Summary
Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.
Abstract
Os recentes avanços na pesquisa sobre câncer ilustraram a natureza altamente complexa da metástase do câncer. Vários genes ou redes de genes estão envolvidos na regulação diferencial de genes em cascata metastáticas do câncer e produtos genéticos dependentes do tipo de câncer, tecido e características individuais do paciente. Estes representam alvos potencialmente importantes para terapêutica genética e abordagens medicinais personalizadas. O desenvolvimento de plataformas de triagem rápida é essencial para a identificação desses alvos genéticos.
A membrana corioallantóica do filhote (CAM) é uma membrana altamente vascularizada, rica em colágeno localizada sob a casca de ovo que permite a troca de gás no embrião em desenvolvimento. Devido à localização e vascularização da CAM, desenvolvemos-a como um modelo de metástase intravital de câncer humano que permite a xenoenxerização robusta de células cancerígenas humanas e a imagem em tempo real das interações celulares cancerígenas com a matriz rica em colágeno e a vasculatura.
Utilizando este modelo, uma plataforma de triagem quantitativa foi projetada para a identificação de novos condutores ou supressores de metástase de câncer. Transturamos um grupo de células cancerígenas HEp3 com uma biblioteca completa de genes de genoma humano, depois injetamos as células, em baixa densidade, na vasculatura cam. As células proliferaram e formaram colônias de células de tumor único. Colônias individuais que não puderam invadir o tecido CAM eram visíveis como um fenótipo de colônia compacta e excisadas para identificação do shRNA transduzido presente nas células. Imagens de colônias individuais foram avaliadas por sua invasividade. Foram realizadas várias rodadas de seleções para diminuir a taxa de falsos positivos. Clones individuais e isolados de células cancerígenas ou clones recém-projetados que expressam genes de interesse foram submetidos a ensaios de formação de tumores primários ou análise de co-opção de vasculatura de células cancerosas. Em resumo, apresentamos uma plataforma de triagem rápida que permite a identificação de alvos anti-metastáticos e a análise intravital de uma cascata dinâmica e complexa de eventos.
Introduction
Metástase é a principal causa de morte de paciente com câncer1,2,3. As células cancerígenas metastáticas utilizam caminhos de sinalização distintos, dependentes do tipo de câncer, ao longo das cinco etapas da cascata metastática: invasão local, intravasão, sobrevivência na circulação, extravasão e expansão de colônias em locais metastáticos distantes. A compreensão atual desse processo metastático sugere que há duas etapas de gargalo, uma é a invasão direcional da célula cancerígena do tumor primário, e a segunda é o estabelecimento da lesão metastática do local distante4,5,6. Ambas as etapas exigem que as células cancerígenas interajam ativamente com colágeno e vasculatura nos locais de invasão inicial ou formação de lesão metastática distante. Portanto, as células cancerígenas metastáticas devem ser capazes de se conectar às células, remodelar as fibras de colágeno e invadir direcionalmente ao longo das paredes vasculares7. Modelos de rastreamento que podem identificar rapidamente alvos terapêuticos antimetastáticos para impedir que as células cancerígenas preeniram essas etapas é de maior importância. Os modelos de triagem in vitro existentes não imitam totalmente o complexo ambiente de tecido vivo. Os modelos de mouse são caros e demorados. Portanto, há uma necessidade urgente de plataformas de triagem intravital que forneçam ambientes complexos de tecido vivo e identificação rápida de alvos.
Na última década, o embrião de frango foi estabelecido como um modelo robusto e econômico de metástase do câncer humano8,9,10,11,12. O tecido da membrana corioallantóica do pintinho (CAM) é fino e translúcido, o que o torna ideal para imagens microscópicas intravitais de comportamentos celulares e colônias em tumores primários e/ou locais metastáticos12. O crescimento do tumor primário a partir de múltiplas linhas de células cancerígenas humanas pode ser iniciado e metástase dentro de um período de apenas vários dias após a microinjeção no tecido CAM. As células cancerígenas podem ser administradas no tecido CAM de várias maneiras, incluindo intravenosa, intra-CAM ou como onplants de colágeno, essa flexibilidade permite ao pesquisador focar em estágios específicos de progressão do câncer, por exemplo, formação de lesão metastática, invasão do tumor primário ou angiogênese.
Aqui descrevemos uma plataforma de triagem quantitativa que pode ser usada para medir a capacidade das células cancerosas de estabelecer lesões metastáticas invasivas. Células cancerígenas que foram transduzidas com uma biblioteca de expressão são injetadas intravenosamente na vasculatura CAM em baixa densidade. Colônias metastáticas se formam por 4-5 dias, então a capacidade de invasão e interação vasculatura das colônias resultantes é avaliada. Colônias individuais que não invadem são extirpadas, propagadas e seu fenótipo é confirmado na CAM por reinjeção e quantificação da compactação colônia e contatos de células cancerígenas-vasos sanguíneos. As construções da biblioteca de expressão responsáveis pelo fenótipo mutante da colônia metastática são identificadas a partir de DNA genômico de colônias isoladas através de sequenciamento de alto rendimento. A mesma plataforma pode ser usada para validar o nexo causal entre um gene e o fenótipo observado ou para realizar estudos mecanicistas aprofundados sobre o fenótipo observado.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Alberta. Embriões aviários não são considerados animais vivos por muitos institutos de pesquisa e nenhum protocolo animal é necessário. É, no entanto, uma visão aceita de que os embriões aviários podem sentir dor e, portanto, devem ser tratados da forma mais humana possível. A autoridade local de pesquisa animal deve ser contatada antes do início de qualquer trabalho de pesquisa para garantir que as regulamentações adequadas sejam seguidas.
1. Cultura de ovos sem casca
- Adquira ovos de galinha fertilizados do provedor local. Este experimento usa raça de frango Leghorn Branco; no entanto, outras raças também podem ser usadas.
NOTA: Recomenda-se adquirir 10% mais ovos do que o necessário no caso de alguns dos embriões serem danificados durante a rachadura e não poderem ser usados neste protocolo. - Transfira o número necessário de ovos para uma incubadora de rochas umidificada de 60%. O resto dos ovos pode ser armazenado por até duas semanas a 12 °C sem perda de viabilidade.
- Incubar os ovos na incubadora de rochas umidificadas por quatro dias.
NOTA: Dia 1 é quando os ovos são transferidos para a incubadora de balanço. - Prepare os pratos de pesagem e as tampas plásticas para a cultura do ovo sem casca. Corte um dos cantos de cada um dos pratos de pesagem para permitir um acesso eficiente ao ar ao embrião (Figura 1A).
- Disponha os pratos de pesagem preparados em fileiras no capô de fluxo. (Figura 1B).
- Em um prato de pesagem separado prepare 70% de etanol para enxaguar ovos.
- Mergulhe brevemente o ovo em 70% de etanol, em seguida, use a ferramenta rotativa elétrica para fazer cuidadosamente quatro cortes de 2-3 mm paralelos ao maior diâmetro latitudinal do ovo(Figura 1C).
- Transfira o ovo cortado em um prato de pesagem e pressione suavemente o ovo contra o fundo do prato até que uma rachadura se forme na casca de ovo(Figura 1D).
- Puxe as cascas de ovos pela metade, deixando o embrião escorregar no prato de pesagem. Descarte a casca de ovo e cubra o prato de pesagem com uma tampa.
- Transfira os embriões para uma incubadora não-rochosa umidificada(Figura 1E).
NOTA: Os pratos de pesagem contendo os embriões são colocados em recipientes plásticos separados (12 embriões/recipiente). Isso aumenta a viabilidade do embrião e permite a organização de embriões específicos do experimento. - Incubar embriões por mais 6 dias (até 10 dias). Verifique se há embriões mortos ou contaminados diariamente e remova-os da incubadora.
NOTA: Os embriões podem ser contaminados por esporos de mofo no ar. A contaminação por moldes se manifesta inicialmente como manchas brancas na superfície do embrião CAM. Remova os embriões contaminados imediatamente e limpe a incubadora com 70% de etanol semanalmente para evitar a contaminação. Em nossa experiência, os níveis de contaminação são muito baixos ~1-3%. - Use esses embriões para injeção de células cancerosas na manhã do dia 10.
2. Preparação das células cancerígenas para injeção
NOTA: A seleção de colônias metastáticas é baseada em um fenótipo estabelecido por células cancerígenas fluorescentes, derivado de uma biblioteca de expressão ou vetor marcado com proteína fluorescente como proteína fluorescente verde ou vermelha (veja todo o fluxo de tela na Figura 2A). Não é recomendável o uso de células transitoriamente transfeinadas com proteínas fluorescentes ou rotuladas com corantes fluorescentes permeáveis por células devido ao rápido desbotamento do sinal causado pela proliferação de células cancerosas e coloração irregular.
- Cultura células cancerígenas para 60-70% de confluência no momento da injeção. O uso de células cancerígenas em níveis mais elevados de confluência diminuirá sua viabilidade, resultando em baixa eficiência da formação de colônias metastáticas. Certifique-se de que as células cancerígenas utilizadas são livres de micoplasma, uma vez que a contaminação por micoplasma pode levar à diminuição da viabilidade do embrião de frango.
- Enxágüe duas vezes com 1x PBS pH 7.4. Remova o PBS restante, adicione 0,5% Trypsin-EDTA e incubar a 37 °C por 2-5 min até que todas as células sejam levantadas da superfície do prato de cultura.
- Transfira a suspensão celular para tubo cônico de 15 mL e células centrífugas à temperatura ambiente a 200 x g por 5 min.
- Resuspend células em 10 mL de PBS para e centrifugar as células novamente como na etapa 2.3, para remover trippsina e outros componentes da mídia cultural, como antibióticos.
NOTA: A presença de componentes da trippsina ou da cultura celular, como antibióticos na suspensão de células cancerosas, pode resultar em diminuição da viabilidade do embrião de frango. - Aspire cuidadosamente as células supernascidas e resuspend com 1 mL de PBS gelado.
- Conte o número de células usando um hemócito ou qualquer outro equipamento de contagem de células disponível.
NOTA: Este protocolo de triagem exige que cada colônia metastática seja iniciada por uma única célula. Ao contar as células certifique-se de que as células estão totalmente experimentadas e existem como uma única suspensão celular (não há aglomerados de células presentes). - Para células concentradas de injeção intravenosa (IV) para 0,5 x 106 a 1,0 x 106 células/mL. Use 1x PBS gelado para diluir e/ou resuspendar concentrados celulares. Espere que aproximadamente 1 mL de suspensão de células será necessária para cada dez embriões.
NOTA: A concentração necessária de suspensão celular na suspensão é determinada principalmente pelo nível de experiência do experimentador. Consulte a próxima seção para obter mais detalhes.
3. Injeção intravenosa de células cancerígenas para formação de colônia metastática
NOTA: Seguindo este protocolo, até cem embriões podem ser injetados dentro de um dia. Geralmente leva mais tempo para isolar as colônias metastáticas (Passo 5) e, portanto, é recomendável realizar um experimento inicial para estimar o tempo necessário para completar todas as etapas. O uso de rótulos fluorescentes de células cancerígenas diferenciais ajuda a reduzir o número de animais e o tempo necessário para cada experimento. Por exemplo, as células de controle podem ser rotuladas com RFP (proteína fluorescente vermelha), enquanto as células tumorais mutantes podem ser rotuladas alternativamente com GFP (proteína fluorescente verde). Neste caso, cada experimento tem um controle embutido que corrige a variabilidade entre embriões.
- Monte o aparelho de injeção como mostrado na Figura 2B. Primeiro monte uma agulha na seringa e, em seguida, estenda a agulha da seringa com um pedaço de tubo de 3-5 cm de comprimento.
- Quebre a ponta da agulha borossilicada usando os fórceps finos (~20-60 μL de largura).
- Carregue a seringa com a suspensão celular do câncer (50-200 μL) e insira a agulha de borossilicato na tubulação(Figura 2B).
- Inspecione a agulha de borossilicato para entupimento celular e bolhas de ar. É fundamental injetar células como uma única suspensão celular para garantir que cada colônia metastática seja iniciada por uma única célula.
NOTA: As células cancerígenas tendem a se agregar em PBS dentro de 1-2 h pós-trippsinização e, portanto, devem ser preparadas imediatamente antes da injeção. Se necessário, as células podem ser resuspended periodicamente usando a seringa de 1 mL usada para injeções (sem a agulha borossilicada). - Se o entupimento celular for observado dentro do capilar, remova o capilar, suspenda as células e substitua-as por uma nova capilar. Use o êmbolo para empurrar as bolhas. Se não forem observados entupimentos celulares ou bolhas, proceda ao próximo passo.
- Remova a tampa da tampa e transfira o embrião sob o estereoscópio. Identifique a veia apropriada a ser injetada na superfície cam. Veias e artérias formam a intrincada rede dentro do tecido CAM(Figura 2C). As veias são distinguidas pela cor vermelha mais brilhante porque carregam sangue rico em oxigênio para o embrião.
NOTA: Para manipulação geral de embriões, injeção de células cancerígenas e excisão de colônia metastática, use um estereóquio fluorescente equipado com objetivos de 0,8x e 1,5x e oculares 10x para visualização. Microscópio menos avançado também pode ser usado com sucesso para esses procedimentos, dependendo do nível de experiência dos usuários. Os leitores podem entrar em contato com os autores para obter recomendações mais detalhadas. - Encontre a veia ideal para injetar células que normalmente é apenas um pouco mais larga (10-20%) do que o diâmetro da ponta da agulha borossilica e localizada no meio do caminho entre o embrião e a parede do prato de pesagem. Geralmente é mais fácil injetar no ponto imediatamente adjacente à bifurcação da veia.
NOTA: A injeção em uma veia maior pode parecer mais fácil, mas levará a sangramento excessivo e diminuição da sobrevida embrionária. - Pressione a ponta da agulha contra a parede do vaso sanguíneo e aplique pressão suave na mesma direção que o fluxo sanguíneo. Se necessário, use um cotonete (segurado em outra mão) para ajudar a ancorar ou estabilizar o vaso que está sendo injetado.
- Deprimir suavemente o êmbolo da seringa. Pode-se visualizar uma injeção bem sucedida observando uma "clareira" do vaso sanguíneo quando a suspensão celular do câncer entra na corrente sanguínea.
- Continue deprimindo o êmbolo da seringa por 2-10 s até que o volume de suspensão desejado seja injetado na corrente sanguínea da veia. Ao todo, a injeção de um único embrião pode exigir de 1 a 10 min, dependendo do nível de experiência do usuário. Se houver sangramento excessivo ou acúmulo de líquido claro no local da injeção, descarte o embrião.
NOTA: É fácil "injetar demais" um embrião. A consideração geral que deve ser considerada em mente é que as colônias metastáticas não devem se tocar após um período de crescimento de 4 a 5 dias. Idealmente ~5-10% dos capilares de veias CAM terminais devem ter células imobilizadas nelas após uma injeção bem sucedida(Figura 2D,E). Como mencionado na etapa 2, uma faixa de concentração celular pode ser usada (0,5 x 106 - 1,0 x 106 células/mL). Concentrações mais baixas exigirão mais tempo de injeção, mas diminuirão o entupimento da agulha. Concentrações mais altas exigirão tempos de injeção mais curtos, mas aumentarão o entupimento da agulha. Recomenda-se tentar várias concentrações para encontrar a mais confortável para um operador. Geralmente, a maior concentração (1,0 x 106 células/mL) é preferível diminuir o tempo de injeção. - Remova a agulha da CAM e dobre suavemente o local da injeção com um cotonete para remover qualquer sangue ou células cancerígenas em excesso.
- Cubra o embrião no prato de pesagem com uma tampa e devolva o embrião de frango injetado na incubadora.
- Repita o procedimento com o próximo embrião até que todos os embriões sejam injetados.
4. Manutenção de embriões durante o crescimento da colônia metastática
- Inspecione visualmente os embriões. Se houver algum morto e/ou contaminado com bactérias ou mofo, remova-os da incubadora, então autoclave e descarte-os de acordo com procedimentos de descarte laboratorial.
NOTA: Recomenda-se que os embriões sejam inspecionados a cada dois dias (dias 1, 3, 5 pós-injeção de células cancerígenas) para o crescimento de colônias metastáticas. Evite mover os embriões injetados desnecessariamente, pois pode causar danos e/ou morte embriões. - Se as células apresentarem crescimento excessivo (colônias metastáticas se sobrepõem umas às outras) ou distribuição desigual dentro do tecido CAM (colônias metastáticas localizadas em pequenas subáreas da superfície CAM) remova esse embrião do experimento. Eutanize embriões descartados congelando a -20 °C (ou outro método aprovado) imediatamente após a remoção do experimento. O número de células metastáticas viáveis dentro do tecido CAM diminuirá inicialmente (dias 1-2) e, em seguida, aumentará (dias 2-5).
NOTA: Alguns embriões podem "rejeitar" as células cancerosas, ou seja, todas as células cancerígenas desaparecerão do tecido CAM. Esses embriões devem ser removidos do experimento. Normalmente, colônias de células cancerígenas podem ser vistas através da tampa transparente sob o microscópio estéreo fluorescente sem abrir o prato de pesagem. - Certifique-se de que as colônias metastáticas pareçam uniformes em forma (primeiro 1-3 dias após a injeção). Identifique colônias metastáticas invasivas ou não invasivas nos dias 4-5 pós-injeção (consulte Seção 5 para obter mais detalhes).
5. Isolamento de colônias metastáticas
- No dia 5, a injeção pós-injeção remove os embriões da incubadora e inspeciona os CAMs do embrião para distribuição de colônias metastáticas. Identifique os embriões com distribuição uniforme de colônias em que colônias compactas (ou excessivamente invasivas) estão presentes.
NOTA: O processo de cultivo de embriões de frango não é estéril, portanto, todas as etapas de triagem devem ser realizadas em condições altamente limpas para evitar futura contaminação da cultura tecidual. A contaminação é bastante rara e pode ser facilmente evitada usando luvas e uma máscara e usando apenas ferramentas estéreis durante procedimentos de injeção celular e isolamento de colônias. Recomenda-se inspecionar embriões um a um para diminuir sua exposição à temperatura do laboratório ambiente e evitar contaminação. - Localize a colônia metastática de interesse. Uma colônia compacta pode ser descrita como aquela com a maioria das células cancerígenas localizadas dentro de uma área limitada no tecido CAM (as células parecem "agrupadas"). Uma colônia invasora pode ser descrita como colônia onde as células cancerígenas "se espalham" no tecido CAM(Figura 3A, B).
NOTA: A "compactação" da colônia metastática pode ser explicada pela inibição da invasão celular cancerígeno, pela inibição da proliferação de células cancerosas, ou ambos. Atenção a todos os cenários e colônias de contato devem ser isoladas (Figura 3A,B). Um simples estereoscópio fluorescente pode ser usado para discriminar entre fenótipos de colônia metastática compacta e invasiva. - Sob o microscópio de dissecção puxe suavemente o tecido CAM que contém a colônia metastática de interesse para cima usando fórceps finos(Figura 3C).
- Corte o tecido CAM que contém a colônia metastática usando uma tesoura cirúrgica.
- Transfira o tecido CAM que contém a colônia metastática em um tubo vazio e estéril de 1,5 mL (no gelo) e feche a tampa do tubo.
NOTA: Colônias isoladas podem ser mantidas no gelo por até 3 horas sem perda de viabilidade. - Repita o procedimento de excisão até que todas as colônias de interesse sejam coletadas em tubos separados. Para evitar o sofrimento animal, não extirpro mais de 2-3 colônias de um embrião. Eutanize embriões congelando a -20 °C (ou outro método aprovado) imediatamente após a excisão da colônia.
- Pique suavemente o tecido CAM em um tubo de microcentrifuuge usando uma agulha de calibre 18 estéril. Use uma agulha separada para cada colônia.
- Adicione 100 μL de solução de colagenase 1x e incubar por 30 min a 37 °C.
- Gire as células e o tecido CAM a 300 x g por 5 minutos a temperatura ambiente.
- Aspire a solução de colagemnase e resuspend células em mídia completa usada para a linha celular de interesse.
NOTA: Normalmente, o tecido CAM não é completamente dissociado após o tratamento de colagem e as células cancerígenas primeiro se proliferarão dentro dos pedaços de tecido CAM e só mais tarde migrarão para o prato de cultura tecidual. - Gire as células e o tecido CAM novamente a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Células resuspendas e pedaços de tecido CAM em 1 mL de mídia completa mais fator de seleção (se houver), em seguida, transfira para um único prato de cultura de tecido de 12 poços bem.
NOTA: Os fibroblastos de Chicken CAM podem persistir na cultura tecidual para múltiplas passagens inibindo a expansão clonal. A capacidade de expandir as colônias metastáticas na presença de fator de seleção (ou seja, se um vetor que foi usado para tornar as células cancerígenas fluorescentes também codifica um gene de resistência a antibióticos mamíferos) pode acelerar muito a expansão clonal. Um experimento de curva de morte deve ser realizado antes da triagem para garantir que a concentração adequada de antibiótico seja usada. - Durante as próximas 1-3 semanas monitore as células cancerígenas diariamente para crescimento e contaminação.
- Quando as células atingem 70-80% das células de transferência de confluência em um prato de cultura de volume maior.
NOTA: Recomenda-se expandir as células até que pelo menos dois frascos criogênicos de cada clone possam ser congelados. Manter grandes quantidades de cultura tecidual pode ser trabalhoso e desnecessário. - Prossiga para sequenciamento ou próxima rodada de seleção assim que números suficientes de células cancerosas forem atingidos. Geralmente, 1 x106 de células cancerosas são suficientes para técnicas modernas de sequenciamento de alto rendimento.
- Prossiga para a reinjeção do clone e imagem e quantificação da compactação colônia ou contato células cancerígenas -vasos sanguíneos(Figura 2A). Alternativamente, proceda ao sequenciamento de alto rendimento ou repita a seleção da colônia.
NOTA: Para diminuir o número de falsos positivos, recomenda-se pelo menos duas rodadas de seleção. Duas abordagens foram empregadas com sucesso. 1) Expandir cada clone e reinjetar individualmente para confirmar o fenótipo da colônia. 2) Misture todos os clones expandidos em uma proporção de 1:1 cada, reinjete como uma mistura e repita o ciclo de seleção.
6. Injeção de lectinas fluorescentes marcadas na vasculatura CAM.
- Identifique a veia a ser injetada. É mais fácil usar o mesmo local de injeção para lectina que foi usado para injeção de células tumorais.
- Diluir a solução de estoque de lectina fluorescente (5 mg/mL) 50-100x com 1x PBS e carregá-lo no mesmo aparelho de injeção usado para injeção de células cancerosas.
NOTA: A quantidade de lectina que precisa ser injetada (normalmente 20-100 μL) para visualização dos vasos sanguíneos depende da sensibilidade do microscópio e deve ser determinada experimentalmente antes da triagem. - Injete lectina usando a mesma técnica da injeção de células tumorais (ver passos 3.6.-3.10.).
- Após a injeção de lectina, coloque o embrião na incubadora para se recuperar por 5 minutos. Injete apenas um embrião de cada vez e imediatamente antes de imaginar o embrião.
NOTA. Embriões com 12 dias ou mais geralmente se recuperam bem das injeções de lectina e podem ser reinjetados com lectina novamente no dia seguinte para imagens sequenciais. Embriões mais jovens são mais sensíveis e podem apresentar coagulação sanguínea.
7. Visualização de contatos de células cancerígenas
- Defina o gabinete do microscópio regulado pela temperatura para 37 °C aproximadamente 6 h antes da imagem. Isso estabilizará a temperatura do microscópio e ajudará a minimizar a deriva do XYZ durante a imagem.
NOTA. Foi utilizada uma câmara especializada de imagem de embrião de frango9,10,11,12,13 para este experimento. Um microscópio de dissecção fluorescente simples pode ser usado para todas as etapas que vão desde a injeção de células cancerosas até a seleção de clones e reinjeção de clones, e avaliação da compactação da colônia. Um microscópio confocal equipado com uma câmara de imagem é necessário para a imagem e quantificação dos contatos dos vasos sanguíneos de células cancerosas. Nenhum aquecimento é necessário para até 1 h e geralmente os embriões sobrevivem pelo menos duas sessões de imagem sequenciais sem impacto à sua viabilidade. - Certifique-se de que a lente objetiva necessária (lente objetiva de imersão de água 20x ou 25x é recomendada) foi instalada.
- Aplique uma fina camada de graxa de vácuo na parte inferior da tampa da câmara de imagem para criar uma vedação segura com a mancha de cobertura.
- Posicione suavemente uma mancha na tampa e limpe qualquer excesso de graxa de vácuo.
- Tire o embrião injetado de lectina da incubadora e corte as bordas do prato de pesagem, se necessário.
- Posicione o embrião na câmara de imagem com o deslizamento abaixado diretamente para a área da CAM onde estão localizadas as colônias metastáticas de interesse. Abaixe lentamente a tampa sobre o embrião até que o deslizamento de tampas entre em contato com a CAM. Aperte os parafusos para fixar a tampa no lugar, certifique-se de que a tampa está nivelada e que a tampa não está colocando nenhuma pressão para baixo sobre a CAM.
- Adquira imagens de múltiplas colônias aleatórias de grupos de controle e experimentais (10-20) de vários (5-10) embriões.
NOTA. Recomenda-se a aquisição de pilhas 3D aleatórias (1-5um Z-passos; 50-100um; 25x) de cada campo. - Use a opção de costura de campo no software de aquisição de microscópio, se disponível. Uma vez que as imagens usadas para quantificação não serão qualidade de publicação, use modos de aquisição rápida, como digitalização ressonante, se disponível. Use 25x objetivo e 3 x 3 pontos com 5-10 μm Z-step, 100 μm de faixa total. Imagem de pelo menos 100 células (~20 colônias) por condição.
8. Quantificação de contatos com vasos sanguíneos de células cancerosas
- Abra o arquivo 3D como uma pilha Z usando o software necessário.
NOTA. O software especializado deve ser usado para adquirir e analisar imagens de alta resolução, a fim de quantificar o contato entre células cancerígenas e vasos sanguíneos. Vários pacotes de software capazes de análise de imagem 3D estão disponíveis. Consulte Tabela de Materiais para obter mais detalhes. - Se o movimento XY significativo ocorreu durante a aquisição da imagem, alinhe a pilha Z usando o plugin ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Localize o celular (s) de interesse.
- Role a imagem XYZ na direção Z e identifique a seção óptica que contém o comprimento máximo do contato dos vasos sanguíneos de células cancerosas para a célula de interesse(Figura 2E).
- Meça o contato célula-sangue do câncer usando a "função de medição de comprimento manual".
- Insira as medidas no pacote de software de dados que é usado para análise estatística.
NOTA: A capacidade das células cancerígenas de se anexar aos vasos sanguíneos pode ser medida tanto quanto o comprimento dos contatos de células cancerígenas ou a porcentagem da célula em contato com a vasculatura para clones de células cancerosas particulares (ou ambos). - Vá para a próxima célula de interesse.
- Analise os dados para significância estatística comparando clones mutantes (s) e conjuntos de dados de controle.
9. Quantificação da compactação da colônia
- Reinjetar as células do clone expandido usando a mesma técnica da etapa 2.
- Cinco dias após a injeção adquirem imagens de 10-50 colônias metastáticas aleatórias para cada clone.
NOTA: Não são necessárias imagens de alta qualidade para quantificação da compactação da colônia metastática. Imagens monocromáticas e estereósicas (ampliação de 10x) são suficientes. Deve-se prestar atenção ao brilho da imagem (a maioria das células dentro da colônia deve ser vista) e ao contraste (diferença entre uma ou duas células). - Isole digitalmente a imagem da colônia (ver Figura 2C,D) e prossiga para quantificação da compactação da colônia usando o módulo de quantificação de compactação da colônia autônoma ou pontuação cega13.
- Vá para a próxima colônia de interesses.
- Analise os dados para significância estatística comparando os conjuntos de dados clones (s) mutantes e controle (ou seja, scramble shRNA).
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Representative Results
A injeção de células cancerígenas é considerada bem sucedida se a maioria das células que estão alojadas nos capilares forem solteiras e localizadas a uma diferença significativa entre si (~0,05-0,1 cm) para que as colônias não se sobreponham após 5-6 dias de período de incubação(Figura 3A). A injeção não foi bem sucedida se um acúmulo de células cancerígenas pode ser visto na maioria dos capilares, embriões que exibem isso devem ser descartados(Figura 2E). Um número significativo de células cancerígenas injetadas perece dentro de 24 horas de injeção fazendo com que alguns embriões pareçam rejeitar todas as células cancerígenas. A sobrevivência das células cancerígenas variará dependendo do fornecedor local de óvulos (ou seja, a quantidade de células a serem injetadas pode variar) e recomendamos fortemente que as condições ideais de injeção (concentração de células cancerosas versus duração da injeção) sejam determinadas antes de prosseguir com o experimento. Recomendamos concentração celular na faixa entre 0,5 x 106 a 1,0 x 106 células/m. Quando a concentração celular ideal e a duração da injeção são alcançadas, o dia 5 células transduzidas pós-injeção deve produzir uma grande variedade de fenótipos de colônias com a maioria das colônias aparecendo invasivas como determinada pelas células cancerosas que aparecem espalhadas no tecido CAM(Figura 3A). Atenção deve ser dada às colônias metastáticas que parecem "compactas" e estão localizadas longe o suficiente das colônias vizinhas que podem ser excisadas com fórceps e tesouras em um pedaço de tecido CAM(Figura 3C). Um impacto isolado da tela positiva (ou seja, uma colônia compacta) deve exibir o fenótipo da colônia compacta após a reinjeção(Figura 3B). Uma diminuição na sobrevida celular (ou taxa de proliferação celular dentro da colônia) também pode ser observada. Portanto, é possível que números de células mais altos precisem ser injetados para alguns dos acessos positivos da tela para obter números suficientes de colônias. Para a medição do vaso sanguíneo celular-câncer, deve-se prestar atenção ao brilho da mancha de parede vascular (lectina fluorescente; Figura 3D,E) e a quantidade apropriada de lectina deve ser injetada para o sinal de parede vascular brilhante/contraste. Qualquer software de análise de imagem disponível pode ser usado durante as etapas de quantificação após a calibração do software do microscópio ter sido realizada.
Figura 1: Visão geral da cultura sem casca de embrião de frango. (A) Um prato de pesagem com tampa preparada para a cultura sem casca. A seta aponta para o canto cortado. (B) Pratos de pesagem dispostos em fileiras no capô de fluxo. (C) Corte uma casca de ovo com uma ferramenta rotativa elétrica. (D) Quebrar um ovo em um prato de pesagem. (E) Embriões cultivados na incubadora umidificada. Barras de escala =1 cm (A-D) ou 5 cm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Contorno da injeção de células cancerosas e isolamento da colônia metastática. (A) Fluxograma delineando as etapas da plataforma de triagem de embriões de frango. (B) Injeção de células cancerígenas configurada no estágio de microscópio fluorescente estéreo. (C) Injeção das células cancerígenas na vasculatura CAM. (D) Imagem mostrando injeção de células cancerígenas bem sucedidas (densidade celular cancerígena aceitável), tomada imediatamente após a injeção. (E) Imagem mostrando má injeção de células cancerosas, vista como um embrião sobre-injetado. Note que as células cancerígenas se acumulam nos capilares sanguíneos (setas brancas). Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados representativos para diferentes etapas do protocolo de triagem. (A) Colônias metastáticas formadas por heterogênios (biblioteca transduzida células cancerígenas HEp3), 5 dias após a injeção. A seta vermelha mostra colônia compacta (potencial acerto positivo) que deve ser extirpada. (B) Colônias metastáticas formadas por uma das batidas isoladas da tela (KIF3B) após a reinjeção, 5 dias após a injeção. Os insets mostram imagens de colônias metastáticas cortadas digitalmente dos quadrados tracejados. Esta é uma qualidade de imagem aceitável para quantificação de C.I. O valor médio da C.I. para reinjeção de acerto(KIF3B)é mostrado. (C) Isolamento da colônia metastática de interesse do tecido CAM. Seções ópticas representativas de (D) uma colônia de controle, e (E) uma colônia de superexpressão kif3B shRNA, ambas mostrando medidas de contato células cancerígenas-vasos sanguíneos. A vasculatura CAM é rotulada com lectina fluorescente-649. Barras de escala =1 cm (A-C) ou 50 μm (D, E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo de triagem intravital baseado em microscopia de fluorescência rápida que pode ser utilizado para aplicações importantes, como telas genéticas ou candidatas a medicamentos. Células cancerígenas que foram transduzidas com uma biblioteca genética de interesse ou transfeinadas com construtos de expressão individual podem ser rapidamente rastreadas e quantificadas quanto ao fenótipo de interesse usando este modelo CAM pintinho. Uma vez que os protocolos de transdução ou transfecção variam significativamente, dependendo do tipo de biblioteca, eles não estão incluídos neste procedimento. Colônias metastáticas fenotipicamente relevantes são extirpadas da CAM, expandidas, e o DNA isolado para sequenciamento de alto rendimento para identificar a construção de expressão de interesse. Geralmente, cada biblioteca genética é equipada com sequências de primer e métodos recomendados de purificação genômica de DNA. Recomendamos o uso de diretrizes locais para obter os melhores resultados de sequenciamento de alto rendimento.
Recomenda-se determinar a multiplicidade ideal de infecção (M.O.I.) para uma biblioteca e linha celular antes da triagem. Idealmente, cada célula (e, portanto, futura colônia metastática) deve conter apenas uma construção de expressão genética, no entanto, em nossa experiência, nem sempre é alcançável. Recomendamos seguir o protocolo do fabricante da biblioteca e testar uma ampla gama de M.O.I. (0,01-5) para alcançar o mais próximo possível de 1. A presença de múltiplas construções de expressão bibliográfica dentro de cada colônia metastática pode complicar significativamente a análise do fenótipo da colônia. Também recomendamos que o uso do fabricante da biblioteca forneceu controle negativo em seus experimentos (ou seja, embaralhar o vetor de expressão shRNA que é marcado fluorescentemente).
Nosso protocolo de triagem é baseado na seleção de colônias fluorescentes não invasivas; é fundamental garantir que todas as linhas celulares usadas nos experimentos tenham intensidade de fluorescência semelhante. A intensidade de fluorescência desigual entre as células (e colônias metastáticas) pode resultar em uma seleção tendenciosa de colônias devido ao brilho celular ou colônia em vez de invasividade.
Em comparação com os métodos existentes, nosso protocolo oferece várias vantagens únicas, como velocidade, baixo custo e capacidade de completar o ciclo de tela intravital sem a necessidade de equipamentos de imagem sofisticados12,13,14. Além disso, todo o ciclo de triagem pode ser concluído com 3 a 6 semanas desde a injeção celular até o estágio de sequenciamento. Nenhum microscópio de alta resolução é necessário para injeção de células cancerosas ou isolamento de colônias metastáticas, pois essas etapas podem ser executadas usando microscópio estéreo fluorescente básico que está disponível para a maioria dos pesquisadores. Finalmente, como a cultura de embriões sem casca é completamente autossustentada, não há necessidade de uma pesquisa complicada de habitação animal ou horários de alimentação. A maioria das instituições de pesquisa não considera os embriões de frango como animais vivos, o que diminui significativamente a carga de custo e documentação associada a esse modelo.
No entanto, existem algumas limitações associadas ao modelo de embrião sem casca. Em primeiro lugar, nem todas as linhas de células cancerígenas funcionam nesse modelo de forma eficiente. Em nosso laboratório usamos rotineiramente várias linhas de células cancerígenas, como HT1080 (fibrosarcoma humano), HEp3 (cabeça & pescoço) e melanoma b16 de camundongos e linhas de células cancerígenas de mama 4T1, que formam robustamente colônias metastáticas quando injetadas na vasculatura cam de frango. Outras linhas celulares com diferentes tipos de câncer, como mama (MDA468), cérebro (U87 e U118) ou ovário (A2780s) formam prontamente colônias metastáticas quando injetadas na CAM e, portanto, podem ser usadas neste protocolo detriagem,bem como12,14,15. No entanto, em nossa experiência, linhas de células cancerígenas comumente usadas como LnCaP e PC3 não têm um bom desempenho neste modelo (observações inéditas). Outra limitação é que um microscópio confocal com uma faixa de imagem de 100 a 200 μm é necessário para imagens de alta resolução, como a visualização de contatos com vasos sanguíneos de células cancerosas, este equipamento pode não estar disponível para muitos pesquisadores.
Ao todo, este protocolo descreve uma plataforma de triagem intravital rápida que pode ser usada para a descoberta de supressores e motoristas de metástase de câncer. Acreditamos fortemente que a robustez e a facilidade de uso deste modelo o tornarão um modelo essencial de triagem para muitos pesquisadores.
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Disclosures
Nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 à JDL e KS. Dr. Lewis ocupa a Cadeira Frank e Carla Sojonky em Pesquisa de Câncer de Próstata apoiada pela Alberta Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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