sont de la plus haute importance. Les modèles de dépistage in vitro existants n’imitent pas complètement l’environnement complexe des tissus vivants. Les modèles murins sont coûteux et prennent beaucoup de temps. Par conséquent, il existe un besoin urgent de plates-formes de dépistage intravital qui fournissent des environnements tissulaires vivants complexes et une identification rapide des cibles.
Au cours de la dernière décennie, l’embryon de poulet a été établi comme un modèle robuste et rentable de métastases cancéreuses humaines8,9,10,11,12. Le tissu de la membrane chorioallantoïque (CAM) du poussin est mince et translucide, ce qui le rend idéal pour l’imagerie microscopique intravitale des comportements cellulaires et des colonies dans les sites tumoraux primaires et / ou métastatiques12. La croissance tumorale primaire à partir de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines peut être initiée et métastasée en l’espace de quelques jours seulement après la microinjection dans le tissu CAM. Les cellules cancéreuses peuvent être administrées dans le tissu CAM de plusieurs façons, y compris par voie intraveineuse, intra-CAM ou sous forme de collagène sur les plantes, cette flexibilité permet au chercheur de se concentrer sur des stades spécifiques de la progression du cancer, par exemple, la formation de lésions métastatiques, l’invasion de la tumeur primaire ou l’angiogenèse.
Nous décrivons ici une plateforme de dépistage quantitatif qui peut être utilisée pour mesurer la capacité des cellules cancéreuses à établir des lésions métastatiques invasives. Les cellules cancéreuses qui ont été transduites avec une bibliothèque d’expression sont injectées par voie intraveineuse dans la vascularisation CAM à faible densité. Les colonies métastatiques se forment pendant 4 à 5 jours, puis la capacité d’invasion et l’interaction vasculaire des colonies résultantes sont évaluées. Les colonies individuelles qui ne parviennent pas à envahir sont excisées, propagées et leur phénotype est confirmé dans le CAM par réinjection et quantification de la compacité des colonies et des contacts cellules cancéreuses-vaisseaux sanguins. Les constructions de la bibliothèque d’expression responsables du phénotype mutant de la colonie métastatique unique sont identifiées à partir de l’ADN génomique de colonie isolée via un séquençage à haut débit. La même plate-forme peut en outre être utilisée pour valider le lien de causalité entre un gène et le phénotype observé ou pour effectuer des études mécanistes approfondies sur le phénotype observé.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règlements et aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Alberta. Les embryons aviaires ne sont pas considérés comme des animaux vivants par de nombreux instituts de recherche et aucun protocole animal n’est requis. Il est toutefois admis que les embryons aviaires peuvent ressentir de la douleur et, par conséquent, doivent être traités aussi humainement que possible. L’autorité locale de recherche sur les animaux doit être contactée avant le début de tout travail de recherche pour s’assurer que les règlements appropriés sont respectés.
1. Culture d’œufs sans coquille
- Acquérir des œufs de poule fécondés auprès du fournisseur local. Cette expérience utilise la race de poulet White Leghorn; cependant, d’autres races peuvent également être utilisées.
REMARQUE: Il est recommandé d’acquérir 10% plus d’ovules que nécessaire au cas où certains des embryons seraient endommagés pendant la fissuration et ne peuvent pas être utilisés dans ce protocole. - Transférez le nombre requis d’œufs dans un incubateur à bascule humidifié à 60%. Le reste des œufs peut être conservé jusqu’à deux semaines à 12 °C sans perte de viabilité.
- Incuber les œufs dans l’incubateur à bascule humidifié pendant quatre jours.
REMARQUE: Le jour 1 est le moment où les œufs sont transférés dans l’incubateur à bascule. - Préparez la vaisselle de pesée et les couvercles en plastique pour la culture d’œufs sans coquille. Couper l’un des coins de chacune des boîtes de pesée pour permettre un accès efficace de l’air à l’embryon (Figure 1A).
- Disposez les plats de pesée préparés en rangées dans la hotte d’écoulement. (Figure 1B).
- Dans un plat de pesée séparé, préparez 70% d’éthanol pour le rinçage des œufs.
- Trempez brièvement l’œuf dans de l’éthanol à 70 %, puis utilisez l’outil rotatif électrique pour effectuer soigneusement quatre coupes de 2 à 3 mm parallèles au plus grand diamètre latitudinal de l’œuf(Figure 1C).
- Transférer l’œuf coupé dans un plat de pesée et presser doucement l’œuf contre le fond du plat jusqu’à ce qu’une fissure se forme dans la coquille de l’œuf (Figure 1D).
- Séparez la coquille d’œuf en deux en laissant l’embryon glisser dans le plat de pesée. Jeter la coquille d’œuf et couvrir le plat de pesée avec un couvercle.
- Transférer les embryons dans un incubateur non berçant humidifié (Figure 1E).
REMARQUE: Les boîtes de pesée contenant les embryons sont placées dans des récipients en plastique séparés (12 embryons / récipient). Cela augmente la viabilité de l’embryon et permet une organisation embryonnaire spécifique à l’expérience. - Incuber des embryons pendant 6 jours de plus (jusqu’à l’âge de 10 jours). Vérifiez quotidiennement la recherche d’embryons morts ou contaminés et retirez-les de l’incubateur.
REMARQUE: Les embryons peuvent être contaminés par des spores de moisissure en suspension dans l’air. La contamination par la moisissure se manifeste initialement par des taches blanches sur la surface de l’embryon CAM. Retirez immédiatement les embryons contaminés et essuyez l’incubateur avec 70% d’éthanol sur une base hebdomadaire pour éviter la contamination. D’après notre expérience, les niveaux de contamination sont très faibles ~ 1-3%. - Utilisez ces embryons pour l’injection de cellules cancéreuses le matin du jour 10.
2. Préparation des cellules cancéreuses pour injection
REMARQUE: La sélection des colonies métastatiques est basée sur un phénotype établi par des cellules cancéreuses fluorescentes, dérivé d’une bibliothèque d’expression ou d’un vecteur marqué avec une protéine fluorescente telle que la protéine fluorescente verte ou rouge (voir l’ensemble du flux de l’écran à la figure 2A). Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules transitoirement transfectées avec des protéines fluorescentes ou étiquetées avec des colorants fluorescents perméables aux cellules en raison de la décoloration rapide du signal causée par la prolifération des cellules cancéreuses et la coloration inégale.
- Culturez les cellules cancéreuses à 60-70% de confluence au moment de l’injection. L’utilisation de cellules cancéreuses à des niveaux de confluence plus élevés diminuera leur viabilité, ce qui entraînera une faible efficacité de la formation de colonies métastatiques. Assurez-vous que les cellules cancéreuses utilisées sont exemptes de mycoplasmes, car la contamination par les mycoplasmes peut entraîner une diminution de la viabilité des embryons de poulet.
- Rincez les cellules deux fois avec 1x PBS pH 7,4. Retirez le PBS restant, puis ajoutez 0,5 % de trypsine-EDTA et incubez à 37 °C pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce que toutes les cellules soient soulevées de la surface de la boîte de culture.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et des cellules centrifuges à température ambiante à 200 x g pendant 5 min.
- Remettre en service les cellules dans 10 mL de PBS et centrifuger à nouveau les cellules comme à l’étape 2.3, pour éliminer la trypsine et d’autres composants des milieux de culture tels que les antibiotiques.
REMARQUE: La présence de trypsine ou de composants de culture cellulaire tels que des antibiotiques dans la suspension de cellules cancéreuses peut entraîner une diminution de la viabilité de l’embryon de poulet. - Aspirer soigneusement les cellules surnageantes et les réaporer avec 1 mL de PBS glacé.
- Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou de tout autre équipement de comptage cellulaire disponible.
REMARQUE: Ce protocole de dépistage exige que chaque colonie métastatique soit initiée par une seule cellule. Lors du comptage des cellules, assurez-vous que les cellules sont entièrement trypsinisées et existent sous la forme d’une suspension cellulaire unique (aucun amas cellulaire n’est présent). - Pour l’injection intraveineuse (IV), concentrez les cellules à 0,5 x10 6 à 1,0 x 106 cellules/mL. Utilisez du PBS glacé 1x pour diluer et/ou resuspender les concentrés cellulaires. Attendez-vous à ce qu’environ 1 mL de suspension de cellules soit nécessaire pour dix embryons.
REMARQUE: La concentration nécessaire de la suspension cellulaire en suspension est principalement déterminée par le niveau d’expérience de l’expérimentateur. Veuillez consulter la section suivante pour plus de détails.
3. Injection intraveineuse de cellules cancéreuses pour la formation de colonies métastatiques
REMARQUE: En suivant ce protocole, jusqu’à une centaine d’embryons peuvent être injectés en une journée. Il faut généralement plus de temps pour isoler les colonies métastatiques (étape 5) puis pour injecter les cellules cancéreuses et, par conséquent, il est recommandé d’effectuer une première expérience pour estimer le temps nécessaire pour compléter toutes les étapes. L’utilisation d’étiquettes fluorescentes différentielles pour les cellules cancéreuses aide à réduire le nombre d’animaux et le temps requis pour chaque expérience. Par exemple, les cellules témoins peuvent être étiquetées avec RFP (protéine fluorescente rouge) tandis que les cellules tumorales mutantes peuvent être alternativement étiquetées avec GFP (protéine fluorescente verte). Dans ce cas, chaque expérience a un contrôle intégré qui corrige la variabilité inter-embryonnaire.
- Assemblez l’appareil d’injection comme indiqué sur la figure 2B. Montez d’abord une aiguille sur la seringue, puis étendez l’aiguille de la seringue avec un tube de 3 à 5 cm de long.
- Cassez l’extrémité de l’aiguille de borosilicate à l’aide de la pince fine (~ 20-60 μL de large).
- Charger la seringue avec la suspension de cellules cancéreuses (50-200 μL) et insérer l’aiguille de borosilicate dans le tube (Figure 2B).
- Inspectez l’aiguille de borosilicate pour le colmatage des cellules et les bulles d’air. Il est essentiel d’injecter des cellules sous forme de suspension unicellulaire pour s’assurer que chaque colonie métastatique est initiée par une seule cellule.
REMARQUE: Les cellules cancéreuses ont tendance à s’agréger dans le PBS dans les 1-2 heures suivant la trypsinisation et, par conséquent, doivent être préparées immédiatement avant l’injection. Si nécessaire, les cellules peuvent être ressuspendées périodiquement à l’aide de la seringue de 1 mL utilisée pour les injections (sans l’aiguille de borosilicate). - Si un colmatage cellulaire est observé dans le capillaire, retirez le capillaire, re-suspendez les cellules et remplacez-le par un nouveau capillaire. Utilisez le piston pour pousser les bulles. Si aucun colmatage cellulaire ou bulle n’est observé, passez à l’étape suivante.
- Retirez le couvercle du couvercle et transférez l’embryon sous le stéréoscope. Identifier la veine appropriée à injecter sur la surface CAM. Les veines et les artères forment le réseau complexe à l’intérieur du tissu CAM (Figure 2C). Les veines se distinguent par la couleur rouge plus vif car elles transportent le sang riche en oxygène vers l’embryon.
REMARQUE: Pour la manipulation générale de l’embryon, l’injection de cellules cancéreuses et l’excision de colonies métastatiques, utilisez un stéréomicroscope fluorescent équipé d’objectifs 0,8x et 1,5x et d’oculaires 10x pour la visualisation. Un microscope moins avancé peut également être utilisé avec succès pour ces procédures, en fonction du niveau d’expérience des utilisateurs. Les lecteurs peuvent contacter les auteurs pour des recommandations plus détaillées. - Trouvez la veine idéale pour injecter des cellules qui n’est normalement que légèrement plus large (10-20%) que le diamètre de la pointe de l’aiguille borosilicate et située à mi-chemin entre l’embryon et la paroi de la boîte de pesée. Il est généralement plus facile d’injecter au point immédiatement adjacent à la bifurcation veineuse.
REMARQUE: L’injection dans une veine plus grosse peut sembler plus facile, mais entraînera des saignements excessifs et une diminution de la survie de l’embryon. - Appuyez sur la pointe de l’aiguille contre la paroi des vaisseaux sanguins et appliquez une légère pression dans la même direction que le flux sanguin. Si nécessaire, utilisez un coton-tige (tenu dans l’autre main) pour aider à ancrer ou à stabiliser le récipient injecté.
- Appuyez doucement sur le piston de la seringue. On peut visualiser une injection réussie en observant un « dégagement » du vaisseau sanguin lorsque la suspension de cellules cancéreuses pénètre dans la circulation sanguine.
- Continuez à enfoncer le piston de la seringue pendant 2 à 10 s jusqu’à ce que le volume de suspension souhaité soit injecté dans la circulation sanguine de la veine. Dans l’ensemble, l’injection d’un seul embryon peut nécessiter 1 à 10 minutes en fonction du niveau d’expérience de l’utilisateur. Si un saignement excessif ou une accumulation liquide claire apparaît au site d’injection, jetez l’embryon.
REMARQUE: Il est facile de « sur-injecter » un embryon. La considération générale à garder à l’esprit est que les colonies métastatiques ne doivent pas se toucher après une période de croissance de 4 à 5 jours. Idéalement~ 5-10% des capillaires veineux CAM terminaux devraient avoir des cellules immobilisées en eux après une injection réussie (Figure 2D, E). Comme mentionné à l’étape 2, une plage de concentration cellulaire peut être utilisée (0,5 x 106 - 1,0 x 106 cellules / mL). Des concentrations plus faibles nécessiteront un temps d’injection plus long, mais diminueront le colmatage de l’aiguille. Des concentrations plus élevées nécessiteront des temps d’injection plus courts, mais augmenteront le colmatage de l’aiguille. Il est recommandé d’essayer plusieurs concentrations pour trouver celle qui est la plus confortable pour un opérateur. Généralement, une concentration plus élevée (1,0 x 106 cellules/mL) est préférable pour diminuer le temps d’injection. - Retirez l’aiguille du CAM et tamponnez doucement le site d’injection avec un coton-tige pour enlever tout sang ou excès de cellules cancéreuses.
- Couvrir l’embryon dans le plat de pesée avec un couvercle et retourner l’embryon de poulet injecté dans l’incubateur.
- Répétez la procédure avec l’embryon suivant jusqu’à ce que tous les embryons soient injectés.
4. Maintien de l’embryon pendant la croissance de la colonie métastatique
- Inspectez visuellement les embryons. S’il y en a qui sont morts et / ou contaminés par des bactéries ou des moisissures, retirez-les de l’incubateur, autoclavez-les et jetez-les selon les procédures d’élimination en laboratoire.
REMARQUE: Il est recommandé que les embryons soient inspectés tous les deux jours (jours 1, 3, 5 après l’injection de cellules cancéreuses) pour la croissance de colonies métastatiques. Évitez de déplacer inutilement les embryons injectés, car cela pourrait causer des dommages aux embryons et / ou la mort. - Si les cellules présentent une prolifération (les colonies métastatiques se chevauchent) ou une distribution inégale dans le tissu CAM (colonies métastatiques situées dans une petite sous-zone de la surface CAM), retirez cet embryon de l’expérience. Euthanasier les embryons mis au rebut par congélation à -20 °C (ou une autre méthode approuvée) immédiatement après leur retrait de l’expérience. Le nombre de cellules métastatiques viables dans le tissu CAM diminuera d’abord (jours 1-2), puis augmentera (jours 2-5).
REMARQUE: Certains embryons peuvent « rejeter » les cellules cancéreuses, c’est-à-dire que toutes les cellules cancéreuses disparaîtront du tissu CAM. Ces embryons doivent être retirés de l’expérience. Normalement, les colonies de cellules cancéreuses peuvent être vues à travers le couvercle transparent sous le stéréomicroscope fluorescent sans ouvrir la boîte de pesée. - S’assurer que les colonies métastatiques semblent de forme uniforme (1 à 3 premiers jours après l’injection). Identifier les colonies métastatiques invasives ou non invasives aux jours 4 à 5 suivant l’injection (voir rubrique 5 pour plus de détails).
5. Isolement des colonies métastatiques
- Au jour 5 après l’injection, retirez les embryons de l’incubateur et inspectez les MCA d’embryons pour la distribution des colonies métastatiques. Identifier les embryons à distribution uniforme des colonies dans lesquels des colonies compactes (ou trop invasives) sont présentes.
REMARQUE: Le processus de culture des embryons de poulet n’est pas stérile, par conséquent, toutes les étapes de dépistage doivent être effectuées dans des conditions très propres pour éviter une contamination future de la culture tissulaire. La contamination est assez rare et peut être facilement évitée en portant des gants et un masque et en utilisant uniquement des outils stériles lors des procédures d’injection cellulaire et d’isolement des colonies. Il est recommandé d’inspecter les embryons un par un pour diminuer leur exposition à la température ambiante du laboratoire et prévenir la contamination. - Localisez la colonie métastatique d’intérêt. Une colonie compacte peut être décrite comme une colonie avec la plupart des cellules cancéreuses situées dans une zone limitée du tissu CAM (les cellules semblent « agglomérées »). Une colonie invasive peut être décrite comme une colonie où les cellules cancéreuses « se dispersent » dans le tissu CAM (Figure 3A, B).
REMARQUE: La « compacité » de la colonie métastatique peut s’expliquer soit par l’inhibition de l’invasion des cellules cancéreuses, soit par l’inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses, soit par les deux. Il convient de prêter attention à tous les scénarios et d’isoler les colonies de contact (Figure 3A, B). Un simple stéréomicroscope fluorescent peut être utilisé pour faire la distinction entre les phénotypes de colonies métastatiques compactes et invasives. - Sous le microscope à dissection, tirez doucement le tissu CAM qui contient la colonie métastatique d’intérêt vers le haut à l’aide de pinces fines (Figure 3C).
- Coupez le tissu CAM qui contient la colonie métastatique à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Transférer le tissu CAM qui contient la colonie métastatique dans un tube vide et stérile de 1,5 mL (sur de la glace) et fermer le couvercle du tube.
REMARQUE: Les colonies isolées peuvent être maintenues sur la glace jusqu’à 3 heures sans perte de viabilité. - Répétez la procédure d’excision jusqu’à ce que toutes les colonies d’intérêt soient rassemblées dans des tubes séparés. Pour éviter la souffrance animale, n’excédez pas plus de 2-3 colonies d’un embryon. Euthanasier les embryons par congélation à -20 °C (ou une autre méthode approuvée) immédiatement après l’excision de la colonie.
- Hachez délicatement le tissu CAM dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 18. Utilisez une aiguille séparée pour chaque colonie.
- Ajouter 100 μL de solution de 1x collagénase et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Faites tourner les cellules et le tissu CAM à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer la solution de collagénase et ressusser les cellules dans un milieu complet utilisé pour la lignée cellulaire d’intérêt.
REMARQUE: Normalement, le tissu CAM n’est pas complètement dissocié après le traitement par la collagénase et les cellules cancéreuses prolifèrent d’abord dans les morceaux de tissu CAM et ne migrent que plus tard sur la boîte de culture tissulaire. - Faire tourner à nouveau les cellules et le tissu CAM à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre ensse des cellules et des morceaux de tissu CAM dans 1 mL de milieu complet plus facteur de sélection (le cas échéant), puis transférer dans un seul puits de culture tissulaire de 12 puits.
REMARQUE: Les fibroblastes CAM de poulet peuvent persister dans la culture tissulaire pour de multiples passages inhibant l’expansion clonale. La capacité d’étendre les colonies métastatiques en présence d’un facteur de sélection (c.-à-d. si un vecteur utilisé pour rendre les cellules cancéreuses fluorescentes code également un gène de résistance aux antibiotiques chez les mammifères) peut accélérer considérablement l’expansion clonale. Une expérience de courbe de destruction doit être effectuée avant le dépistage pour s’assurer qu’une concentration appropriée d’antibiotique est utilisée. - Pendant les 1 à 3 prochaines semaines, surveillez quotidiennement les cellules cancéreuses pour la croissance et la contamination.
- Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de la confluence, les cellules de transfert dans une boîte de culture à plus grand volume.
REMARQUE: Il est recommandé d’étendre les cellules jusqu’à ce qu’au moins deux flacons cryogéniques de chaque clone puissent être congelés. Le maintien de grandes quantités de culture tissulaire peut être laborieux et inutile. - Passez au séquençage ou à la prochaine ronde de sélection dès que suffisamment de nombre de cellules cancéreuses sont atteints. Généralement, 1 x 106 de cellules cancéreuses sont suffisantes pour les techniques modernes de séquençage à haut débit.
- Procéder à la réinjection du clone et à l’imagerie et à la quantification de la compacité de la colonie ou du contact cellule-vaisseau sanguin cancéreux (Figure 2A). Vous pouvez également procéder au séquençage à haut débit ou répéter la sélection de la colonie.
REMARQUE : Pour réduire le nombre de faux positifs, il est recommandé d’avoir au moins deux cycles de sélection. Deux approches ont été utilisées avec succès. 1) Développez chaque clone et réinjectez-le individuellement pour confirmer le phénotype de la colonie. 2) Mélangez tous les clones expansés dans un rapport de 1:1 chacun, réinjectez-les sous forme de mélange et répétez le cycle de sélection.
6. Injection de lectines marquées par fluorescence dans le système vasculaire CAM.
- Identifiez la veine à injecter. Il est plus facile d’utiliser le même site d’injection pour la lectine que celui utilisé pour l’injection de cellules tumorales.
- Diluer la solution souche de lectine fluorescente (5 mg/mL) 50-100x avec 1x PBS et la charger dans le même appareil d’injection que celui utilisé pour l’injection de cellules cancéreuses.
REMARQUE: La quantité de lectine qui doit être injectée (normalement 20-100 μL) pour la visualisation des vaisseaux sanguins dépend de la sensibilité du microscope et doit être déterminée expérimentalement avant le dépistage. - Injecter de la lectine en utilisant la même technique que pour l’injection de cellules tumorales (voir étapes 3.6.-3.10.).
- Après l’injection de lectine, placez l’embryon dans l’incubateur pour récupérer pendant 5 min. Injectez un seul embryon à la fois et immédiatement avant l’imagerie de l’embryon.
NOTE. Les embryons âgés de 12 jours ou plus se rétablissent généralement bien des injections de lectine et peuvent être réinjectés avec de la lectine le lendemain pour une imagerie séquentielle. Les embryons plus jeunes sont plus sensibles et peuvent présenter une coagulation sanguine.
7. Visualisation des contacts cellules cancéreuses-vaisseaux sanguins
- Réglez le boîtier du microscope à température régulée à 37 °C environ 6 h avant l’imagerie. Cela stabilisera la température du microscope et aidera à minimiser la dérive XYZ pendant l’imagerie.
NOTE. Une chambre d’imagerie spécialisée d’embryons de poulet9,10,11,12,13 a été utilisée pour cette expérience. Un simple microscope à dissection fluorescente peut être utilisé pour toutes les étapes, de l’injection de cellules cancéreuses à la sélection du clone et à la réinjection du clone, en passant par l’évaluation de la compacité de la colonie. Un microscope confocal équipé d’une chambre d’imagerie est nécessaire pour l’imagerie et la quantification des contacts cellules cancéreuses-vaisseaux sanguins. Aucun chauffage n’est nécessaire jusqu’à 1 h et généralement les embryons survivent à au moins deux séances d’imagerie séquentielle sans impact sur leur viabilité. - Assurez-vous que la lentille d’objectif nécessaire (une lentille d’objectif à immersion dans l’eau de 20 ou 25x est recommandée) a été installée.
- Appliquez une fine couche de graisse sous vide sur la face inférieure du couvercle de la chambre d’imagerie pour créer un joint sécurisé avec le couvercle.
- Positionnez doucement un couvercle dans le couvercle et essuyez tout excès de graisse sous vide.
- Sortez l’embryon injecté de lectine de l’incubateur et coupez les bords du plat de pesée si nécessaire.
- Placez l’embryon dans la chambre d’imagerie avec le couvercle abaissé directement sur la zone du CAM où se trouvent les colonies métastatiques d’intérêt. Abaissez lentement la paupière sur l’embryon jusqu’à ce que le couvercle entre en contact avec le CAM. Serrez les vis pour fixer le couvercle en place, assurez-vous que le couvercle est nivelle et que le couvercle ne met aucune pression vers le bas sur le CAM.
- Acquérir des images de colonies multiples et aléatoires à partir de groupes témoins et expérimentaux (10-20) de plusieurs (5-10) embryons.
NOTE. Il est recommandé d’acquérir des piles 3D aléatoires (1-5um Z-steps; 50-100um range; 25x) de chaque champ. - Utilisez l’option d’assemblage sur le terrain dans le logiciel d’acquisition de microscope, le cas échéant. Étant donné que les images utilisées pour la quantification ne seront pas de qualité de publication, utilisez des modes d’acquisition rapide tels que la numérisation résonnante, le cas échéant. Utilisez un objectif 25x et une couture 3 x 3 avec un pas Z de 5 à 10 μm, une portée totale de 100 μm. Imagez au moins 100 cellules (~ 20 colonies) par condition.
8. Quantification des contacts des vaisseaux sanguins des cellules cancéreuses
- Ouvrez le fichier 3D en tant que pile Z à l’aide du logiciel nécessaire.
NOTE. Un logiciel spécialisé doit être utilisé pour acquérir et analyser des images à haute résolution afin de quantifier le contact entre les cellules cancéreuses et les vaisseaux sanguins. Plusieurs progiciels capables d’analyser des images 3D sont disponibles. Veuillez consulter le Tableau des matériaux pour plus de détails. - Si un mouvement XY important s’est produit lors de l’acquisition de l’image, alignez la pile Z à l’aide du plug-in ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Localisez la ou les cellules qui vous intéressent.
- Faites défiler l’image XYZ dans la direction Z et identifiez la section optique qui contient la longueur maximale du contact des vaisseaux sanguins de la cellule cancéreuse pour la cellule d’intérêt (Figure 2E).
- Mesurez le contact entre les cellules cancéreuses et les vaisseaux sanguins à l’aide de la « fonction de mesure manuelle de la longueur ».
- Entrez les mesures dans le progiciel de données utilisé pour l’analyse statistique.
REMARQUE: La capacité des cellules cancéreuses à se fixer aux vaisseaux sanguins peut être mesurée soit comme la longueur des contacts cellules cancéreuses-vaisseaux sanguins ou le pourcentage de la cellule en contact avec le système vasculaire pour un clone de cellule cancéreuse particulier (ou les deux). - Passez à la cellule suivante qui vous intéresse.
- Analyser les données pour la signification statistique en comparant les clones mutants et les ensembles de données de contrôle.
9. Quantification de la compacité des colonies
- Réinjectez les cellules du clone étendu en utilisant la même technique qu’à l’étape 2.
- Cinq jours après l’injection, acquérir des images de 10 à 50 colonies métastatiques aléatoires pour chaque clone.
REMARQUE: Aucune image de haute qualité n’est nécessaire pour la quantification de la compacité des colonies métastatiques. Les images monochromatiques au stéréomicroscope (grossissement 10x) sont suffisantes. Il faut faire attention à la luminosité de l’image (la plupart des cellules de la colonie doivent être vues) et au contraste (différence entre une ou deux cellules). - Isoler numériquement l’image de la colonie (voir Figure 2C,D) et procéder à la quantification de la compacité de la colonie à l’aide du module autonome de quantification de la compacité de la colonie ou de la notation à l’aveugle13.
- Passez à la prochaine colonie d’intérêt.
- Analyser les données pour la signification statistique en comparant les clones mutants et les ensembles de données de contrôle (c.-à-d. brouillage shRNA).
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Representative Results
L’injection de cellules cancéreuses est considérée comme réussie si la majorité des cellules logées dans les capillaires sont uniques et situées à une différence significative les unes des autres (~0,05-0,1 cm) de sorte que les colonies ne se chevauchent pas après 5-6 jours de période d’incubation (Figure 3A). L’injection n’a pas réussi si une accumulation de cellules cancéreuses peut être observée dans la plupart des capillaires, les embryons présentant cela doivent être jetés (Figure 2E). Un nombre important de cellules cancéreuses injectées périssent dans les 24 heures qui ont eu lieu, ce qui fait que certains embryons semblent rejeter toutes les cellules cancéreuses. La survie des cellules cancéreuses variera en fonction du fournisseur local d’ovules (c.-à-d. la quantité de cellules à injecter peut varier) et nous recommandons fortement que les conditions d’injection optimales (concentration de cellules cancéreuses par rapport à la durée de l’injection) soient déterminées avant de poursuivre l’expérience. Nous recommandons une concentration cellulaire comprise entre 0,5 x 106 et 1,0 x 106 cellules/m. Lorsque la concentration cellulaire optimale et la durée de l’injection sont atteintes, les cellules transduites après injection du jour 5 devraient produire une grande variété de phénotypes de colonies, la majorité des colonies semblant invasives telles que déterminées par les cellules cancéreuses apparaissant dispersées dans le tissu CAM (Figure 3A). Il faut prêter attention aux colonies métastatiques qui semblent « compactes » et qui sont situées suffisamment loin des colonies voisines pour pouvoir être excisées avec des pinces et des ciseaux dans un morceau de tissu CAM(Figure 3C). Un écran positif isolé (c.-à-d. une colonie compacte) devrait afficher le phénotype de la colonie compacte lors de la réinjection(figure 3B). Une diminution de la survie cellulaire (ou du taux de prolifération cellulaire au sein de la colonie) peut également être observée. Par conséquent, il est possible que des nombres de cellules plus élevés devront être injectés pour certains des résultats positifs de l’écran afin d’obtenir suffisamment de nombres de colonies. Pour mesurer les contacts entre les cellules cancéreuses et les vaisseaux sanguins, il convient de prêter attention à la luminosité des taches de la paroi vasculaire (lectine fluorescente; Figure 3D,E) et la quantité appropriée de lectine doivent être injectées pour le signal de paroi vasculaire brillant/contrasté. Tout logiciel d’analyse d’image disponible peut être utilisé pendant les étapes de quantification après l’étalonnage du logiciel de microscope.
Figure 1: Vue d’ensemble de la culture sans coquille d’embryon de poulet. (A) Un plat de pesée avec couvercle préparé pour la culture sans coquille. La flèche pointe vers le coin coupé. (B) Peser les plats disposés en rangées dans la hotte d’écoulement. (C) Couper une coquille d’œuf avec un outil rotatif électrique. (D) Casser un œuf dans un plat de pesée. (E) Embryons cultivés dans l’incubateur humidifié. Barres d’échelle = 1 cm (A-D) ou 5 cm (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Aperçu de l’injection de cellules cancéreuses et de l’isolement des colonies métastatiques. (A) Organigramme décrivant les étapes de la plateforme de dépistage des embryons de poulet. (B) Injection de cellules cancéreuses mise en place au stade du microscope stéréofluoré. (C) Injection des cellules cancéreuses dans le système vasculaire CAM. (D) Image montrant une injection réussie de cellules cancéreuses (densité de cellules cancéreuses acceptable), prise immédiatement après l’injection. (E) Image montrant une mauvaise injection de cellules cancéreuses, considérée comme un embryon sur-injecté. Notez l’accumulation de cellules cancéreuses dans les capillaires sanguins (flèches blanches). Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Résultats représentatifs pour les différentes étapes du protocole de dépistage. (A) Colonies métastatiques formées par des cellules hétérogéniques (cellules HEp3 de la lignée cellulaire cancéreuse transduites par bibliothèque), 5 jours après l’injection. La flèche rouge indique une colonie compacte (coup positif potentiel) qui devrait être excisée. (B) Colonies métastatiques formées par l’un des écrans isolés (KIF3B) après réinjection, 5 jours après l’injection. Les encarts montrent des images de colonies métastatiques découpées numériquement à partir des carrés en pointillés. Il s’agit d’une qualité d’image acceptable pour la quantification de l’I.C. La valeur moyenne de C.I. pour la réinjection de hit (KIF3B) est indiquée. (C) Isolement de la colonie métastatique d’intérêt du tissu CAM. Sections optiques représentatives de (D) une colonie témoin, et (E) d’une colonie de surexpression de l’ARNH KIF3B, les deux montrant des mesures de contact cellule-sang cancéreux. La vascularisation CAM est étiquetée avec de la lectine fluorescente-649. Barres d’échelle = 1 cm (A-C) ou 50 μm (D, E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole de dépistage intravital basé sur la microscopie à fluorescence rapide qui peut être utilisé pour des applications importantes telles que les criblages génétiques ou candidats médicaments. Les cellules cancéreuses qui ont été transduies avec une bibliothèque génétique d’intérêt ou transfectées avec des constructions d’expression individuelles peuvent être rapidement dépistées et quantifiées quant au phénotype d’intérêt à l’aide de ce modèle CAM de poussin. Étant donné que les protocoles de transduction ou de transfection varient considérablement en fonction du type de bibliothèque, ils ne sont pas inclus dans cette procédure. Les colonies métastatiques phénotypiquement pertinentes sont excisées de la CAM, élargies et l’ADN isolé pour un séquençage à haut débit afin d’identifier la construction d’expression d’intérêt. Généralement, chaque bibliothèque génétique est équipée de séquences d’amorce et de méthodes recommandées de purification de l’ADN génomique. Nous vous recommandons d’utiliser les directives locales de l’installation pour obtenir les meilleurs résultats de séquençage à haut débit.
Il est recommandé de déterminer la multiplicité optimale de l’infection (M.O.I.) pour une bibliothèque et une lignée cellulaire avant le dépistage. Idéalement, chaque cellule (et donc la future colonie métastatique) ne devrait contenir qu’une seule construction d’expression génique, mais selon notre expérience, ce n’est pas toujours réalisable. Nous vous recommandons de suivre le protocole du fabricant de la bibliothèque et de tester une large gamme de M.O.I. (0,01-5) pour obtenir le plus proche possible de 1. La présence de plusieurs constructions d’expression de bibliothèque dans chaque colonie métastatique peut compliquer considérablement l’analyse du phénotype de la colonie. Nous vous recommandons également d’utiliser le contrôle négatif fourni par le fabricant de la bibliothèque dans vos expériences (c’est-à-dire un vecteur d’expression de shRNA brouillé qui est marqué par fluorescence).
Notre protocole de dépistage est basé sur la sélection de colonies fluorescentes non invasives; il est essentiel de s’assurer que toutes les lignées cellulaires utilisées dans les expériences ont une intensité de fluorescence similaire. L’intensité inégale de la fluorescence entre les cellules (et les colonies métastatiques) peut entraîner une sélection biaisée des colonies en raison de la luminosité des cellules ou des colonies au lieu de l’invasivité.
Par rapport aux méthodes existantes, notre protocole offre plusieurs avantages uniques tels que la rapidité, le faible coût et la capacité de compléter le cycle d’écran intravital sans avoir besoin d’un équipement d’imagerie sophistiqué12,13,14. De plus, l’ensemble du cycle de dépistage peut être complété en 3 à 6 semaines, de l’injection cellulaire au stade du séquençage. Aucun microscope à haute résolution n’est nécessaire pour l’injection de cellules cancéreuses ou l’isolement de colonies métastatiques, car ces étapes peuvent être effectuées à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent de base à la disposition de la plupart des chercheurs. Enfin, étant donné que la culture d’embryons sans coquille est complètement autonome, il n’est pas nécessaire de prévoir des horaires compliqués de logement ou d’alimentation des animaux de recherche. La plupart des établissements de recherche ne considèrent pas les embryons de poulet comme des animaux vivants, ce qui réduit considérablement le coût et le fardeau de documentation associés à ce modèle.
Cependant, il existe certaines limitations associées au modèle d’embryon sans coquille. Tout d’abord, toutes les lignées cellulaires cancéreuses ne fonctionnent pas efficacement dans ce modèle. Dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement plusieurs lignées cellulaires cancéreuses, telles que HT1080 (fibrosarcome humain), HEp3 (tête et cou) et mélanome b16 de souris et lignées cellulaires de cancer du sein 4T1, qui forment de manière robuste des colonies métastatiques lorsqu’elles sont injectées dans le système vasculaire CAM du poulet. D’autres lignées cellulaires avec différents types de cancer tels que le sein (MDA468), le cerveau (U87 et U118) ou l’ovaire (A2780s) forment facilement des colonies métastatiques lorsqu’elles sont injectées dans le CAM et peuvent donc être utilisées dans ce protocole de dépistage ainsi que12,14,15. Pourtant, d’après notre expérience, les lignées cellulaires cancéreuses couramment utilisées telles que LnCaP et PC3 ne fonctionnent pas bien dans ce modèle (observations non publiées). Une autre limitation est qu’un microscope confocal avec une plage d’imagerie de 100 à 200 μm est nécessaire pour l’imagerie à haute résolution, telle que la visualisation des contacts des vaisseaux sanguins des cellules cancéreuses, cet équipement peut ne pas être disponible pour de nombreux chercheurs.
Dans l’ensemble, ce protocole décrit une plate-forme de dépistage intravital rapide qui peut être utilisée pour la découverte de suppresseurs et de facteurs de métastases cancéreuses. Nous croyons fermement que la robustesse et la facilité d’utilisation de ce modèle en feront un modèle de dépistage essentiel pour de nombreux chercheurs.
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Disclosures
Rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de l’Institut de recherche de la Société canadienne du cancer #702849 à JDL et KS. Le Dr Lewis est titulaire de la Chaire Frank et Carla Sojonky en recherche sur le cancer de la prostate soutenue par l’Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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