Summary
Это эффективный метод скрининга супрессоров или драйверов метастазирования рака. Клетки, трансдуцированные с помощью библиотеки экспрессии, вводятся в сосудистую сеть хориоаллантоической мембраны курицы с образованием метастатических колоний. Колонии, имеющие пониженную или повышенную инвазивность, иссекаются, расширяются, повторно встраиваются для подтверждения их фенотипа и, наконец, анализируются с использованием высокопроизводительного секвенирования.
Abstract
Последние достижения в исследованиях рака проиллюстрировали очень сложную природу метастазирования рака. Было обнаружено, что несколько генов или генных сетей участвуют в дифференциальной регуляции генов метастатического каскада рака и генных продуктов в зависимости от типа рака, ткани и индивидуальных характеристик пациента. Они представляют собой потенциально важные цели для генетической терапии и персонализированной медицины. Разработка платформ быстрого скрининга имеет важное значение для идентификации этих генетических мишеней.
Хориоаллантоическая мембрана цыпленка (CAM) представляет собой высоко васкуляризированную, богатую коллагеном мембрану, расположенную под яичной скорлупой, которая обеспечивает газообмен в развивающемся эмбрионе. Из-за расположения и васкуляризации CAM мы разработали его как модель метастазирования рака человека прижизной, которая позволяет надежно проводить ксенотрансплантирование раковых клеток человека и визуализацию в режиме реального времени взаимодействий раковых клеток с богатой коллагеном матрицей и сосудистой системой.
Используя эту модель, была разработана платформа количественного скрининга для идентификации новых драйверов или супрессоров метастазирования рака. Мы трансдуцировали пул раковых клеток HEp3 головы и шеи с полной библиотекой генов шРНК генома человека, а затем вводили клетки с низкой плотностью в сосудистую азкулятуру CAM. Клетки размножались и образовывали одноопухолевые клеточные колонии. Отдельные колонии, которые не могли вторгнуться в ткань CAM, были видны как компактный колониальный фенотип и иссякались для идентификации трансдуцированной шРНК, присутствующей в клетках. Изображения отдельных колоний оценивали на их инвазивность. Было проведено несколько раундов отбора, чтобы уменьшить частоту ложных срабатываний. Отдельные, изолированные клоны раковых клеток или недавно спроектированные клоны, которые экспрессируют гены, представляющие интерес, были подвергнуты первичному анализу опухолевого образования или анализу кооптации сосудистой основе раковых клеток. Таким образом, мы представляем платформу быстрого скрининга, которая позволяет идентифицировать антиметастатическую мишень и прижизальный анализ динамического и сложного каскада событий.
Introduction
Метастазы являются основной причиной смерти онкологического больного1,2,3. Метастатические раковые клетки используют различные сигнальные пути, зависящие от типа рака, на протяжении пяти этапов метастатического каскада: локальная инвазия, интравазация, выживаемость в кровообращении, экстравазация и расширение колонии в отдаленных метастатических местах. Современное понимание этого метастатического процесса предполагает, что существует два узких места, один из них – направленная инвазия раковой клетки из первичной опухоли, а вторая – установление отдаленного участка метастатического поражения4,5,6. Оба этапа требуют, чтобы раковые клетки активно взаимодействовали с коллагеном и сосудистой клеткой в местах первоначальной инвазии или образования отдаленного метастатического поражения. Поэтому метастатические раковые клетки должны быть способны прикрепляться к клеткам, ремоделировать коллагеновые волокна и направленно вторгаться вдоль сосудистых стенок7. Скрининговые модели, которые могут быстро идентифицировать антиметастатические терапевтические мишени для блокирования раковых клеток от завершения этих шагов, имеют первостепенное значение. Существующие модели скрининга in vitro не полностью имитируют сложную среду живых тканей. Мышиные модели являются дорогостоящими и трудоемкими. Поэтому существует острая необходимость в платформах для скрининга прижизностных сред, которые обеспечивают сложную среду живой ткани и быструю идентификацию целей.
В течение последнего десятилетия куриный эмбрион был создан как надежная и экономически эффективная модель метастазирования рака человека8,9,10,11,12. Ткань хориоаллантоической мембраны (CAM) цыпленка является тонкой и полупрозрачной, что делает ее идеальной для прижизненных микроскопических изображений поведения клеток и колоний в первичных опухолевых и/или метастатических участках12. Первичный рост опухоли из нескольких линий раковых клеток человека может быть инициирован и метастазирован в течение всего нескольких дней после микроинъекции в ткань CAM. Раковые клетки могут быть введены в ткань CAM несколькими способами, включая внутривенно, внутри CAM или в виде коллагеновых растений, эта гибкость позволяет исследователю сосредоточиться на конкретных стадиях прогрессирования рака, например, образовании метастатического поражения, инвазии из первичной опухоли или ангиогенезе.
Здесь мы описываем платформу количественного скрининга, которая может быть использована для измерения способности раковых клеток устанавливать инвазивные метастатические поражения. Раковые клетки, которые были трансдуцированы с помощью библиотеки экспрессии, вводятся внутривенно в сосудистую сосудистую клетку CAM при низкой плотности. Метастатические колонии образуются в течение 4-5 дней, затем оценивается инвазионная способность и сосудистое взаимодействие полученных колоний. Отдельные колонии, которые не могут вторгаться, иссякаются, размножаются, и их фенотип подтверждается в CAM путем повторной инжекции и количественной оценки компактности колонии и контактов раковых клеток и кровеносных сосудов. Конструкции библиотеки экспрессии, ответственные за один метастатический колониальный мутантный фенотип, идентифицируются из изолированной колонии геномной ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования. Эта же платформа может быть дополнительно использована для проверки причинно-следственной связи между геном и наблюдаемым фенотипом или для проведения углубленных механистических исследований наблюдаемого фенотипа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Альберты. Птичьи эмбрионы не считаются живыми животными многими научно-исследовательскими институтами, и никаких протоколов для животных не требуется. Однако общепринятым считается, что птичьи эмбрионы могут чувствовать боль и, следовательно, к ним следует относиться как можно гуманеннее. С местным органом по исследованию животных необходимо связаться до начала любой исследовательской работы, чтобы обеспечить соблюдение надлежащих правил.
1. Культура яиц без скорлупы
- Приобретайте оплодотворенные куриные яйца у местного поставщика. В этом эксперименте используется белая порода кур Ливорно; однако могут быть использованы и другие породы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется приобретать на 10% больше яйцеклеток, чем необходимо, в случае, если некоторые из эмбрионов повреждены во время растрескивания и не могут быть использованы в этом протоколе. - Переложите необходимое количество яиц в 60% увлажненный качающийся инкубатор. Остальные яйца могут храниться до двух недель при 12 °C без потери жизнеспособности.
- Высиживайте яйца в увлажненный качающийся инкубатор в течение четырех дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 - это когда яйца переносятся в качающийся инкубатор. - Подготовьте посуду для взвешивания и пластиковые крышки для культуры яиц без скорлупы. Срежьте один из углов каждой из взвешивающих посуд, чтобы обеспечить эффективный доступ воздуха к эмбриону(рисунок 1А).
- Расположите приготовленную весовую посуду рядами в вытяжке. (Рисунок 1B).
- В отдельном весовом блюде готовят 70% этанол для промывки яиц.
- Ненадолго окуните яйцо в 70% этанол, затем с помощью электрического вращающегося инструмента аккуратно сделайте четыре разреза по 2-3 мм параллельно наибольшему широтному диаметру яйца(рисунок 1С).
- Переложите нарезанного яйца в весовую посуду и аккуратно прижмите яйцо к дну блюда до образования трещины в яичной скорлупе(рисунок 1D).
- Раздвините половинки яичной скорлупы, позволив эмбриону проскользнуть в весовую чашку. Отбросьте яичную скорлупу и накройте весовое блюдо крышкой.
- Перенесите эмбрионы в увлажненный некачивающийся инкубатор(рисунок 1Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Весовая посуда, содержащая эмбрионы, помещается в отдельные пластиковые контейнеры (12 эмбрионов/контейнер). Это повышает жизнеспособность эмбриона и позволяет проводить специфическую для эксперимента организацию эмбрионов. - Инкубировать эмбрионы еще 6 дней (до 10 дней). Ежедневно проверяйте наличие мертвых или загрязненных эмбрионов и извлекайте их из инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут быть загрязнены спорами плесени, переносимыми по воздуху. Загрязнение плесенью первоначально проявляется в виде белых пятнышек на поверхности CAM эмбриона. Немедленно удалите загрязненные эмбрионы и еженедельно протирайте инкубатор 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. По нашему опыту, уровни загрязнения очень низкие ~ 1-3%. - Используйте эти эмбрионы для инъекции раковых клеток утром 10-го дня.
2. Подготовка раковых клеток к инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Метастатический выбор колонии основан на фенотипе, установленном флуоресцентными раковыми клетками, полученном из библиотеки экспрессии или вектора, помеченного флуоресцентным белком, таким как зеленый или красный флуоресцентный белок (см. весь поток экрана на рисунке 2A). Не рекомендуется использовать клетки, временно трансфекционированные флуоресцентными белками или помеченные клеточными проницаемыми флуоресцентными красителями из-за быстрого затухания сигнала, вызванного пролиферацией раковых клеток и неравномерным окрашиванием.
- Культивировать раковые клетки до 60-70% слития в момент инъекции. Использование раковых клеток на более высоких уровнях слияния снизит их жизнеспособность, что приведет к низкой эффективности метастатического колониеобразования. Убедитесь, что используемые раковые клетки свободны от микоплазмы, поскольку загрязнение микоплазмой может привести к снижению жизнеспособности куриного эмбриона.
- Промыть ячейки дважды с 1x PBS pH 7,4. Удалить оставшийся PBS, затем добавить 0,5% трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37 °C в течение 2-5 мин до тех пор, пока все клетки не будут подняты с поверхности чашки для культивации.
- Переложите клеточную суспензию в 15 мл конической трубки и центрифужные ячейки при комнатной температуре 200 х г в течение 5 мин.
- Повторное суспендировать клетки в 10 мл PBS и снова центрифугировать клетки, как на этапе 2.3, чтобы удалить трипсин и другие компоненты культуральных сред, такие как антибиотики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие трипсина или компонентов клеточной культуры, таких как антибиотики, в суспензии раковых клеток может привести к снижению жизнеспособности куриного эмбриона. - Осторожно аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки 1 мл ледяного PBS.
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или любого другого доступного оборудования для подсчета клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол скрининга требует, чтобы каждая метастатическая колония была инициирована одной клеткой. При подсчете клеток убедитесь, что клетки полностью трипсинизированы и существуют в виде одноклеточной суспензии (клеточных сгустков нет). - Для внутривенных (IV) инъекций концентрат клеток по 0,5 х 106 до 1,0 х 106 клеток/мл. Используйте холодный лед 1x PBS для разбавления и/или повторного суспендирования клеточных концентратов. Ожидайте, что на каждые десять эмбрионов потребуется примерно 1 мл клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимая концентрация клеточной суспензии в основном определяется уровнем опыта экспериментатора. Пожалуйста, смотрите следующий раздел для получения более подробной информации.
3. Внутривенное введение раковых клеток для метастатического колониеобразования
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя этому протоколу, в течение одного дня можно ввести до ста эмбрионов. Как правило, для выделения метастатических колоний (шаг 5) требуется больше времени, чем для инъекции раковых клеток, и, следовательно, рекомендуется провести первоначальный эксперимент, чтобы оценить время, необходимое для завершения всех этапов. Использование дифференциальных флуоресцентных этикеток раковых клеток помогает уменьшить численность животных и время, необходимое для каждого эксперимента. Например, контрольные клетки могут быть помечены RFP (красным флуоресцентным белком), в то время как мутантные опухолевые клетки могут быть альтернативно помечены GFP (зеленым флуоресцентным белком). В этом случае каждый эксперимент имеет встроенный контроль, который корректирует межимбриональную изменчивость.
- Соберите инъекционное устройство, как показано на рисунке 2B. Сначала установите иглу на шприц, а затем протяните иглу шприца с куском трубки длиной 3-5 см.
- Оторвайте кончик боросиликатной иглы с помощью тонких щипцов (~ 20-60 мкл шириной).
- Загрузите шприц суспензией раковых клеток (50-200 мкл) и вставьте боросиликатную иглу в трубку(рисунок 2B).
- Осмотрите боросиликатную иглу на предмет закупорки клеток и пузырьков воздуха. Очень важно вводить клетки в виде одноклеточной суспензии, чтобы гарантировать, что каждая метастатическая колония инициируется одной клеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раковые клетки, как правило, накапливаются в PBS в течение 1-2 ч после трипсинизации и, следовательно, должны быть подготовлены непосредственно перед инъекцией. При необходимости клетки могут периодически повторно суспендироваться с помощью шприца 1 мл, используемого для инъекций (без боросиликатной иглы). - Если в капилляре наблюдается закупорка клеток, удалите капилляр, повторно приостановите клетки и замените его новым капилляром. Используйте плунжер, чтобы вытолкнуть любые пузырьки. Если не наблюдается засорения клеток или пузырьков, переходите к следующему шагу.
- Снимите крышку крышки и перенесите эмбрион под стереоскоп. Определите подходящую вену для инъекции на поверхность CAM. Вены и артерии образуют сложную сеть внутри ткани CAM(рисунок 2C). Вены отличаются более ярким красным цветом, потому что они несут богатую кислородом кровь к эмбриону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для общих манипуляций с эмбрионами, инъекции раковых клеток и метастатического иссечения колонии используйте флуоресцентный стереомикроскоп, оснащенный объективами 0,8x и 1,5x и 10x окулярами для визуализации. Менее продвинутый микроскоп также может быть успешно использован для этих процедур, в зависимости от уровня опыта пользователей. Читатели могут связаться с авторами для получения более подробных рекомендаций. - Найдите идеальную вену для инъекции клеток, которая обычно немного шире (10-20%), чем диаметр кончика боросиликатной иглы и расположена на полпути между эмбрионом и стенкой весовой чашки. Как правило, легче вводить в точку, непосредственно прилегающую к бифуркации вен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в большую вену может показаться более легкой, но приведет к чрезмерному кровотечению и снижению выживаемости эмбриона. - Прижмите кончик иглы к стенке кровеносного сосуда и нажмите мягкое давление в том же направлении, что и кровоток. При необходимости используйте ватный тампон (удерживаемый в другой руке), чтобы помочь закрепить или стабилизировать сосуд, который вводится.
- Осторожно нажмите на шприц-поршень. Можно визуализировать успешную инъекцию, наблюдая «очистку» кровеносного сосуда, когда суспензия раковых клеток попадает в кровоток.
- Продолжайте угнетать шприцевой поршень в течение 2-10 с до тех пор, пока нужный объем суспензии не будет введен в кровоток вен. Все вместе инъекция одного эмбриона может занять 1-10 минут в зависимости от уровня опыта пользователя. Если в месте инъекции появляется чрезмерное кровотечение или прозрачное скопление жидкости, выбросьте эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легко «чрезмерно ввести» эмбрион. Общее соображение, которое следует иметь в виду, заключается в том, что метастатические колонии не должны касаться друг друга после 4-5-дневного периода роста. В идеале ~5-10% концевных КАМ-капилляров вен должны иметь иммобилизованные клетки после успешной инъекции(рисунок 2D,E). Как упоминалось на этапе 2, можно использовать диапазон клеточных концентраций (0,5 х 106 - 1,0 х 106 клеток/мл). Более низкие концентрации потребуют более длительного времени инъекции, но уменьшат засорение иглы. Более высокие концентрации потребуют более короткого времени инъекции, но увеличат засорение иглы. Рекомендуется попробовать несколько концентраций, чтобы найти ту, которая наиболее удобна для оператора. Как правило, более высокая концентрация (1,0 х10 6 клеток/мл) предпочтительна для уменьшения времени инъекции. - Извлеките иглу из КАМ и аккуратно смажайте место инъекции валопчатобумажным тампоном, чтобы удалить кровь или лишние раковые клетки.
- Накройте эмбрион в весовой чашке крышкой и верните введенный куриный эмбрион в инкубатор.
- Повторяйте процедуру со следующим эмбрионом до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы.
4. Поддержание эмбриона во время роста метастатической колонии
- Визуально осмотрите эмбрионы. Если есть какие-либо, которые мертвы и / или загрязнены бактериями или плесенью, удалите их из инкубатора, затем автоклав и выбросьте их в соответствии с лабораторными процедурами утилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется осматривать эмбрионы через день (дни 1, 3, 5 после инъекции раковых клеток) на предмет метастатического роста колонии. Избегайте перемещения введенных эмбрионов без необходимости, так как это может привести к повреждению эмбриона и / или смерти. - Если клетки демонстрируют чрезмерный рост (метастатические колонии перекрывают друг друга) или неравномерное распределение внутри ткани CAM (метастатические колонии, расположенные в небольших подобласти поверхности CAM), удалите этот эмбрион из эксперимента. Усыпить выброшенные эмбрионы путем замораживания при -20 °C (или другим утвержденным методом) сразу после удаления из эксперимента. Количество жизнеспособных метастатических клеток в ткани CAM сначала уменьшится (дни 1-2), а затем увеличится (дни 2-5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эмбрионы могут «отторгать» раковые клетки, т.е. все раковые клетки исчезнут из ткани CAM. Эти эмбрионы должны быть удалены из эксперимента. Как правило, колонии раковых клеток можно увидеть через прозрачную крышку под флуоресцентным стереомикроскопом, не открывая весовую тарелку. - Обеспечить наличие у метастатических колоний однородной формы (первые 1-3 дня после инъекции). Выявить инвазивные или неинвазивные метастатические колонии на 4-5 день после инъекции (см. Раздел 5 для получения более подробной информации).
5. Выделение метастатических колоний
- На 5 день после инъекции извлеките эмбрионы из инкубатора и осмотрите CAMs эмбриона на предмет метастатического распределения колоний. Определите эмбрионы с однородным распределением колоний, в которых присутствуют компактные (или чрезмерно инвазивные) колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс культивирования куриных эмбрионов не является стерильным, поэтому все этапы скрининга должны выполняться в высокочистых условиях, чтобы избежать будущего загрязнения культуры тканей. Заражение встречается довольно редко и его можно легко избежать, надев перчатки и маску и используя только стерильные инструменты во время процедур инъекции клеток и изоляции колоний. Рекомендуется осматривать эмбрионы один за другом, чтобы уменьшить их воздействие на лабораторную температуру окружающей среды и предотвратить загрязнение. - Найдите метастатическую колонию, которая представляет интерес. Компактная колония может быть описана как колония с большинством раковых клеток, расположенных в ограниченной области в ткани CAM (клетки кажутся «слипанными вместе»). Инвазивная колония может быть описана как колония, где раковые клетки «рассеиваются» в ткани CAM(рисунок 3A,B).
ПРИМЕЧАНИЕ: «Компактность» метастатической колонии может быть объяснена либо ингибированием инвазии раковых клеток, либо ингибированием пролиферации раковых клеток, либо и тем, и другим. Следует обратить внимание на все сценарии и изолировать контактные колонии(рис. 3А,В). Простой флуоресцентный стереомикроскоп может быть использован для различия компактных и инвазивных метастатических колониальных фенотипов. - Под рассечением микроскоп осторожно потяните CAM-ткань, содержащую метастатическую колонию интереса, вверх с помощью тонких щипцов(рисунок 3C).
- Отрежьте ТКАНЬ CAM, содержащую метастатическую колонию, хирургическими ножницами.
- Перенесите ткань CAM, содержащую метастатическую колонию, в пустую, стерильную трубку 1,5 мл (на льду) и закройте крышку трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные колонии можно держать на льду до 3 ч без потери жизнеспособности. - Повторяйте процедуру иссечения до тех пор, пока все интересующих колонии не будут собраны в отдельные трубки. Чтобы избежать страданий животных, не иссекать более 2-3 колоний из одного эмбриона. Усыпленить эмбрионы путем замораживания при -20 °C (или другим одобренным методом) сразу после иссечения колонии.
- Аккуратно измергайте ткань CAM в микроцентрифужной трубке, используя стерильную иглу 18 калибра. Используйте отдельную иглу для каждой колонии.
- Добавить 100 мкл 1x раствора коллагеназы и инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
- Раскрутите клетки и CAM-ткань при 300 х г в течение 5 мин при температуре окружающей среды.
- Аспирировать раствор коллагеназы и повторно суспендировать клетки в полной среде, используемой для интересующих клеточной линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно ткань CAM не полностью диссоциирует после лечения коллагеназой, и раковые клетки сначала размножаются в кусочках ткани CAM и только позже мигрируют на чашку культуры ткани. - Снова раскрутите клетки и ТКАНЬ CAM при 300 х г в течение 5 мин при температуре окружающей среды.
- Повторно суспендировать клетки и кусочки ткани CAM в 1 мл полной среды плюс фактор отбора (если таковой имеется), затем перенести в одну 12-хорошую чашку для культивирование тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты куриного CAM могут сохраняться в культуре тканей в течение нескольких проходов, ингибируя клональное расширение. Способность расширять метастатические колонии в присутствии фактора отбора (т. Е. Если вектор, который использовался для придания раковым клеткам флуоресцентности, также кодирует ген устойчивости к антибиотикам млекопитающих) может значительно ускорить клональное расширение. Перед скринингом следует провести эксперимент с кривой уничтожения, чтобы убедиться, что используется правильная концентрация антибиотика. - В течение следующих 1-3 недель ежедневно контролируйте раковые клетки на предмет роста и загрязнения.
- Когда клетки достигают 70-80% конфюентности, переносят клетки в культурную чашку большего объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется расширять клетки до тех пор, пока не удастся заморозить по крайней мере два криогенных флакона каждого клона. Поддержание большого количества культуры тканей может быть трудоемким и ненужным. - Приступайте к секвенированию или следующему раунду отбора, как только будет достигнуто достаточное количество раковых клеток. Как правило, 1 х 106 раковых клеток достаточно для современных высокопроизводительных методов секвенирования.
- Приступают к повторной задаче клона и визуализации и количественной оценке компактности колонии или контакта раковых клеток с кровеносными сосудами(рисунок 2А). В качестве альтернативы приступают к высокопроизводительной последовательности или повторяют отбор колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения количества ложных срабатываний рекомендуется не менее двух раундов отбора. Успешно используются два подхода. 1) Разверните каждый клон и повторно введите индивидуально, чтобы подтвердить фенотип колонии. 2) Смешайте все расширенные клоны в соотношении 1:1 каждый, повторно вставляйте в виде смеси и повторяйте цикл отбора.
6. Инъекция флуоресцентно помеченных лектинов в сосудистую сосудистую гамму CAM.
- Определите вену, в которую необходимо ввести инъекцию. Проще использовать то же место инъекции для лектина, которое использовалось для инъекции опухолевых клеток.
- Разбавить флуоресцентный раствор лектина (5 мг/мл) 50-100x с 1x PBS и загрузить его в тот же инъекционный аппарат, который используется для инъекции раковых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество лектина, которое необходимо ввести (обычно 20-100 мкл) для визуализации кровеносных сосудов, зависит от чувствительности микроскопа и должно быть определено экспериментально перед скринингом. - Вводят лектин с использованием той же методики, что и для инъекции опухолевых клеток (см. шаги 3.6.-3.10.).
- После инъекции лектина поместите эмбрион в инкубатор для восстановления в течение 5 минут. Вводите только один эмбрион за раз и непосредственно перед визуализацией эмбриона.
ЗАМЕТКА. Эмбрионы, которым 12 дней или старше, как правило, хорошо восстанавливаются после инъекций лектина и могут быть повторно введены с лектином снова на следующий день для последовательной визуализации. Молодые эмбрионы более чувствительны и могут проявлять свертываемость крови.
7. Визуализация контактов раковых клеток и кровеносных сосудов
- Установите регулируемый температуру корпуса микроскопа на 37 °C примерно за 6 часов до начала визуализации. Это стабилизирует температуру микроскопа и поможет свести к минимуму дрейф XYZ во время визуализации.
ЗАМЕТКА. Для этого эксперимента была использована специализированная камера визуализации куриногоэмбриона9,10,11, 12,13. Простой флуоресцентный рассеченный микроскоп может быть использован для всех этапов, начиная от инъекции раковых клеток до выбора клонов и повторной инъекции клонов, а также оценки компактности колонии. Конфокальный микроскоп, оснащенный камерой визуализации, необходим для визуализации и количественной оценки контактов раковых клеток и кровеносных сосудов. Нагрев не требуется в течение 1 ч, и, как правило, эмбрионы выживают, по крайней мере, два последовательных сеанса визуализации без влияния на их жизнеспособность. - Убедитесь, что установлен необходимый объектив (рекомендуется объектив 20x или 25x с погружением в воду).
- Нанесите тонкий слой вакуумной смазки на нижнюю сторону крышки камеры визуализации, чтобы создать надежное уплотнение с помощью крышки.
- Аккуратно поместите крышку в крышку и протрите излишки вакуумной смазки.
- Выньте введенный лектин эмбрион из инкубатора и при необходимости вырежьте ободки весовой чашки.
- Поместите эмбрион в камеру визуализации с помощью покровного листа, опущенного вниз непосредственно на область CAM, где расположены метастатические колонии, представляющие интерес. Медленно опустите крышку на эмбрион до тех пор, пока крышка не соберется с CAM. Затяните винты, чтобы закрепить крышку на месте, убедитесь, что крышка выровняна и что крышка не оказывает никакого давления вниз на CAM.
- Получение изображений множественных случайных колоний из контрольных и экспериментальных групп (10-20) из нескольких (5-10) эмбрионов.
ЗАМЕТКА. Рекомендуется приобретать случайные 3D-стеки (1-5 мм Z-шагов; диапазон 50-100 мм; 25x) из каждого поля. - Используйте опцию полевого сшивания в программном обеспечении для сбора микроскопов, если таковое имеется. Поскольку изображения, используемые для количественной оценки, не будут качества публикации, используйте быстрые режимы получения, такие как резонансное сканирование, если таковые имеются. Используйте объектив 25x и 3 x 3 сшивания с Z-шагом 5-10 мкм, общим диапазоном 100 мкм. Изображение не менее 100 клеток (~20 колоний) на каждое условие.
8. Количественная оценка контактов кровеносных сосудов раковых клеток
- Откройте 3D-файл как Z-стек с помощью необходимого программного обеспечения.
ЗАМЕТКА. Специализированное программное обеспечение должно использоваться для получения и анализа изображений с высоким разрешением, чтобы количественно оценить контакт раковых клеток и кровеносных сосудов. Доступно несколько программных пакетов, способных к 3D-анализу изображений. Пожалуйста, смотрите Таблицу материалов для получения более подробной информации. - Если во время получения изображения произошло значительное движение XY, выровняйте Z-стек с помощью плагина ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
- Найдите интересующих ячейки.
- Прокрутите изображение XYZ в направлении Z и определите оптический участок, который содержит максимальную длину контакта кровеносного сосуда раковой клетки для интересуемой клетки(рисунок 2E).
- Измерьте контакт раковых клеток и кровеносных сосудов с помощью «функции ручного измерения длины».
- Введите измерения в программный пакет данных, который используется для статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Способность раковых клеток прикрепляться к кровеносным сосудам может быть измерена либо как длина контактов раковых клеток с кровеносными сосудами, либо как процент клетки, контактировав с сосудистой клеткой для конкретного клона раковой клетки (или и того, и другого). - Переходите к следующей ячейке интереса.
- Анализируйте данные на статистическую значимость, сравнивая мутантные клоны (клоны) и контрольные наборы данных.
9. Количественная оценка компактности колонии
- Повторно вставите ячейки из расширенного клона, используя ту же технику, что и на шаге 2.
- Через пять дней после инъекции получите изображения 10-50 случайных метастатических колоний для каждого клона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки компактности метастатической колонии не требуется высококачественных изображений. Достаточно монохроматических, стереомикроскопических (10-кратное увеличение) изображений. Следует обратить внимание на яркость изображения (должно быть видно большинство клеток внутри колонии) и контрастность (разница между одной или двумя клетками). - Цифровое выделение изображения колонии (см. Рисунок 2C,D)и переход к количественной оценке компактности колонии с использованием автономного модуля количественной оценки компактности колонии или слепой оценки13.
- Переходим к следующей колонии интересов.
- Анализ данных на статистическую значимость, сравнивая мутантные клоны (клоны) и контрольные (т.е. скрембл шРНК) наборы данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекция раковых клеток считается успешной, если большинство клеток, которые находятся в капиллярах, являются одиночными и расположены при значительном отличии друг от друга (~0,05-0,1 см), поэтому колонии не будут перекрываться через 5-6 дней инкубационного периода(рисунок 3А). Инъекция не была успешной, если накопление раковых клеток можно увидеть в большинстве капилляров, эмбрионы, демонстрирующие это, должны быть выброшены(рисунок 2E). Значительное количество введенных раковых клеток погибает в течение 24 ч после инъекции, в результате что некоторые эмбрионы, по-видимому, отторгают все раковые клетки. Выживаемость раковых клеток будет варьироваться в зависимости от местного поставщика яйцеклеток (т. Е. Количество клеток, которые будут введены, может варьироваться), и мы настоятельно рекомендуем определить оптимальные условия инъекции (концентрация раковых клеток или продолжительность инъекции), прежде чем приступать к эксперименту. Мы рекомендуем концентрацию клеток в диапазоне от 0,5 х 106 до 1,0 х 10 6 клеток/м. Когда достигается оптимальная концентрация клеток и продолжительность инъекции, на 5-й день после инъекции трансдуцированные клетки должны производить широкий спектр колониальных фенотипов, причем большинство колоний кажутся инвазивными, что определяется раковыми клетками, разбросанными в ткани CAM(рисунок 3A). Следует обратить внимание на метастатические колонии, которые кажутся «компактными» и расположены достаточно далеко от соседних колоний, чтобы их можно было иссекать щипцами и ножницами в одном кускеCAM-ткани (рисунок 3C). Изолированное положительное попадание на экран (т.е. компактная колония) должно отображать фенотип компактной колонии при повторной заезде(рисунок 3B). Также может наблюдаться снижение выживаемости клеток (или скорости пролиферации клеток в пределах колонии). Поэтому вполне возможно, что для некоторых положительных попаданий на экран необходимо будет ввести более высокие номера клеток, чтобы получить достаточное количество колоний. Для измерения контактов раковых клеток и кровеносных сосудов следует обратить внимание на яркость пятна сосудистой стенки (флуоресцентный лектин; Рисунок 3D,E) и соответствующее количество лектина должны быть введены для яркого/контрастного сигнала сосудистой стенки. Любое доступное программное обеспечение для анализа изображений может быть использовано на этапах количественной оценки после калибровки программного обеспечения микроскопа.
Рисунок 1:Обзор культуры без оболочки куриного эмбриона. (A) Взвешивающая посуда с крышкой, приготовленная для культуры без оболочки. Стрелка указывает на срезанный угол. (B) Взвешивание посуды, расположенных рядами в вытяжке потока. (C)Резка яичной скорлупы электрическим вращающимся инструментом. (D) Разбить яйцо в весовую посуду. (E) Эмбрионы, культивированные в увлажненный инкубатор. Шкала стержней = 1 см (A-D) или 5 см (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схема инъекции раковых клеток и выделения метастатической колонии. (A) Блок-схема, описывающая этапы платформы скрининга куриного эмбриона. (B) Инъекция раковых клеток, установленная на стадии стереофлуоресцентного микроскопа. (C) Инъекция раковых клеток в сосудистую сосудистую клетку CAM. (D) Изображение, показывающее успешную инъекцию раковых клеток (приемлемая плотность раковых клеток), взятое сразу после инъекции. (E) Изображение, показывающее плохую инъекцию раковых клеток, рассматриваемую как чрезмерно введенный эмбрион. Обратите внимание, что раковые клетки накапливаются в кровеносных капиллярах (белые стрелки). Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативные результаты для различных этапов протокола скрининга. (A) Метастатические колонии, образованные гетерогенными (библиотекой трансдуцированных клеток линии раковых клеток HEp3), через 5 дней после инъекции. Красная стрелка показывает компактную колонию (потенциальное положительное попадание), которую следует иссекать. (B) Метастатические колонии, образованные одним из изолированных попаданий экрана(KIF3B)после повторной инъекции, через 5 дней после инъекции. Вставки показывают цифровое вырезание изображений метастатической колонии из пунктирных квадратов. Это приемлемое качество изображения для количественной оценки C.I. Показано среднее значение C.I. для повторной закачка удара(KIF3B). (C) Выделение метастатической колонии, представляющих интерес, из ткани CAM. Репрезентативные оптические участки(D)контрольной колонии и(E)сверхэкспрессивной колонии KIF3B шРНК, оба показывают измерения контакта раковых клеток и кровеносных сосудов. Сосудистая азкулятор CAM маркируется флуоресцентным лектином-649. Шкала стержней = 1 см (A-C) или 50 мкм (D, E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол скрининга приживитых прижизвых скринингов на основе быстрой флуоресцентной микроскопии, который может быть использован для важных применений, таких как генетические скрининги или скрининги кандидатов на лекарства. Раковые клетки, которые были трансдуцированы с помощью генетической библиотеки, представляющих интерес, или трансфектурированы индивидуальными конструкциями экспрессии, могут быть быстро проверены и количественно определены в отношении фенотипа, представляющим интерес, с использованием этой модели CAM цыпленка. Поскольку протоколы трансдукции или трансфекции значительно различаются в зависимости от типа библиотеки, они не включены в эту процедуру. Фенотипически значимые метастатические колонии иссекаются из CAM, расширяются, а ДНК выделяется для высокопроизводительного секвенирования для идентификации интересующей конструкции экспрессии. Как правило, каждая генетическая библиотека оснащена праймерными последовательностями и рекомендуемыми методами геномной очистки ДНК. Мы рекомендуем использовать рекомендации по локальным объектам для достижения наилучших результатов секвенирования с высокой пропускной способностью.
Рекомендуется определить оптимальную множественность инфекции (M.O.I.) для библиотеки и клеточной линии перед скринингом. В идеале каждая клетка (и, следовательно, будущая метастатическая колония) должна содержать только одну конструкцию экспрессии генов, однако, по нашему опыту, это не всегда достижимо. Мы рекомендуем следовать протоколу производителя библиотеки и тестировать широкий диапазон M.O.I. (0.01-5), чтобы достичь как можно ближе к 1. Наличие нескольких библиотечных конструкций экспрессии внутри каждой метастатической колонии может существенно усложнить анализ фенотипа колонии. Мы также рекомендуем использовать в своих экспериментах предоставленный производителем библиотеки отрицательный контроль (т.е. скремблирование шРНК-экспрессирующий вектор, который флуоресцентно помечен).
Наш протокол скрининга основан на отборе неинвазивных флуоресцентных колоний; крайне важно обеспечить, чтобы все клеточные линии, используемые в экспериментах, имели одинаковую интенсивность флуоресценции. Неравномерная интенсивность флуоресценции среди клеток (и метастатических колоний) может привести к смещенному выбору колонии из-за яркости клеток или колоний вместо инвазивности.
По сравнению с существующими методами наш протокол предоставляет несколько уникальных преимуществ, таких как скорость, низкая стоимость и возможность завершения цикла прижизального экрана без необходимости использования сложного оборудования визуализации12,13,14. Кроме того, весь цикл скрининга может быть завершен в течение 3-6 недель от инъекции клетки до стадии секвенирования. Для инъекции раковых клеток или выделения метастатической колонии не требуется микроскоп с высоким разрешением, поскольку эти шаги могут быть выполнены с использованием базового флуоресцентного стереомикроскопа, который доступен большинству исследователей. Наконец, поскольку культивирование эмбрионов без оболочки полностью самоподдерживается, нет необходимости в сложном исследовательском размещении животных или графиках кормления. Большинство научно-исследовательских институтов не считают куриные эмбрионы живыми животными, что значительно снижает стоимость и бремя документации, связанные с этой моделью.
Тем не менее, существуют некоторые ограничения, связанные с моделью эмбриона без оболочки. Во-первых, не все линии раковых клеток работают в этой модели эффективно. В нашей лаборатории мы регулярно используем несколько линий раковых клеток, таких как HT1080 (фибросаркома человека), HEp3 (голова и шея) и мышиная меланома b16 и клеточные линии рака молочной железы 4T1, которые надежно образуют метастатические колонии при введении в сосудистую сеть CAM курицы. Другие клеточные линии с различными типами рака, такие как грудь (MDA468), мозг (U87 и U118) или яичники (A2780s), легко образуют метастатические колонии при введении в CAM и, следовательно, могут быть использованы в этом протоколескрининга,а также12,14,15. Тем не менее, по нашему опыту, широко используемые линии раковых клеток, такие как LnCaP и PC3, не очень хорошо работают в этой модели (неопубликованные наблюдения). Другим ограничением является то, что конфокальный микроскоп с диапазоном визуализации от 100 до 200 мкм требуется для визуализации с высоким разрешением, такой как визуализация контактов кровеносных сосудов раковых клеток, это оборудование может быть недоступно для многих исследователей.
В целом, этот протокол описывает платформу быстрого прижизневого скрининга, которая может быть использована для обнаружения супрессоров и драйверов метастазирования рака. Мы твердо верим, что надежность и простота использования этой модели сделают ее важной моделью скрининга для многих исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Канадского онкологического общества #702849 JDL и KS. Доктор Льюис возглавляет кафедру Фрэнка и Карлы Соджонки в области исследований рака предстательной железы при поддержке Фонда рака Альберты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).
