Summary
Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.
Abstract
Recente vooruitgang in kankeronderzoek heeft de zeer complexe aard van kankermetastasen aangetoond. Meerdere genen of genennetwerken bleken betrokken te zijn bij het differentieel reguleren van kankermetastaseerde cascadegenen en genproducten die afhankelijk zijn van het kankertype, weefsel en individuele patiëntkenmerken. Deze vertegenwoordigen potentieel belangrijke doelen voor genetische therapieën en gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen. De ontwikkeling van platforms voor snelle screening is essentieel voor de identificatie van deze genetische doelen.
Het kuiken chorioallantoic membraan (CAM) is een sterk gevasculariseerd, collageenrijk membraan onder de eierschaal dat gasuitwisseling in het zich ontwikkelende embryo mogelijk maakt. Vanwege de locatie en vascularisatie van de CAM, ontwikkelden we het als een intravitaal metastasemodel voor menselijke kankercellen dat robuuste menselijke kankercel xenografting en real-time beeldvorming van kankercelinteracties met de collageenrijke matrix en vasculatuur mogelijk maakt.
Met behulp van dit model is een kwantitatief screeningsplatform ontworpen voor de identificatie van nieuwe drivers of suppressors van kankermetastasen. We transduceerden een pool van hoofd-hals HEp3 kankercellen met een complete menselijke genoom shRNA genbibliotheek, en injecteerden de cellen vervolgens, met lage dichtheid, in de CAM vasculatuur. De cellen verspreidden zich en vormden eencellige celkolonies. Individuele kolonies die niet in staat waren om binnen te dringen in het CAM-weefsel waren zichtbaar als een compact koloniefenotype en verwijderd voor identificatie van het transduceerde shRNA dat in de cellen aanwezig was. Beelden van individuele kolonies werden beoordeeld op hun invasiviteit. Meerdere selectierondes werden uitgevoerd om het aantal valse positieven te verlagen. Individuele, geïsoleerde kankercelklonen of nieuw ontwikkelde klonen die genen van belang uitdrukken, werden onderworpen aan primaire tumorvormingstest of kankercel vasculatuur co-optie analyse. Samenvattend presenteren we een platform voor snelle screening dat antimetastatische doelidentificatie en intravitale analyse van een dynamische en complexe cascade van gebeurtenissen mogelijk maakt.
Introduction
Metastase is de belangrijkste oorzaak van de dood van kankerpatiënten1,2,3. Gemetastaseerde kankercellen maken gebruik van verschillende signaleringsroutes, afhankelijk van het type kanker, gedurende de vijf stappen van de gemetastaseerde cascade: lokale invasie, intravasatie, overleving in de bloedsomloop, extravasatie en kolonieuitbreiding op verre gemetastaseerde locaties. Huidig begrip van dit gemetastaseerde proces suggereert dat er twee knelpuntstappen zijn, de ene is directionele invasie van de kankercel van de primaire tumor, en de tweede is de oprichting van de verre plaats gemetastaseerde laesie4,5,6. Beide stappen vereisen dat kankercellen actief interageren met collageen en vasculatuur op de plaatsen van initiële invasie of verre gemetastaseerde laesievorming. Daarom moeten gemetastaseerde kankercellen zich aan cellen kunnen hechten, collageenvezels kunnen remodelleren en directioneel langs vaatwanden kunnen binnendringen7. Screeningsmodellen die snel antimetastatic therapeutische doelen kunnen identificeren om kankercellen te blokkeren van het voltooien van deze stappen is van het grootste belang. Bestaande in vitro screeningmodellen bootsen de complexe levende weefselomgeving niet volledig na. Muismodellen zijn duur en tijdrovend. Daarom is er dringend behoefte aan intravital screeningplatforms die complexe leefweefselomgevingen en snelle identificatie van doelen bieden.
In het afgelopen decennium is het kippenembryo vastgesteld als een robuust en kosteneffectief model van menselijke kankermetastasen8,9,10,11,12. Het kuiken chorioallantoic membraan (CAM) weefsel is dun en doorschijnend waardoor het ideaal is voor intravitale microscopische beeldvorming van cel- en koloniegedrag in primaire tumor- en/of gemetastaseerde plaatsen12. Primaire tumorgroei uit meerdere menselijke kankercellijnen kan worden gestart en uitgezaaid binnen een periode van slechts enkele dagen na micro-inititie in het CAM-weefsel. Kankercellen kunnen op verschillende manieren in het CAM-weefsel worden toegediend, waaronder intraveneus, intra-CAM of als collageen op planten, deze flexibiliteit stelt de onderzoeker in staat om zich te concentreren op specifieke stadia van kankerprogressie, bijvoorbeeld gemetastaseerde laesievorming, invasie uit de primaire tumor of angiogenese.
Hier beschrijven we een kwantitatief screeningsplatform dat kan worden gebruikt om het vermogen van kankercellen te meten om invasieve gemetastaseerde laesies vast te stellen. Kankercellen die zijn getransduceerd met een expressiebibliotheek worden intraveneus geïnjecteerd in de CAM-vasculatuur met een lage dichtheid. Gemetastaseerde kolonies vormen zich gedurende 4-5 dagen, waarna de invasiecapaciteit en vasculatuurinteractie van de resulterende kolonies wordt geëvalueerd. Individuele kolonies die niet binnenvallen worden verwijderd, vermeerderd en hun fenotype wordt bevestigd in het CAM door herintroductie en kwantificering van kolonieverdichting en kankercel-bloedvatcontacten. De expressiebibliotheekconstructies die verantwoordelijk zijn voor het mutante fenotype van de enkele gemetastaseerde kolonie worden geïdentificeerd aan de deleis van geïsoleerd colony genomisch DNA via sequencing met hoge doorvoer. Hetzelfde platform kan verder worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen een gen en het waargenomen fenotype te valideren of om diepgaande mechanistische studies uit te voeren naar het waargenomen fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Alberta. Aviaire embryo's worden door veel onderzoeksinstituten niet als levende dieren beschouwd en er zijn geen dierprotocollen vereist. Het is echter een aanvaarde opvatting dat aviaire embryo's pijn kunnen voelen en daarom zo humaan mogelijk moeten worden behandeld. De plaatselijke instantie voor dieronderzoek moet worden gecontacteerd voordat met onderzoek wordt gewerkt om ervoor te zorgen dat de juiste voorschriften worden nageleefd.
1. Shell-less eiercultuur
- Koop bevruchte kippeneieren van de lokale leverancier. Dit experiment maakt gebruik van white leghorn kippenras; andere rassen kunnen echter ook worden gebruikt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 10% meer eieren te verkrijgen dan nodig is in het geval dat sommige embryo's beschadigd raken tijdens het kraken en niet kunnen worden gebruikt in dit protocol. - Breng het vereiste aantal eieren over in een 60% bevochtigde schommelincubator. De rest van de eieren kan maximaal twee weken bij 12 °C worden bewaard zonder verlies van levensvatbaarheid.
- Incubeer de eieren vier dagen in de bevochtigde schommelincubator.
OPMERKING: Dag 1 is wanneer de eieren worden overgebracht naar de schommelende incubator. - Bereid de weegschalen en plastic deksels voor op de schaalloze eiercultuur. Snijd een van de hoeken van elk van de weegschalen om een efficiënte luchttoegang tot het embryo mogelijk te maken (figuur 1A).
- Schik de bereide weegschalen in rijen in de flowkap. (figuur 1B).
- Bereid in een aparte weegschaal 70% ethanol voor het spoelen van eieren.
- Dompel het ei kort in 70% ethanol en gebruik vervolgens het elektrische roterende gereedschap om voorzichtig vier sneden van 2-3 mm parallel aan de grootste latituinale diameter van het ei te maken (figuur 1C).
- Doe het gesneden ei in een weegschaal en druk het ei voorzichtig tegen de bodem van de schaal tot er een scheur in de eierschaal ontstaat (afbeelding 1D).
- Trek de eierschaalhelften uit elkaar en laat het embryo in de weegschaal glijden. Gooi de eierschaal weg en bedek de weegschaal met een deksel.
- Breng de embryo's over in bevochtigde niet-schommelende incubator (figuur 1E).
OPMERKING: Weegschalen die de embryo's bevatten, worden in aparte plastic containers (12 embryo's/containers) geplaatst. Dit verhoogt de levensvatbaarheid van embryo's en maakt experimentspecifieke embryo-organisatie mogelijk. - Incubeer embryo's nog 6 dagen (tot 10 dagen oud). Controleer dagelijks op dode of besmette embryo's en verwijder ze uit de incubator.
OPMERKING: Embryo's kunnen worden besmet door schimmelsporen in de lucht. Schimmelbesmetting manifesteert zich aanvankelijk als witte spikkels op het CAM-oppervlak van het embryo. Verwijder de besmette embryo's onmiddellijk en veeg de incubator wekelijks af met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. In onze ervaring zijn de besmettingsniveaus zeer laag ~1-3%. - Gebruik deze embryo's voor kankercelinjectie in de ochtend van dag 10.
2. Voorbereiding van de kankercellen voor injectie
OPMERKING: Gemetastaseerde kolonieselectie is gebaseerd op een fenotype dat is vastgesteld door fluorescerende kankercellen, afgeleid van een expressiebibliotheek of vector gelabeld met fluorescerend eiwit zoals groen of rood fluorescerend eiwit (zie de hele schermstroom in figuur 2A). Het wordt niet aanbevolen om cellen te gebruiken die tijdelijk zijn getransfecteerd met fluorescerende eiwitten of gelabeld met celdoorlatende fluorescerende kleurstoffen als gevolg van snelle vervaging van het signaal veroorzaakt door proliferatie van kankercellen en ongelijkmatige vlekken.
- Kweek kankercellen tot 60-70% samenvloeiing op het moment van injectie. Het gebruik van kankercellen bij hogere niveaus van samenvloeiing zal hun levensvatbaarheid verminderen, wat resulteert in een lage efficiëntie van gemetastaseerde kolonievorming. Zorg ervoor dat de gebruikte kankercellen mycoplasmavrij zijn, omdat mycoplasmabesmetting kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid van kippenembryo's.
- Spoel cellen tweemaal met 1x PBS pH 7,4. Verwijder de resterende PBS, voeg vervolgens 0,5% Trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2-5 minuten totdat alle cellen van het oppervlak van de kweekschaal zijn opgetild.
- Breng de celsuspensie over in 15 ml conische buis en centrifugeer cellen bij kamertemperatuur bij 200 x g gedurende 5 minuten.
- Resuspend cellen in 10 ml PBS om de cellen opnieuw te centrifugeren zoals in stap 2.3, om trypsine en andere cultuurmediacomponenten zoals antibiotica te verwijderen.
OPMERKING: De aanwezigheid van trypsine of celkweekcomponenten zoals antibiotica in de suspensie van kankercellen kan leiden tot een verminderde levensvatbaarheid van kippenembryo's. - Aspireer de supernatant en resuspend cellen voorzichtig met 1 ml ijskoud PBS.
- Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of andere beschikbare celtelapparatuur.
OPMERKING: Dit screeningsprotocol vereist dat elke gemetastaseerde kolonie wordt geïnitieerd door één cel. Let er bij het tellen van de cellen op dat de cellen volledig zijn trypsinized en bestaan als een enkele celsuspensie (er zijn geen celklonters aanwezig). - Voor intraveneuze (IV) injectieconcentraatcellen tot 0,5 x 106 tot 1,0 x 106 cellen/ml. Gebruik ijskoud 1x PBS om celconcentraten te verdunnen en/of te resuspenden. Verwacht dat ongeveer 1 ml celsuspensie nodig is voor elke tien embryo's.
OPMERKING: De noodzakelijke celsuspensieconcentratie in suspensie wordt voornamelijk bepaald door het niveau van de ervaring van de experimenteerder. Zie de volgende sectie voor meer informatie.
3. Intraveneuze injectie van kankercellen voor gemetastaseerde kolonievorming
OPMERKING: Volgens dit protocol kunnen maar liefst honderd embryo's binnen één dag worden geïnjecteerd. Het duurt over het algemeen langer om de gemetastaseerde kolonies te isoleren (stap 5) en vervolgens de kankercellen te injecteren en daarom wordt aanbevolen om een eerste experiment uit te voeren om de tijd te schatten die nodig is om alle stappen te voltooien. Het gebruik van differentiële fluorescerende kankercellabels helpt het aantal dieren en de tijd die nodig is voor elk experiment te verminderen. Controlecellen kunnen bijvoorbeeld worden gelabeld met RFP (rood fluorescerend eiwit), terwijl gemuteerde tumorcellen als alternatief kunnen worden gelabeld met GFP (groen fluorescerend eiwit). In dit geval heeft elk experiment een ingebouwde controle die corrigeert voor inter-embryo variabiliteit.
- Monteer het injectieapparaat zoals afgebeeld op figuur 2B. Monteer eerst een naald op de spuit en verleng vervolgens de spuitnaald met een 3-5 cm lang stuk slang.
- Breek de punt van de borosilicaatnaald af met behulp van de fijne tang (~20-60 μL breed).
- Plaats de spuit met de suspensie van de kankercel (50-200 μL) en steek de borosilicaatnaald in de slang (afbeelding 2B).
- Inspecteer de borosilicaatnaald op celverstopping en luchtbellen. Het is van cruciaal belang om cellen te injecteren als een enkele cel suspensie om ervoor te zorgen dat elke gemetastaseerde kolonie wordt geïnitieerd door een enkele cel.
OPMERKING: Kankercellen hebben de neiging om binnen 1-2 uur na trypsinisatie in PBS samen te voegen en moeten daarom onmiddellijk vóór de injectie worden bereid. Indien nodig kunnen cellen periodiek worden geresuspendeerd met behulp van de 1 ml spuit die wordt gebruikt voor injecties (zonder de borosilicaatnaald). - Als celverstopping wordt waargenomen in het capillair, verwijdert u het capillair, schorst u de cellen opnieuw en vervangt u het door een nieuw capillair. Gebruik de zuiger om eventuele bellen naar buiten te duwen. Als er geen celverstopping of bellen worden waargenomen, gaat u verder met de volgende stap.
- Verwijder het deksel van het deksel en breng het embryo onder de stereoscoop over. Identificeer de juiste ader die op het CAM-oppervlak moet worden geïnjecteerd. Aders en slagaders vormen het ingewikkelde netwerk in het CAM-weefsel (Figuur 2C). Aders onderscheiden zich door de helderdere rode kleur omdat ze zuurstofrijk bloed naar het embryo vervoeren.
OPMERKING: Gebruik voor algemene embryomanipulatie, kankercelinjectie en gemetastaseerde kolonie-excisie een fluorescerende stereomicroscoop met 0,8x en 1,5x doelstellingen en 10x oculairs voor visualisatie. Minder geavanceerde microscoop kan ook met succes worden gebruikt voor deze procedures, afhankelijk van het ervaringsniveau van de gebruikers. Lezers kunnen contact opnemen met de auteurs voor meer gedetailleerde aanbevelingen. - Zoek de ideale ader om cellen te injecteren die normaal gesproken slechts iets breder zijn (10-20%) dan de diameter van de naaldpunt van borosilicaat en zich halverwege tussen het embryo en de wand van de weegschaal bevinden. Het is over het algemeen gemakkelijker om te injecteren op het punt direct grenzend aan de ader bifurcatie.
OPMERKING: Injectie in een grotere ader lijkt misschien gemakkelijker, maar zal leiden tot overmatig bloeden en verminderde embryo-overleving. - Druk de punt van de naald tegen de bloedvatwand en oefen zachte druk uit in dezelfde richting als de bloedstroom. Gebruik indien nodig een wattenstaafje (met andere hand) om het geïnjecteerde vat te helpen verankeren of stabiliseren.
- Druk de zuiger van de spuit voorzichtig in. Men kan een succesvolle injectie visualiseren door een "opheldering" van het bloedvat te observeren wanneer de suspensie van de kankercel in de bloedstroom komt.
- Blijf de zuiger van de spuit 2-10 s in drukken totdat het gewenste suspensievolume in de bloedstroom van de ader wordt geïnjecteerd. Alles bij elkaar kan de injectie van een enkel embryo 1-10 minuten vereisen, afhankelijk van het ervaringsniveau van de gebruiker. Als er overmatige bloedingen of duidelijke vochtophoping op de injectieplaats verschijnen, gooi het embryo dan weg.
OPMERKING: Het is gemakkelijk om een embryo te "over-injecteren". De algemene overweging die in gedachten moet worden gehouden, is dat gemetastaseerde kolonies elkaar niet mogen raken na een groeiperiode van 4-5 dagen. Idealiter ~5-10% van terminale CAM ader haarvaten moeten cellen geïmmobiliseerd in hen na een succesvolle injectie(Figuur 2D,E). Zoals vermeld in stap 2 kan een celconcentratie worden gebruikt (0,5 x 106 - 1,0 x 106 cellen/ml). Lagere concentraties vereisen een langere injectietijd, maar verminderen de naald verstopping. Hogere concentraties vereisen kortere injectietijden, maar verhogen de naald verstopping. Het wordt aanbevolen om verschillende concentraties te proberen om degene te vinden die het meest comfortabel is voor een operator. Over het algemeen heeft een hogere concentratie (1,0 x10 6 cellen/ml) de voorkeur om de injectietijd te verkorten. - Verwijder de naald van de CAM en dep de injectieplaats voorzichtig met een wattenstaafje om bloed of overtollige kankercellen te verwijderen.
- Bedek het embryo in de weegschaal met een deksel en breng het geïnjecteerde kippenembryo terug in de incubator.
- Herhaal de procedure met het volgende embryo totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd.
4. Embryoonderhoud tijdens de gemetastaseerde koloniegroei
- Inspecteer de embryo's visueel. Als er doden zijn en/of besmet zijn met bacteriën of schimmels, verwijder ze dan uit de incubator, autoclaaf ze en gooi ze weg volgens laboratoriumverwijderingsprocedures.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om embryo's om de andere dag (dag 1, 3, 5 na kankercelinjectie) te inspecteren op gemetastaseerde koloniegroei. Vermijd onnodig bewegen van de geïnjecteerde embryo's, omdat dit embryoschade en/of de dood kan veroorzaken. - Als cellen overgroei vertonen (gemetastaseerde kolonies overlappen met elkaar) of ongelijke verdeling in het CAM-weefsel (gemetastaseerde kolonies in kleine deelgebieden van het CAM-oppervlak) verwijder dat embryo dan uit het experiment. Euthanaseer afgedankte embryo's door ze onmiddellijk na verwijdering uit het experiment in te vriezen bij -20 °C (of een andere goedgekeurde methode). Het aantal levensvatbare gemetastaseerde cellen in het CAM-weefsel zal in eerste instantie afnemen (dagen 1-2) en vervolgens toenemen (dagen 2-5).
OPMERKING: Sommige embryo's kunnen de kankercellen "afwijzen", d.w.z. alle kankercellen zullen uit het CAM-weefsel verdwijnen. Deze embryo's moeten uit het experiment worden verwijderd. Normaal gesproken zijn kankercelkolonies te zien door het transparante deksel onder de fluorescerende stereomicroscoop zonder de weegschaal te openen. - Zorg ervoor dat gemetastaseerde kolonies uniform van vorm lijken (eerste 1-3 dagen na injectie). Identificeer invasieve of niet-invasieve gemetastaseerde kolonies op dag 4-5 na injectie (zie rubriek 5 voor meer informatie).
5. Isolatie van gemetastaseerde kolonies
- Op dag 5 na injectie embryo's uit de incubator verwijderen en de embryo-CAMs inspecteren op gemetastaseerde kolonieverdeling. Identificeer de embryo's met een uniforme kolonieverdeling waarin compacte (of overdreven invasieve) kolonies aanwezig zijn.
OPMERKING: Het proces van het cultiveren van kippenembryo's is niet steriel, daarom moeten alle screeningsstappen onder zeer schone omstandigheden worden uitgevoerd om toekomstige weefselkweekbesmetting te voorkomen. Besmetting is vrij zeldzaam en kan gemakkelijk worden vermeden door handschoenen en een masker te dragen en alleen steriel gereedschap te gebruiken tijdens celinjectie en kolonieisolatieprocedures. Het wordt aanbevolen om embryo's één voor één te inspecteren om hun blootstelling aan de omgevingstemperatuur van het laboratorium te verminderen en besmetting te voorkomen. - Lokaliseer de gemetastaseerde kolonie van belang. Een compacte kolonie kan worden beschreven als een kolonie met de meeste kankercellen in een beperkt gebied in het CAM-weefsel (cellen lijken "samengeklonterd"). Een invasieve kolonie kan worden omschreven als kolonie waar kankercellen zich "verspreiden" in het CAM-weefsel (figuur 3A, B).
OPMERKING: "Compactheid" van de gemetastaseerde kolonie kan worden verklaard door de remming van de invasie van kankercellen, remming van de proliferatie van kankercellen of beide. Er moet aandacht worden besteed aan alle scenario's en contactkolonies moeten worden geïsoleerd (figuur 3A, B). Een eenvoudige fluorescerende stereomicroscoop kan worden gebruikt om te discrimineren tussen compacte en invasieve gemetastaseerde koloniefenotypes. - Trek onder de dissectiemicroscoop voorzichtig het CAM-weefsel dat de gemetastaseerde kolonie van belang bevat naar boven met behulp van fijne tang (figuur 3C).
- Snijd het CAM-weefsel dat de gemetastaseerde kolonie bevat af met een chirurgische schaar.
- Breng het CAM-weefsel dat de gemetastaseerde kolonie bevat over in een lege, steriele buis van 1,5 ml (op ijs) en sluit het buisdeksel.
OPMERKING: Geïsoleerde kolonies kunnen tot 3 uur op ijs worden gehouden zonder verlies van levensvatbaarheid. - Herhaal de excisieprocedure totdat alle kolonies van belang in afzonderlijke buizen zijn verzameld. Om dierenleed te voorkomen, mag niet meer dan 2-3 kolonies uit één embryo worden verwijderd. Euthanaseer embryo's door in te vriezen bij -20 °C (of een andere goedgekeurde methode) onmiddellijk na de excisie van de kolonie.
- Gehakt het CAM-weefsel voorzichtig in een microcentrifugebuis met behulp van een steriele naald van 18 gauge. Gebruik een aparte naald voor elke kolonie.
- Voeg 100 μL 1x collagenaseoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Draai de cellen en het CAM-weefsel gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur op 300 x g.
- Aspireer de collagenase-oplossing en resuspend cellen in volledige media die worden gebruikt voor de cellijn van belang.
OPMERKING: Normaal gesproken is CAM-weefsel niet volledig gescheiden na collagenasebehandeling en kankercellen zullen zich eerst verspreiden in de stukjes CAM-weefsel en pas later migreren naar de weefselkweekschaal. - Draai de cellen en het CAM-weefsel opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur.
- Resuspend cellen en CAM weefsel stukken in 1 ml van complete media plus selectiefactor (indien aanwezig), vervolgens overbrengen in enkele 12 goed weefsel cultuur schotel goed.
OPMERKING: KippenCAM fibroblasten kunnen in weefselkweek blijven bestaan voor meerdere passages die de klarenexpansie remmen. Het vermogen om de gemetastaseerde kolonies uit te breiden in aanwezigheid van selectiefactor (d.w.z. als een vector die werd gebruikt om kankercellen fluorescerend te maken ook codeert voor een zoogdier antibioticumresistentiegen) kan de klaonale expansie aanzienlijk versnellen. Vóór de screening moet een kill curve-experiment worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de juiste concentratie antibioticum wordt gebruikt. - Controleer de komende 1-3 weken kankercellen dagelijks op groei en besmetting.
- Wanneer cellen 70-80% van de samenvloeiing bereiken, worden cellen overgedragen in een groter volume kweekschaal.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om cellen uit te breiden totdat ten minste twee cryogene flacons van elke kloon kunnen worden ingevroren. Het handhaven van grote hoeveelheden weefselkweek kan moeizaam en onnodig zijn. - Ga verder met sequencing of de volgende selectieronde zodra voldoende kankercelnummers zijn bereikt. Over het algemeen is 1 x10 6 van kankercellen voldoende voor moderne sequencingtechnieken met hoge doorvoer.
- Ga verder met de kloonherintroductie en beeldvorming en kwantificering van kolonieverdichting of contact tussen kankercel en bloedvaten (figuur 2A). U kunt ook doorgaan met sequencing met hoge doorvoer of de kolonieselectie herhalen.
OPMERKING: Om het aantal valse positieven te verminderen, wordt ten minste twee selectierondes aanbevolen. Er zijn twee benaderingen met succes toegepast. 1) Breid elke kloon uit en hervind individueel om het koloniefenotype te bevestigen. 2) Meng alle geëxpandeerde klonen in een verhouding van 1:1 elk, herbeter als een mengsel en herhaal de selectiecyclus.
6. Injectie van fluorescerend gelabelde lectines in de CAM vasculatuur.
- Identificeer de te injecteren ader. Het is gemakkelijker om dezelfde injectieplaats te gebruiken voor lectine die werd gebruikt voor tumorcelinjectie.
- Verdun fluorescerende lectinevoorraadoplossing (5 mg/ml) 50-100x met 1x PBS en laad deze in hetzelfde injectieapparaat als gebruikt voor kankercelinjectie.
OPMERKING: De hoeveelheid lectine die moet worden geïnjecteerd (normaal 20-100 μL) voor bloedvatvisualisatie is afhankelijk van de gevoeligheid van de microscoop en moet experimenteel worden bepaald vóór screening. - Injecteer lectine met dezelfde techniek als bij tumorcelinjectie (zie stap 3.6.-3.10.).
- Plaats na de lectine-injectie het embryo in de incubator om 5 minuten te herstellen. Injecteer slechts één embryo tegelijk en vlak voor het in beeld brengen van het embryo.
NOTITIE. Embryo's die 12 dagen of ouder zijn, herstellen over het algemeen goed van de lectine-injecties en kunnen de volgende dag opnieuw met lectine worden geïnjecteerd voor sequentiële beeldvorming. Jongere embryo's zijn gevoeliger en kunnen bloedstolling vertonen.
7. Visualisatie van contacten tussen kankercellen en bloedvaten
- Stel de temperatuurgeregelde microscoopbehuizing ongeveer 6 uur voor de beeldvorming in op 37 °C. Dit stabiliseert de microscooptemperatuur en helpt XYZ-drift tijdens beeldvorming te minimaliseren.
NOTITIE. Een gespecialiseerde kip embryo beeldvorming kamer9,10,11,12,13 werd gebruikt voor dit experiment. Een eenvoudige fluorescerende dissectiemicroscoop kan worden gebruikt voor alle stappen, van kankercelinjectie tot kloonselectie en kloonherintroductie, en evaluatie van de kolonieverdichting. Een confocale microscoop die is uitgerust met een beeldvormingskamer is nodig voor beeldvorming en kwantificering van contacten tussen kankercellen en bloedvaten. Er is geen verwarming nodig tot 1 uur en over het algemeen overleven embryo's ten minste twee opeenvolgende beeldvormingssessies zonder gevolgen voor hun levensvatbaarheid. - Zorg ervoor dat de benodigde objectieve lens (20x of 25x water dompel objectief wordt aanbevolen) is geïnstalleerd.
- Breng een dun laagje vacuümvet aan op de onderkant van het deksel van de beeldkamer om een veilige afdichting met de afdeklip te creëren.
- Plaats voorzichtig een afdeklip in het deksel en veeg eventueel overtollig vacuümvet weg.
- Haal het in lectine geïnjecteerde embryo uit de incubator en snijd indien nodig de randen van de weegschaal door.
- Plaats het embryo in de beeldvormingskamer met de afdeklip direct naar beneden op het gebied van de CAM waar de gemetastaseerde kolonies van belang zich bevinden. Laat het deksel langzaam op het embryo zakken totdat de afdeklip net in contact komt met de CAM. Draai de schroeven vast om het deksel vast te zetten, zorg ervoor dat het deksel waterpas staat en dat de afdeklip geen neerwaartse druk uitoefent op de NOK.
- Verkrijg beelden van meerdere, willekeurige kolonies uit controle- en experimentele groepen (10-20) uit verschillende (5-10) embryo's.
NOTITIE. Het verkrijgen van willekeurige 3D-stacks (1-5um Z-stappen; 50-100um bereik; 25x) van elk veld wordt aanbevolen. - Gebruik de optie veldsteken in de microscoopacquisitiesoftware indien beschikbaar. Aangezien afbeeldingen die worden gebruikt voor kwantificering geen publicatiekwaliteit zijn, gebruikt u snelle acquisitiemodi zoals resonant scannen indien beschikbaar. Gebruik 25x objectief en 3 x 3 stiksels met 5-10 μm Z-step, 100 μm totaal bereik. Afbeelding ten minste 100 cellen (~ 20 kolonies) per voorwaarde.
8. Kwantificering van bloedvatcontacten met kankercellen
- Open het 3D-bestand als een Z-stack met behulp van de benodigde software.
NOTITIE. Gespecialiseerde software moet worden gebruikt om beelden met hoge resolutie te verkrijgen en te analyseren om contact tussen kankercel en bloedvaten te kwantificeren. Er zijn verschillende softwarepakketten beschikbaar die in staat zijn tot 3D-beeldanalyse. Zie de tabel met materialen voor meer informatie. - Als er tijdens de beeldverwerving significante XY-beweging heeft plaatsgevonden, lijnt u de Z-stack uit met behulp van de ImageJ StackReg-plug-in (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Zoek de cel(en) van belang.
- Blader door de XYZ-afbeelding in de Z-richting en identificeer de optische sectie die de maximale lengte van het contact met het bloedvat van kankercellen voor de cel van belang bevat (Figuur 2E).
- Meet het contact tussen kankercel en bloedvat met behulp van de "handmatige lengtemetingsfunctie".
- Voer de metingen in het gegevenssoftwarepakket in dat wordt gebruikt voor statistische analyse.
OPMERKING: Het vermogen van kankercellen om zich aan de bloedvaten te hechten kan worden gemeten als de lengte van de contacten tussen kankercellen en bloedvaten of het percentage van de cel dat in contact komt met de vasculatuur voor een bepaalde kloon van kankercellen (of beide). - Ga naar de volgende cel van belang.
- Analyseer de gegevens voor statistische significantie waarbij mutante kloon(en) en besturingsgegevenssets worden vergeleken.
9. Kwantificering van kolonieverdichting
- Plaats de cellen van de uitgevouwen kloon opnieuw met dezelfde techniek als in stap 2.
- Vijf dagen na injectie krijgen beelden van 10-50 willekeurige gemetastaseerde kolonies voor elke kloon.
OPMERKING: Er zijn geen afbeeldingen van hoge kwaliteit nodig voor de kwantificering van de gemetastaseerde kolonieverdichting. Monochromatische, stereomicroscoop (10x vergroting) beelden zijn voldoende. Er moet aandacht worden besteed aan de helderheid van het beeld (de meeste cellen in de kolonie moeten worden gezien) en het contrast (verschil tussen een of twee cellen). - Isoleer het koloniebeeld digitaal (zie figuur 2C, D) en ga verder met kolonieverdichting kwantificering met behulp van de zelfstandige kolonieverdichtingskwantificeringsmodule of blinde score13.
- Ga naar de volgende kolonie van belang.
- Analyseer de gegevens voor statistische significantie waarbij mutante kloon(en) en controlegegevenssets (d.w.z. scramble shRNA) worden vergeleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kankercelinjectie wordt als succesvol beschouwd als de meerderheid van de cellen die zich in de haarvaten bevinden, enkelvoudig zijn en zich op een significant verschil van elkaar bevinden (~ 0,05-0,1 cm), zodat de kolonies elkaar niet zullen overlappen na 5-6 dagen incubatieperiode (Figuur 3A). De injectie was niet succesvol als een opeenhoping van kankercellen in de meeste haarvaten kan worden waargenomen, embryo's die dit vertonen, moeten worden weggegooid (figuur 2E). Een aanzienlijk aantal geïnjecteerde kankercellen vergaat binnen 24 uur na injectie, waardoor sommige embryo's alle kankercellen lijken af te wijzen. De overleving van kankercellen zal variëren afhankelijk van de lokale eileverancier (d.w.z. de hoeveelheid te injecteren cellen kan variëren) en we raden ten zeerste aan om optimale injectieomstandigheden (kankercelconcentratie versus injectieduur) te bepalen voordat u doorgaat met het experiment. Wij adviseren celconcentratie in het bereik tussen 0,5 x 106 tot 1,0 x 106 cellen/m. Wanneer de optimale celconcentratie en de duur van de injectie wordt bereikt, moeten de dag 5 na injectie transduceerde cellen een breed scala aan koloniefenotypen produceren, waarbij de meerderheid van de kolonies invasief lijkt, zoals bepaald door de kankercellen die verspreid in het CAM-weefsel verschijnen (Figuur 3A). Er moet aandacht worden besteed aan de gemetastaseerde kolonies die "compact" lijken en zich ver genoeg van naburige kolonies bevinden dat ze met een tang en schaar in één stuk CAM-weefsel kunnen worden verwijderd (figuur 3C). Een geïsoleerde positieve schermhit (d.w.z. een compacte kolonie) moet het compacte koloniefenotype bij herintroductie weergeven (figuur 3B). Een afname van de celoverleving (of celproliferatiesnelheid binnen de kolonie) kan ook worden waargenomen. Daarom is het mogelijk dat hogere celnummers moeten worden geïnjecteerd voor sommige van de positieve schermtreffers om voldoende kolonienummers te verkrijgen. Voor het meten van de contacten tussen kankercel en bloedvaten moet aandacht worden besteed aan de helderheid van de vaatwandvlek (fluorescerend lectine; Figuur 3D,E) en de juiste hoeveelheid lectine moeten worden geïnjecteerd voor het heldere/contrast vasculaire wandsignaal. Alle beschikbare beeldanalysesoftware kan worden gebruikt tijdens de kwantificeringsstappen nadat de kalibratie van microscoop-software is uitgevoerd.
Figuur 1: Kippenembryo schaalloos kweekoverzicht. (A) Een weegschaal met deksel voorbereid op schelploze kweek. Pijl wijst naar de snijhoek. (B) Weegschalen gerangschikt in rijen in de stromingskap. (C) Het snijden van een eierschaal met een elektrisch roterend gereedschap. (D) Een ei in een weegschaal kraken. (E) Embryo's gekweekt in de bevochtigde incubator. Schaalbalken =1 cm (A-D) of 5 cm (E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van kankercelinjectie en gemetastaseerde kolonieisolatie. (A) Stroomdiagram met de stappen van het kippenembryoscreeningsplatform. (B) Kankercelinjectie opgezet op het stereo fluorescerende microscoopstadium. (C) Injectie van de kankercellen in het CAM-vasculatuur. (D) Afbeelding met succesvolle kankercelinjectie (aanvaardbare kankerceldichtheid), onmiddellijk na injectie genomen. (E) Afbeelding met slechte kankercelinjectie, gezien als een overge injecteerd embryo. Let op de opbouw van kankercellen in de bloedcapillairen (witte pijlen). Schaalbalken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten voor verschillende stappen van het screeningsprotocol. (A) Gemetastaseerde kolonies gevormd door heterogene (bibliotheektransduceerde kankercellijn HEp3-cellen), 5 dagen na injectie. Rode pijl toont compacte kolonie (potentiële positieve hit) die moet worden verwijderd. (B) Gemetastaseerde kolonies gevormd door een van de geïsoleerde schermtreffers (KIF3B) na herinjectie, 5 dagen na injectie. Insets tonen digitaal uitgesneden gemetastaseerde koloniebeelden van de stippelige vierkanten. Dit is acceptabele beeldkwaliteit voor C.I kwantificering. De gemiddelde C.I.-waarde voor hit reinjection (KIF3B) wordt weergegeven. (C) Isolatie van de gemetastaseerde kolonie van belang uit het CAM-weefsel. Representatieve optische secties van (D) een controlekolonie en (E) een KIF3B shRNA overexpressiekolonie, beide met kankercel-bloedvatcontactmetingen. CAM vasculatuur is gelabeld met fluorescerende lectine-649. Schaalbalken =1 cm (A-C) of 50 μm (D, E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een snel fluorescentiemicroscopie gebaseerd intravital screening protocol dat kan worden gebruikt voor belangrijke toepassingen zoals genetische of drug kandidaat schermen. Kankercellen die zijn getransduceerd met een genetische bibliotheek van belang of getransfecteerd met individuele expressieconstructies kunnen snel worden gescreend en gekwantificeerd met behulp van dit chick CAM-model. Aangezien transductie- of transfectieprotocollen aanzienlijk variëren, afhankelijk van het type bibliotheek, zijn ze niet opgenomen in deze procedure. Fenotypisch relevante gemetastaseerde kolonies worden uit de CAM verwijderd, uitgebreid en DNA geïsoleerd voor sequencing met hoge doorvoer om de uitdrukkingsconstructie van belang te identificeren. Over het algemeen is elke genetische bibliotheek uitgerust met primersequenties en aanbevolen methoden voor genomische DNA-zuivering. We raden u aan lokale faciliteitsrichtlijnen te gebruiken voor de beste resultaten voor sequencing met hoge doorvoer.
Het wordt aanbevolen om de optimale multipliciteit van infectie (M.O.I.) voor een bibliotheek en cellijn te bepalen voordat deze wordt gescreend. Idealiter zou elke cel (en dus toekomstige gemetastaseerde kolonie) slechts één genexpressieconstructie moeten bevatten, maar in onze ervaring is dat niet altijd haalbaar. We raden aan om het protocol van de bibliotheekfabrikant te volgen en een breed scala aan M.O.I. (0.01-5) te testen om zo dicht mogelijk bij 1 te komen. De aanwezigheid van meerdere bibliotheekexpressieconstructies binnen elke gemetastaseerde kolonie kan de fenotypeanalyse van de kolonie aanzienlijk bemoeilijken. We raden ook aan om de meegeleverde negatieve controle van de bibliotheekfabrikant te gebruiken in uw experimenten (d.w.z. shRNA-expressieve vector die fluorescerend is getagd).
Ons screeningsprotocol is gebaseerd op selectie van niet-invasieve fluorescerende kolonies; het is van cruciaal belang ervoor te zorgen dat alle cellijnen die in de experimenten worden gebruikt, een vergelijkbare fluorescentie-intensiteit hebben. Ongelijke fluorescentie-intensiteit tussen de cellen (en gemetastaseerde kolonies) kan resulteren in een bevooroordeelde kolonieselectie als gevolg van cel- of koloniehelderheid in plaats van invasiviteit.
In vergelijking met bestaande methoden biedt ons protocol verschillende unieke voordelen, zoals snelheid, lage kosten en de mogelijkheid om de intravital schermcyclus te voltooien zonder geavanceerde beeldapparatuur12,13,14. Bovendien kan de hele screeningscyclus worden voltooid met 3 tot 6 weken van de celinjectie tot de sequencingfase. Er is geen hoge resolutie microscoop nodig voor kankercelinjectie of gemetastaseerde kolonieisolatie, omdat deze stappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een basis fluorescerende stereomicroscoop die beschikbaar is voor de meeste onderzoekers. Ten slotte, omdat het cultiveren van embryo's zonder schelpen volledig zelfvoorzienend is, is er geen behoefte aan gecompliceerde onderzoekshuisvesting of voedingsschema's. De meeste onderzoeksinstellingen beschouwen kippenembryo's niet als levende dieren, wat de kosten en documentatielast van dit model aanzienlijk vermindert.
Er zijn echter enkele beperkingen verbonden aan het shell-less embryomodel. Ten eerste werken niet alle kankercellijnen efficiënt in dit model. In ons laboratorium gebruiken we routinematig verschillende kankercellijnen, zoals HT1080 (humaan fibrosarcoom), HEp3 (hoofd & nek) en muis b16 melanoom en 4T1 borstkankercellijnen, die robuust gemetastaseerde kolonies vormen wanneer ze in de cam-vasculatuur van de kip worden geïnjecteerd. Andere cellijnen met verschillende kankertypes zoals borst (MDA468), hersenen (U87 en U118) of eierstok (A2780s) vormen gemakkelijk gemetastaseerde kolonies wanneer ze in de CAM worden geïnjecteerd en kunnen daarom ook in dit screeningsprotocol worden gebruikt12,14,15. Toch presteren veelgebruikte kankercellijnen zoals LnCaP en PC3 in onze ervaring niet goed in dit model (ongepubliceerde waarnemingen). Een andere beperking is dat een confocale microscoop met een beeldvormingsbereik van 100 tot 200 μm vereist is voor beeldvorming met hoge resolutie, zoals visualisatie van contacten met kankercellen, deze apparatuur is mogelijk niet beschikbaar voor veel onderzoekers.
Al met al beschrijft dit protocol een snel intravital screeningplatform dat kan worden gebruikt voor de ontdekking van kankermetastaseonderdrukkers en -drivers. We zijn ervan overtuigd dat de robuustheid en het gebruiksgemak van dit model het voor veel onderzoekers een essentieel screeningsmodel zullen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 aan JDL en KS. Dr. Lewis bekleedt de Frank en Carla Sojonky Chair in Prostate Cancer Research, ondersteund door de Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).
